CN107739372A - 一种多索茶碱注射液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多索茶碱注射液的有关物质，所述有关物质包括杂质A”、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质A、杂质G、茶碱，还提供了分离和合成包括杂质A、杂质A”、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质G等在内用于多索茶碱注射液有关物质测定的对照品的合成方法。

Description

一种多索茶碱注射液
本申请是申请号为2013105339455、申请日为2013年11月03、发明名称为“多索茶碱注射液有关物质测定方法”的母案的分案申请(申请号： 2015102956048)的再次分案。
技术领域
本发明属于注射液的有关物质测定领域，主要涉及一种多索茶碱注射剂的有关物质的测定方法。
背景技术
多索茶碱注射液(10ml:0.2g、10ml:0.1mg、20ml:0.3mg)是以多索茶碱为原料的小容量注射液。作为直接给予人体静脉给药的剂型，由于其存在较高的不良反应发生率等安全性问题，因此注射剂的安全性问题是广大医患人群和监管部门非常重视的重大问题。在影响注射剂的安全性问题的因素中，有关物质的确认和控制是至关重要的，因此良好的有关物质控制和检测方法，能够从根本上解决注射液的安全性问题。多索茶碱注射液的现有的质量标准中，只有规格10ml:0.2g的质量标准中规定了有关物质检测，且无单一杂质的限度要求，只规定总杂不得过0.8％，更没有杂质对照品的参与。在本领域中，研究注射液的有关物质时所用原料药的有关物质概况、制剂处方工艺、降解途径研究结果等因素都会对有关物质有影响，因此明确各有关物质的结构与溯源是比较困难的，现有技术的方法无法定性和定量多索茶碱注射液中的有关物质，虽然多索茶碱注射液已经上市多年，但是上述问题仍然没有得到解决。
另外，多索茶碱的合成路线较多，因此不同生产路线、储存条件和制剂工艺所带来的有关物质也不完全相同。因此，如何分离和确定不同合成路线的有关物质，用理想的检测方法来控制，一直是现有技术中存在的问题。
发明内容
本发明首先提供了一种耐用性好、操作简便快捷的、系统适用性高的利用高效液相色谱法有效控制多索茶碱注射液的有关物质的方法。本发明还提供了分离和合成用于多索茶碱注射液有关物质测定的对照品的方法。
本发明的一种多索茶碱注射液有关物质测定方法，所述方法采用高效液相色谱法(HPLC)进行测定，所述方法是在如下色谱条件与系统适用性试验条件进行，并包括如下步骤：
色谱条件与系统适用性试验条件：填充剂包括十八烷基硅烷键合硅胶；流动相包括乙腈、甲醇、磷酸盐缓冲液中的一种或几种；检测波长240-295nm；理论板数按多索茶碱峰计算不低于1000；
供试品溶液配制步骤：取所述多索茶碱用水稀释，作为供试品溶液；
对照溶液配制步骤：取所述供试品溶液用水稀释，作为对照溶液；
对照品配制步骤：取若干种对照品分别用水溶解并定量稀释制成对照品溶液，作为对照品溶液，所述对照品至少包括茶碱、杂质A、杂质B，所述杂质A为茶碱乙醇，所述杂质B为茶碱乙醛；
检测步骤：将所述对照品溶液、对照溶液、供试品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
判断步骤：供试品溶液的色谱图中与对照品保留时间相一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，均不得过0.2％；其他未知杂质峰，其峰面积总和不得大于对照溶液主峰面积的0.4倍，杂质总和不得过0.7％。
本发明优选的用于多索茶碱注射液有关物质测定的色谱条件与系统适用性试验条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为12：88的乙腈和磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液pH值为5.8；检测波长为273nm；理论板数按多索茶碱峰计算不低于2000。
采用上述的色谱条件与系统适用性方法，多索茶碱注射液有关物质测定方法为：
