CN102753976B - 用于检测pnh ii型白细胞的试剂和方法及其作为血栓形成病症的风险因子的鉴定 - Google Patents

用于检测pnh ii型白细胞的试剂和方法及其作为血栓形成病症的风险因子的鉴定 Download PDF

Info

Publication number
CN102753976B
CN102753976B CN201080060850.0A CN201080060850A CN102753976B CN 102753976 B CN102753976 B CN 102753976B CN 201080060850 A CN201080060850 A CN 201080060850A CN 102753976 B CN102753976 B CN 102753976B
Authority
CN
China
Prior art keywords
patient
type
pnh
cell
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201080060850.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102753976A (zh
Inventor
M.莫瓦利亚
A.伊林沃思
S.法斯麦奈特
R.P.罗瑟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alexion Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Alexion Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alexion Pharmaceuticals Inc filed Critical Alexion Pharmaceuticals Inc
Publication of CN102753976A publication Critical patent/CN102753976A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102753976B publication Critical patent/CN102753976B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/727—Heparin; Heparan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/19—Platelets; Megacaryocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/196—Thrombopoietin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/22—Haematology
    • G01N2800/226—Thrombotic disorders, i.e. thrombo-embolism irrespective of location/organ involved, e.g. renal vein thrombosis, venous thrombosis

Abstract

本公开内容涉及用于检测生物样品中PNH II型细胞群的方法以及根据患者血液中PNH II型细胞的百分比确定患者是否处于发生血小板减少症或血栓形成的风险增加的状态的方法。本公开内容的特征还在于用于所述方法的试剂和缀合物。

