CN102796102A

CN102796102A - 咖啡因半抗原、偶联物及应用、咖啡因检测或测定方法

Info

Publication number: CN102796102A
Application number: CN2012101951062A
Authority: CN
Inventors: 邓发亮; 王继华
Original assignee: Guangzhou Wondfo Biotech Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Wondfo Biotech Co Ltd
Priority date: 2012-06-13
Filing date: 2012-06-13
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2032-06-13
Also published as: CN102796102B

Abstract

本发明公开一种咖啡因半抗原、偶联物及应用、咖啡因检测或测定方法，应用在免疫层析技术上，具有高灵敏度、高特异性、简单快捷、易于操作和无需任何仪器设备等优点。

Description

咖啡因半抗原、偶联物及应用、咖啡因检测或测定方法

技术领域

本发明涉及制备抗体的半抗原和偶联物的领域，确切地说是指一种咖啡因半抗原、偶联物及应用、咖啡因检测或测定方法。

背景技术

咖啡因(Caffine)又称咖啡碱、茶素，白色或微黄绿色，质地轻软而有丝光的针状结晶，无臭，易溶于水，在干燥空气中可风解。

咖啡因对中枢神经系统有广泛的兴奋作用，小剂量时可祛除疲劳、兴奋神经、消除睡意、改善思维的作用，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏；此外，咖啡因还常配伍麦角胺治疗偏头痛；配伍解热镇痛药治疗一般性头痛。此时，它由于收缩脑血管，减少脑血管搏动的幅度而加强以上药物止头痛的作用。在具有依赖性的药物中，咖啡因的毒副作用较低，但是，应用大剂量咖啡因时会兴奋脊髓，以及引起惊厥；孕期饮用过量咖啡则会导致胎儿发育迟缓，分娩低体重婴儿的危害性增加。此外，咖啡因在刺激兴奋期过后，紧接着会出现行为和精神抑制，患者表现昏昏沉沉。如果是高空作业者、驾驶员或操纵机器者则易发生事故。咖啡因被列入国家第一类精神药品管理范围，临床上限制使用。

随着因吸食咖啡因而导致的刑事案件逐年上升和国家对咖啡因管理的日趋严格，本领域对咖啡因和滥用药物者生物标本中咖啡因的检测提出了更高的要求。

目前，咖啡因的检测主要有薄层色谱法和基于色谱分析方法，如气相色谱分析法(GC)和高效液相色谱分析法(HPLC)。这些色谱分析方法具有高灵敏度和特异性，但操作繁琐，需要精密仪器和受过专业培训的操作人员，且耗时长。

而特定的结合反应，例如抗原-抗体反应，已经广泛用于检测生物样品中存在的各种物质的免疫测试中。其中，胶体金免疫层析技术发展迅速，已被人们所熟知，与仪器色谱分析法比较，胶体金层析技术具有高灵敏度、高特异性、简单快捷、易于操作和无需任何仪器设备等优点。

因此，本领域迫切需要用于建立咖啡因免疫层析分析方法所需的半抗原及偶联物。

发明内容

针对上述缺陷，本发明解决的技术问题在于提供用于建立咖啡因免疫层析分析方法所需的半抗原及偶联物。

为了解决以上的技术问题，本发明提供的咖啡因半抗原，在咖啡因代谢物之一茶碱的7位氮原子上用连接臂衍生而成。

优选地，咖啡因半抗原的结构式为：

其中R表示连接臂，X表示末端基团。

优选地，R选自取代或未取代的亚烷基或芳香基成分、直链或支链的亚烷基或芳香基成分、饱和或不饱和的亚烷基或芳香基成分；X选自羧酸或其酯、胺、马来酰亚胺、卤代羧酸或其酯、醛、醇、二硫吡啶、乙烯砜或硫代羧酸或其酯成分。

