CN102775596A - 紫杉醇衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种能抑制肿瘤细胞多药耐药的紫杉醇衍生物、其制备方法以及在抑制肿瘤细胞多药耐药中的用途。所述紫杉醇衍生物的分子式为：Pluronic-(S-S-PTX)2，其中，Pluronic为表面活性剂普朗尼克，其结构通式为(HO-[CH2CH2O]X-[CH2CH(CH3)O]Y-[CH2CH2O]X-H；x和y代表基团个数，x为2-100的整数，y为30-70的整数；PTX为抗肿瘤药物紫杉醇；S-S-为二硫键；即两分子PTX通过二硫键与一分子Pluronic相连。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及抗肿瘤药紫杉醇的衍生物、其制备方法以及在抑制肿瘤细胞多药耐药中的用途。
背景技术
紫杉醇(PTX)是20世纪末由美国施贵宝公司开发的一种天然抗癌药物，属细胞抑制剂类药物，其作用机理独特。可促进微管蛋白装配成微管，抑制微管的解聚，使微管稳定，从而导致微管束的排列异常，使纺锤体失去正常功能导致细胞死亡，对乳腺癌、卵巢癌疗效突出，另外，对肝癌、肺癌和食管癌、头颈部癌、前列腺癌也有一定疗效。
紫杉醇作为注射用化疗药物，应用的主要障碍是其在水中的溶解度太低，只有0.25μg/mL左右，在体内有效利用率低。现行临床使用的紫杉醇注射液(Taxol)中的紫杉醇是靠聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)与脱水乙醇以1∶1的混合液来稳定和溶解的，浓度为6mg/mL，使用前用生理盐水或5％葡萄糖稀释到最终给药体积。由于治疗需要紫杉醇的量相对较大，而高浓度的表面活性剂Cremophor EL易引起病人产生过敏性反应，故在给药前病人需预先进行抗过敏处理：给予该制剂之前的10～12h先口服地塞米松5～20mg，在滴注该制剂之前30min再肌注或口服苯海拉明50mg，和静脉注射西咪替丁300mg或雷尼替丁50mg。临用前将该制剂稀释于9g/L氯化钠注射液或50g/L葡萄糖注射液500mL中，用非聚氯乙烯材料的输液瓶和输液管，并通过所连接的过滤器(0.22μm孔径)过滤后，静脉注射。该制剂使用时存在以下问题：①Cremophor EL在体内可导致严重的急性过敏反应和低血压；②Cremophor EL可导致PVC包装中的增塑剂溶出，进一步增加毒性；③临床使用前的稀释易使紫杉醇结晶析出；④紫杉醇在溶液中易与玻璃或者塑料的表面发生非特异性结合，导致浓度降低。这些问题使该药临床应用受到限制。
与其他抗肿瘤药物一样，紫杉醇面临的另一个问题是肿瘤细胞的多药耐药。肿瘤细胞对结构、细胞靶点和作用机理迥然不同的抗癌药物同时产生耐药的现象称为肿瘤多药耐药(muhidmg resistance，MDR)，是肿瘤化疗失败的主要原因。产生这一问题的一个重要原因是抗肿瘤药物难以进入肿瘤细胞，或肿瘤细胞内药物浓度低，肿瘤细胞在长期低剂量药物的刺激下产生了耐药现象。
围绕这三个问题，即紫杉醇制剂中助溶紫杉醇的聚氧乙烯蓖麻油的过敏问题；抗肿瘤药物难以进入肿瘤细胞问题；肿瘤细胞内药物浓度低的问题，本发明人设计合成了一类紫杉醇衍生物。
发明内容
本发明提供一种能抑制肿瘤细胞多药耐药的紫杉醇衍生物，其分子式为：Pluronic-(S-S-PTX)2。Pluronic为表面活性剂普朗尼克，其结构通式为(HO-[CH2CH2O]X-[CH2CH(CH3)O]Y-[CH2CH2O]X-H；其中，x、y代表基团个数，x为2-100的整数，y为30-70的整数；PTX为抗肿瘤药物紫杉醇；S-S-为二硫键；即两分子PTX通过二硫键与一分子Pluronic相连。其中，Pluronic优选为普朗尼克F68、普朗尼克P85、普朗尼克P84、普朗尼克P105、普朗尼克L35五种型号。
本发明的紫杉醇衍生物的粒径为60～80nm，其为直接注射给药，无需其他表面活性剂助溶。