Description

用于检测PNH II型白细胞的试剂和方法及其作为血栓形成病症的风险因子的鉴定
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年11月9日提交的题名为“用于检测PNH II型细胞的试剂和方法”的美国临时专利申请顺序号61/280,897的优先权和权益，其完整内容通过引用结合到本文中。
序列表
本申请包括通过EFS-Web提交的序列表，并且通过引用以其整体结合到本文中。2010年11月5日创建的所述ASCII副本命名为ALXN150WO1.txt，大小为26,000字节。
技术领域
本发明的领域是医学、免疫学、分子生物学和蛋白质化学。
背景
阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是罕见的衰弱性疾病，其特征尤其为血细胞生成异常、补体介导的血管内溶血和血栓形成倾向。参见例如Rosse和Nishimura (2003) Int J Hematol 77(2):121-124和Brodsky (2008) Blood Rev 22(2):65-74。PNH由X连锁磷脂酰肌醇聚糖互补型A类(phosphatidylinositol glycan complementation class A，PIGA)基因中的体细胞突变引起，该基因编码糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚生物合成最初步骤所必需的酶。参见Miyata等(1993) Science 259:1318-1320和Bessler等(1994) EMBO J 13:110-117。GPI锚(GPI anchor)将许多蛋白质与造血细胞表面连接。这些所谓的GPI锚定蛋白(GPI-anchored protein)尤其包括补体调节蛋白，例如CD55 (DAF)和CD59。根据发生在PIGA基因上的突变的类型，可导致GPI锚生物合成的部分丧失或完全丧失，其相当于细胞表面上GPI锚定蛋白(例如GPI锚定的CD55和CD59)存在的部分丧失或完全丧失。参见Rosse (1997) Medicine 76:63-93。红细胞(RBC)表面上补体调节蛋白的部分或完全缺乏导致这些细胞对补体介导的裂解的敏感性升高和受累患者中PNH的相关症状。参见Nicholson-Weller等(1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:5066-5070和Yamashina等(1990) N Engl J Med 323:1184-1189。
传统上，PNH的诊断和PNH患者的监测包括采用流式细胞术，对RBC和粒细胞表面上的CD55和CD59表达进行分析。Sutherland等(2009) Am J Clin Pathol 132:564-572。最近研发的PNH诊断方法采用了重组的非裂解形式的细菌蛋白质气单胞菌溶素，其与造血细胞表面上的GPI锚结合。参见授予Buckley和Brodsky的美国专利号6,593,095。传统的和新的方法两者皆可供医学从业人员将PNH患者的RBC或白细胞分成以下三类之一：I型细胞，其具有正常或几乎正常的细胞表面表达的GPI锚定蛋白；PNH III型细胞，其没有或完全缺乏细胞表面表达的GPI锚定蛋白；和PNH II型细胞，其具有中等水平的细胞表面表达的GPI锚定蛋白。Brodsky等(2000) Am J Clin Pathol 114:459-466。由于白细胞谱系中的II型细胞难以与正常I型白细胞相区别开来，因此未对这些细胞进行表征。
概述
本公开内容至少部分基于本发明人的以下发现：与不具有PNH II型细胞群或具有白细胞和红细胞分别少于1.2%或0.02%的PNH II型细胞群的患者相比，具有至少1.2%的PNH II型白细胞群或至少0.02%的PNH II型红细胞群的患者更可能患血小板减少症。患有因血小板破坏所致血小板减少症的患者极更可能发生血栓形成，而在PNH患者中，血栓形成是死亡的主要原因。因此，本公开内容提供用于根据患者中相对的PNH II型细胞群确定患者是否处于血小板减少症和/或血栓形成风险增加的状态的方法。部分通过开发检测PNH II型细胞的改进方法，辅助鉴定PNH II型细胞和血小板减少症之间的关系。
因此，本公开内容还提供可用于在例如患者的生物样品中检测PNH II型细胞(例如II型白细胞和/或II型红细胞)的试剂和方法。本公开内容还提供用于根据患者中PNH II型细胞的存在情况或量诊断和治疗患者的方法。例如，本公开内容的特征在于根据在疑患PNH的患者的生物样品中检测的PNH II型白细胞的百分比而确定患者的血小板减少症的风险的方法。本文所述诊断方法具有优于现有技术方法的许多优势。例如，本文所述方法可更有效地将PNH II型白细胞与I型细胞分离，这可供更准确和精密地测量生物样品中II型细胞的百分比，以及更准确地评价包含II型和III型细胞两者的PNH克隆的整体大小。另外，因为红细胞的高度更新(因对补体介导的裂解的敏感性升高所引起的PNH III型RBC固有的较短寿命)和PNH患者接受频繁的RBC输入，因此依赖于II型RBC上GPI表达的PNH诊断方法可能不可靠。因此，本文所述诊断方法不仅可供从业人员准确精密地量化生物样品中II型白细胞的百分比，从而量化样品中的异常克隆整体大小，而且该方法还比依赖于检测相对不稳定的PNH II型RBC群的现有方法更可靠。
在一个方面，本公开内容的特征在于用于预测患者是否处于血栓形成风险增加的状态的方法。所述方法包括根据表明患者处于血栓形成风险增加的状态的患者的生物样品中相同组织学类型(相同谱系)的细胞总数的PNH II型细胞的百分比，确定患者是否处于血栓形成风险增加的状态。
在另一个方面，本公开内容的特征在于用于预测患者是否可能是血小板减少性的方法。所述方法包括根据表明患者可能是血小板减少性的患者的生物样品中相同组织学类型(相同谱系)的细胞总数的PNH II型细胞(例如II型红细胞和/或II型白细胞)的百分比，确定患者是否可能是血小板减少性的。
在另一个方面，本公开内容的特征在于用于确定患者是否处于血栓形成风险增加的状态的方法。所述方法包括提供(或接收)有关患者的生物样品中相同组织学类型(相同谱系)的总细胞的PNH II型细胞的百分比的信息；和确定患者是否处于血栓形成风险增加的状态，其中生物样品中相同组织学类型的细胞总数的PNH II型细胞的百分比表明患者处于血栓形成风险增加的状态。
在另一个方面，本公开内容的特征在于用于预测患者是否处于发生血栓形成风险的状态的方法，所述方法包括测定患者的生物样品中PNH II型细胞的百分比；和提供患者是否处于血栓形成风险增加的状态的预测，其中生物样品中相同组织学类型的细胞总数的PNH II型细胞的百分比表明患者处于血栓形成风险增加的状态。
在一些实施方案中，PNH II型细胞是白细胞(例如粒细胞或单核细胞)。在一些实施方案中，PNH II型细胞是红细胞。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，大于或等于1.2%的PNH II型白细胞的百分比与大于或等于0.02%的PNH II型红细胞的百分比的组合表明患者是否处于发生血栓形成的风险增加的状态或可能是血小板减少性的。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，当PNH II型白细胞的百分比为至少1.2% (例如至少1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、65.3%或70%以上)时，患者处于发生血栓形成的风险增加的状态(和/或可能是血小板减少性的)。在本文所述任何方法的一些实施方案中，当PNH II型红细胞的百分比为至少0.02% (例如至少0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、71.3%或75%以上)时，患者处于发生血栓形成的风险增加的状态(和/或可能是血小板减少性的)。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，介于1.2%-65%之间、包括1.2%和65%的PNH II型白细胞群表明患者处于血栓形成风险增加的状态(和/或可能是血小板减少性的)。在一些实施方案中，大于或等于5%的PNH II型白细胞群表明患者处于血栓形成风险增加的状态(和/或可能是血小板减少性的)。在一些实施方案中，大于或等于10%、20%或甚至50%的PNH II型白细胞群表明患者处于血栓形成风险增加的状态(和/或可能是血小板减少性的)。
在一些实施方案中，本文所述任何方法还可包括从患者中获取生物样品。生物样品可以是例如全血样品。
在另一个方面，本公开内容的特征在于用于预测患者是否处于发生血栓形成的风险增加的状态(和/或可能是血小板减少性)的方法。所述方法包括测定患者的生物样品中相同组织学类型的全部白细胞的II型白细胞的百分比；和预测患者是否处于发生血栓形成的风险增加的状态，其中如果II型白细胞的百分比大于或等于1.2% (例如大于或等于1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、65.3%或70%以上)，则患者处于发生血栓形成的风险增加的状态(和/或可能是血小板减少性的)。
在另一个方面，本公开内容的特征在于用于预测患者是否处于发生血栓形成的风险增加的状态(和/或可能是血小板减少性)的方法。所述方法包括测定患者的生物样品中相同组织学类型的全部红细胞的II型红细胞的百分比；和预测患者是否处于发生血栓形成的风险增加的状态(和/或可能是血小板减少性的)，其中如果II型红细胞的百分比大于或等于0.02% (例如大于或等于0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、71.3%或75%以上)，则患者处于发生血栓形成的风险增加的状态(和/或可能是血小板减少性的)。
在又一个方面，本公开内容的特征在于用于为患者选择疗法的方法，所述方法包括为确定具有以下细胞群的患者选择抗血栓疗法和抗血小板减少疗法的一种或两种：大于或等于1.2% (例如大于或等于1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、65.3%或70%以上)的PNH II型白细胞群和/或大于或等于0.02% (例如大于或等于0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、71.3%或75%以上)的PNH II型红细胞群。
在另一个方面，本公开内容的特征在于用于治疗患者的方法。如果患者被确定为具有以下细胞群，则所述方法包括给予有需要的患者抗血栓疗法和抗血小板减少疗法的一种或两种：大于或等于1.2% (例如大于或等于1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、65.3%或70%以上)的PNH II型白细胞群和/或大于或等于0.02% (例如大于或等于0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、71.3%或75%以上)的PNH II型红细胞群。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，抗血小板减少疗法可以是例如血小板输注。
在又一个方面，本公开内容的特征在于用于确定患者是否处于发生血栓形成的风险增加的状态的基于计算机的方法，所述方法包括接收包括PNH患者的医学概况的数据，所述概况包括有关患者生物样品中相同组织学类型(相同谱系)的全部白细胞的PNH II型白细胞的百分比的信息；和对至少包括所述信息的数据部分进行处理以确定患者是否处于发生血栓形成的风险增加的状态，其中如果II型白细胞的百分比大于或等于1.2% (例如大于或等于1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、65.3%或70%以上)，则患者处于发生血栓形成的风险增加的状态。
在又一个方面，本公开内容的特征在于用于确定患者是否处于发生血栓形成的风险增加的状态的基于计算机的方法，所述方法包括接收包括PNH患者的医学概况的数据，所述概况包括有关患者生物样品中相同组织学类型(相同谱系)的全部红细胞的PNH II型红细胞的百分比的信息；和对至少包括所述信息的数据部分进行处理以确定患者是否处于发生血栓形成的风险增加的状态，其中如果II型红细胞的百分比大于或等于0.02% (例如大于或等于0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、71.3%或75%以上)，则患者处于发生血栓形成的风险增加的状态。
在另一个方面，本公开内容的特征在于用于确定患者是否处于发生血栓形成的风险增加的状态的基于计算机的方法，所述方法包括提供有关患者生物样品中相同组织学类型(相同谱系)的全部白细胞的PNH II型白细胞的百分比的信息；将信息输入计算机；和应用计算机和输入信息计算表明患者是否处于血栓形成的风险增加的状态的参数，其中如果II型白细胞的百分比大于或等于1.2% (例如大于或等于1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、65.3%或70%以上)，则患者处于发生血栓形成的风险增加的状态。
在另一个方面，本公开内容的特征在于用于确定患者是否处于发生血栓形成的风险增加的状态的基于计算机的方法，所述方法包括提供有关患者生物样品中相同组织学类型的全部白细胞的PNH II型白细胞的百分比的信息；将信息输入计算机；和应用计算机和输入信息计算表明患者是否处于血栓形成的风险增加的状态的参数，其中如果II型白细胞的百分比大于或等于0.02% (例如大于或等于0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、71.3%或75%以上)，则患者处于发生血栓形成的风险增加的状态。
在一些实施方案中，本文所述任何基于计算机的方法还可包括在计算机可读介质上存储参数和/或输出参数。
在一些实施方案中，如果患者处于发生血栓形成的风险增加的状态，则本文所述任何方法可包括针对出现至少一种血栓形成症状监测患者的步骤。在一些实施方案中，如果患者处于发生血栓形成的风险增加的状态，则本文所述任何方法可包括为患者选择抗血栓疗法。在一些实施方案中，如果患者处于发生血栓形成的风险增加的状态，则本文所述任何方法可包括给予患者抗血栓疗法。抗血栓疗法可以是例如抗凝血药或溶血栓药。抗凝血药可以是例如香豆定、肝素或其衍生物。溶血栓药可以是例如组织纤溶酶原激活物、链激酶或尿激酶型纤溶酶原激活物。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，气单胞菌溶素蛋白的非裂解变体形式可用来测定生物样品中PNH II型白细胞的百分比。
在一些实施方案中，本文所述任何方法可包括记录所测定的生物样品中PNH II型细胞的百分比。在一些实施方案中，本文所述任何方法可包括记录患者是处于发生血栓形成的风险增加的状态还是患者不处于发生血栓形成的风险增加的状态的预测。记录可载于计算机可读介质。记录还可载于例如有形介质(例如患者的实际记录或图表)。
在又一个方面，本公开内容的特征在于用于白细胞分类的方法。该方法使大量的白细胞与结合(i) GPI或(ii) GPI锚定蛋白的试剂接触；和根据与细胞结合的试剂的量将一种或多种白细胞归类为PNH II型细胞。
在另一个方面，本公开内容的特征在于用于白细胞分类的方法，所述方法包括使大量白细胞与结合(i) GPI或(ii) GPI锚定蛋白的试剂接触；根据与细胞结合的试剂的量，检查(interrogate)至少一部分与试剂接触的白细胞；和将所检查的一种或多种细胞归类为PNH II型细胞。
在另一个方面，本公开内容的特征在于用于区分不同白细胞群的方法。所述方法包括使大量白细胞与结合(i) GPI或(ii) GPI锚定蛋白的试剂接触；和根据结合细胞的试剂的量，将至少一部分白细胞与所述大量的其它白细胞区分开来，其中足以将PNH II型白细胞(如存在的话)与相同组织学类型(相同谱系)的I型白细胞和PNH III型细胞区分开来，以供测定所述大量中相同组织学类型的全部白细胞的PNH II型白细胞的百分比。该方法还可包括测定PNH II型白细胞的百分比。
在又一个方面，本公开内容的特征在于用于测定样品中PNH II型白细胞的百分比的方法，所述方法包括根据与细胞结合的试剂的量，检查与试剂接触的大量白细胞，其中试剂与(i) GPI或(ii) GPI锚定蛋白结合，其中检查足以将PNH II型白细胞(如存在的话)与相同组织学类型的I型白细胞和PNH III型细胞区分开来，以供测定所述大量中相同组织学类型的全部白细胞的PNH II型白细胞的百分比；并测定PNH II型白细胞的百分比。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，使大量白细胞与结合GPI的试剂和结合GPI连接的蛋白质的试剂接触。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，白细胞的区分或检查(和/或PNH II型白细胞的百分比的测定)包括流式细胞术。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，待检查的大量白细胞获自患有、疑似患有PNH或有发生PNH的风险的患者。在一些实施方案中，患者是这样的患者，之前已测定其PNH II型红细胞的百分比，但是可疑和/或非决定性的。
在一些实施方案中，本文所述任何方法还可包括记录PNH II型白细胞的百分比。记录可载于计算机可读介质或有形介质(例如患者图表或记录)。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，试剂可与人GPI部分结合。试剂可以是例如抗体或其抗原结合片段，或气单胞菌溶素蛋白。气单胞菌溶素蛋白可以是例如与蛋白质的野生型形式相比，是非裂解的或基本上非裂解的气单胞菌溶素蛋白的变体形式。非裂解的或基本上非裂解的气单胞菌溶素蛋白可包含SEQ ID NO:2或7中所述氨基酸序列，其中253位的苏氨酸被半胱氨酸取代，且300位上的丙氨酸用半胱氨酸取代。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，试剂可与GPI锚定蛋白结合。例如，试剂可以是例如与GPI锚定蛋白结合的抗体或其抗原结合片段。GPI锚定蛋白可以是例如碱性磷酸酶、5'核苷酸酶、乙酰胆碱酯酶、二肽酶、LFA-3、NCAM、PH-20、CD55、CD59、Thy-1、Qa-2、CD14、CD33、CD16 (Fcγ受体III)、癌胚抗原(CEA)、CD24、CD66b、CD87、CD48、CD52或本领域已知的和/或本文给出的任何其它GPI锚定蛋白。
在一些实施方案中，所测定的具有大于或等于1.2%的PNH II型白细胞群或者大于或等于0.02%的PNH II型红细胞群的患者可诊断为患有PNH。在一些实施方案中，所测定的具有大于或等于1.2%的PNH II型白细胞群或者大于或等于0.02%的PNH II型红细胞群的被诊断为患有PNH的患者或以前诊断的PNH患者可开给补体抑制剂的处方和/或用补体抑制剂治疗，例如但不限于依库珠单抗。
在又一个方面，本公开内容的特征在于与人GPI部分结合的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段可以是例如重组抗体、双链抗体、嵌合化抗体或嵌合抗体、去免疫化人抗体(deimmunized human antibody)、完全人抗体、单链抗体、Fv片段、Fd片段、Fab片段、Fab'片段和F(ab')2片段。
除非另有定义，否则本文所用所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。万一有抵触，则以本文件(包括定义)为准。下面描述了优选的方法与材料，但是与本文所述方法与材料类似或等同的方法与材料也可用于本公开方法和组合物的实践或测试中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用以其整体结合到本文中。