优选地，R为C_1-6。

优选地，X是羧基(COOH)、巯基(SH)或氨基(NH₂)成分。

优选地，半抗原选自下面的咖啡因半抗原衍生物：茶碱-7-乙酸；茶碱-7-丁酸；茶碱-7-戊酸。

本发明还一种咖啡因半抗原与产生抗原性的载体物质结合的偶联物，所述咖啡因半抗原为前述的咖啡因半抗原，载体物质为蛋白质、蛋白质片段、合成多肽或半合成多肽。

还有，本发明进一步公开前述的咖啡因半抗原与产生抗原性的载体物质结合的偶联物在检测或测定样品中咖啡因的应用。

另外，本发明再提供一种咖啡因检测或测定方法，包括如下步骤：

(1)、将样品与前述的偶联物接触；(2)、检测或测定咖啡因结合的偶联物；(3)、从校准曲线推测样品中咖啡因的存在或者数量。

以及，一种检测或测定咖啡因的免疫层析分析试纸，所述试纸包括前述的偶联物。

与现有技术相比，本发明提供的咖啡因半抗原、偶联物及应用、咖啡因检测或测定方法，应用在免疫层析技术上，具有高灵敏度、高特异性、简单快捷、易于操作和无需任何仪器设备等优点。

附图说明

图1本发明实施例中咖啡因和它的主要代谢物的结构图；

图2本发明实施例中咖啡因半抗原1的¹H-NMR谱图；

图3本发明实施例中咖啡因半抗原2的¹H-NMR谱图；

图4本发明实施例中咖啡因半抗原3的¹H-NMR谱图；

图5本发明实施例中咖啡因偶联物A偶联成功-紫外扫描图谱；

图6本发明实施例中咖啡因偶联物B偶联成功-紫外扫描图谱；

图7本发明实施例中咖啡因偶联物C偶联成功-紫外扫描图谱。

具体实施方式

为了本领域的技术人员能够更好地理解本发明所提供的技术方案，下面结合具体实施例进行阐述。

半抗原的制备

半抗原茶碱-7-乙酸(半抗原1)、茶碱-7-丁酸(半抗原2)和茶碱-7-戊酸(半抗原3)根据以下路线合成。

以茶碱为起始原料，在N₂保护，18-冠-6催化下，与2-溴乙酸乙酯反应，产物经水解得到茶碱-7-乙酸(半抗原1)；

在乙腈溶液中，N₂保护，18-冠-6催化，茶碱与4-溴丁酸乙酯反应，产物经水解得到茶碱-7-丁酸(半抗原2)；

在N，N-二甲基甲酰胺中，N₂保护，18-冠-6催化，茶碱与5-溴丁酸乙酯反应，产物经水解得到茶碱-7-戊酸(半抗原3)。

偶联物的制备

本发明提供了半抗原的确切结构，但它们本身不具有免疫原性，只具备反应原性，所以需要与载体物质偶联，对宿主动物施与偶联物，将引发免疫原性应答产生抗体。适当的载体物质通常含有聚合片段并且包括多肽、蛋白质和糖蛋白。有用载体物质的例证性实例是牛血清白蛋白(BSA)、鸡蛋白蛋白(OVA)、钥孔戚血蓝蛋白(KLH)等。或者，可以利用具有足够数目氨基的合成聚(氨基酸)，如赖氨酸，也可以是其他具有反应官能团的合成或天然多聚体物质。特定地，可以将碳水化合物、酵母或多糖可以与半抗原结合制备偶联物。

使用本发明的半抗原制备偶联物时，若其中含有巯基基团，首先可以利用同型或异型双功能交联剂将活性基团如马来酸亚胺、卤素或乙烯砜等导入载体物质或标记物质中，之后这些修饰的载体物质可以与本发明中半抗原的巯基偶联起来。这些同型或异型双功能交联剂如苯二马来酰亚胺、马来酰亚胺-琥珀酰亚胺酯、N-琥珀酰亚胺基-(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯、溴乙酰基甘氨酸-N-羟基琥珀酰亚胺，或乙烯砜等。对于没有巯基基团的半抗原，如半抗原1、半抗原2和半抗原3，可以与没有预先修饰的载体物质结合，通过标准结合方法，如EDC、NHS或戊二醛法进行。