本发明提供上述紫杉醇衍生物的制备方法：取Pluronic和3-3’-二硫代二丙酸混合，加入二甲氨基吡啶和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，溶于二氯甲烷中，在25℃水浴保温48小时，加入PTX保温24小时，真空干燥后将样品置于无水乙醇中溶解，加注射用水超声，置于3500道尔顿的透析袋中透析，即得粒径为60～80nm紫杉醇衍生物。它可以直接注射给药，无需其他溶剂助溶。在制备方法中，所选用的各种物质的重量比为：
本发明还涉及上述紫杉醇衍生物在制备治疗肿瘤的药物中的用途，尤其是在抑制肿瘤细胞多药耐药中的用途。
有益效果
由于本发明制备的紫杉醇衍生物粒径在60～80nm，可以直接用于注射而不会堵塞注射针管或血管，因此不需要聚氧乙烯蓖麻油与脱水乙醇等其他溶剂的对紫杉醇的助溶，可以完全避免聚氧乙烯蓖麻油与脱水乙醇带来的过敏反应。同时，由于肿瘤细胞的PCR效应，60～80nm的药物颗粒能很容易进入肿瘤细胞内部。进入肿瘤细胞内部的紫杉醇衍生物中的二硫键在氧化还原酶的作用下迅速断裂，游离的紫杉醇被迅速释放使肿瘤细胞内的药物浓度迅速提高，从而抑制肿瘤细胞的多药耐药。实验证明，本发明的紫杉醇衍生物对耐药的肿瘤细胞株杀伤效果好，对肿瘤细胞抑制率高，证实了其对肿瘤细胞的多药耐药有抑制作用。
具体实施方式
下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。
实施例1～8
制备方法为：根据表1所示用量，取不同型号的Pluronic和3-3’-二硫代二丙酸混合，加入二甲氨基吡啶和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，溶于二氯甲烷中，在25℃水浴保温48小时，加入PTX保温24小时，真空干燥后将样品置于无水乙醇中溶解，加注射用水超声，置于3500道尔顿的透析袋中透析，即得本发明的紫杉醇衍生物(即分子量大于3500道尔顿的物质)。
表1制备各种紫杉醇衍生物的原辅料用量
高效液相色谱法鉴别紫杉醇衍生物的生成：色谱柱为：BEH C18柱，流动相为：A乙腈、B水，梯度洗脱，从开始到3分钟50％A，7分钟70％A，13分钟73％A，17分钟75％A，24分钟80％A，24.5分钟100％A。流速为：每分钟1毫升。紫杉醇在此色谱系统的保留时间为7分钟，而实施例1至8中紫杉醇衍生物的保留时间分别为15、13.5、14.2、14.7、14.5、15.2、14.3、12分钟。取此段保留时间的紫杉醇衍生物进行氢谱测定，证明紫杉醇衍生物的形成。氢谱数据如下：
实施例1制备的紫杉醇衍生物：δ1.17ppm为Pluronic中CH2CH(CH3)O的甲基特征峰，δ3.3-3.7ppm为Pluronic中CH2CH(CH3)O和CH2CH2O的亚甲基特征峰；δ7.2-7.8ppm为紫杉醇中苯环的特征峰，δ2.2ppm为紫杉醇中-OOC-CH3甲基的特征峰；δ2.4ppm，δ2.8ppm属于-OOCCH2CH2SSCH2CH2COO-中亚甲基的特征峰。从1H-NMR上既有紫杉醇和Pluronic的峰，又有二硫键的峰，证明紫杉醇衍生物的形成。
实施例2制备的紫杉醇衍生物：δ1.18ppm为Pluronic中CH2CH(CH3)O的甲基特征峰，δ3.3-3.7ppm为Pluronic中CH2CH(CH3)O和CH2CH2O的亚甲基特征峰；δ7.2-7.8ppm为紫杉醇中苯环的特征峰，δ2.2ppm为紫杉醇中-OOC-CH3甲基的特征峰；δ2.4ppm，δ2.8ppm属于-OOCCH2CH2SSCH2CH2COO-中亚甲基的特征峰。
实施例3制备的紫杉醇衍生物：δ1.18ppm为Pluronic中CH2CH(CH3)O的甲基特征峰，δ3.3-3.7ppm为Pluronic中CH2CH(CH3)O和CH2CH2O的亚甲基特征峰；δ7.2-7.8ppm为紫杉醇中苯环的特征峰，δ2.2ppm为紫杉醇中-OOC-CH3甲基的特征峰；δ2.4ppm，δ2.8ppm属于-OOCCH2CH2SSCH2CH2COO-中亚甲基的特征峰。