取所述多索茶碱注射液，用水稀释制成每1ml中含多索茶碱0.01-5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取0.5-5ml，置10-250ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另取茶碱对照品、杂质A对照品、杂质B对照品、用水溶解并定量稀释制成每1ml中含茶碱、杂质A、杂质B各0.1-5μg的溶液，作为对照品溶液；照含量测定项下的色谱条件，取对照品溶液进样1-50μl，各色谱峰之间的分离度均就符合要求，且连续进样6针，其相对标准偏差不得过2.0％；另取对照溶液1-50μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10-30％；再精密量取供试品溶液1-50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍；供试品溶液的色谱图中与茶碱对照品、杂质A对照品、杂质B对照品保留时间相一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，均不得过 0.1％；其他未知杂质峰，其峰面积总和不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍，杂质总和不得过0.5％。
进一步优选的多索茶碱注射液有关物质测定方法，所述测定方法为：
取所述多索茶碱注射液，用水稀释制成每1ml中基本上含多索茶碱1.0mg或1.2mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置200ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另取茶碱对照品、杂质A对照品、杂质B对照品、用水溶解并定量稀释制成每1ml 中基本上含茶碱、杂质A、杂质B各0.5μg的溶液，作为对照品溶液；照含量测定项下的色谱条件，取对照品溶液进样10μl，各色谱峰之间的分离度均就符合要求，且连续进样6针，其相对标准偏差不得过2.0％；另取对照溶液10μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％；再精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍；供试品溶液的色谱图中与茶碱对照品、杂质A对照品、杂质B对照品保留时间相一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，均不得过0.1％；其他未知杂质峰，其峰面积总和不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍(0.1％)，杂质总和不得过(0.5％)。
本发明的“基本上含”与本领域的“约含”的术语概念相同，一方面应理解为溶液中含有相应的溶质的数量是以实际称量数为准的，并且该称量数应符合有效数字保留位数的要求，另一方面，由于测量工具精度范围限制，必然存在测量误差，因而不可能正好称量或量取整数。比如，制备“用水稀释制成每1ml中基本上含多索茶碱1.0mg的溶液”，制备1ml含有0.90mg-1.10mg的多索茶碱都是可以的，而且符合本发明的检测要求。
本发明的多索茶碱注射液有关物质测定方法，所述对照品还包括杂质A”、杂质C、杂质D、杂质E和杂质G中的一种或若干种，各杂质的结构式如下：
杂质的化学名如下：
杂质A”：1-((1，3-二氧戊烷-2-基)甲基)-N-甲基-4-(甲基氨基)-1H-咪唑-5-甲酰胺
杂质C：7-(2，2-二甲氧基乙基)-1，3-二甲基-1H-嘌呤-2，6(3H，7H)-二酮
杂质D：7-(2，2-二乙氧基乙基)-1，3-二甲基-1H-嘌呤-2，6(3H，7H)-二酮
杂质E：2-(1，2，3，6-四氢-1，3-二甲基-2，6-二氧代嘌呤-7-基)乙酸
杂质G：2-(1，2，3，6-四氢-1，3-二甲基-2，6-二氧代嘌呤-7-基)乙酸乙酯。
本发明的多索茶碱注射液有关物质测定方法，所述对照品还包括杂质咖啡因、三甲基黄嘌呤、杂质C’、杂质D’、杂质E’、杂质2和茶碱乙酸中的一种或若干种：
部分杂质的化学名如下：
杂质C’：N-(6-氨基-1，3-二甲基-2，4-二氧代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)甲酰胺、
杂质D’：N-甲基-5-(甲基氨基)-1H-咪唑-4-甲酰胺、
杂质E’：1，3-二甲基-7，9-二氢-1H-嘌呤-2，6，8(3H)-三酮、
杂质2：1，3-二甲基-2，6-酮-7-乙醛-1，2，3，6-四氢吡啶。
本发明特别提供了制备本发明所述多索茶碱注射液所用的多索茶碱，按如下合成路线发生如下反应制得：