咖啡因偶联物的应用-咖啡因检测用免疫层析分析试纸

咖啡因的检测采用竞争抑制法。本发明将咖啡因偶联物(CAF-BSA)固定于硝酸纤维素膜上的检测区域，待检样品溶液中的咖啡因小分子与咖啡因偶联物竞争结合功能性微球(如胶体金、彩色胶乳、荧光胶乳等)标记的抗咖啡因单抗。待检样品中的咖啡因小分子将抑制抗咖啡因单抗与咖啡因偶联物的结合，从而抑制在硝酸纤维素膜上的检测区域形成色带(或者荧光带)。检测后如果检测区域形成色带(或者荧光带)，则结果为阴性，表明待测样品中不含咖啡因；反之，不形成色带(或者荧光带)，则结果为阳性，检测样品中含有咖啡因。

通常，在检测中设置内质控。在硝酸纤维素膜上临近检测区域设置质控区域，将羊抗鼠IgG多抗固定在质控区域。检测过程中，无论待检样品中是否含有咖啡因，层析载体玻璃纤维上预包被的功能性微球标记或其他有色标记的咖啡因单克隆抗体总能与质控区域羊抗鼠IgG多抗结合形成一条有色(或荧光)质控带，该条带是判定层析过程是否正常和检测试纸是否变质的标准。

请参见图1-图7，图1本发明实施例中咖啡因和它的主要代谢物的结构图；图2本发明实施例中咖啡因半抗原1的¹H-NMR谱图；图3本发明实施例中咖啡因半抗原2的¹H-NMR谱图；图4本发明实施例中咖啡因半抗原3的¹H-NMR谱图；图5本发明实施例中咖啡因偶联物A偶联成功-紫外扫描图谱；图6本发明实施例中咖啡因偶联物B偶联成功-紫外扫描图谱；图7本发明实施例中咖啡因偶联物C偶联成功-紫外扫描图谱。

在图1中，咖啡因的代谢在肝脏中发生，由细胞色素P 450氧化酶酶系统氧化，形成三种不同的二甲基黄嘌呤：副黄嘌呤(1，7-二甲基黄嘌呤，84％)、可可碱(12％)、茶碱(4％)，这些化合物进一步代谢，最终通过尿液排泄出体外。

实施例1：茶碱-7-乙酸(半抗原1)的合成

将茶碱1.80g(10mmol)和溴乙酸乙酯2.0g(12mmol)置于50ml三口圆底烧瓶中，加入乙腈20ml搅拌溶解，通入氮气保护，依次加入KI(2mmol)、催化剂18-冠-6(0.1mmol)、碳酸钾(12mmol)，升温回流反应24h，TLC跟踪检测。反应完毕，减压除去溶剂，加入冰水30ml搅拌溶解，用乙酸乙酯15ml×3萃取3次，合并有机相，盐水洗涤两次，收集有机相，无水硫酸钠干燥1h。过滤收集母液，回收溶剂得茶碱-7-乙酸乙酯粗品2.4g，不经纯化用于下一步反应。

将茶碱-7-乙酸乙酯粗品2.4g溶于10ml无水乙醇中，滴加20％氢氧化锂溶液15ml，加毕，室温反应4h。加水100ml稀释，调pH至6.5～7.0，用氯仿20ml×3萃取3次，合并有机相，水洗涤两次，收集有机相，无水硫酸钠干燥2h。过滤除去固体，回收溶剂得茶碱-7-乙酸(半抗原1)1.86g。

¹H-NMR(CDCl₃)δ：8.0445(1H，H-8)，5.0728(2H，7-CH₂COO)，3.4431(3H，4-CH₃)，3.2090(3H，2-CH₃)，谱图中没有显示-COOH的氢原子，且两个甲基氢原子的积分与溶剂的峰积在一起，无法分辨。

