CN102772447A - 一种从粉虱座壳孢菌代谢物中提取抑菌剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从粉虱座壳孢菌(Aschersoniaaleyrodis)代谢物中提取抑菌剂的方法，所述的微生物抑菌剂为粉虱座壳孢菌代谢物乙酸乙酯提取物。主要包括以下步骤：液体培养、分离、加有机溶剂萃取、浓缩制得抑菌物、回收有机溶剂。本发明的抑菌剂原材料具有生长周期短、繁殖快的特点，抑菌剂来源于天然产物，具有无毒副作用，不易导致病原微生物产生抗耐药性，且制备简单，成本较低。

Description

一种从粉虱座壳孢菌代谢物中提取抑菌剂的方法
技术领域
本发明涉及一种从粉虱座壳孢菌代谢物中提取抑菌剂的方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌是人类口腔微生物中的主要致病菌，还是引起化脓感染的重要病原菌，随着抗生素的广泛应用，使得金黄色葡萄球菌越来越具有耐药性。
本发明的原材料粉虱座壳孢菌(Aschersonia aleyrodis)隶属于子囊菌门、粪菌纲、肉座菌目、麦角菌科、座壳孢菌属，是一种虫生真菌，从其天然产物中提取的物质具有无毒副作用、不易导致病原微生物产生抗耐药性的特点，对开发生物抑菌剂具有重要的科学和应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种从粉虱座壳孢菌代谢物中提取抑菌剂的方法，得到的抑菌剂来源于天然产物，无毒副作用，不易导致人类和工业病原微生物产生抗耐药性，且制备简单，成本较低。
本发明的技术方案如下：
一种从粉虱座壳孢菌代谢物中提取抑菌剂的方法，包括以下步骤：
1)将粉虱座壳孢菌活化后，取菌块接种PDB培养基中，在120-160r/min、20-28℃条件下连续培养5-10天即初级培养，按8％-10％接种量再次转接到PDB培养基中，继续在120-160r/min、20-28℃条件下连续培养25-30天即次级培养；
2) 培养后将菌液、菌丝体过滤分离，用乙酸乙酯对菌液进行液液萃取，萃取液旋蒸浓缩得菌液粗提物，将乙酸乙酯回收；
3) 菌丝体在28-35℃条件下干燥、粉碎，再用乙酸乙酯超声萃取，萃取液旋蒸浓缩得菌丝体粗提物，回收乙酸乙酯；
4） 将菌丝体粗提物和菌液粗提物合并加乙醇溶出过滤，制得抑菌剂。
步骤2）所述液液萃取的条件为：乙酸乙酯与菌液按体积比2:1～1:1，在22℃-28℃下摇瓶萃取20-40min、再静止20-40min，如此反复萃取3-5次。
步骤3）所述超声萃取的条件为：乙酸乙酯与菌丝体按体积比2:1～1:1，在22℃-28℃下超声萃取20-40min，静止20-40min，如此反复萃取3-5次。
步骤3）所述超声萃取的功率：300～500W，频率：30～40KHz。
步骤3）所述粉碎的颗粒直径为10～30目。
PDB培养基的制备如下：200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L。
本发明的显著优点：
1)      本发明的抑制剂原材料具有生长周期短、繁殖快的特点。
2)      本发明的抑菌剂可以有效地抑制金黄色葡萄球菌，其MIC为0.052mg/ml,对枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等也有一定的抑菌效果。
3)      本发明的抑菌剂来源于天然产物，具有无毒副作用，不易导致人类和工业病原微生物产生抗耐药性，且制备简单，成本较低，在医药领域具有潜在的应用价值。
具体实施方式
实施例1
1）取粉虱座壳孢菌（邱君志等，昆虫病原真菌粉虱座壳孢对烟粉虱侵染行为的初步研究. 菌物学报,2004，23(1):115～121）为材料，无菌条件下挑取长宽约为1cm的菌块到PDB培养基（200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L，分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，在121℃高压下灭菌25min）中，在160r/min、25℃条件下连续培养8天即初级培养，按9％接种量再次转接到PDB培养基中，继续在160r/min、25℃条件下连续培养28天即次级培养；
2） 培养后将菌液、菌丝体过滤分离，用乙酸乙酯对菌液进行液液萃取，加液量按体积比2:1，在25℃下摇瓶萃取30min、再静止30min，如此将菌液萃取4次，旋蒸浓缩得菌液菌粗提物，将乙酸乙酯回收；
3）菌丝体在30℃条件下干燥，将其粉碎过20目筛，用乙酸乙酯进行超声萃取，加液量按体积比2:1，在25℃下超声萃取30min，静止30min，如此反复萃取4次，旋蒸浓缩得菌丝体粗提物，回收乙酸乙酯；
4) 将菌丝体粗提物和菌液粗提物合并，即得抑菌物质A。
实施例2
1）取粉虱座壳孢菌（邱君志等，昆虫病原真菌粉虱座壳孢对烟粉虱侵染行为的初步研究. 菌物学报,2004，23(1):115～121）为材料，无菌条件下挑取长宽约为1cm的菌块到PDB培养基（200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L，分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，在121℃高压下灭菌25min）中，在120r/min、20℃条件下连续培养5天即初级培养，按8％％接种量再次转接到PDB培养基中，继续在120r/min、20℃条件下连续培养25天即次级培养；
2） 培养后将菌液、菌丝体过滤分离，用乙酸乙酯对菌液进行液液萃取，加液量按体积比1:1，在22℃℃下摇瓶萃取20min、再静止20min，如此将菌液萃取3次，旋蒸浓缩得菌液菌粗提物，将乙酸乙酯回收；
3）菌丝体在28℃条件下干燥，将其粉碎过10目筛，用乙酸乙酯进行超声萃取，加液量按体积比1:1，在22℃℃下超声萃取20min，静止20min，如此反复萃取3次，旋蒸浓缩得菌丝体粗提物，回收乙酸乙酯；
4) 将菌丝体粗提物和菌液粗提物合并加乙醇溶出过滤，制得抑菌剂。
实施例3
1）取粉虱座壳孢菌（邱君志等，昆虫病原真菌粉虱座壳孢对烟粉虱侵染行为的初步研究. 菌物学报,2004，23(1):115～121）为材料，无菌条件下挑取长宽约为1cm的菌块到PDB培养基（200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L，分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，在121℃高压下灭菌25min）中，在160r/min、28℃条件下连续培养10天即初级培养，按10％接种量再次转接到PDB培养基中，继续在160r/min、28℃条件下连续培养30天即次级培养；
2） 培养后将菌液、菌丝体过滤分离，用乙酸乙酯对菌液进行液液萃取，加液量按体积比2:1，在28℃下摇瓶萃取40min、再静止40min，如此将菌液萃取5次，旋蒸浓缩得菌液菌粗提物，将乙酸乙酯回收；
3）菌丝体在35℃条件下干燥，将其粉碎过30目筛，用乙酸乙酯进行超声萃取，加液量按体积比2:1，在28℃下超声萃取40min，静止40min，如此反复萃取5次，旋蒸浓缩得菌丝体粗提物，回收乙酸乙酯；
4) 将菌丝体粗提物和菌液粗提物合并加乙醇溶出过滤，制得抑菌剂。
  对比实施例1
1）同实施例1的步骤1）。
将实施例1的步骤2）中乙酸乙酯替换为二氯甲烷，方法同实施例1。
将实施例1的步骤3）中乙酸乙酯替换为二氯甲烷，方法同实施例1。
2）将菌丝体粗提物和菌液粗提物合并，即得抑菌物质B。
对比实施例2
1）同实施例1的步骤1）。
2）将实施例1的步骤2）中乙酸乙酯替换为甲醇，方法同实施例1。
3）将实施例1的步骤3）中乙酸乙酯替换为甲醇，方法同实施例1。
4）将菌丝体粗提物和菌液粗提物合并，即得抑菌物质C。
抑菌实验：用乙醇将抑菌物配制成浓度为10 mg/ml的母液并进行二倍梯度稀释，配制各梯度浓度的抑菌剂，用无菌水分别将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌配成浓度均为108cfu/ml的菌液，在无菌条件下，分别将直径6 mm的无菌滤纸片放入个各浓度的抑菌剂中浸泡30 min，以浸泡在乙醇中的滤纸片为对照，取出，挥干溶剂，覆盖在以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌为指示菌的培养基表面，在35℃培养24小时，每种抑菌剂做三个重复，抑菌圈直径越大抑菌效果越好。 
表1 在35℃、菌液浓度108cfu/ml、抑菌剂浓度为10mg/ml下观察对抑菌圈大小
由表1可见，抑菌物质A的效果最明显，用实施例1可以高效地提取抑菌物质，此表还显示抑菌物质对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌均有抑菌效果，且对金黄色葡萄球菌抑菌效果显著，抑菌圈平均直径为25.7 mm。
表2 在35℃、菌液浓度108cfu/ml下测定对各病原菌MIC值
Figure 483700DEST_PATH_IMAGE002
从表2可见，抑菌物质A的效果最好，抑菌活性最高，其中对金黄色葡萄球菌抑菌效果显著，最小抑菌浓度为0.052 mg/ml，对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为1.66 mg/ml，对苏云金芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌最小抑菌浓度均为2.08 mg/ml。

