CN103289932B - 一种嗜热脂肪地芽孢杆菌lj-2及其在制备抗病毒制剂和肥料中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2及其在制备抗病毒制剂和肥料中的应用。所述嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2保藏编号为：CGMCC No.7572，利用本发明所述菌株LJ-2来制备生物制剂，可以避免使用农药，减少了对环境造成的不良影响，而且利用菌株之间的拮抗作用，可以达到比农药更好的杀菌效果和预防效果；其发酵上清液和多糖能够有效抑制病毒对植物的侵染；利用所述菌株LJ-2来制备烟草生物有机肥，该生物有机肥用量少，见效快，持效性长；主要用作烟草基肥、追肥，具有抗病促生等多种功能，促进生长、杀虫防病、降解农残、提高烟叶品质，可增产20%以上，具有防病和增产双重功效。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2及其在制备抗病毒制剂和肥料中的应用。
背景技术
烟草是我国主要的经济作物，其产量及质量关系着国计民生。目前，控制烟草病害的一般方法是使用化学农药，然而，长期使用化学农药会导致病原菌产生抗药性而降低化学药剂的防病效果，同时长期使用化学药剂会造成农药残留超标和环境污染，导致烟叶内在品质下降，烟田生态失衡，甚至严重影响了烟叶生产的可持续发展。而生物防治是控制植物病害的一种新途径，它主要是利用生防菌与植物病原微生物之间的拮抗作用，抑制植物病原菌的生长。微生物制剂中生防菌的种类、与病原微生物之间的拮抗作用大小是决定其抗病毒能力的关键，因此现在将寻找拮抗致病菌或致病害虫的高活性微生物及其代谢产物来预防和解决植物病毒病是目前的研究热点和突破口。
我国各地在烟叶生产中长期使用化肥，造成土壤贫瘠，土壤板结，营养失衡，导致烟叶内在品质下降，香气质量变差。加之连年轮作，病虫害加重，且抗药性增强，烟田生态失衡，甚至严重影响了烟叶生产的可持续发展。农业的高速发展而引起的农业水土流失、土壤生产力下降、农产品与农业环境污染、生态环境破坏等问题，已经引起社会的广泛关注，特别是农产品质量安全问题，成为公众关注的焦点。为此，相继出现的有机农业、生物农业、自然农业、生态农业及可持续农业等多种形式的替代农业，已经被很多国家作为解决食品安全、保护生物多样性、进行可持续发展等一系列问题的可实践途径。而“无公害”、“绿色”、“有机”也正在成为标示农产品安全、健康、环保的新概念。有机烟叶随着有机农业的发展，不断受到人们的重视和青睐。
微生物肥料在解决化学肥料所带来的问题上有独到的作用，并取得了良好的使用效果，将是我国农业技术发展的重点和依托。微生物肥料中有益微生物的种类、生命活动是否旺盛是其有效性的关键，寻找拮抗致病菌或致病害虫的高活性微生物及其代谢产物来预防和解决土传病害是目前微生物肥料的研究热点和突破口。
发明内容
本发明提供了一种嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2及其在在制备抗病毒制剂和肥料中的应用。所述菌株LJ-2可抗真菌性病害，其次级代谢产物可抗病毒，亦可对三生NN烟产生系统抗性，应用于烟草专用肥中可以达到增产抗病的效果。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
一种嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2，其分类命名为嗜热脂肪地芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.7572。
所述嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2为短杆状，芽孢为圆形，芽孢端生，菌落边缘不规则，菌落直径3.0mm-5.0mm，呈白色，粉质，干燥，无光泽，无凸起。
所述嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2发酵后去除菌体的发酵上清液能有效抑制烟草花叶病毒。
本发明提供了含有所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2的LJ-2菌制剂。
其中，所述LJ-2菌制剂中含菌量为2亿/mL以上。
本发明提供了含有嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2的LJ-2菌制剂在制备烟草抗病毒制剂和病毒预防剂中的应用。
其中，所述病毒为烟草镰刀菌或烟草花叶病毒。
本发明还提供了所述的含有嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2的LJ-2菌制剂在制备烟草生物有机肥中的应用。