在甲醇中醋酸乙烯酯(II)与溴素发生加成反应、并同时醇解，生成溴乙醛缩二甲醇 (III)；溴乙醛缩二甲醇(III)经二氯甲烷萃取后，直接在对甲苯磺酸催化下，与乙二醇发生缩醛交换，生成新的缩醛，即溴甲基二氧五环(IV)，该过程先通过分馏，逐渐除去低沸点的溶剂及新产生的甲醇，以便促进反应的顺利进行，再经减压蒸馏收集溴甲基二氧五环(IV)；以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂、在无水碳酸钾作用下，茶碱(V)与溴甲基二氧五环(IV)顺利发生取代反应，即可生成多索茶碱(I)；最后经乙醇重结晶，即可获得药用要求的合格产品。
用上述方法制得的多索茶碱注射液的有关物质，所述有关物质包括杂质A”、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质A、杂质G、茶碱，各个杂质的合成路线优选如下：
其中杂质A”按如下合成路线发生如下反应：
取多索茶碱30.0g(112.6mmol)，加入20％氢氧化钠水溶液60mL，缓慢加热至80℃、在持续保温反应3小时，HPLC监控反应结束；加入无水乙醇200mL，冰水浴冷却下以盐酸调pH＝8，析出大量固体，过滤；滤液减压浓缩，所得粗品经乙酸乙酯柱层析(或乙酸乙酯重结晶)，得杂质A”。
其中杂质B按如下合成路线发生如下反应：
取多索茶碱10.0g(37.5mmol)，加入35mL水后加热溶解，再加入2M盐酸约6mL，调pH值为1，反应回流8h，TLC监测无原料剩余，浓缩剩约10mL溶剂，加入20mL四氢呋喃分散，抽滤得白色固体，用少量四氢呋喃淋洗得杂质B。
其中杂质C按如下合成路线发生如下反应：
将7H-茶碱9.0g(50.0mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺80mL，然后将溴乙醛缩二甲醇7.3mL(60mmol)和粉末状无水碳酸钾20.7g(150mmol)依次加入混合液中，缓慢升至120℃，持续搅拌反应5h，TLC监测几乎无原料剩余；冷却，抽滤去除无机盐，滤液减压浓缩DMF，向其中加入无水甲醇30mL，室温搅拌0.5h，析出乳白色固体；滤出固体用甲醇重结晶，得杂质C。
其中杂质D按如下合成路线发生如下反应：
取7H-茶碱9.0g(50.0mmol)，溶于N，N-二甲基甲酰胺80mL，搅拌状态下依次加入溴乙醛缩二乙醇9.0mL(60mmol)，粉末状无水碳酸钾20.7g(150mmol)，逐渐升温至120℃，反应5h，TLC监测无原料剩余，冷却后抽滤，滤液减压蒸出DMF，向浓缩后的反应液中加入无水乙醇30mL，室温搅拌0.5h，析出乳白色固体，抽滤后用甲醇重结晶得杂质D。
其中杂质E的合成方法为：
取7H-茶碱4.0g(22.2mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺30mL，搅拌状态下依次加入无水碳酸钾6.2g(44.8mmol)，溴乙酸甲酯2.8mL(30.0mmol)，逐渐升温至30℃，反应3h，TLC监测无原料剩余，抽滤除去无机盐，向滤液中加入水50mL，用乙酸乙酯萃取 (30mL×4)，合并有机层，蒸馏水洗有机层3次，干燥，浓缩得白色固体3.0g；白色固体溶于40mL甲醇，加入氢氧化钠水溶液(1.9g/10mL)，45℃下反应1h，冰水浴下用盐酸甲醇调节pH至3-4，析出大量白色固体，搅拌0.5h，抽滤，干燥得杂质E。
其中杂质A按如下合成路线发生如下反应：
取有关物质B 4.0g(18.0mmol)，加入30mL甲醇，冰水浴下缓慢加入硼氢化钠1.1 g(29.0mmol)，加料完毕，逐渐升至室温反应2h，TLC监测无原料剩余，冰水浴下用2M 盐酸调节pH为3-4，再用饱和碳酸钠溶液调节pH至8-9，减压蒸除甲醇，用水-乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，浓缩得乳白色固体，乙醇重结晶，得杂质A(下文又称杂质F)。
其中杂质G按如下合成路线发生如下反应：
取7H-茶碱4.0g(22.2mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺30mL，搅拌状态下依次加入无水碳酸钾6.2g(44.8mmol)，再加入溴乙酸乙酯2.8mL(30.0mmol)，逐渐升温至50℃，反应4h，TLC监测无原料剩余，抽滤除去无机盐，向滤液中加入水50mL，用乙酸乙酯萃取(30mL×4)，合并有机层，用蒸馏水洗有机层3次，干燥，浓缩得杂质G。