实施例2：茶碱-7-丁酸(半抗原2)的合成

将茶碱1.80g(10mmol)和4-溴丁酸乙酯2.34g(12mmol)置于25ml三口圆底烧瓶中，加入乙腈15ml搅拌溶解，通入氮气保护，依次加入KI(2mmol)、催化剂18-冠-6(0.1mmol)、碳酸钾(12mmol)，升温回流反应16h，TLC跟踪检测。反应完毕，减压除去溶剂，加入冰水30ml搅拌溶解，用乙酸乙酯15ml×3萃取3次，合并有机相，盐水洗涤两次，收集有机相，无水硫酸钠干燥1h。过滤收集母液，回收溶剂得茶碱-7-丁酸乙酯粗品3.0g，不经纯化用于下一步反应。

将茶碱-7-丁酸乙酯粗品3.0g溶于10ml无水乙醇中，滴加20％氢氧化锂溶液15ml，加毕，室温反应4h。加水100ml稀释，调pH至6.5～7.0，用氯仿20ml×3萃取3次，合并有机相，水洗涤三次，收集有机相，无水硫酸钠干燥2h。过滤除去固体，回收溶剂得茶碱-7-丁酸(半抗原2)2.1g。

¹H-NMR(CDCl₃)δ：7.930(1H，H-8)，4.382(2H，7-1’-N-CH₂-)，3.535(3H，2-CH₃)，3.353(3H，4-CH₃)，2.328(2H，7-2’-CH₂-)，2.167(2H，7-3’-CH₂-COO)谱图中没有显示-COOH的氢原子，且溶剂的峰δ：4.884(8H)没有剔除。

实施例3：茶碱-7-戊酸(半抗原3)的合成

将茶碱1.80g(10mmol)和溴戊酸乙酯2.5g(12mmol)置于50ml三口圆底烧瓶中，加入乙腈20ml搅拌溶解，通入氮气保护，依次加入KI(2mmol)、催化剂18-冠-6(0.1mmol)、甲醇钠(10mmol)，升温回流反应10h，TLC跟踪检测。反应完毕，减压除去溶剂，加入冰水30ml搅拌溶解，用乙酸乙酯15ml×3萃取3次，合并有机相，盐水洗涤两次，收集有机相，无水硫酸钠干燥1h。过滤收集母液，回收溶剂得茶碱-7-戊酸乙酯粗品4.1g，不经纯化用于下一步反应。

将茶碱-7-戊酸乙酯粗品4.1g溶于10ml乙醇中，滴加20％氢氧化锂溶液15ml，加毕，室温反应3h。加水100ml稀释，调pH至6.5～7.0，用氯仿30ml×3萃取3次，合并有机相，水洗涤两次，收集有机相，无水硫酸钠干燥2h。过滤除去固体，回收溶剂得茶碱-7-戊酸乙酯(半抗原3)2.6g。

¹H-NMR(CDCl₃)δ：12.0357(lH，COOH)，8.0987(lH，H-8)，4.2476(2H，7-1’-N-CH₂-)，3.235(3H，2-CH₃)，2.5513(3H，4-CH₃)，2.2310(2H，7-2’-CH₂-)，1.7856(2H，7-3’-CH₂-)，1.4253(2H，7-4’-CH₂-)。

实施例4：半抗原1与BSA的偶联-偶联物A

将50mg半抗原1溶于1ml DMF中，边搅拌边加入100mg EDC盐酸盐和50mg NHS，室温反应2h，缓慢加入预先配好的200mg BSA与5ml PBS(0.01mol/L，pH 7.2)的溶液，室温下搅拌反应24h。然后用PBS(0.01mol/L，pH 7.4)于4℃透析3天(换液3次)，离心，收集上清液，冷冻干燥得偶联物A。