本公开内容的其它特征和优势，例如用于测定受试者的血小板减少症或血栓形成的风险的方法，根据下列描述、实施例和权利要求将是清楚明了的。
附图简述
图 1是双色点图，其描述了与含有与Alexa Fluor® 488缀合的气单胞菌溶素的非裂解变体和结合与藻红蛋白(phyocoerythrin) (PE)缀合的CD24的抗体两者的溶液一起孵育的人外周血粒细胞群。非裂解气单胞菌溶素与GPI锚特异性结合，因此表达任何GPI锚定蛋白的细胞被这种荧光蛋白标记。CD24是在粒细胞上表达的GPI连接的蛋白质，因此表达CD24的细胞将被抗CD24抗体和非裂解气单胞菌溶素两者结合。X轴表示由与细胞结合的气单胞菌溶素缀合物产生的可检测信号的log强度，Y轴表示由与细胞结合的抗CD24抗体缀合物产生的可检测信号的log强度。通过该分析揭示了3个粒细胞群：III型细胞，其没有GPI连接的蛋白质，因此似乎未被抗CD24抗体和非裂解气单胞菌溶素的任一种标记；I型粒细胞，其相对于缺乏GPI锚的细胞，表达高水平的GPI连接的蛋白质；II型粒细胞，其表达中等水平的GPI连接的蛋白质，因此以低于正常(I型)粒细胞中观察到的水平的水平被抗CD24和非裂解气单胞菌溶素两者标记。
图 2是描述绝对血小板计数相对于PNH患者血液中PNH II型粒细胞的百分比的散点图。Y轴表示1 μL患者血液的血小板计数(x 10-3)，X轴表示总粒细胞群内PNH II型粒细胞的百分比。图的左半边是在无可检测的PNH II型粒细胞群的PNH患者(N= 141)中观察到的血小板计数的分布。图的右半边是在有可检测的PNH II型粒细胞群的PNH患者(N=19)中观察到的血小板计数的分布。
发明详述
本公开内容的特征在于尤其可用于确定患者是否具有PNH II型细胞群和/或是否处于发生血小板减少症和/或血栓形成的风险增加的状态的各种诊断和治疗应用。本公开内容的特征还在于可用于所述方法的试剂。虽然绝无意限制，但下面对使用前述任一个的示例性试剂、缀合物和方法进行详细说明，并在工作实施例中举例说明。
试剂
本公开内容的特征在于可用于本文所述诊断和治疗方法的多种试剂。在一些实施方案中，试剂与糖基磷脂酰肌醇(GPI)部分结合，该部分将许多细胞表面蛋白锚定于细胞膜上。GPI部分一般含有乙醇胺-HPO4-6Manα1-2Manα1-6Manα1-4GlcNH21-6myo-肌醇-1HPO4-二酰甘油(或烷基酰基甘油或神经酰胺)核心。参见例如Paulick和Bertozzi (2008) Biochemistry 47(27):6991-7000。然而，已报道了该核心结构上的多种变异。例如，聚糖核心可用侧链修饰，例如但不限于磷酸乙醇胺、甘露糖、半乳糖、唾液酸或其它糖。出处同上。
在一些实施方案中，试剂可以是气单胞菌溶素蛋白，例如非裂解气单胞菌溶素蛋白。气单胞菌溶素是由有毒的气单胞菌(Aeromonas)菌种(例如但不限于嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida))表达的形成通道的细胞溶解蛋白。气单胞菌溶素作为52 kDa前体由细菌细胞分泌，所述前体通过蛋白水解除去C端肽而转化成活性形式(活化)。气单胞菌溶素前体可被宿主蛋白酶以及由气单胞菌溶素表达细菌分泌的蛋白酶激活。一旦与细胞结合，气单胞菌溶素便在细胞中寡聚化产生通道，并最终裂解细胞(Howard和Buckley (1985) J Bacteriol 163:336-340)。
由气单胞菌科各不同成员产生的气单胞菌溶素多肽的氨基酸序列是高度保守的。因此，本文所用气单胞菌溶素多肽可来自气单胞菌的任何菌种，例如但不限于嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌(A. caviae)、维氏气单胞菌(A. veronii) (生物型sobria)、维氏气单胞菌(生物型veronii)、简氏气单胞菌(A. jandaei)、杀鲑气单胞菌和舒氏气单胞菌(A. schubertii)。
在一些实施方案中，气单胞菌溶素多肽来自嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌。在一些实施方案中，气单胞菌溶素多肽是含有24个氨基酸信号肽的前体形式(proform)。在一些实施方案中，前体形式气单胞菌溶素多肽可具有带有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6中所述氨基酸序列的多肽，或者由带有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6中所述氨基酸序列的多肽组成。
在一些实施方案中，气单胞菌溶素多肽是其中已除去信号序列的蛋白质形式。例如，气单胞菌溶素多肽可具有带有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7中所述氨基酸序列的多肽，或者由带有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7中所述氨基酸序列的多肽组成。
在一些实施方案中，气单胞菌溶素多肽是蛋白质的活性形式。例如，气单胞菌溶素多肽可具有带有SEQ ID NO:3中所述氨基酸序列的多肽，或者由带有SEQ ID NO:3中所述氨基酸序列的多肽组成。
本文所用“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，意指不论长度或翻译后修饰的氨基酸的任何肽连接链。本文所述气单胞菌溶素多肽可含有或可以是野生型蛋白质或者可以是具有至多50个(例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40或50个)保守氨基酸取代的野生型多肽的变体。保守取代通常包括下列组别内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。
本文所述气单胞菌溶素多肽还包括多肽的“GPI结合片段”，其比全长的前体形式多肽短，但仍保持与GPI部分结合的活性多肽的能力的至少10% (例如至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、至少99.5%或100%以上)。气单胞菌溶素多肽的GPI结合片段包括蛋白质的末端及内部缺失变体。缺失变体可缺少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个(两个或更多个氨基酸的)氨基酸区段或非连续的单个氨基酸。GPI结合片段的长度可为至少40个(例如至少41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300个或325个以上)氨基酸残基(例如SEQ ID No:1-3的至少40个连续氨基酸残基)。在一些实施方案中，气单胞菌溶素多肽的GPI结合片段的长度小于400个(例如小于350、325、300、275、250、225、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、60、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41或40个)氨基酸残基(例如小于SEQ ID No:1-3的400个连续氨基酸残基)。在一些实施方案中，气单胞菌溶素多肽的GPI结合片段长为至少40个氨基酸残基，但小于400个氨基酸残基。
在一些实施方案中，气单胞菌溶素多肽的GPI结合片段可包含具有下列氨基酸序列的多肽或由具有下列氨基酸序列的多肽组成：L D P D S F K H G D V T Q S D R Q L V K T V V G W A V N D S D T P Q S G Y D V T L R Y D T A T N W S K T N T Y G L S E K V T T K N K F K W P L V G E T E L S I E I A A N Q S W A S Q N G G S T T T S L S Q S V R P T V P A R S K I P V K I E L Y K A D I S Y P Y (SEQ ID NO:4)。
在一些实施方案中，气单胞菌溶素多肽的GPI结合片段可包含具有下列氨基酸序列的多肽或由具有下列氨基酸序列的多肽组成：L D P D S F K H G D V T Q S D R Q L V K T V V G W A V N D S D T P Q S G Y D V T L R Y D T A T N W S K T N T Y G L S E K V T T K N K F K W P L V G E C E L S I E I A A N Q S W A S Q N G G S T T T S L S Q S V R P T V P A R S K I P V K I E L Y KC D I S Y P Y (SEQ ID NO:5)。
在一些实施方案中，气单胞菌溶素多肽可具有与带有SEQ ID No:1-3、6或7 (见下文)中任一个所描述的氨基酸序列的气单胞菌溶素序列有以下同一性或大于以下同一性的氨基酸序列：70% (例如71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)。
百分比(%)氨基酸序列同一性定义为在比对序列并引入空位(必要时)以达到最大百分比序列同一性后，候选序列中与参比序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分比。用于测定百分比序列同一性的目的的比对可以本领域技术人员所掌握的各种方式实现，例如，应用公众可获取的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)软件。可通过已知方法确定用于测量比对的合适参数，包括在比较的序列的全长范围内实现最大比对所需的任何算法。
在一些实施方案中，根据既定应用，可优选使用缺乏裂解细胞能力的变体气单胞菌溶素多肽。气单胞菌溶素多肽的这种变体形式是本领域已知的，并描述于例如Brodsky等(2000) Am J Clin Pathol 114:459-466。在一些实施方案中，气单胞菌溶素的非裂解变体形式含有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列，或者由之组成，其中具有以下的一个或多个变化：132位上的组氨酸取代了天冬酰胺(His132Asn)；202位上的甘氨酸为半胱氨酸；253位上的苏氨酸为半胱氨酸，且300位上的丙氨酸为半胱氨酸；和225位上的苏氨酸为甘氨酸。气单胞菌溶素的一个示例性非裂解变体包含SEQ ID No：2或7所述氨基酸序列，其中253位上的苏氨酸为半胱氨酸，且300位上的丙氨酸为半胱氨酸。如上所述，变体形式可保持与GPI部分结合的能力。
在一些实施方案中，变体气单胞菌溶素多肽具有小于10% (例如小于9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)的非变体对应物气单胞菌溶素多肽裂解靶细胞的能力。在一些实施方案中，变体气单胞菌溶素多肽没有可检测的细胞溶解活性。
用于测定变体气单胞菌溶素多肽是否与GPI部分结合的方法是本领域已知的，并以工作实施例为例说明。例如，用于检测的基于细胞的方法，可采用流式细胞术技术和可检测标记的(例如荧光团标记的)变体气单胞菌溶素多肽，测定变体气单胞菌溶素多肽与细胞表面上的GPI部分之间的结合。参见例如Hong等(2002) EMBO J 21(19):5047-5056。
同样地，用于检测和/或定量测定气单胞菌溶素多肽或其变体的细胞溶解活性的方法也是本领域已知的。例如，可通过使变体多肽与正常的人红细胞接触，并测定自红细胞释放的血红蛋白的量，来测定变体气单胞菌溶素多肽的溶血活性。参见例如Howard和Buckley (1982) Biochemistry 21(7):1662-1667；Avigad和Bernheimer (1976) Infection and Immunity 13(5):1378-1381；Garland和Buckley (1988) Infection and Immunity 56(5):1249-1253；以及Bernheimer和Avigard (1974) Infection and Immunity 9:1016-1021。与非变体对应物多肽具有的细胞溶解活性的量相比，因变体引起细胞溶解活性的量的降低或缺乏表明变体多肽的细胞溶解活性降低或缺乏。
用于获得气单胞菌溶素多肽或产生本文所述多肽的变体的方法是分子生物学领域已知的，并以工作实施例为例说明。参见例如Sambrook等(1989) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition,” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.和Ausubel等(1992) “Current Protocols in Molecular Biology,” Greene Publishing Associates。可采用标准技术(参见例如Sambrook等(1989)，同上)，自本文所述的任何气单胞菌菌种获得编码气单胞菌溶素多肽的模板DNA。例如，Howard等人描述了编码嗜水气单胞菌的气单胞菌溶素多肽的核酸序列的分离和表征(Howard等(1987) J Bacteriol 169(6):2869-2871)。Buckley (1990) Biochem. Cell Biol. 68:221-224和Wong等(1989) J Bacteriol. 171:2523-2527描述了从杀鲑气单胞菌分离的气单胞菌溶素多肽。
在一些实施方案中，气单胞菌溶素多肽可含有内部或末端(羧基端或氨基端)无关的或异源的氨基酸序列(例如来源于不相当于任何天然存在的蛋白质的其它蛋白质或合成序列的序列)。所述序列可以是例如抗原标签(例如FLAG、聚组氨酸、血凝素(HA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或麦芽糖结合蛋白(MBP))。异源序列还可包括可用作诊断或可检测标记的蛋白质，例如萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。
示例性的气单胞菌溶素多肽以及用于制备和纯化多肽的方法描述于美国临时专利申请顺序号61/200,655，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中。
在一些实施方案中，试剂可以是与GPI部分结合的抗体。已鉴定和分离出与非人GPI部分结合的抗体。参见例如Naik等(2006) Infection and Immunity 74(2):1412 (与恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的GPI部分结合的天然存在抗体的分离)。正如本文详细描述的一样，与人GPI部分结合的抗体的产生尽在本领域普通技术人员的能力范围内。
本文所用术语“抗体”是指整个或完整抗体分子(例如IgM、IgG (包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA、IgD或IgE)或任何其抗原结合片段。术语抗体包括例如嵌合化抗体或嵌合抗体、人源化抗体、去免疫化抗体和完全人抗体。抗体的抗原结合片段包括例如单链抗体、单链Fv片段(scFv)、Fd片段、Fab片段、Fab'片段或F(ab')2片段。scFv片段是单条多肽链，其包含scFv得自其中的抗体的重链和轻链可变区两者。另外，胞内抗体、微型抗体(minibodies)、三链抗体(triabodies)和双链抗体(参见例如Todorovska等(2001) J Immunol Methods 248(1):47-66；Hudson和Kortt (1999) J Immunol Methods 231(1):177-189；Poljak (1994) Structure 2(12):1121-1123；Rondon和Marasco (1997) Annual Review of Microbiology 51:257-283，其每个的公开内容均通过引用以其整体结合到本文中)也包括在抗体的定义中，并可适用于本文所述方法。双特异性抗体也包括在术语“抗体”中。双特异性抗体是具有针对至少两种不同抗原的结合特异性的单克隆抗体，优选人或人源化抗体。本文论述了用于产生抗体或其片段的方法。
在一些实施方案中，试剂可与GPI锚定蛋白结合。例如，试剂可以是与GPI锚定蛋白结合的抗体。在一些实施方案中，试剂可以是GPI锚定蛋白的配体。GPI锚定蛋白众多，包括而不限于碱性磷酸酶、5’核苷酸酶乙酰胆碱酯酶、二肽酶、LFA-3、NCAM、PH-20、CD55、CD59、Thy-1、Qa-2、CD14、CD33、CD16 (Fcγ受体III)、癌胚抗原(CEA)和CD52。与GPI锚定蛋白结合的抗体是本领域公知的，描述于例如Hall和Rosse (1996)，同上，Richards等(2008) Cytometry B Clin Cytom 76B(1):47-55；Richards和Barnett (2007) Clin Lab Med 27(3):577-590；Luzzatto等(2006) Int J Hematol 84(2):104-112；以及Thomason等(2004) Am J Clin Pathol 122(1):128-134。这类抗体可经商业途径获自例如Santa Cruz Biotechology，Inc. (Santa Cruz，California)，Novus Biologicals (Littleton，Colorado)和R& D Systems (Minneapolis，MN)。
用于产生与GPI锚定蛋白或GPI部分结合的用于所述诊断和/或治疗方法的抗体的合适方法是本领域已知的，并在下面的部分中进行了描述。
用于产生抗体的方法
本领域已知且本文描述了用于产生本公开内容的抗体(例如与GPI部分或GPI锚定蛋白结合的抗体)或其抗原结合片段的合适方法。例如，单克隆抗CD55抗体可如下产生：采用人CD55表达细胞、CD55多肽或CD55多肽的抗原片段作为免疫原，然后在产抗体细胞来自其中的动物中产生免疫应答，进而可分离出单克隆抗体。可测定该抗体的序列，并通过重组技术产生抗体或其变体。可根据单克隆抗体的序列以及能够与GPI锚定蛋白或GPI部分结合的多肽，采用重组技术来产生嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体和完全人抗体。
此外，可根据靶标特异性，采用例如表达GPI部分或GPI锚定蛋白、重组GPI连接的蛋白质或游离GPI部分的细胞作为诱饵分离抗体或多肽，来选择来源于重组文库(“噬菌体抗体”)的抗体。非人抗体和嵌合抗体的产生和分离尽在技术人员的能力范围之内。
可采用重组DNA技术以改进在非人细胞中产生的抗体的一种或多种性质。因此，可构建嵌合抗体，以降低其在诊断或治疗应用中的免疫原性。此外，可通过CDR移植和任选构架修饰使抗体人源化，使免疫原性最小化。参见美国专利号5,225,539和7,393,648，其每个的内容均通过引用结合到本文中。
抗体可获自动物血清，或者在单克隆抗体或其片段的情况下在细胞培养物中产生。可根据已确立的方法，包括在细菌或优选哺乳动物细胞培养中的方法，利用重组DNA技术产生抗体。所选择的细胞培养系统优选分泌抗体产物。
在另一个实施方案中，用于产生本文公开的抗体的方法包括培养已用杂交载体转化的宿主，例如大肠杆菌(E. coli)或哺乳动物细胞。载体包含一个或多个含有启动子的表达盒，所述启动子在合适读框中与编码抗体蛋白的第二DNA序列连接的编码信号肽的第一DNA序列有效连接。然后收集抗体蛋白并进行分离。任选表达盒可包含与编码抗体蛋白的多顺反子(例如双顺反子) DNA序列有效连接的启动子，所述序列在合适的读框中与信号肽各自独立地有效连接。