其中，所述生物有机肥含有有效LJ-2活性菌2亿个/g以上。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明从烟草根际土壤中分离得到嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株LJ-2，并通过实验证明菌株LJ-2发酵上清液和多糖粗品对TMV（烟草花叶病毒，tobacco mosaic virus）有明显的抑制作用，可以用于制备烟草抗病毒生物制剂和病毒预防剂，而且所述菌株LJ-2还可以用于制备烟草专用活性海藻生物有机肥。利用本发明所述菌株LJ-2来制备烟草抗病毒制剂，可以避免使用农药，减少了对环境造成的不良影响，而且利用菌株之间的拮抗作用，可以达到比农药更好的杀菌效果和预防效果；利用本发明所述菌株LJ-2来制备烟草生物有机肥，该生物有机肥用量少，见效快，持效性长；主要用作烟草基肥、追肥，具有抗病促生等多种功能，促进生长、杀虫防病、降解农残、提高烟叶品质，可增产20%以上，具有防病和增产双重功效。
结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1是本发明所述嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2的平板培养基照片。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
一、菌株的分离纯化及活性筛选
2012年7月4日从山东沂水烟区采集烟草根际土壤，取2g样品悬浮在20ml生理盐水中，取100μL样品悬浮液在营养琼脂平板均匀涂布，35℃培养箱中倒置培养12小时，挑取不同菌落形态的菌株在营养琼脂平板上划线分离，分离多次直至菌种纯化，斜面保存，共分离获得24株菌株。
采用平板对峙法将上述菌株分别接种于烟草镰刀菌平板上，30℃培养6天，筛选平板上对烟草镰刀菌具有明显抑制作用的菌株。结果有6株纯菌有明显抑菌活性，抑制率在50%以上，其中一株芽孢杆菌LJ-2对烟草镰刀菌菌丝生长的抑制作用最为显著，抑制率达到80%以上。
二、对嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2菌株的分子生物学遗传鉴定
对LJ-2菌株提取DNA，以该DNA为模板，16S rDNA通用引物为引物，对16S rDNA片段进行扩增。将扩增的片段直接进行序列测定。将测序的结果输入NCBI网站上的BLAST程序进行比对，结果显示该菌株16S rDNA序列与GenBank基因库中芽孢杆菌属中的Geobacillus stearothermophilus的16s rDNA序列同源度最高，同源率达到99%。通过DNAMAN6.0对Genbank中已有的芽孢杆菌属的16S rDNA序列进行遗传进化分析，结果显示，菌株LJ-2的16SrDNA与Geobacillus stearothermophilus同源性最高，因此可以判定该菌株为芽孢杆菌属的嗜热脂肪地芽孢杆菌，命名为嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2。
将筛选到的嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2013年5月8日；Geobacillusstearothermophilus的编号为CGMCC No.7572。
如图1所示，所述嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2的菌体为短杆状，芽孢为圆形，芽孢端生。在营养琼脂平板上37℃培养18h形成的菌落边缘不规则，直径3.0mm-5.0mm，呈白色，粉质，干燥，无光泽，无凸起。
三、LJ-2菌株发酵上清及多糖对TMV的抑制作用
将活化的LJ-2菌株接种于LB培养基中，28℃恒温，140rpm振荡培养48h，4℃，12000rpm离心10min，去菌体，制成胞外代谢物的发酵上清液。每1ml上清液加入1.5ml95%乙醇、2.5mg CaCl2，均匀搅拌后产生沉淀，3000rpm，5min离心，取沉淀溶于适量无菌蒸馏水中。重复上述步骤，将所产生的沉淀用少量无菌蒸馏水溶解，即为多糖粗品。取发酵上清液和多糖粗品，分别稀释1×、10×、50×、100×分别与等体积40倍TMV病毒汁液混合15min，接种三生NN烟，以无菌水与等体积TMV混合为对照，检测其枯斑抑制率。
表1菌株LJ-2发酵上清液稀释后对TMV的抑制作用
从表1可知，LJ-2菌株发酵上清液稀释后对TMV的枯斑抑制率分别为96.8%、65.0%、58.0%，而不接LJ-2菌株的LB培养基对TMV几乎不存在抑制作用。
表2菌株LJ-2提取的多糖粗品对TMV的抑制作用
从表2可知，将发酵液中提取的多糖粗品与TMV混合后，对TMV的抑制率可达到97.9%，随着稀释加倍，抑制效果逐渐降低，稀释50倍时，对TMV的抑制效果仍然可以达到90%以上。以上发现说明菌株的发酵上清液和多糖成分可以有效的抑制烟草病害，菌株可分泌有益的次级代谢产物，抵抗病害的侵染。
