CN102757967B - 一种启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种启动子，其具有序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。试验显示，该启动子在NaCl处理条件下能够驱动GUS基因表达上调。
Description
本专利申请是如下专利的分案申请：发明名称为《一种与植物抗逆性相关的基因及其应用》，申请日为2010-05-14；申请号为：201110154807.7。
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域。
背景技术
大豆原产我国，豆科大豆属一年生草本植物，是世界上广泛栽培的重要的粮食和油料作物，干旱、盐碱等环境胁迫对大豆的生长发育具有重要影响，严重时会造成大豆大规模减产。解析大豆抵抗逆境的分子机制，培育耐逆性强的大豆品种是目前大豆育种的主要目标之一。目前，应用基因工程育种已经成为增强作物耐逆性的重要手段。高等植物在应答环境胁迫时启动了多种应答网络，目前已成为提高大豆产量及保证农业可持续发展的重要途径之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种启动子及其应用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
一种启动子，其具有序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
扩增上述启动子的引物对，其序列分别如序列表中SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。
上述启动子的应用，是在盐胁迫诱导下驱动目的基因表达；目的基因是GUS基因；具体操作步骤如下：
A、启动子的克隆
根据启动子的序列SEQ ID NO：2设计引物对，根据载体pCAMBIA3301的多克隆位点，引物末端分别引入EcoRI和BglII酶切识别位点，以CTAB法提取的大豆测序品种Williams82的DNA为模板，PCR扩增启动子；
引物序列为：
5'-CGGAATTC GATCTACTTAAGTCAATAAC-3'；
5'-GAAGATCT CGTGGCGCTTCTTTTTTTTA-3'；
PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1113bb左右的条带；连pMD19-T载体，挑阳性克隆，测序；
B、重组表达载体的构建
①提取含有正确测序的Promoter序列的T载体质粒，用限制性内切酶EcoRI和BglII酶切，回收酶切产物；
②用限制性内切酶EcoRI和BglII酶切空载体pCAMBIA3301，回收载体骨架；
③用T4连接酶将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接；
④将步骤3的连接产物热激转化感受态DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pCAMBIA3301-PGAL1::GUS；
C、农杆菌的转化
采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作如下：
a.取出冻存的200μl感受态细胞，融化后加入5-10μl质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30min；
b.放入液氮中5min后取出，将管转入37°C、5min融化后，加入800μl LB无抗性液体培养基，28°C150rpm低速振荡4-5h；
d.10000rpm，30sec,去上清，加100μl LB液体培养基，悬浮菌体后涂板，含50mg／ml卡那霉素；
e.置28°C培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化；
D、农杆菌K599介导的毛状根转化
以大豆品种吉林小粒1号为材料，取种子材料用氯气消毒10小时后，在B5培养基上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶节处纵横切割数刀，浸在活化的农杆菌K599中侵染30min后，OD：0.6，将外植体转至1/2MS培养基上共培生长3天后，再转至1/2MS培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，取根进行GUS染色分析；其中，1/2MS培养基的具体配方为：2％蔗糖，0.8琼脂粉sigma，0.5×MURA SHIGE & SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS Phyto TechnologyLaboratories，货号：G519；B5培养基的具体配方为：2％蔗糖，0.8sigma琼脂粉，1×GAMBORG B-5BASAL，型号为Phyto TechnologyLaboratories，货号为G398，pH调至5.7；
E、胁迫处理及GUS染色
将转基因毛状根浸没在1/2MS培养基、150mM NaCl中进行胁迫处理；3,6,24h后进行GUS染色，以1/2MS培养基中的毛状根作为对照；
F、结果
GUS染色结果表明，在NaCl处理条件下GUS基因表达上调。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
实施例1的试验显示：将本发明提供的启动子插入到携带有GUS基因的载体pCAMBIA3301内，能够驱动GUS基因在大豆毛状根中表达。
附图说明
图1为pCAMBIA3301-PGAL1::GUS的在盐胁迫下的GUS染色结果；1，Ck；2，150mM NaCl处理。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明的基因来源于大豆属大豆。
实施例1
（1）启动子的克隆
根据基因的启动子序列（见SEQ ID NO：2）设计引物对，根据载体pCAMBIA3301多克隆位点，引物末端分别引入EcoRI和BglII酶切识别位点，以CTAB法提取的大豆测序品种Williams82的DNA为模板，PCR扩增基因的启动子；
引物序列为：
5'-CGGAATTC GATCTACTTAAGTCAATAAC-3'（SEQ ID NO：7）；
5'-GAAGATCT CGTGGCGCTTCTTTTTTTTA-3'（SEQ ID NO：8）；
PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1113bb左右的条带；连T载体（pMD19-T），挑阳性克隆，测序；
（2）重组表达载体的构建
①提取含有正确测序的Promoter序列的T载体质粒，用限制性内切酶EcoRI和BglII酶切，回收酶切产物；
②用限制性内切酶EcoRI和BglII酶切空载体pCAMBIA3301，回收载体骨架；
③用T4连接酶将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接；
④将步骤3的连接产物热激转化感受态DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pCAMBIA3301-PGAL1::GUS；
（3）农杆菌的转化
采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作如下：