在合适的培养基中进行杂交瘤细胞或哺乳动物宿主细胞的体外增殖，所述培养基包括常规标准培养基(例如Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)或RPMI 1640培养基)，任选补充了哺乳动物血清(例如胎牛血清)或痕量元素和生长维持补充剂(例如饲养细胞，例如正常小鼠腹膜渗出物细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞、2-氨基乙醇、胰岛素、运铁蛋白、低密度脂蛋白、油酸等)。作为细菌细胞或酵母细胞的宿主细胞的增殖同样在本领域已知的合适培养基中进行。例如，对于细菌，合适的培养基包括培养基LE、NZCYM、NZYM、NZM、Terrific Broth、SOB、SOC、2 xYT或M9基本培养基。对于酵母，合适的培养基包括培养基YPD、YEPD、基本培养基或完全极限省却培养基(Complete Minimal Dropout Medium)。
体外生产提供相对纯的抗体制备物和可供扩大生产以得到大量所需抗体。用于细菌细胞、酵母、植物或哺乳动物细胞培养的技术是本领域已知的，包括均质悬浮培养(例如在气升式反应器中或在连续搅拌反应器中)和固定化或截留细胞培养(例如在中空纤维、微囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷柱体上)。
还可通过使哺乳动物细胞在体内繁殖来得到大量所需抗体。为此，将产生所需抗体的杂交瘤细胞注射入组织相容性哺乳动物中以引起产抗体肿瘤的生长。任选动物在注射前用烃、尤其是矿物油例如姥鲛烷(四甲基-十五烷)初免。1-3周后，自这些哺乳动物的体液中分离抗体。例如，将通过把合适的骨髓瘤细胞与Balb/c小鼠的产抗体脾细胞融合获得的杂交瘤细胞或由产生所需抗体的杂交瘤细胞系Sp2/0获得的转化细胞腹膜内注射给任选用姥鲛烷预治疗的Balb/c小鼠。1-2周后，从动物中取出腹水。
例如，在Kohler和Milstein，(1975) Nature 256:495-497；美国专利号4,376,110；Harlow和Lane，Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor (其公开内容均通过引用结合到本文中)中论述了前述技术和其它技术。用于制备重组抗体分子的技术描述于上述参考文献和例如WO97/08320；美国专利号5,427,908；美国专利号5,508,717；Smith (1985) Science 225:1315-1317；Parmley和Smith (1988) Gene 73:305-318；De La Cruz等(1988) Journal of Biological Chemistry 263:4318-4322；美国专利号5,403,484；美国专利号5,223,409；WO88/06630；WO92/15679；美国专利号5,780,279；美国专利号5,571,698；美国专利号6,040,136；Davis等(1999) Cancer Metastasis Rev. 18(4):421-5；以及Taylor等(1992) Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Tomizuka等(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA97( 2) ：722-727，其每个的内容均通过引用以其整体结合到本文中。
优选通过GPI或GPI锚定蛋白表达细胞的免疫荧光染色法、通过免疫印迹法、通过酶免疫测定法(例如夹心测定法或斑点测定法或放射免疫测定法)，针对所需抗体对细胞培养上清液进行筛选。
对于抗体的分离，可通过例如用硫酸铵沉淀、针对吸湿性材料(例如聚乙二醇)透析、通过选择性膜过滤等，浓缩培养上清液中或腹水中的免疫球蛋白。必要和/或需要时，抗体通过常规层析方法纯化，例如凝胶过滤、离子交换层析法、经DEAE-纤维素层析法和/或(免疫)亲和层析法，例如用GPI部分、在其表面表达GPI锚的细胞、GPI锚定的多肽、在其表面表达GPI锚定蛋白的细胞或者用A蛋白或G蛋白的亲和层析法。
另一个实施方案提供用于制备在合适的哺乳动物中分泌针对GPI部分或GPI锚定蛋白的抗体的细菌细胞系的方法。例如，兔用GPI部分、在其表面表达GPI锚的细胞、GPI锚定的多肽、在其表面表达GPI锚定蛋白的细胞或其片段免疫。按照本领域众所周知的方法(例如通过引用结合到本文的各参考文献所公开的方法)，构建自经免疫的兔产生的噬菌体展示文库，并淘选所需抗体。
还公开了分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。优选的杂交瘤细胞是遗传上稳定的，分泌本文所述的具有所需特异性的单克隆抗体，并可通过体外融化和繁殖由深度冷冻培养物或作为体内腹水扩繁。
在另一个实施方案中，提供用于制备分泌抗GPI部分或GPI锚定蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法。在该方法中，合适的哺乳动物(例如Balb/c小鼠)用一种或多种多肽或其抗原片段(例如CD55或CD14)或用一种或多种得自CD55表达细胞的多肽或抗原片段、CD55表达细胞本身或含有上述纯化的多肽的抗原载体免疫。类似地，哺乳动物可用人GPI部分、其片段或表达人GPI部分的细胞免疫(或许以高的量)。使经免疫的哺乳动物的产抗体细胞短暂生长在培养物中，或与合适骨髓瘤细胞系的细胞融合。将在融合中获得的杂交细胞克隆，选择分泌所需抗体的细胞克隆。例如，使用用例如GPI锚定蛋白或GPI部分免疫的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系PAI或骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag 14的细胞融合。然后针对所需抗体的分泌筛选所得杂交细胞，将阳性杂交瘤细胞克隆。
用于制备杂交瘤细胞系的方法包括通过在几个月内(例如介于2和4个月之间)皮下和/或腹膜内注射目标抗原几次(例如4-6次)来免疫Balb/c小鼠。最后一次注射后2-4天取出经免疫小鼠的脾细胞，并在融合启动子、优选聚乙二醇存在下，与骨髓瘤细胞系PAI的细胞融合。优选在含有约30%-约50%分子量约4000的聚乙二醇的溶液中，将骨髓瘤细胞与3-20倍过量的经免疫小鼠的脾细胞融合。融合后，在补充了选择培养基的如上所述的合适培养基(例如HAT培养基)中，每隔一定间隔使细胞扩繁，以防止正常骨髓瘤细胞生长超过所需要的杂交瘤细胞。
抗体和其片段可以是“嵌合的”。嵌合抗体和其抗原结合片段包含来自两个或更多个不同物种(例如小鼠和人)的部分。可用剪接至人恒定结构域基因区段的具有所需特异性的小鼠可变区产生嵌合抗体(例如美国专利号4,816,567)。如此，可对非人抗体进行修饰以使之更适于人的临床应用(例如用于检测II型PNH细胞的方法)。
本公开内容的单克隆抗体包括非人(例如小鼠)抗体的“人源化”形式。人源化或CDR移植mAb特别用作人用治疗药物，因为它们不会像小鼠抗体一样快速从循环中清除，通常不引起不良免疫反应。一般而言，人源化抗体具有自非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。制备人源化抗体的方法一般是本领域众所周知的。例如，可基本按照Winter和同事的方法(参见例如Jones等(1986) Nature 321:522-525；Riechmann等(1988) Nature 332:323-327；以及Verhoeyen等(1988) Science 239:1534-1536)，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代相应的人抗体序列，来进行人源化。另参见例如Staelens等(2006) Mol Immunol 43:1243-1257。在一些实施方案中，非人(例如小鼠)抗体的人源化形式是这样的人抗体(接受者抗体)，其中接受者抗体的超变(CDR)区残基被非人物种(供体抗体)的超变区残基置换，所述非人物种例如具有所需特异性、亲和力和结合能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区残基还被相应的非人残基置换(所谓的“回复突变”)。另外，可利用噬菌体展示文库改变在抗体序列内的选定位置上的氨基酸。人源化抗体的性质还受人构架的选择的影响。此外，可对人源化和嵌合化抗体进行修饰以包含不存在于接受者抗体或供体抗体中的残基，以进一步改进抗体性质，例如亲和力或效应子功能。
本公开内容中还提供完全人抗体。术语“人抗体”包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如存在的话)的抗体。人抗体可包括不是人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或位点专一诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，术语“人抗体”不包括这样的抗体，其中来源于另一种哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列移植入人构架序列(即人源化抗体)。完全人抗体或人抗体可来源于携带人抗体基因(携带可变(V)、多样性(D)、连接(J)和恒定(C)外显子)的转基因小鼠或来源于人细胞。例如，目前可产生这样转基因动物(例如小鼠)，其能够在缺乏内源免疫球蛋白产生的情况下在免疫时产生完整的人抗体库。(参见例如Jakobovits等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551；Jakobovits等(1993) Nature 362:255-258；Bruggemann等(1993) Year in Immunol. 7:33；以及Duchosal等(1992) Nature 355:258)。可对转基因小鼠品系进行改造以含有来自未重排人免疫球蛋白基因的基因序列。人序列可编码人抗体的重链和轻链两者，并可在小鼠中正确起作用，经历重排以提供类似于人的抗体库的大范围抗体库。转基因小鼠可用靶蛋白(例如GPI部分或GPI锚定蛋白，例如CD55或CD14)免疫以产生一系列各种各样的特异性抗体及其编码RNA。然后，可将编码这类抗体的抗体链组分的核酸自动物克隆至展示载体中。通常，克隆编码重链和轻链序列的各个核酸群，然后将各个群在插入载体时重组，使得任何指定的载体拷贝接收重链和轻链的随机组合。设计载体表达抗体链，使得它们可在含有载体的展示包(display package)外表面上装配并展示。例如，抗体链可与来自噬菌体外表面的噬菌体外壳蛋白一起作为融合蛋白表达。此后，可针对与靶标结合的抗体的展示来筛选展示包。
另外，人抗体可来源于噬菌体展示文库(Hoogenboom等(1991) J. Mol. Biol. 227:381；Marks等(1991) J. Mol. Biol.，222:581-597；以及Vaughan等(1996) Nature Biotech 14:309 (1996))。可产生使用随机化组合的合成人抗体V区的合成噬菌体文库。通过在抗原上选择，可制备其中V区在性质上非常类似人的完全人抗体。参见例如美国专利号6,794,132、6,680,209、4,634,666，以及Ostberg等(1983)，Hybridoma 2:361-367，其每个的内容均通过引用以其整体结合到本文中。
对于人抗体的产生，另参见Mendez等(1998) Nature Genetics 15:146-156，Green和Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188:483-495，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中。以下文献中进一步论述和描述了人抗体：美国专利号5,939,598、6,673,986、6,114,598、6,075,181、6,162,963、6,150,584、6,713,610和6,657,103以及美国专利公布号20030229905 A1、20040010810 A1、US 20040093622 A1、20060040363 A1、20050054055 A1、20050076395 A1、20050287630 A1。另参见国际公布号WO 94/02602、WO 96/34096和WO 98/24893以及欧洲专利号EP 0 463 151 B1。上文引述的专利、申请和参考文献各自的公开内容通过引用以其整体结合到本文中。
在一备选方法中，他人，包括GenPharm International，Inc.，利用“小基因座(minilocus)”方法。在小基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的各片段(各个基因)来模拟外源Ig基因座。因此，将一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定区和第二恒定区(优选γ恒定区)构成用于插入动物的构建体。该方法描述于例如美国专利号：5,545,807、5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650和5,814,318、5,591,669、5,612,205、5,721,367、5,789,215、5,643,763、5,569,825、5,877,397、6,300,129、5,874,299、6,255,458和7,041,871，其公开内容通过引用结合到本文中。另参见欧洲专利号0 546 073 B1、国际专利公布号WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884，其各自的公开内容通过引用以其整体结合到本文中。另参见Taylor等(1992) Nucleic Acids Res. 20：6287；Chen等(1993) Int. Immunol. 5：647；Tuaillon等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：3720-4；Choi等(1993) Nature Genetics 4：117；Lonberg等(1994) Nature 368：856-859；Taylor等(1994) International Immunology 6：579-591；Tuaillon等(1995) J. Immunol. 154：6453-65；Fishwild等(1996) Nature Biotechnology 14：845；以及Tuaillon等(2000) Eur. J. Immunol. 10：2998-3005，其各自的公开内容通过引用以其整体结合到本文中。
在某些实施方案中，提供去免疫化抗体(例如与人GPI部分或与GPI锚定蛋白结合的抗体)或其抗原结合片段。可对去免疫化抗体或其抗原结合片段进行修饰以赋予抗体或其抗原结合片段对指定物种无免疫原性或较少免疫原性。可利用本领域技术人员已知的任何各种技术，通过修饰抗体或其抗原结合片段来实现去免疫化(参见例如PCT 公布号WO 04/108158和WO 00/34317)。例如，可采用例如重组技术，通过鉴定抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列内的潜在的T细胞表位和/或B细胞表位，并从抗体或其抗原结合片段中除去一个或多个潜在的T细胞表位和/或B细胞表位，使抗体或其抗原结合片段去免疫化。然后可任选产生并测试修饰抗体或其抗原结合片段以鉴定保持一种或多种所需生物活性(例如结合亲和力)但降低了免疫原性的抗体或其抗原结合片段。可采用本领域已知技术，例如计算方法(参见例如PCT公布号WO 02/069232)、体外技术或计算机技术和生物测定法或物理方法(例如测定肽与MHC分子的结合、测定肽:MHC复合物与来自接受抗体或其抗原结合片段的物种的T细胞受体的结合、使用转基因动物与接受抗体或其抗原结合片段的物种的MHC分子测试蛋白质或其肽部分或者用来自接受抗体或其抗原结合片段的物种的免疫系统细胞再生的转基因动物测试等)，实施用于鉴定潜在的T细胞表位和/或B细胞表位的方法。在各种实施方案中，本文所述去免疫化抗体包括去免疫化抗原结合片段、Fab、Fv、scFv、Fab'和F(ab')2、单克隆抗体、鼠抗体、工程抗体(例如嵌合抗体、单链抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、完全人抗体和人工选择的抗体)、合成抗体和半合成抗体。
在一些实施方案中，产生重组DNA，其包含编码抗体表达细胞系的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的插入序列。术语DNA包括编码单链DNA、所述编码DNA及其互补DNA组成的双链DNA或这些互补(单链) DNA本身。
此外，可以酶合成或化学合成编码抗体(例如抗GPI抗体或抗GPI锚定蛋白抗体)的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的DNA，以含有编码重链可变结构域和/或轻链可变结构域的真实DNA (authentic DNA)序列或其突变体。真实DNA的突变体是编码上述抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的DNA，其中一个或多个氨基酸缺失、插入或被一个或多个其它氨基酸交换。在人源化和表达最优化应用中，优选所述修饰位于抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的CDR之外。术语突变体DNA还包括沉默突变体，其中一个或多个核苷酸被具有编码相同氨基酸的新的密码子的其它核苷酸置换。术语突变体序列还包括简并序列。简并序列是遗传密码含义内的简并，因为无数的核苷酸被其它核苷酸置换而又不引起起始编码的氨基酸序列的变化。由于其不同的限制位点和/或特定宿主(特别是大肠杆菌)优选的特定密码子的频率所致，这种简并序列可用于获得重链鼠可变结构域和/或轻链鼠可变结构域的最佳表达。
术语突变体欲包括按照本领域已知方法通过真实DNA的体外诱变而获得的DNA突变体。
对于完全四聚体免疫球蛋白分子的装配和嵌合抗体的表达，使编码重链和轻链可变结构域的重组DNA插入序列与相应的编码重链和轻链恒定结构域的DNA融合，然后转移到合适的宿主细胞中，例如在掺入杂交载体中后转移。
可以使用包含插入序列的重组DNA，所述插入序列编码与人恒定结构域IgG (例如γ1、γ2、γ3或γ4，特别是实施方案γ1或γ4)融合的目标抗体的重链鼠可变结构域。还提供包含插入序列的重组DNA，所述插入序列编码与人恒定结构域κ或λ (优选κ)融合的抗体的轻链鼠可变结构域。
另一个实施方案涉及编码重组多肽的重组DNA，其中重链可变结构域和轻链可变结构域通过间隔基连接，任选包含有利于抗体在宿主细胞中加工的信号序列和/或编码有利于抗体纯化的肽和/或切割位点和/或肽间隔基和/或作用剂的DNA序列。编码作用剂的DNA应是指编码可用于诊断或治疗应用中的作用剂的DNA。因此，特别表示作为毒素或酶、尤其是能够催化前药活化的酶的作用剂分子。编码这种作用剂的DNA具有天然存在的酶或毒素编码DNA的序列或其突变体，并可通过本领域众所周知的方法制备。
因此，本公开内容的单克隆抗体或抗原结合片段可以是不与其它作用剂(例如治疗药物或检测标记)缀合的裸抗体或抗原结合片段。或者，单克隆抗体或抗原结合片段可与以下作用剂缀合：例如细胞毒性剂、小分子、激素、酶、生长因子、细胞因子、核酶、肽模拟物、化学物质、前药、包含编码序列的核酸分子(例如反义物、RNAi、基因靶向构建体等)或检测标记(例如NMR或X光造影剂、荧光分子等)。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段(例如Fab、Fv、单链scFv、Fab'和F(ab')2)与延长抗体或抗原结合片段的半寿期的分子连接(参见题名“缀合物”的部分)。