实施例4制备的紫杉醇衍生物：δ1.16ppm为Pluronic中CH2CH(CH3)O的甲基特征峰，δ3.3-3.7ppm为Pluronic中CH2CH(CH3)O和CH2CH2O的亚甲基特征峰；δ7.2-7.8ppm为紫杉醇中苯环的特征峰，δ2.2ppm为紫杉醇中-OOC-CH3甲基的特征峰；δ2.4ppm，δ2.8ppm属于-OOCCH2CH2SSCH2CH2COO-中亚甲基的特征峰。
实施例5制备的紫杉醇衍生物：δ1.17ppm为Pluronic中CH2CH(CH3)O的甲基特征峰，δ3.3-3.7ppm为Pluronic中CH2CH(CH3)O和CH2CH2O的亚甲基特征峰；δ7.2-7.8ppm为紫杉醇中苯环的特征峰，δ2.2ppm为紫杉醇中-OOC-CH3甲基的特征峰；δ2.4ppm，δ2.8ppm属于-OOCCH2CH2SSCH2CH2COO-中亚甲基的特征峰。
实施例6制备的紫杉醇衍生物：δ1.17ppm为Pluronic中CH2CH(CH3)O的甲基特征峰，δ3.3-3.7ppm为Pluronic中CH2CH(CH3)O和CH2CH2O的亚甲基特征峰；δ7.2-7.8ppm为紫杉醇中苯环的特征峰，δ2.2ppm为紫杉醇中-OOC-CH3甲基的特征峰；δ2.4ppm，δ2.8ppm属于-OOCCH2CH2SSCH2CH2COO-中亚甲基的特征峰。
实施例7制备的紫杉醇衍生物：δ1.19ppm为Pluronic中CH2CH(CH3)O的甲基特征峰，δ3.3-3.7ppm为Pluronic中CH2CH(CH3)O和CH2CH2O的亚甲基特征峰；δ7.2-7.8ppm为紫杉醇中苯环的特征峰，δ2.2ppm为紫杉醇中-OOC-CH3甲基的特征峰；δ2.4ppm，δ2.8ppm属于-OOCCH2CH2SSCH2CH2COO-中亚甲基的特征峰。
实施例8制备的紫杉醇衍生物：δ1.17ppm为Pluronic中CH2CH(CH3)O的甲基特征峰，δ3.3-3.7ppm为Pluronic中CH2CH(CH3)O和CH2CH2O的亚甲基特征峰；δ7.2-7.8ppm为紫杉醇中苯环的特征峰，δ2.2ppm为紫杉醇中-OOC-CH3甲基的特征峰；δ2.4ppm，δ2.8ppm属于-OOCCH2CH2SSCH2CH2COO-中亚甲基的特征峰。
又将紫杉醇和紫杉醇衍生物分别进行差示热扫描分析，结果表明紫杉醇在216℃是有明显的吸热峰，而紫杉醇衍生物此处无吸热峰出现，证明紫杉醇衍生物的形成。
实验实施例1
采用与下述相同的实验方法，测定实施例1至实施例8制备的紫杉醇衍生物的粒径，并测定对人乳腺癌细胞株MCF-7的生长抑制率，结果如下表2所示。
表2制备各种紫杉醇衍生物的粒径和肿瘤细胞生长抑制率
| 样品 | 粒径 | 肿瘤细胞生长抑制率 |
| 实施例1 | 65nm±2nm | 85.43％±12.12％ |
| 实施例2 | 74nm±3nm | 82.07％±20.48％ |
| 实施例3 | 66nm±5nm | 76.58％±18.54％ |
| 实施例4 | 77nm±8nm | 86.55％±11.87％ |
| 实施例5 | 66nm±12nm | 83.48％±16.58％ |
| 实施例6 | 68nm±8nm | 88.95％±25.48％ |
| 实施例7 | 74nm±6nm | 79.58％±16.84％ |
| 实施例8 | 76nm±10nm | 76.44％±13.85％ |
结果表明，本发明制备的紫杉醇衍生物均对多药耐药的肿瘤细胞有抑制作用。
实验实施例2
测定紫杉醇对照品、紫杉醇胶束对照品和实施例2制备的本发明的紫杉醇衍生物的IC50值和肿瘤细胞生长抑制率。
紫杉醇对照品：采用市售紫杉醇制剂，商品名为泰素，由法国安万特公司生产。
紫杉醇胶束对照品：取紫杉醇20mg，加5ml无水乙醇溶解，加入PluronicP85，超声10分钟，使用旋转蒸发仪上将乙醇除去，残渣加37℃的注射用水5ml水化，即得紫杉醇胶束。