四、菌株LJ-2对三生NN烟的诱导抗性
取5-6叶期三生NN烟，接种TMV前2d、4d、6d、8d、10d、12d，叶面喷雾LJ-2发酵液（2亿/mL），每株10ml。以喷清水为对照，每处理3株，接种上部3片叶，统计枯斑数，计算枯斑抑制率，结果如表3。
表3菌株LJ-2对烟草植株的诱导抗性
通过表3可以看出，喷施LJ-2发酵液，可以提高三生NN烟抗TMV侵染。三生NN烟接种TMV前1-12d喷施LJ-2，平均枯斑数为33.3，均显著低于NB（149.7）和清水（155.3）处理。与CK相比，接种前1-12d，喷施LJ-2，对TMV的诱导抗性在78.6%，实验结果表明在接种TMV前10天左右喷施LJ-2均能提高三生NN烟的抗性，是一种良好的病毒预防剂。
五、海藻活性生物有机无机肥的制备
本发明还提供一种活性生物有机无机肥的制备方法，含有以下组分：LJ-2菌剂原液有效活性菌2亿个/g、黄腐酸钾8-12wt%（重量百分比）、N：P：K=10：8：12（重量百分比）、海藻活性物质1wt%（重量百分比）。将上述各原料按照配方比例混匀即可。
该生物有机肥用量少，见效快，持效性长；主要用于烟草等大田作物，可作为基肥、追肥，具有抗病促生等多种功能，促进生长、杀虫防病、降解农残、提高烟叶品质，可增产20%以上，具有防病和增产双重功效。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2，其特征在于其分类命名为嗜热脂肪地芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.7572。
2.含有权利要求1所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2的LJ-2菌制剂。
3.根据权利要求2所述的含有嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2的LJ-2菌制剂，其特征在于：所述LJ-2菌制剂中含菌量为2亿/mL以上。
4.根据权利要求2所述的含有嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2的LJ-2菌制剂在制备烟草抗病毒制剂和病毒预防剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的含有嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2的LJ-2菌制剂在制备烟草抗病毒制剂和病毒预防剂中的应用，其特征在于：所述病毒为烟草花叶病毒。
6.根据权利要求2所述的含有嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2的LJ-2菌制剂在制备烟草生物有机肥中的应用。
7.根据权利要求6所述的含有嗜热脂肪地芽孢杆菌LJ-2的LJ-2菌制剂在制备烟草生物有机肥中的应用，其特征在于：所述生物有机肥含有有效LJ-2活性菌2亿个/g以上。
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Denomination of invention: Bacillus stearothermophilus LJ-2 and its application in preparation of antiviral agents and fertilizers Effective date of registration: 20210622 Granted publication date: 20140924 Pledgee: Qingdao high tech Industrial Development Zone sub branch of China Construction Bank Co.,Ltd. Pledgor: QINGDAO SEAWIN BIOTECH GROUP Co.,Ltd. Registration number: Y2021370010037 |
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Date of cancellation: 20220506 Granted publication date: 20140924 Pledgee: Qingdao high tech Industrial Development Zone sub branch of China Construction Bank Co.,Ltd. Pledgor: QINGDAO SEAWIN BIOTECH GROUP Co.,Ltd. Registration number: Y2021370010037 |