本发明的有益效果在于：提供了一种耐用性好、操作简便快捷、系统适用性高的利用高效液相色谱法可以有效控制多索茶碱注射液的有关物质的方法。经过方法学考察实验，在专属性、重现性、稳定性、精密度等方面均符合要求，创造性的提出了至少含有茶碱、茶碱乙醇、茶碱乙醛在内的三种对照品用于有关物质的测定，同时又提供了杂质A”、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质G、杂质咖啡因、三甲基黄嘌呤、杂质C’、杂质D’、杂质E’、杂质2和茶碱乙酸等用于多索茶碱有关物质测定的杂质对照品，可以控制由于不同合成路线、制剂制备过程和贮存过程带来的有关物质。本发明还提供了分离和合成包括杂质A、杂质A”、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质G等在内用于多索茶碱注射液有关物质测定的对照品的合成方法。特别指出的的是，本发明的测定方法也适用于以氯化钠作为渗透压调节剂的多索茶碱注射液，详细实验见试验例3。
附图说明
图1.茶碱乙醛氢谱谱图；
图2.茶碱乙醛碳谱谱图；
图3.茶碱乙醛质谱谱图；
图4.Impurity F氢谱谱图；
图5.Impurity F碳谱谱图；
图6.ImpurityF质谱谱图。
下面通过试验例，进一步说明本发明的方法：
试验例1方法学考察实验
1、色谱条件
仪器：安捷伦1100高效液相色谱仪
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(大连依利特Hypersil ODS2 5μm4.6x250mm)
流动相：乙睛-磷酸盐缓冲液(pH5.8)(12：88)
检测器：DAD检测器
2、专属性
通过筛查多索茶碱原料和多索茶碱注射液有关物质的检测结果可知，多索茶碱注射液的杂质有三个：除了原料中引入有关物质茶碱与杂质X(暂定)，在茶碱峰前，产生了一个新的未知杂质——杂质Y(暂定)。
根据分析杂质可能产生的来源，共制备了除茶碱以外的七个，分别为：A”、B、C、 D、E、F、G。
2.1杂质定位：取多索茶碱注射液(批号：121019)，精密量取5ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密吸取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
取茶碱和七个杂质，精密称取10mg，分别置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，再精密量取1ml置10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。精密吸取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，多索茶碱、茶碱及七个杂质的保留时间、最大吸收波长结果见表一：
表一：多索茶碱与杂质保留时间表
2.2杂质确定
根据多索茶碱原料及注射液中有关物质现状及杂质对照品的比较分析，可以明确多索茶碱注射液中的三个杂质：茶碱、X、Y，茶碱为杂质对照品中的杂质H；杂质X为杂质对照品中的杂质F；杂质Y为杂质对照品中的杂质B。杂质确认后，将三个杂质根据保留时间的先后顺序依次代码为：茶碱、杂质A(杂质概况及结构确证中的杂质F)、杂质B(杂质概况及结构确证中的杂质B)。
2.2溶剂：精密吸取水10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，与供试品溶液(批号：120915)色谱图相比较，溶剂对三个杂质及主成分峰无干扰。
2.3辅料：配制0.9％氯化钠溶液，精密吸取10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，与供试品溶液(批号：120915)色谱图相比较，辅料对三种杂质及主成分峰无干扰。
2.4杂质代码：杂质确认后，将三个杂质根据保留时间的先后顺序依次代码为：茶碱、杂质A(杂质概况及结构确证中的杂质F)、杂质B(杂质概况及结构确证中的杂质B)。
3、杂质纯度检测：
3.1茶碱(供含量测定用)：批号：100121-199903，由中国药品生物制品检定所提供，纯度为100％。
3.2杂质A、B：取取杂质A、杂质B的色谱图，按峰面积归一化法计算，杂质A 为99.45％，杂质B：97.18％。
取杂质A与杂质B分别检测水分、炽灼残渣，溶剂残留，
结果见表二：
表二：杂质检测结果数据表
杂质A纯度：99.45-0.11-0.02-0.02＝99.30％，
杂质B纯度：97.18-0.23-0.02-0.03＝96.91％。
4、定量限与检测限
取茶碱、杂质A、杂质B的贮备液，在分别用水稀释后，分别精密吸取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，最低检测限与定量限如下：