偶联A紫外扫描图谱如图5所示，波长260-300nm范围，BSA在波长280nm处有最大吸收峰，OD值约为0.35，咖啡因半抗原1在波长约280nm处有最大吸收峰，OD值约为4.0，而偶联物A在波长约280nm处有最大吸收峰，OD值大于0.35小于4.0，根据文献Chen XJ，Zhao HJ.Application ofimmunological technic in plant science[M].Beijing：Agriculture Pree，1998，30-38的报道，可推测CAF半抗原1与载体蛋白质BSA偶联成功。

实施例5：半抗原2与BSA的偶联-偶联物B

偶联方法同实施例4。

偶联B紫外扫描图谱如图6所示。

实施例6：半抗原3与BSA的偶联-偶联物C

偶联方法同实施例4。

偶联C紫外扫描图谱如图7所示。

实施例7：咖啡因检测用胶体金免疫层析分析试纸的制备

(1)胶体金-单抗结合物玻璃纤维条的制备

将广州万孚生物技术有限公司提供的胶体金标记的咖啡因抗体与pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲溶液混合，配制成浓度0.5mg/ml的溶液，均匀地涂布在玻璃纤维素纸上，涂布量为50μl/cm²，真空干燥12h。

(2)检测线和质控线的制备

检测线：将偶联物C与pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲溶液混合，配制成浓度0.5mg/ml的溶液，喷在硝酸纤维素膜上。

质控线：将羊抗鼠IgG多抗与pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲溶液混合，配制成浓度0.6mg/ml的溶液，喷在硝酸纤维素膜上。

然后在50℃干燥12h。

(3)胶体金免疫层析分析试纸的组装

将滤样纸、包被有胶体金标记的咖啡因抗体的玻璃纤维素纸、包被有咖啡因偶联物C(检测线)和羊抗鼠IgG多抗(质控线)的硝酸纤维素膜、吸水纸依次搭接组装成测试条，将测试条置于支撑板上，用胶带固定。

实施例8：咖啡因检测用胶体金免疫层析分析试纸的灵敏度测试

(1)样本配制：

根据测试要求，在空白尿样中添加咖啡因标准品，分别配制成含咖啡因的样本，浓度为1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、16μg/ml、17μg/ml、18μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml和30μg/ml。

(2)检测与结果

将上述系列浓度定量梯度测试，灵敏度实验结果如表1。表1胶体金免疫层析分析试纸的灵敏度实验结果

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。

实验结果表示，实施例7制备的胶体金免疫层析分析试纸最低检测量15μg/ml。

实施例9：咖啡因检测用胶体金免疫层析分析试纸的药物交叉实验

157种毒品和常用药物，分别用阴性尿液配成浓度100ug/ml的样本。显色情况按广州万孚生物技术有限公司比色卡判读，测试线显色达C5以上，试剂条显两条明显条带，判为阴性结果，用“-”表示。T线显色达C5以下，T线较浅，只显一条明显条带，判为阳性结果，用“+”表示。

本实施例的检测咖啡因的胶体金免疫层析分析试纸采用常规的制备方法制成，包括测试条和支撑测试条的支撑板；测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成，其中，层析材料预包被胶体金标记或有色标记的咖啡因单克隆抗体或多克隆抗体。硝酸纤维素膜上吸附检测线和质控线；检测线为咖啡因偶联物，检测线所在的区域为检测区；质控线为羊抗鼠多克隆

抗体，质控线所在的区域为质控区。

实施例10：咖啡因检测用荧光胶乳免疫层析分析试纸的制备

(1)荧光胶乳-单抗结合物玻璃纤维条的制备

将广州万孚生物技术有限公司提供的荧光胶乳标记的咖啡因抗体与DH为7.8的10mM磷酸盐缓冲溶液混合，配制成浓度0.5mg/ml的溶液，均匀地涂布在玻璃纤维素纸上，涂布量为40μl/cm²，真空干燥12h。