可获得在哺乳动物细胞中表达克隆的重链和轻链基因的若干可能的载体系统。一类载体有赖于所需基因序列整合至宿主细胞基因组。可通过同时引入以下抗药基因，来选择具有稳定整合的DNA的细胞：例如大肠杆菌gpt (Mulligan和Berg (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA，78:2072)或Tn5 neo (Southern和Berg (1982) Mol. Appl. Genet. 1:327)。选择标记基因可与待表达的DNA基因序列连接，或通过共转染导入同一细胞(Wigler等(1979) Cell 16:77)。第二类载体利用赋予染色体外质粒自主复制能力的DNA元件。这些载体可来源于动物病毒，例如牛乳头瘤病毒(Sarver等(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA，79:7147)、多瘤病毒(Deans等(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1292)或SV40病毒(Lusky和Botchan (1981) Nature 293:79)。
由于免疫球蛋白cDNA只由表示编码抗体蛋白的成熟mRNA的序列组成，因此免疫球蛋白mRNA的合成需要调节基因转录和加工RNA的其它基因表达元件。这些元件可包括剪接信号、转录启动子(包括诱导型启动子)、增强子和终止信号。掺入这类元件的cDNA表达载体包括以下文献描述的载体：Okayama和Berg (1983) Mol. Cell Biol. 3:280；Cepko等(1984) Cell 37:1053；以及Kaufman (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:689。
从本公开内容来看显而易见，抗GPI部分抗体或抗GPI锚定蛋白抗体可用于诊断疾病(例如诊断PNH或发生血小板减少症的风险增加)、监测疾病进展和选择合适疗法(包括联合疗法)以治疗受试者的PNH、血小板减少症或血栓形成的方法。
在本公开内容的诊断实施方案中，预期双特异性抗体。双特异性抗体是与至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆的优选人抗体或人源化抗体。在本发明的情况下，结合特异性之一针对细胞上的GPI部分或GPI锚定蛋白(例如白细胞或红细胞)，另一种针对任何其它抗原，优选针对细胞表面蛋白或受体或受体亚基。
用于制备双特异性抗体的方法属于本领域技术人员的能力范围。传统上，重组产生双特异性抗体以两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达为基础，其中两条重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello (1983) Nature 305:537-539)。具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)可与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合优选是与免疫球蛋白重链恒定结构域，包括至少部分的铰链、CH2和CH3区。将编码免疫球蛋白重链融合物的DNA和免疫球蛋白轻链(如有需要)插入独立的表达载体中，并共转染至合适的宿主生物中。有关制备双特异性抗体的现有已知说明性方法的更多详情参见例如Suresh等(1986) Methods in Enzymology 121:210；PCT公布号WO 96/27011；Brennan等(1985) Science 229:81；Shalaby等，J. Exp. Med. (1992) 175:217-225；Kostelny等(1992) J. Immunol. 148(5):1547-1553；Hollinger等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Gruber等(1994) J. Immunol. 152:5368；以及Tutt等(1991) J. Immunol. 147:60。双特异性抗体还包括交联或杂缀合物(heteroconjugate antibodies)。杂缀合物可采用任何合宜的交联方法制备。连同许多交联技术一起，合适的交联剂是本领域公知的，公开于美国专利号4,676,980。
也已描述了直接由重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各项技术。例如，使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等(1992) J. Immunol. 148(5):1547-1553)。得自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽可通过基因融合与两个不同抗体的Fab'部分连接。可在铰链区还原抗体同二聚体，形成单体，然后再氧化形成抗体异二聚体。还可利用该方法产生抗体同二聚体。Hollinger等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448描述的“双链抗体”技术提供了用于制备双特异性抗体片段的备选机制。该片段包含与轻链可变结构域(VL)通过接头连接的重链可变结构域(VH)，所述接头短到不允许相同链中两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫使与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合部位。还报道了通过用单链Fv (scFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略(参见例如Gruber等(1994) J. Immunol. 152:5368)。或者，抗体可以是以下文献描述的“线性抗体”：例如Zapata等(1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062。简单地说，这些抗体包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其形成抗原结合区对。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
缀合物
在一些实施方案中，本文所述试剂(例如非裂解气单胞菌溶素多肽或与GPI部分或GPI锚定蛋白结合的抗体)可与异源部分缀合。异源部分可以是例如异源蛋白质(见上文)、治疗药物(例如毒素或药物)或检测标记，例如但不限于放射性标记、酶标记、荧光标记或发光标记。合适的放射性标记包括例如32P、33P、14C、125I、131I、35S和3H。合适的荧光标记包括而不限于荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、Alexa Fluor® 488、Alexa Fluor® 647、GFP、DyLight 488、藻红蛋白(PE)、碘化丙啶(PI)、PerCP、PE-Alexa Fluor® 700、Cy5、别藻蓝蛋白、Cy7和PE-Alexa Fluor® 750。发光标记包括例如各种发光镧系元素(例如铕或铽)螯合物中的任一种。例如，合适的铕螯合物包括二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的铕螯合物。酶标记包括例如碱性磷酸酶、CAT、萤光素酶和辣根过氧化物酶。
将异源部分与试剂缀合的合适方法是蛋白质化学领域众所周知的。例如，可采用许多已知的化学交联剂的任一种使两种蛋白质交联。所述交联剂的实例是通过包含“受阻的”二硫键在内的键连接两个氨基酸残基的交联剂。在这些键中，交联单元内的二硫键受保护(通过二硫键任一侧的阻碍基团)不被例如还原型谷胱甘肽或二硫化物还原酶作用还原。一种合适的试剂4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α (2-吡啶基联硫基)甲苯(SMPT)，在两种蛋白质之间利用一种蛋白质的末端赖氨酸和另一种蛋白质的末端半胱氨酸形成这类键。还可使用通过各蛋白质上的不同偶联部分交联的异双官能试剂。其它有用的交联剂包括而不限于连接以下基团的试剂：两个氨基(例如N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺)、两个巯基(例如1,4-双-马来酰亚胺基丁烷)、氨基与巯基(例如间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、氨基与羧基(例如4-[对叠氮基水杨基酰氨基]丁胺)和氨基与存在于精氨酸侧链的胍基(例如对叠氮基苯基乙二醛一水合物)。
放射性标记可通过共价键或非共价键(例如离子键或疏水键)与试剂缀合。它们可与蛋白质的任何部分缀合，前提是所述缀合不干扰试剂与GPI部分或GPI锚定蛋白结合的能力。在一些实施方案中，如果试剂是蛋白质，则放射性标记可与试剂的氨基酸骨架直接缀合。或者，还可包含放射性标记作为较大分子的部分(例如间-[125I]碘苯基-N-羟基琥珀酰亚胺([125I]mIPNHS)中的125I，其与游离氨基结合形成相关蛋白质的间碘苯基(mIP)衍生物(参见例如Rogers等(1997) J. Nucl. Med. 38:1221-1229)或螯合物(例如与DOTA或DTPA的螯合物)，其进而与蛋白质骨架结合。使放射性标记或含有放射性标记的较大分子/螯合物与本文所述试剂缀合的方法是本领域已知的。这类方法包括在有利于放射性标记或螯合物与所述试剂结合的条件下(例如pH、盐浓度和/或温度)，将所述试剂与放射性标记一起温育(参见例如美国专利号6,001,329，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中)。
使荧光标记(有时称为“荧光团”)与试剂(例如非裂解气单胞菌溶素蛋白或抗体)缀合的方法是蛋白质化学领域已知的。例如，可使用与荧光团连接的琥珀酰亚胺基(NHS)酯或TFP酯部分，使荧光团与蛋白质的游离氨基(例如赖氨酸的游离氨基)或巯基(例如半胱氨酸的巯基)缀合。在一些实施方案中，可使荧光团与异双官能交联剂部分(例如磺基-SMCC)缀合。合适的缀合方法包括在有利于荧光团与试剂结合的条件下，使试剂与荧光团一起温育。参见例如Welch和Redvanly (2003) “Handbook of Radiopharmaceuticals: Radiochemistry and Applications,” John Wiley and Sons (ISBN：0471495603)。用于使荧光团与蛋白质缀合的各种试剂盒是市售的，例如，Alexa Fluor® 488蛋白质标记试剂盒(Protein Labeling Kit)和Alexa Fluor® 647蛋白质标记试剂盒(Molecular Probes，Invitrogen™)。在一些实施方案中，荧光团可以1-2 mol染料/mol蛋白质与试剂缀合。
在一些实施方案中，试剂(例如气单胞菌溶素蛋白或与GPI部分或GPI锚定蛋白结合的抗体)可用例如改进抗体自身在循环中(例如在血液、血清或其它组织中)的稳定和/或保留的部分修饰。例如，可按以下文献所述使本文所述试剂聚乙二醇化：例如Lee等(1999) Bioconjug. Chem 10(6)：973-8；Kinstler等(2002) Advanced Drug Deliveries Reviews 54:477-485；以及Roberts等(2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476。稳定部分可改进受试者机体(例如血液或组织)中试剂的稳定性或保留达至少1.5倍(例如至少2、5、10、15、20、25、30、40倍或50倍以上)。
生物样品和样品收集
用于本文所述方法的合适的生物样品包括包含一种或多种白细胞和/或一种或多种红细胞的任何生物流体、细胞群、组织或其部分。生物样品可以是例如获自受试者(例如哺乳动物，例如人)的样品或可来源于所述受试者。例如，样品可以是通过活组织检查得到的组织切片或者置于或适应组织培养的细胞。生物样品还可以是生物流体，例如尿液、全血或其部分(例如血浆)、唾液、精液、痰、脑脊液、眼泪或粘液。如有需要，可将生物样品进一步分级分离成含有特殊细胞类型的流分。例如可将全血样品分级分离成血清或含有特殊类型的血液细胞例如红细胞或白细胞(leukocyte)的流分。如有需要，生物样品可以是受试者的不同生物样品的组合，例如组织和流体样品的组合。
生物样品可获自受试者，例如患有、疑似患有阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)或有发生阵发性睡眠性血红蛋白尿症风险的受试者。可采用获取生物样品的任何合适方法，但示例性方法包括例如静脉切开术、拭子(例如口腔拭子)、灌洗液或细针穿刺活组织检查法(fine needle aspirate biopsy procedure)。易于细针穿刺的组织的非限制性实例包括淋巴结、肺、甲状腺、乳房和肝脏。生物样品还可获自骨髓。还可通过例如显微切割(例如激光捕获显微切割(LCM)或激光显微切割(LMD))、膀胱冲洗、涂片(PAP涂片)或导管灌洗来收集样品。
用于获取和/或保存保持生物样品中细胞的活性或完整性的样品的方法为本领域技术人员所熟知。例如，可将生物样品与一种或多种其它的作用剂进一步接触，例如合适的缓冲剂和/或抑制剂，包括蛋白酶抑制剂、意在保持或使细胞中的变化(例如摩尔渗透压浓度或pH的变化)或细胞表面上的细胞表面蛋白(例如GPI连接的蛋白质)或GPI部分的变性降到最小的作用剂。这种抑制剂包括例如螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)；蛋白酶抑制剂，例如苯甲磺酰氟(PMSF)、抑蛋白酶肽和亮抑酶肽。以下文件描述了用于保存或以其它方式操作完整细胞的合适的缓冲剂和条件：例如Pollard和Walker (1997), “Basic Cell Culture Protocols,” Methods in Molecular Biology 第75卷, Humana Press；Masters (2000) “Animal cell culture: a practical approach,” Practical approach series 第232卷, Oxford University Press；以及Jones (1996) “Human cell culture protocols,” Methods in molecular medicine 第2卷, Humana Press”。
还可对样品进行处理以清除干扰物质或使干扰物质的存在情况减到最低。例如，可对生物样品进行分级分离或纯化以除去一种或多种非目标材料(例如细胞)。分级分离或纯化生物样品的方法包括但不限于流式细胞术、荧光激活细胞分选术和沉淀。
诊断和治疗方法
如上所述并如在工作实施例中详尽说明的一样，本发明人发现了PNH II型造血细胞(例如II型白细胞和/或II型红细胞)的存在情况或量与患者的血小板减少症之间的临床关系。例如，本发明人已证实与受测生物样品中相同组织学类型(相同谱系)的全部白细胞相比，PNH II型白细胞群为至少1.2% (例如至少1.2、1.5、2、3、5、7、9、10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47、50、52、55、57、60、62、65%或65.3%以上)的患者比不具有可检测的PNH II型白细胞群的患者或PNH II型白细胞群低于1.2%的患者极更可能是血小板减少性的。与没有可检测的II型粒细胞群的患者样品相比，具有PNH II型粒细胞群的患者样品具有类似的外周白细胞计数、外周红细胞计数、绝对嗜中性粒细胞计数和血红蛋白(Hgb)水平，这表明了血小板计数的差异可能不是因潜在骨髓产生的差异所致。换句话说，具有可检测的PNH II型粒细胞克隆的患者中血小板计数降低可能是因末期补体介导的血小板消耗或破坏增加所致，这可能与PNH患者死亡的主要原因血栓形成有关。参见例如Franchini (2006) Hematology 11(3):139-146。因此，本公开内容的特征在于利用与患者样品中PNH II型白细胞的百分比有关的信息以确定患者是否处于发生血小板减少症和/或血栓形成的风险增加的状态的方法。类似地，本发明人已确定与不具有可检测的PNH II型RBC群的患者或PNH II型RBC群低于0.02%的患者相比，PNH II型RBC群至少为0.02% (例如至少0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、71.3%或75%以上)的患者极更可能是血小板减少性的。因此，本公开内容的特征还在于利用与患者中PNH II型RBC克隆量相关的信息以确定患者是否有发生血小板减少症和/或血栓形成的风险的方法。
可采用以下方法检测与患者生物样品中相同组织学类型(相同谱系)的细胞总量相比PNH II型造血细胞(例如II型PNH白细胞)的存在情况或测定PNH II型造血细胞(例如II型PNH白细胞)的百分比。在其中检查大量白细胞的实施方案中，所述方法可用于供从业人员将相同组织学类型(相同谱系)的PNH I型、II型和III型白细胞群区分开来，以便准确地测定与所述大量中相同组织学类型的白细胞总数相比，总的异常PNH群(即II型加III型细胞)的大小(和/或供从业人员测定所述大量中PNH II型白细胞的百分比)。首先，使细胞群(例如白细胞、红细胞或白细胞和红细胞的组合)与结合(i) GPI部分或(ii) GPI连接的蛋白质的试剂在允许试剂与GPI部分或GPI连接的蛋白质(如果在存在于样品中的细胞表面上存在)结合的条件下接触一段时间。细胞群可存在于生物样品中(例如全血样品；参见题为“生物样品和样品收集”的部分)，例如获自患者的生物样品。例如，存在于患者的全血样品中的细胞可与气单胞菌溶素蛋白(例如非裂解形式的气单胞菌溶素)或与GPI部分或GPI锚定蛋白(例如CD59)结合的抗体接触。参见例如Hall和Rosse (1996) Blood 87(12):5332-5340和美国专利号6,593,095。可根据与细胞表面结合的试剂的量，区分与试剂接触的至少一部分细胞(例如白细胞或RBC)。例如，如果使用可检测标记的试剂，则可测定与表面结合的试剂的量为由与细胞表面结合的可检测标记的试剂所产生的信号总量的函数。如上所述，试剂与细胞结合的量反映了GPI部分和/或GPI锚定蛋白表达的量，其表明细胞是否是PNH III型细胞(GPI和GPI锚定蛋白几乎不表达或不表达)、正常细胞(I型细胞；与III型细胞相比，具有相对较高水平的GPI和GPI锚定蛋白表达)还是PNH II型细胞(与I型细胞和III型细胞相比，具有中等水平的GPI和GPI锚定蛋白表达)。区分或检查方法可包括例如流式细胞术。
在一些实施方案中，采用所述方法检测试剂与患者样品的RBC结合的量。在一些实施方案中，可采用所述方法检测试剂与患者样品的白细胞结合的量。特别适宜在本文所述诊断方法中评价的白细胞包括例如粒细胞和单核细胞(例如巨噬细胞)。
样品可来自患有、疑似患有阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)或有发生阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)的风险的患者。在一些实施方案中，患者具有一种或多种症状，包括例如库姆斯阴性血管内溶血(Coombs negative intravascular hemolysis)、LDH水平升高、复发性缺铁性贫血、反常部位血栓形成、间歇性吞咽困难或腹痛。