茶碱：最低检测限为：11.51mg/50mlx1/10x1/50x1/10x10x1000＝ 0.4604ng，信噪比为3∶1；定量限为：0.4604μg/ml。
杂质A：最低检测限为：11.91mgx99.30％/50mlx1/10x1/50x1/10x10x1000＝0.4732ng，信噪比为1∶1；定量限为：0.4732μg/ml。
杂质B：最低检测限为：11.07mg x96.91％/50mlx1/10x1/50x1/10x10x1000＝0.4292ng，信噪比为2∶1；定量限为：0.4292μg/ml。
5、线性关系
取茶碱、杂质A、杂质B的备用液，精密量取5ml，分别置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为线性浓度贮备液；每次分别量取0.2ml、0.5ml、1ml、1.5ml、 2ml、2.5ml，置同一25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；分别精密吸取10μl注入液相色谱仪，记录峰面积，结果见表三：
表三：三个杂质线性关系数据表
以浓度对峰面积进行线性回归，得线性方程：
茶碱：A＝54.227C-0.0125 R2＝0.9996 r＝0.9998
杂质A：A＝36.403C+0.5764 R2＝0.9990 r＝0.9995
杂质B：A＝32.394C+0.2567 R2＝0.9992 r＝0.9996
线性试验结果表明：茶碱在0.1842μg/ml～2.302μg/ml，杂质A在0.1893μg/ml～2.366μg/ml，杂质B在0.1717μg/ml～2.146μg/ml之间均具有良好的线性关系。
6、精密度试验
取线性关系项下浓度2样品，精密吸取10ul注入液相色谱仪，连续进样6次，记录峰面积，见表四：
表四：杂质精密度试验数据表
7、稳定性试验
取精密度样品分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h精密吸取10ul注入液相色谱仪，记录峰面积，结果见表五：
表五、杂质溶液稳定性试验结果数据表
试验结果表明：样品溶液在8小时较稳定。
8、重复性试验
因原料与注射液中茶碱与杂质A的峰面积均低于定量限，在重复性试验中取多索茶碱注射液(批号：120915)，精密量取5ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；共制备5份样品，每份分别精密吸取10μl注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，按外标法计算杂质限量，结果见表六：
表六：杂质限量重复性试验数据表
试验结果表明：此方法测得杂质限量结果的重现性良好。
9、耐用性试验
多索茶碱注射液六批样品(其中将多索茶碱直接用水溶解简称“原工艺”、将多索茶碱用氯化钠调节渗透压简称“新工艺”)，在相同的液相色谱条件下，采用不同的色谱柱进行检测，具体检测方法及结果如下：
9.2耐用性试验检测结果
取对照品溶液图谱与供试液色谱图，按外标法以峰面积计算各杂质量，结果见表七：
表七：多索茶碱注射液耐用性试验结果数据表
结论：在相同的液相色谱条件下，选用不同的色谱柱检测有关物质，按外标法计算各杂质量，经比较，无大的差别，说明本方法耐用性良好。
10、杂质限度确定
取含有三种杂质的多索茶碱注射液(原工艺九批、新工艺九批)，进行有关物质检测，分别采用外标法和不加校正因子的主成分自身对照法对三种杂质进行限度计算，结果见表八：
表八、多索茶碱注射液杂质检测结果数据表
试验例2
对含有杂质的多索茶碱原料批次及用该批次制备的注射液进行了汇总，有关物质按不加校正因子的主成分自身对照法计算结果如表九，(汇总表的杂质分别以茶碱、杂质X、杂质Y表示)。
结论：通过对表一的分析可知，茶碱、杂质X是原料里引入的杂质，而杂质 Y是注射液的制备工艺产生的杂质；且多索茶碱注射液三个规格的结论一致，无明显差异。
试验例3
试验目的：在多索茶碱注射液的处方中增加了氯化钠，为考察上述处方中杂质情况，进行了如下新旧处方杂质对照研究。
试验方法：取批号120924原料，按原工艺与新工艺制备样品，并将样品分别置于40℃、60℃恒温干燥箱中进行影响因素试验。
样品制备：按多索茶碱注射液的新、旧工艺规程分别制备试验用样品，制备情况见表十：
表十：新旧工艺样品制备汇总表
取上述已制备的不同规格的多索茶碱注射液的中间产品，按照中间产品的 pH值范围(4.5～5.5)分别调节为不同pH值，灌封后在115℃、30min条件下进行灭菌，比较灭菌前后两种工艺条件下杂质情况，结果见表十一：