(2)检测线和质控线的制备

检测线：将偶联物C与pH为7.8的10mM磷酸盐缓冲溶液混合，配制成浓度0.5mg/ml的溶液，喷在硝酸纤维素膜上。

质控线：将羊抗鼠IgG多抗与pH为7.8的10mM磷酸盐缓冲溶液混合，配制成浓度0.4mg/ml的溶液，喷在硝酸纤维素膜上。然后在50℃干燥12h。

(3)胶体金免疫层析分析试纸的组装

组装方法与实施例7一致。

实施例11：咖啡因检测用彩色胶乳免疫层析分析试纸的灵敏度测试

(1)样本配制：

方法与实施例8一致

(2)检测与结果

将上述系列浓度定量梯度测试，灵敏度实验结果如表2。

表2荧光胶乳免疫层析分析试纸的灵敏度实验结果

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。

实验结果表示，实施例7制备的胶体金免疫层析分析试纸最低检测量3μg/ml。

实施例12：咖啡因检测用荧光胶乳免疫层析分析试纸的药物交叉实验

157种毒品和常用药物，分别用阴性尿液配成浓度100ug/ml的样本。检测情况主要借用广州万孚生物技术有限公司生产的荧光免疫检测仪进行，通过仪器直接判读阴性或者阳性结果。阴性或者阳性的结果可以通过设定仪器判读的阈值进行判读。在本实施例中，设定的判读阈值为10ug/ml，高于该值为阳性(用“+”表示)，低于该值为阴性(用“-”表示)。

本实施例的检测咖啡因的荧光胶乳免疫层析分析试纸采用常规的制备方法制成，包括测试条和支撑测试条的支撑板；测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成，其中，层析材料预包被荧光胶乳标记或其他类型胶乳标记的咖啡因单克隆抗体或多克隆抗体。硝酸纤维素膜上吸附检测线和质控线；检测线为咖啡因偶联物，检测线所在的区域为检测区；质控线为羊抗鼠多克隆抗体，质控线所在的区域为质控区。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种咖啡因半抗原，其特征在于，在咖啡因代谢物之一茶碱的7位氮原子上用连接臂衍生而成。

2.根据权利要求1所述的咖啡因半抗原，其特征在于，其结构式为：

其中R表示连接臂，X表示末端基团。

3.根据权利要求2所述的咖啡因半抗原，其特征在于，R选自取代或未取代的亚烷基或芳香基成分、直链或支链的亚烷基或芳香基成分、饱和或不饱和的亚烷基或芳香基成分；X选自羧酸或其酯、胺、马来酰亚胺、卤代羧酸或其酯、醛、醇、二硫吡啶、乙烯砜或硫代羧酸或其酯成分。

4.根据权利要求3所述的咖啡因半抗原，其特征在于，R为C_1-6。

5.根据权利要求3所述的咖啡因半抗原，其特征在于，X是羧基(COOH)、巯基(SH)或氨基(NH₂)成分。

6.根据权利要求1-5任一项所述的咖啡因半抗原，其特征在于，半抗原选自下面的咖啡因半抗原衍生物：茶碱-7-乙酸；茶碱-7-丁酸；茶碱-7-戊酸。

7.一种咖啡因半抗原与产生抗原性的载体物质结合的偶联物，其特征在于，所述咖啡因半抗原为前述任一项权利要求的咖啡因半抗原，载体物质为蛋白质、蛋白质片段、合成多肽或半合成多肽。

8.一种咖啡因检测或测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)、将样品与权利要求7所述的偶联物接触；(2)、检测或测定咖啡因结合的偶联物；(3)、从校准曲线推测样品中咖啡因的存在或者数量。

9.一种检测或测定咖啡因的免疫层析分析试纸，其特征在于，所述试纸包括权利要求7所述的偶联物。

10.权利要求7所述的偶联物在检测或测定样品中咖啡因的应用。