在一些实施方案中，为了辅助鉴定正常细胞或PNH细胞，也可对一组对照细胞群实施所述检测方法。在评价目标细胞群之前、同时或之后可对对照群进行评价。如下面更详细的论述一样，从业人员可选择对已知为PNH II型细胞的对照细胞群、已知为PNH III型细胞的对照细胞群和/或已知为正常或I型细胞的对照细胞群实施所述方法以测定与用于特殊细胞类型的试剂的结合的典型量或平均量。可利用该对照信息把目标细胞(例如白细胞或红细胞)归类或鉴定为正常细胞、PNH II型细胞和/或PNH III型细胞。
取决于生物样品内细胞群的特定组成，根据高结合试剂量、低结合试剂量或结合试剂的中等水平，可将所述群的至少一些细胞与其它细胞区分开来。在一些情况下，仅具有高结合试剂量的细胞可存在(例如来自健康患者或未患PNH的患者的细胞)。在一些情况下，较大百分比的细胞将几乎没有或没有与其表面结合的试剂(例如具有高百分比的PNH III型细胞的PNH患者的白细胞或RBC)。在一些实施方案中，可根据与细胞结合的试剂的量，将与试剂接触的细胞群归类为高、低和中等类别。
在一些实施方案中，可根据与其细胞表面结合的试剂的量，对一种或多种细胞(例如一种或多种经区分或检查的细胞)进行分类。如以工作实施例为例说明和图1中的描述一样，可采用流式细胞术方法容易地将群中各细胞归类为高试剂结合的、低或差试剂结合的和中等试剂结合的。例如，使获自PNH患者的白细胞与以下两种不同的试剂接触：与GPI部分(例如可检测标记的非裂解气单胞菌溶素蛋白)结合的第一试剂和与GPI锚定蛋白结合的第二试剂(例如与人CD24结合的可检测标记的抗体)。第一试剂和第二试剂用不同的可检测标记进行标记。然后对经接触的细胞进行流式细胞术。根据各试剂与细胞结合的量，流式细胞术领域的技术人员可容易地采用该方法区分细胞。参见例如Macey (2007) “Flow Cytometry: principles and applications,” Humana Press (ISBN: 1588296911)和Brodsky等(2000) Am J Clin Pathol 114:459-466。如图1所示，可容易地采用流式细胞术方法将获自PNH患者的粒细胞归类为具有各试剂的高结合量(右上方的细胞群；正常细胞或I型细胞)、各试剂的低结合量(左下方的细胞群；III型细胞)和各试剂的中等结合量(底中部的细胞群；II型细胞)。
可通过将与细胞结合的试剂的量与对照量(例如试剂与PNH I型细胞、PNH II型细胞和/或PNH III型细胞结合的对照量)进行比较，来进行细胞的分类。试剂与PNH I型细胞结合的对照量可以例如所观察到试剂与获自一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40个以上)健康个体的相同组织学类型的细胞结合的平均量为基础。试剂与PNH III型细胞结合的对照量可以例如所观察到的获自一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、或40个以上) PNH患者的相同类型细胞结合的平均量为基础。试剂与PNH II型细胞结合的对照量可以例如所观察到的获自一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40个以上)患有PNH并具有相同组织学类型(相同谱系)的PNH II型细胞的可检测群的患者的相同类型的细胞结合的平均量为基础。例如，为了根据与细胞表面结合的试剂的量对目标白细胞进行分类，从业人员可将与细胞结合的试剂的量与试剂与已知为PNH I型白细胞的白细胞、已知为PNH II型白细胞的白细胞和/或已知为PNH III型白细胞的白细胞结合的典型量或平均量进行比较。
在一些实施方案中，可通过确定试剂与细胞结合的量是否落入表明相同组织学类型的PNH I型细胞、PNH II型细胞或PNH III型细胞的预定范围内，来进行目标细胞(例如白细胞或RBC)的区分或分类。在一些实施方案中，目标造血细胞的区分或分类可包括确定试剂与细胞表面结合的量是否落入预定截止值之上还是之下。截止值通常是试剂与细胞表面结合的量(或自细胞检测的信号的量)，超过或低于该值被视为表明某种细胞类型即PNH I型细胞、PNH II型细胞或PNH III型细胞。
一些截止值不是绝对的，因为诊断相关性(例如试剂与细胞表面结合的量与细胞是PNH II型细胞的可能性)在截止值任一侧的数值范围内仍可保持显著性。要理解的是，最佳截止值的求精可根据所用试剂的质量、所用统计方法和检测设备(例如流式细胞术)的先进程度以及所检查的样品的数目和来源来确定。因此，可根据周期性重新评价或方法的改变或样品分布，上下调整截止值。
本文所用“血小板减少症”是指其中患者的血小板计数小于200,000个血小板/μL血液(例如小于150,000、小于140,000、小于130,000、小于120,000、小于110,000、小于100,000或小于90,000个血小板/μL血液)的病况。在一些实施方案中，血小板减少症患者的血小板计数小于100,000个血小板/μL血液。
如上所述，有关PNH II型细胞的百分比的信息可用于确定患者是否处于发生血栓形成的风险增加的状态的方法。有关患者生物样品中PNH II型细胞(例如II型白细胞和/或II型红细胞)的百分比的信息可传达(例如电子或印刷形式)给医学从业人员，以便从业人员将其用于为患者选择合适治疗方案。根据与受测生物样品中相同组织学类型的白细胞的总数相比至少1.2% (例如至少1.2、1.5、2、3、5、7、9、10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47、50、52、55、57、60、62、65%或65.3%以上)的PNH II型白细胞群，从业人员可确定患者有发生血小板减少症的风险，或很可能是血小板减少性的。同样地，与不具有可检测的PNH II型RBC群的患者或PNH II型RBC群低于0.02%的患者相比，受测生物样品中全部RBC的PNH II型RBC群为至少0.02% (例如至少0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、71.3%或75%以上)的患者极更可能是血小板减少性的。具有至少1.2%的PNH II型白细胞群或至少0.02%的PNH II型红细胞群的患者发生血栓的可能性可为正常个体或不具有该PNH II型细胞百分比的患者的例如至少1.5倍(例如2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、15、20、30倍或甚至40倍以上)。
医学从业人员可能要求其它试验以测定患者的血小板计数。用于测定受试者血液来源的样品中的血小板计数的方法是医学领域公知的，并描述于例如Sallah等(1998) Postgraduate Medicine 103:209-210；Kottke-Marchant (1994) Hematol Oncol Clin North Am. 8:809-853；Redei等(1995) J Crit Illn 10:133-137；Butkiewicz等(2006) Thrombosis Research 118(2):199-204；Tomita等(2000) Am J Hematol 63(3):131-135；以及Schrezenmeier等(1998) Br J Haematol 100(3):571-576。
如果患者被医学从业人员确定为是血小板减少性的或可能是血小板减少性的，则从业人员可选择、开予处方或给予患者抗血小板减少疗法。抗血小板减少疗法可以是例如皮质类固醇、血小板输注、脾切除术或血小板产生刺激药物。血小板产生刺激药物可以是例如血小板生成素(TPO)或血小板生成素模拟物。参见例如Kuter和Begley (2002) Blood 100:3457-3469；Li等(2001) Blood 98:3241-3248；以及Vadhan-Raj等(2000) Ann Intern Med 132:364-368。TPO模拟物肽可具有美国专利申请公布号20030049683的图5中描述的氨基酸序列，其公开内容(特别是图5)通过引用以其整体予以结合。
如果患者的生物样品中PNH II型白细胞的百分比约为1.2%，则医学从业人员还可确定患者处于发生血栓形成的风险增加的状态。医学从业人员因此可为患者选择合适的抗血栓疗法。例如，从业人员可选择、开予处方或给予患者抗凝血药或溶血栓药。抗凝血药可以是例如香豆定、肝素或其衍生物。溶血栓药可以是例如组织纤溶酶原激活物(例如Retavase™、Rapilysin™)、链激酶或尿激酶型纤溶酶原激活物。
在一些实施方案中，所测定的具有大于或等于1.2%的PNH II型白细胞群或者大于或等于0.02%的PNH II型红细胞群的患者可诊断为患有PNH。在一些实施方案中，被测定具有大于或等于1.2%的PNH II型白细胞群或者大于或等于0.02%的PNH II型红细胞群的被诊断患有PNH的患者或之前已诊断的PNH患者可开予补体抑制剂和/或用补体抑制剂治疗。
可按照本公开内容使用结合或以别的方式阻断任何人补体组分的产生和/或活性的任何化合物。例如，补体抑制剂可以是例如小分子、核酸或核酸类似物、肽模拟物或不是核酸或蛋白质的大分子。这些物质包括但不限于有机小分子、RNA适配体、L-RNA适配体、Spiegelmers、反义化合物、双链RNA、小干扰RNA、锁定核酸抑制剂和肽核酸抑制剂。在一些实施方案中，补体抑制剂可以是蛋白质或蛋白质片段。
在一些实施方案中，对人补体组分有特异性的抗体在本文中是有用的。一些化合物包括针对补体组分C1、C2、C3、C4、C5 (或其片段；见下文)、C6、C7、C8、C9、因子D、因子B、因子P、MBL、MASP-1和MASP-2的抗体，因此防止产生与C5a有关的过敏毒素活性和/或防止与C5b有关的膜攻击复合物的装配。
还可用于本发明方法的有天然存在的补体抑制化合物或可溶形式的补体抑制化合物，例如CR1、LEX-CR1、MCP、DAF、CD59、因子H、眼镜蛇毒因子、FUT-175、补体结合抑制素和K76 COOH。可用于结合或以别的方式阻断任何人补体组分的产生和/或活性的其它化合物包括但不限于蛋白质、蛋白质片段、肽、小分子、RNA适配体包括ARC187 (其是市售的，可获自Archemix Corporation，Cambridge，MA)、L-RNA适配体、spiegelmers、反义化合物、丝氨酸蛋白酶抑制剂、可用于RNA干扰(RNAi)的分子例如双链RNA包括小干扰RNA (siRNA)、锁定核酸(LNA)抑制剂、肽核酸(PNA)抑制剂等。
在一些实施方案中，补体抑制剂抑制补体活化。例如，补体抑制剂可结合并抑制C1 (例如C1q、C1r或C1s)的补体活化活性，或者补体抑制剂可结合并抑制C2、C3或C4 (例如抑制C2、C3或C4的切割)。在一些实施方案中，抑制剂抑制补体替代途径和/或经典途径的C3转化酶和/或C5转化酶的形成或装配。在一些实施方案中，补体抑制剂抑制末端补体形成，例如C5b-9膜攻击复合物的形成。例如，抗体补体抑制剂可包括抗C5抗体。这种抗C5抗体可直接与C5和/或C5b相互作用，从而抑制C5b的形成和/或生理功能。示例性的抗C5抗体包括例如依库珠单抗(Soliris®；Alexion Pharmaceuticals，Inc.，Cheshire，CT；参见例如Kaplan (2002) Curr Opin Investig Drugs 3(7):1017-23；Hill (2005) Clin Adv Hematol Oncol 3(11):849-50；以及Rother等(2007) Nature Biotechnology 25(11):1256-1488)和培克珠单抗(Alexion Pharmaceuticals，Inc.，Cheshire，CT；参见例如Whiss (2002) Curr Opin Investig Drugs 3(6):870-7；Patel等(2005) Drugs Today (Barc) 41(3):165-70；以及Thomas等(1996) Mol Immunol. 33(17-18): 1389-401)。
用于将合适的抗血栓疗法和/或抗血小板减少疗法给予有需要的患者的方法是医学领域公知的。
在一些实施方案中，用于确定患者是否处于血小板减少症或血栓形成的风险增加的状态的方法可辅以计算机。例如，该方法可包括接收包括PNH患者的医学概况的数据，所述概况包括有关患者生物样品中相同组织学类型(相同谱系)的全部白细胞的PNH II型白细胞的百分比的信息；并对至少包括所述信息的数据部分进行处理以确定患者是否处于发生血栓形成的风险增加的状态。在另一实例中，该方法可包括提供有关患者生物样品中相同组织学类型的全部白细胞的PNH II型白细胞的百分比的信息；将信息输入计算机；并应用计算机和输入信息计算表明患者是否处于血栓形成的风险增加的状态的参数。患者发生血小板减少症或血栓形成的相对风险可通过计算机打印输出和/或可存储在计算机可读介质上。
试剂盒
本文的特征还在于用于以下方面的试剂盒：确定患者的生物样品是否含有PNH II型白细胞群和/或确定患者是否处于发生血小板减少症或血栓形成的风险增加的状态。试剂盒可包括例如一种或多种选自以下的可检测标记的缀合物：气单胞菌溶素缀合物(例如非裂解变体气单胞菌溶素蛋白缀合物)或结合GPI锚定蛋白的抗体的缀合物。试剂盒还可包括含有GPI表达细胞或GPI结合颗粒的对照样品；和任选用于检测GPI表达细胞的存在情况的说明书。试剂盒还可包括用于获取人的生物样品(例如血样)的一种或多种器件和/或上述任何试剂盒组分。
下面的实施例旨在说明，而非限制本发明。
实施例
实施例 1. 材料与方法
获取共2,921名患者的外周血样品以测试PNH II型细胞和PNH III型细胞的存在情况。将血样抽入装有EDTA的无菌小瓶。
为了测定各患者样品中存在的正常白细胞(I型细胞)、PNH II型和PNH III型白细胞的百分比，将外周血混合，并用一种或多种下列缀合物染色：与AlexaFluor® 488缀合的非裂解气单胞菌溶素变体蛋白(Protox Biotech FL2-S)、与藻红蛋白(PE)缀合的抗CD24抗体(Beckman Coulter克隆ALB9)、与PC5缀合的抗CD15抗体(克隆80H5)和与PC7缀合的抗CD45抗体(克隆J.33)。在将血液与一种或多种上述试剂一起在室温下温育15-30分钟后，将血液用Immunoprep™ (Beckman Coulter)裂解，并用PBA缓冲液(磷酸缓冲盐溶液、1%牛血清白蛋白和10 mM NaN3)洗涤2次。然后将细胞重新悬浮于PBA缓冲液中，使用FC 500流式细胞仪(Beckman Coulter)进行分析。如果鉴定出PNH II型或III型粒细胞群，则也使用与一种或多种下列缀合物接触的患者血液，针对II型或III型群对单核细胞进行检查：与AlexaFluor® 488缀合的非裂解气单胞菌溶素变体蛋白(Protox Biotech FL2-S)、结合与藻红蛋白(PE)缀合的CD33的抗体(克隆D3HL60.251)、结合与ECD缀合的CD14的抗体(克隆RMO52)、结合与PC5缀合的CD64的抗体(克隆22)和结合与PC7缀合的CD45的抗体(克隆J.33)，其允许对单核细胞进行谱系特异性门控。
为了测定正常红细胞(I型细胞)、PNH II型和PNH III型红细胞的百分比，将20 μl在EDTA中的外周血加入3 mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，充分混合。使50 μl稀释的患者血液与一种或多种下列缀合物接触：与FITC缀合的抗CD235a抗体(Beckman Coulter克隆11E4B-7-6 / KC16)和与PE缀合的抗CD59抗体(Invitrogen克隆MEM-43)。将血液和缀合物在室温下避光温育1小时，同时每15分钟进行涡旋。在1小时温育后，血液用PBS洗涤两次，重新悬浮于PBS中，并在FC 500流式细胞仪(Beckman Coulter)上进行分析。
实施例 2
采用基于高灵敏度流式细胞术的测定，对2,921名患者的全血样品(提交该样品用于PNH的诊断试验)进行分析以检测白细胞(特别是粒细胞)上GPI和GPI锚定蛋白的表达水平，从而测定各样品中的I型、PNH II型和PNH III型白细胞(粒细胞)群。还利用该测定检测各个患者样品中的I型、PNH II型和PNH III型红细胞群。该方法利用荧光标记的非裂解气单胞菌溶素蛋白变体以及抗特异性GPI锚定的谱系特异性蛋白质抗原的抗体。图1中描述了1名患者样品的示例性流式细胞术分析。使全血样品的细胞与荧光标记的气单胞菌溶素试剂(Alexa Fluor)和藻红蛋白(PE)标记的与GPI锚定蛋白CD24结合的抗体接触。对全血样品的细胞进行流式细胞术分析，根据从与粒细胞表面结合的各种试剂检测的信号的量显现其中的粒细胞。如图1所示，将自AlexaFluor和PE标记检测的最大信号量的粒细胞(右上方；I型细胞)与信号非常低或缺乏信号的粒细胞群(左下方；III型粒细胞)和产生中等信号量的粒细胞(中部群；II型粒细胞)相分离。
使用以下两种试剂检查PNH红细胞群：可检测标记的与CD235结合的抗体和可检测标记的与CD59结合的试剂。使用可检测标记的气单胞菌溶素蛋白和若干抗GPI锚定的谱系特异性细胞表面蛋白(包括CD24、CD14、CD16、CD66b和CD55)的抗体，对PNH白细胞群进行检查。
216个患者样品的可检测的PNH III型粒细胞群>样品中粒细胞总数的0.01%，且绝对计数为至少50个PNH III型粒细胞。可得到这些患者中162位的与几个参数有关的临床信息(例如血红蛋白水平、LDH水平和血小板计数) (参见表1)。
表 1. 具有可检测的 PNH III 型或 II 型粒细胞群的患者的临床特征 ( 其中可获得临床数据 )
。
其中可获得临床信息的患者的样品中，19个(8.8%)患者样品含有独特的II型粒细胞群，其占总粒细胞群的范围为1.2-65.3%，克隆量中位数约为7%。在19个患者样品的4个中，II型粒细胞群显示总异常群(例如PNH II型和III型细胞) >50%。还检测了19个患者样品的10个中的PNH II型单核细胞群。对粒细胞上存在的对各个GPI连接的蛋白质有特异性的各种抗体检测PNH II型粒细胞的能力的评价表明在所有情况下使用可检测标记的气单胞菌溶素试剂均可检测到II型粒细胞群，但使用对CD66b (88%)、CD55 (50%)、CD24 (47%)和CD16 (0%)有特异性的抗体时百分比降低(参见表2)。这些结果表明基于气单胞菌溶素的缀合物特别可用于准确地检测患者样品中的PNH II型粒细胞群。
表 2. 使用气单胞菌溶素或其它抗 GPI 锚定蛋白抗体检测 II 型粒细胞
气单胞菌溶 素 CD24 CD66b CD55 CD16
19/19 (100%) 9/19 (47%) 8/9 (88%) 4/8 (50%) 0/9 (0%)
与没有II型粒细胞的样品相比，含有PNH II型粒细胞群的患者样品具有显著较大的总合并的PNH II型和PNH III型粒细胞群中位数(87%比11%；p = 0.0003)，以及较大的II型和III型RBC群中位数，这反映了检测具有总体较大的PNH细胞群的患者样品的PNH II型白细胞群的方法的能力增强。
在与临床数据进行比较后，发现具有PNH II型粒细胞群的患者样品还具有较低的血小板(plt)计数中位数(54 x 109/L；p<0.01)。参见图2。与没有可检测的II型粒细胞群的患者样品相比，具有PNH II型粒细胞群的患者样品具有相似的外周白细胞计数、外周红细胞计数、绝对嗜中性粒细胞计数和血红蛋白(Hgb)水平(表1)，这就表明血小板计数的差异很可能不是由潜在的骨髓产生的差异所致。换句话说，虽然本公开内容绝不受任何特定理论或作用机制限制，像PNH患者因缺乏GPI连接的补体调节蛋白CD55和CD59所致的补体控制失调一样，但是在具有可检测的PNH II型粒细胞克隆的患者中观察到的血小板计数降低可能是由于末期补体介导的血小板消耗或破坏增加所致，这进而可能与PNH患者死亡的主要原因血栓形成有关。
虽然参照其具体实施方案描述了本公开内容，但是本领域技术人员应当理解的是，可以进行各种变化，并且可代以等同内容而又不偏离本公开内容的真实精神和范围。另外，可进行许多修改以使特定情况、材料、材料组合物、方法、一个或多个方法步骤适应本公开内容的目的、精神和范围。所有的这类修改均在本公开内容的范围内。