本发明的紫杉醇衍生物：实施例2制备的紫杉醇衍生物。
细胞培养人乳腺癌细胞株MCF-7，培养液为含5％胎牛血清的RPMI1640(含100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，置于37℃，5％CO2的湿化培养箱中培养传代。同时，于培养液中加入逐渐增加剂量的阿霉素而筛选出耐药细胞株MCF-7/ADM，其培养液为含0.5mg/L阿霉素的5％胎牛血清RPMI 1640。
细胞生长抑制实验采用MTT法，取对数生长期细胞，用胰酶消化成细胞悬液接种于96孔板中，每孔细胞数1×104，加入不同浓度的紫杉醇对照品、紫杉醇胶束对照品、紫杉醇衍生物注射液，从未加入任何药物的细胞组为对照组，每组设3个复孔，实验重复3次。孵育20h、44h、68h后分别加入MTT，继续孵育4h后离心弃上清液，加入DMSO，再孵育30分钟后震荡，用酶标仪(波长570nm)测定各孔光密度值(D值)。进而计算出5μmoL/L各组细胞生长抑制率，并计算紫杉醇对肿瘤细胞的半数抑制率(IC50)。细胞生长抑制率＝(1-实验组D值/对照组D值)×100％。结果见表3。
表3各种紫杉醇药物对多药耐药肿瘤细胞的效果
| 样品 | IC50 | 肿瘤细胞生长抑制率 |
| 紫杉醇对照品 | 63.87±24.18μmoL/L | 6.88％±1.98％ |
| 紫杉醇胶束对照品 | 43.11±19.88μmoL/L | 16.85％±4.28％ |
| 本发明紫杉醇衍生物 | 5.55±2.38μmoL/L | 82.07％±20.48％ |
从上述结果可见，本发明的紫杉醇衍生物对耐药的肿瘤细胞株杀伤效果好，对肿瘤细胞抑制率高，证明对肿瘤细胞的多药耐药有抑制作用。而没有通过二硫键连接的紫杉醇胶束，由于其粒径小，比一般的紫杉醇对照品更容易进入肿瘤细胞内部，所以杀伤效果比紫杉醇对照品好。但是紫杉醇从紫杉醇胶束对照品里释放是通过肿瘤细胞内部的药物浓度梯度缓慢释放出来，因此肿瘤细胞内的紫杉醇浓度不能迅速被提高，因而紫杉醇胶束对照品对肿瘤细胞的杀伤效果远不如本发明的紫杉醇衍生物。
Claims (7)
1.一种紫杉醇衍生物，其分子式为：Pluronic-(S-S-PTX)2，其中，Pluronic为表面活性剂普朗尼克，其结构通式为(HO-[CH2CH2O]X-[CH2CH(CH3)O]Y-[CH2CH2O]X-H；x、y代表基团个数，x为2-100的整数，y为30-70的整数；PTX为抗肿瘤药物紫杉醇；S-S-为二硫键，在所述紫杉醇衍生物中两分子PTX通过二硫键与一分子Pluronic相连。
2.如权利要求1所述的紫杉醇衍生物，其中，所述Pluronic为普朗尼克F68、普朗尼克P85、普朗尼克P84、普朗尼克P105或普朗尼克L35。
3.如权利要求1所述的紫杉醇衍生物，其中，所述紫杉醇衍生物的粒径为60～80nm。
4.如权利要求1所述的紫杉醇衍生物，其为直接注射给药，无需其他表面活性剂助溶。
5.一种权利要求1所述的紫杉醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：
取Pluronic和3-3’-二硫代二丙酸混合，加入二甲氨基吡啶和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，溶于二氯甲烷中，在25℃水浴保温48小时，加入PTX保温24小时，真空干燥后将样品置于无水乙醇中溶解，加注射用水超声，置于3500道尔顿的透析袋中透析，得粒径为60～80nm紫杉醇衍生物，各原料用量如下：
6.权利要求1所述的紫杉醇衍生物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其为抑制肿瘤细胞多药耐药中的用途。
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