a.取出冻存的200μl感受态细胞，融化后加入5-10μl质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30min；
b.放入液氮中5min后取出，将管转入37°C(5min)融化后，加入800μl LB（无抗性）液体培养基，28°C低速振荡(150rpm)4-5h；
d.10000rpm，30sec,去上清，加100μl LB液体培养基，悬浮菌体后涂板(含50mg/ml卡那霉素)；
e.置28°C培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化；
（4）农杆菌K599介导的毛状根转化
以大豆品种吉林小粒1号为材料，取种子材料用氯气消毒10小时后，在B5培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8琼脂粉（sigma），1×GAMBORG B-5 BASAL（Phyto Technology Laboratories，货号：G398），pH调至5.7左右；）上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶节处纵横切割数刀，浸在活化的农杆菌K599中侵染30min（OD：0.6左右）后，将外植体转至1/2MS培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8琼脂粉（sigma），0.5×MURA SHIGE & SKOOG BASAL MEDIOMw/VITAMINS(Phyto Technology Laboratories，货号：G519），pH调至5.7左右；）上共培生长3天后，再转至1/2MS培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，取根进行GUS染色分析；
（5）GUS染液的配制
首先配制GUS反应缓冲液：Tris Buffer，其中包括100mM Tris和50mM NaCl以浓盐酸调pH至7.4；然后以Tris buffer配制0.5mMK3[Fe(CN)6]溶液。按1mg/ml的浓度称取x-glu（5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸苷），按照每mg加入10μl DMSO(二甲基亚砜)的比例溶解x-glu，加入Tris buffer配制的0.5mM K3[Fe(CN)6]溶液定容，可加入几滴TritonX-100以增强染色效果。迅速分装后于-20℃避光保存；
（6）胁迫处理及GUS染色
将转基因毛状根浸没在1/2MS培养基，150mM NaCl中进行胁迫处理3,6,24h后进行GUS染色，以1/2MS培养基中的毛状根作为对照；
（7）结果
结果如图1所示，表明在NaCl处理条件下GUS基因表达上调；150mM NaCl处理3h后GUS基因表达上调。
上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。
Claims (4)
1.一种启动子，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：2所示。
2.扩增权利要求1所述启动子的引物对，其特征在于：两条引物的序列分别如序列表中SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。
3.权利要求1所述启动子的应用，其特征在于：所述应用是在盐胁迫诱导下驱动目的基因表达；所述目的基因是GUS基因。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
A、启动子的克隆
根据启动子的序列SEQ ID NO：2设计引物对，根据载体pCAMBIA3301的多克隆位点，引物末端分别引入EcoRI和BglII酶切识别位点，以CTAB法提取的大豆测序品种Williams82的DNA为模板，PCR扩增启动子；
引物序列为：
5'-CGGAATTC GATCTACTTAAGTCAATAAC-3'；
5'-GAAGATCT CGTGGCGCTTCTTTTTTTTA-3'；
PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1113bp左右的条带；连pMD19-T载体，挑阳性克隆，测序；
B、重组表达载体的构建
①提取含有正确测序的Promoter序列的T载体质粒，用限制性内切酶EcoRI和BglII酶切，回收酶切产物；
②用限制性内切酶EcoRI和BglII酶切空载体pCAMBIA3301，回收载体骨架；
③用T4连接酶将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接；
④将步骤3的连接产物热激转化感受态DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pCAMBIA3301-P::GUS；
C、农杆菌的转化
采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作如下：
a.取出冻存的200μl感受态细胞，融化后加入5-10μl质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30min；
b.放入液氮中5min后取出，将管转入37°C、5min融化后，加入800μl LB无抗性液体培养基，28°C150rpm低速振荡4-5h；
d.10000rpm，30sec,去上清，加100μl LB液体培养基，悬浮菌体后涂板，含50mg／ml卡那霉素；
e.置28°C培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化；
D、农杆菌K599介导的毛状根转化
以大豆品种吉林小粒1号为材料，取种子材料用氯气消毒10小时后，在B5培养基上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶节处纵横切割数刀，浸在活化的农杆菌K599中侵染30min后，OD：0.6，将外植体转至1/2MS培养基上共培生长3天后，再转至1/2MS培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，取根进行GUS染色分析；
B5培养基的具体配方为：2％蔗糖，0.8sigma琼脂粉，1×GAMBORGB-5BASAL，型号为Phyto Technology Laboratories，货号为G398，pH调至5.7；1/2MS培养基的配方为：2％蔗糖，0.8琼脂粉sigma，0.5×MURA SHIGE & SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS PhytoTechnology Laboratories，货号：G519；
E、胁迫处理及GUS染色
将转基因毛状根浸没在1/2MS培养基、150mM NaCl中进行胁迫处理；3,6,24h后进行GUS染色，以1/2MS培养基中的毛状根作为对照；
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| CN101870972A (zh) * | 2010-05-14 | 2010-10-27 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种盐诱导的启动子及其应用 |
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