Claims (10)

1.结合(i) GPI或(ii) GPI锚定蛋白的试剂在制备用于预测患者是否处于发生血栓形成的风险增加的状态的试剂盒中的用途，所述预测包括：
测定患者生物样品中全部粒细胞的PNH II型粒细胞的百分比；和
预测患者是否处于发生血栓形成的风险增加的状态，其中如果PNH II型粒细胞的百分比大于或等于1.2%，则所述患者处于发生血栓形成的风险增加的状态。
2.权利要求1的用途，其中所述生物样品是全血样品。
3.权利要求1的用途，其中1.2%-65.3%，包括端点1.2%和65.3%的PNH II型粒细胞群表明患者处于血栓形成的风险增加的状态。
4.权利要求1的用途，其中大于或等于a) 5%、b) 10%、c) 20%或d) 50%的PNH II型粒细胞群表明患者处于血栓形成的风险增加的状态。
5.权利要求1的用途，其中所述预测还包括，如果患者处于发生血栓形成的风险增加的状态，则针对出现的至少一种血栓形成症状监测患者。
6.权利要求1的用途，其中所述预测还包括，如果患者处于发生血栓形成的风险增加的状态，则为患者选择抗血栓疗法。
7.权利要求6的用途，其中所述抗血栓疗法是抗凝血药或溶血栓药。
8.权利要求7的用途，其中所述抗凝血药是香豆定或肝素。
9.权利要求7的用途，其中所述溶血栓药是组织纤溶酶原激活物、链激酶型纤溶酶原激活物或尿激酶型纤溶酶原激活物。
10.权利要求1的用途，其中所述预测还包括，如果患者处于发生血栓形成的风险增加的状态，则给予患者抗血栓疗法。
CN201080060850.0A 2009-11-09 2010-11-09 用于检测pnh ii型白细胞的试剂和方法及其作为血栓形成病症的风险因子的鉴定 Expired - Fee Related CN102753976B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28089709P 2009-11-09 2009-11-09
US61/280,897 2009-11-09
US61/280897 2009-11-09
PCT/US2010/055997 WO2011057250A1 (en) 2009-11-09 2010-11-09 Reagents and methods for detecting pnh type ii white blood cells and their identification as risk factors for thrombotic disorders