表十一：新旧工艺不同pH值灭菌杂质检测结果汇总表
结论：以上实验数据结果表明，杂质B是在高温灭菌过程中产生的，与灭菌前pH值有关，pH值越低，杂质越高；杂质的产生与多索茶碱注射液的浓度无关，与新旧工艺中是否加入氯化钠无关。
新旧工艺样品的影响因素试验：
为进一步确定新旧工艺是否会影响杂质的产生，对上述样品进行了温度的影响因素试验考察，结果如表十二：
表十二：多索茶碱注射液新旧工艺温度影响因素试验检测结果对照表
结论：多索茶碱注射液的新旧工艺的样品温度影响因素试验结果进一步表明，杂质B的产生与高温有关，在40℃和60℃条件下，杂质基本无变化，提示了新旧工艺的制剂均可以长期保存。
具体实施方式
实施例1杂质B(Impurity B)茶碱乙醛的制备：
制备过程：于250mL三颈瓶中，依次加入多索茶碱10.20g(37.50mmol)、水35.0mL和2.0M盐酸6.0mL，逐渐加热至回流，反应液逐渐呈均相。继续回流8h，HPLC监测无原料剩余。减压浓缩至剩约10mL溶剂，加入四氢呋喃20.0 mL分散，得白色固体。抽滤，以少量四氢呋喃淋洗，干燥，得Impurity B计7.81 g，收率93.8％。
结构确证：
名称：茶碱乙醛
分子式：C9H10N4O3；
分子量：222.20；
CAS No：5614-53-9
结构式：
茶碱乙醛纯度：HPLC法96.9％
1.1.核磁共振氢谱(1H NMR)
(1)测试仪器：Avance DRX 300Bruker；
(2)测试溶剂：d6-DMSO；
(3)测试结果：茶碱乙醛氢谱谱图见图1，详细数据如下：
1H NMR(DMSO-d6)δ＝3.19(s，3H)，3.44(s，3H)，5.28(s，2H)，7.99(s，1H)， 9.66(s，1H)；
(4)谱图解析：
氢谱数据详细归属为：δ3.19和δ3.44为N1-CH3和N3-CH3；δ5.28为位于 N7-CH2CHO上CH2；δ7.99为C8-CH；δ9.66为CHO。
1.2.核磁共振碳谱(13C NMR)
(1)测试仪器：Avance DRX 600Bruker；
(2)测试溶剂：d6-DMSO；
(3)测试结果：茶碱乙醛碳谱谱图见图2，详细数据如下：
13C NMR(DMSO-d6)δ＝27.90(sp3)，29.92(sp3)，55.55(sp3)，106.74(sp2)， 143.60(sp2)，148.46(sp2)，151.45(sp2)，154.90(sp2)，196.71(sp2)；
(4)谱图解析：
碳谱数据详细归属为：δ27.90为N1-CH3、δ29.92为N3-CH3；δ55.55为 N7-CH2CHO上的CH2；δ106.74为C5-C；δ143.60为C8-CH；δ148.46为N4-C；δ151.45 为C2-羰基碳；δ154.90为C6-羰基碳；196.71为CHO碳。
1.3.质谱(LC-MS)
(1)测试仪器：Finnigan LCQ LS/MS；
(2)测试溶剂：甲醇；
(3)测试结果：茶碱乙醛质谱谱图见图3，详细数据如下：
[M-H]-＝221.1，Impurity B的分子式为C9H10N4O3、分子量为M＝222.20，测试结果与理论值一致。
实施例二杂质F(Impurity F)、茶碱乙醇的制备：
制备过程：于100mL 三颈瓶中依次加入Impurity B 4.20g(18.0mmol)、甲醇30.0mL，冰水浴下缓慢加入硼氢化钠1.11g(29.0 mmol)。加料完毕，逐渐升至室温反应2h，HPLC监测无原料剩余。冰水浴下用2.0M盐酸调节pH为3～4，再用饱和碳酸钠溶液调节pH至8～9，减压蒸除甲醇。用水-乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥。过滤、浓缩得乳白色固体。乙醇重结晶，过滤，干燥，得ImpurityF计2.21g，收率55.5％。
结构确证：
名称：茶碱乙醇
分子式：C9H12N4O3；
分子量：224.22；
CAS No：519-37-9
结构式：
茶碱乙醛纯度：HPLC法99.3％
2.1.核磁共振氢谱(1H NMR)
(1)测试仪器：Avance DRX 600Bruker；
(2)测试溶剂：d6-DMSO；
(3)测试结果：Impurity F氢谱谱图见图4，详细数据如下：
1H NMR(DMSO-d6)δ＝3.22(s，3H)，3.42(s，3H)，3.69～3.70(q，2H)， 4.27～4.28(t，2H)，4.91～4.93(t，1H)，7.98(s，1H)；
(4)谱图解析：