Claims (5)

1.一种从粉虱座壳孢菌代谢物中提取抑菌剂的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1)将粉虱座壳孢菌活化后，取菌块接种PDB培养基中，在120-160r/min、20-28℃条件下连续培养5-10天即初级培养，按8％-10％接种量再次转接到PDB培养基中，继续在120-160r/min、20-28℃条件下连续培养25-30天即次级培养；
2) 培养后将菌液、菌丝体过滤分离，用乙酸乙酯对菌液进行液液萃取，萃取液旋蒸浓缩得菌液粗提物，将乙酸乙酯回收；
3) 菌丝体在28-35℃条件下干燥、粉碎，再用乙酸乙酯超声萃取，萃取液旋蒸浓缩得菌丝体粗提物，回收乙酸乙酯；
4） 将菌丝体粗提物和菌液粗提物合并加乙醇溶出过滤，制得抑菌剂。
2.根据权利要求1所述的从粉虱座壳孢菌代谢物中提取抑菌剂的方法，其特征在于：步骤2）所述液液萃取的条件为：乙酸乙酯与菌液按体积比2:1～1:1，在22℃-28℃下摇瓶萃取20-40min、再静止20-40min，如此反复萃取3-5次。
3.根据权利要求1所述的从粉虱座壳孢菌代谢物中提取抑菌剂的方法，其特征在于：步骤3）所述超声萃取的条件为：乙酸乙酯与菌丝体按体积比2:1～1:1，在22℃-28℃下超声萃取20-40min，静止20-40min，如此反复萃取3-5次。
4.根据权利要求1所述的从粉虱座壳孢菌代谢物中提取抑菌剂的方法，其特征在于：步骤3）所述超声萃取的功率：300～500W，频率：30～40KHz。
5.根据权利要求1所述的从粉虱座壳孢菌代谢物中提取抑菌剂的方法，其特征在于：步骤3）所述粉碎的颗粒直径为10～30目。
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