氢谱数据详细归属为：δ3.22为N1-CH3、δ3.42为N3-CH3；δ3.69～3.70为N7-CH2CH2OH直接与N相连的CH2；δ4.27～4.28为N7-CH2CH2OH直接与O相连的CH2；δ7.98为N8-CH。
2.2.核磁共振碳谱(13C NMR)：
(1)测试仪器：Avance DRX 600Bruker；
(2)测试溶剂：d6-DMSO；
(3)测试结果：Impurity F碳谱谱图见图5，详细数据如下：
13C NMR(DMSO-d6)δ＝28.01(sp3)，29.88(sp3)，49.36(sp3)，60.10(sp3)， 106.33(sp2)，143.59(sp2)，148.89(sp2)，151.48(sp2)，154.92(sp2)；
(4)谱图解析：
碳谱数据详细归属为：δ28.01为N1-C；δ29.88为N3-C；δ49.36为 N7-CH2CH2OH侧链上与N直接相连的碳；δ60.10为N7-CH2CH2OH上与OH相连的碳；δ106.33为C5-C；δ143.59为C8-CH；δ148.89为C4-C；δ151.48为C2-羰基碳；δ154.92为C6-羰基碳。
2.3.质谱(LC-MS)
(1)测试仪器：Finnigan LCQ LS/MS；
(2)测试溶剂：甲醇；
(3)测试结果：Impurity F质谱谱图见图6，详细数据如下：
[M+H]+＝225.1，[M+Na]+＝247.1，Impurity F的分子式为：C9H13N4O3、分子量为M＝224.09，测试结果与理论值一致。
实施例三杂质A(Impurity A)的制备：
制备过程：于250mL三颈瓶中依次加入多索茶碱7.52g(28.15mmol)、20％氢氧化钠水溶液15.0mL，缓慢加热至80℃、保温反应3小时，HPLC监控反应结束。加入无水乙醇50.0mL，冰水浴冷却，盐酸调pH＝8，析出大量固体。过滤，干燥，得Impurity A粗品。经乙酸乙酯两次重结晶，得Impurity A计5.41g，收率79.8％。
实施例四杂质C(Impurity C)的制备：
制备过程：于250mL三颈瓶中依次加入多索茶碱9.10g(50.0mmol)、N，N- 二甲基甲酰胺80.0mL、溴乙醛缩二甲醇7.3mL(60mmol)和粉末状无水碳酸钾 20.71g(150mmol)，缓慢升至120℃，持续搅拌反应5h，HPLC监测几乎无原料剩余。冷却，过滤，滤液减压浓缩DMF。向其中加入无水甲醇30.0mL，室温搅拌0.5h，析出乳白色固体。滤出固体用甲醇重结晶，得Impurity C计5.42g，收率41.2％。
实施例五杂质D(Impurity D)的制备：
制备过程：于250mL三颈瓶中依次加入多索茶碱9.50g(50.0mmol)、N，N- 二甲基甲酰胺80.0mL、溴乙醛缩二乙醇9.0mL(60mmol)和粉末状无水碳酸钾 20.72g(150mmol)，缓慢升至120℃，持续搅拌反应5h，HPLC监测几乎无原料剩余。冷却，过滤，滤液减压浓缩DMF。向其中加入无水乙醇30.0mL，室温搅拌0.5h，析出乳白色固体。滤出固体用甲醇重结晶，得Impurity D计6.82g，收率46.2％。
实施例六杂质E(Impurity E)的制备：
制备过程：于250mL三颈瓶中依次加入茶碱4.10g(22.2mmol)、N，N-二甲基甲酰胺30.0mL，搅拌状态下依次加入无水碳酸钾6.22g(44.8mmol)、溴乙酸甲酯2.8mL(30.0mmol)，逐渐升温至30℃，反应3h，HPLC监测无原料剩余。过滤，向滤液中加入水50.0mL，用乙酸乙酯萃取(30.0mL×4)，合并有机层，蒸馏水洗有机层3次，有机层干燥，过滤、浓缩得白色固体计3.10g。白色固体溶于甲醇40.0mL中，加入氢氧化钠水溶液(1.91g/10.0mL)，45℃下反应1h。冰水浴下用盐酸甲醇调节pH至3～4，析出大量白色固体，搅拌0.5h，抽滤，干燥得ImpurityE计1.91g，收率36％。
实施例七杂质G(Impurity G)的制备：
制备过程：于250mL三颈瓶中依次加入茶碱4.10g(22.2mmol)、N，N-二甲基甲酰胺30.0mL，搅拌状态下依次加入无水碳酸钾6.22g(44.8mmol)、溴乙酸乙酯2.8mL(30.0mmol)，逐渐升温至30℃，反应3h，HPLC监测无原料剩余。过滤，向滤液中加入水50.0mL，用乙酸乙酯萃取(30.0mL×4)，合并有机层，用蒸馏水洗有机层3次，有机层干燥，过滤、浓缩、干燥，得Impurity G计2.92g，收率49.5％。
实施例八
取杂质A与杂质B，茶碱对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号： 100121-199903，供含量测定用，纯度100％计)通过高效液相色谱仪，采用DAD 检测器，确定其最大吸收波长均为274nm，与多索茶碱的最大吸收波长相一致。与原标准中多索茶碱的最大吸收波长为273nm相差1nm，因此在检测时仍采用标准中规定的273nm。
采用杂质定位项有关物质检测的流动相，用液相色谱法对三种杂质进行具体的方法学研究：三种杂质与主峰均能很好分离，且三种杂质之间亦能很好分离，且分离度符合要求，三种杂质的主要研究结果见表十三：
表十三：多索茶碱注射液中三个杂质主要信息表
以上所述实施例仅仅是本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (1)

1.一种多索茶碱注射液的有关物质，其特征在于，所述有关物质包括杂质A”、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质A、杂质G、茶碱；
所述杂质A”按如下合成路线发生如下反应：
取多索茶碱30.0g(112.6mmol)，加入20％氢氧化钠水溶液60mL，缓慢加热至80℃、在持续保温反应3小时，HPLC监控反应结束；加入无水乙醇200mL，冰水浴冷却下以盐酸调pH＝8，析出大量固体，过滤；滤液减压浓缩，所得粗品经乙酸乙酯柱层析(或乙酸乙酯重结晶)，得杂质A”；
所述杂质B按如下合成路线发生如下反应：
取多索茶碱10.0g(37.5mmol)，加入35mL水后加热溶解，再加入2M盐酸约6mL，调pH值为1，反应回流8h，TLC监测无原料剩余，浓缩剩约10mL溶剂，加入20mL四氢呋喃分散，抽滤得白色固体，用少量四氢呋喃淋洗得杂质B；
所述杂质C按如下合成路线发生如下反应：
将7H-茶碱9.0g(50.0mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺80mL，然后将溴乙醛缩二甲醇7.3mL(60mmol)和粉末状无水碳酸钾20.7g(150mmol)依次加入混合液中，缓慢升至120℃，持续搅拌反应5h，TLC监测几乎无原料剩余；冷却，抽滤去除无机盐，滤液减压浓缩DMF，向其中加入无水甲醇30mL，室温搅拌0.5h，析出乳白色固体；滤出固体用甲醇重结晶，得杂质C；
所述杂质D按如下合成路线发生如下反应：
取7H-茶碱9.0g(50.0mmol)，溶于N,N-二甲基甲酰胺80mL，搅拌状态下依次加入溴乙醛缩二乙醇9.0mL(60mmol)，粉末状无水碳酸钾20.7g(150mmol)，逐渐升温至120℃，反应5h，TLC监测无原料剩余，冷却后抽滤，滤液减压蒸出DMF，向浓缩后的反应液中加入无水乙醇30mL，室温搅拌0.5h，析出乳白色固体，抽滤后用甲醇重结晶得杂质D。
所述杂质E的合成方法为：
取7H-茶碱4.0g(22.2mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺30mL，搅拌状态下依次加入无水碳酸钾6.2g(44.8mmol)，溴乙酸甲酯2.8mL(30.0mmol)，逐渐升温至30℃，反应3h，TLC监测无原料剩余，抽滤除去无机盐，向滤液中加入水50mL，用乙酸乙酯萃取(30mL×4)，合并有机层，蒸馏水洗有机层3次，干燥，浓缩得白色固体3.0g；白色固体溶于40mL甲醇，加入氢氧化钠水溶液(1.9g/10mL)，45℃下反应1h，冰水浴下用盐酸甲醇调节pH至3-4，析出大量白色固体，搅拌0.5h，抽滤，干燥得杂质E；
所述杂质A按如下合成路线发生如下反应：
取有关物质B 4.0g(18.0mmol)，加入30mL甲醇，冰水浴下缓慢加入硼氢化钠1.1g(29.0mmol)，加料完毕，逐渐升至室温反应2h，TLC监测无原料剩余，冰水浴下用2M盐酸调节pH为3-4，再用饱和碳酸钠溶液调节pH至8-9，减压蒸除甲醇，用水-乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，浓缩得乳白色固体，乙醇重结晶，得杂质A；
所述杂质G按如下合成路线发生如下反应：
取7H-茶碱4.0g(22.2mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺30mL，搅拌状态下依次加入无水碳酸钾6.2g(44.8mmol)，再加入溴乙酸乙酯2.8mL(30.0mmol)，逐渐升温至50℃，反应4h，TLC监测无原料剩余，抽滤除去无机盐，向滤液中加入水50mL，用乙酸乙酯萃取(30mL×4)，合并有机层，用蒸馏水洗有机层3次，干燥，浓缩得杂质G。
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