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102753976A CN102753976A (zh) 2012-10-24
CN102753976B true CN102753976B (zh) 2015-05-06

Family

ID=43970419

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080060850.0A Expired - Fee Related CN102753976B (zh) 2009-11-09 2010-11-09 用于检测pnh ii型白细胞的试剂和方法及其作为血栓形成病症的风险因子的鉴定

Country Status (15)

Country Link
US (4) US20130045192A1 (zh)
EP (1) EP2499494B1 (zh)
JP (1) JP5635617B2 (zh)
KR (1) KR20120107464A (zh)
CN (1) CN102753976B (zh)
AU (1) AU2010314844B2 (zh)
BR (1) BR112012010985A2 (zh)
CA (1) CA2780153A1 (zh)
ES (1) ES2625470T3 (zh)
IL (1) IL219634A0 (zh)
IN (1) IN2012DN04412A (zh)
MX (1) MX2012005388A (zh)
NZ (1) NZ599813A (zh)
RU (1) RU2012124090A (zh)
WO (1) WO2011057250A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112012010985A2 (pt) 2009-11-09 2016-11-29 Alexion Pharma Inc reagentes e métodos para detectar células sanguíneas tipo ii de hpn e sua identificação como fatores de risco para transtornos trombóticos
AU2019207600A1 (en) 2018-01-09 2020-07-09 Theriva Biologics, Inc. Alkaline phosphatase agents for treatment of neurodevelopmental disorders
WO2019183208A1 (en) 2018-03-20 2019-09-26 Synthetic Biologics, Inc. Intestinal alkaline phosphatase formulations
WO2019183209A1 (en) 2018-03-20 2019-09-26 Synthetic Biologics, Inc. Alkaline phosphatase agents for treatment of radiation disorders
US11845779B2 (en) * 2020-10-28 2023-12-19 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Mutant aerolysin and uses thereof

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5106741A (en) 1985-12-20 1992-04-21 The Upjohn Company Tissue plasminogen activator (TPA) analogs
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
WO1992003917A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International Homologous recombination in mammalian cells
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US7041871B1 (en) 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
EP0648265A4 (en) 1992-06-18 1996-12-04 Genpharm Int PROCESS FOR THE PRODUCTION OF NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS HAVING AN ARTIFICIAL YEAST CHROMOSOME.
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
WO1999036778A1 (en) 1998-01-20 1999-07-22 University Of Victoria Innovation & Development Corporation Detection of gpi anchored proteins
AU776910B2 (en) 1998-12-08 2004-09-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Modifying protein immunogenicity
CN2648437Y (zh) * 2001-02-13 2004-10-13 中国科学院昆明动物研究所 阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断试剂盒
SE0101932D0 (sv) * 2001-05-31 2001-05-31 Astrazeneca Ab Pharmaceutical combinations
WO2003018611A2 (en) * 2001-08-24 2003-03-06 University Of Victoria Innovation And Development Corporation Proaerolysin containing protease activation sequences and methods of use for treatment of prostate cancer
CN1822857A (zh) 2003-06-02 2006-08-23 阿莱克申药物公司 去免疫原性抗cd3抗体
US20070116710A1 (en) 2004-02-03 2007-05-24 Leonard Bell Methods of treating hemolytic anemia
EP4316465A3 (en) * 2006-03-15 2024-04-24 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria patients by an inhibitor of complement
BR112012010985A2 (pt) 2009-11-09 2016-11-29 Alexion Pharma Inc reagentes e métodos para detectar células sanguíneas tipo ii de hpn e sua identificação como fatores de risco para transtornos trombóticos

Also Published As

Publication number Publication date
CA2780153A1 (en) 2011-05-12
EP2499494B1 (en) 2017-03-08
US11112402B2 (en) 2021-09-07
IN2012DN04412A (zh) 2015-08-07
AU2010314844B2 (en) 2015-03-12
BR112012010985A2 (pt) 2016-11-29
AU2010314844A1 (en) 2012-05-31
EP2499494A1 (en) 2012-09-19
CN102753976A (zh) 2012-10-24
US20130045192A1 (en) 2013-02-21
MX2012005388A (es) 2012-07-23
EP2499494A4 (en) 2013-07-10
NZ599813A (en) 2014-07-25
JP5635617B2 (ja) 2014-12-03
US10126293B2 (en) 2018-11-13
ES2625470T3 (es) 2017-07-19
KR20120107464A (ko) 2012-10-02
RU2012124090A (ru) 2013-12-20
US20170285013A1 (en) 2017-10-05
US20140286962A1 (en) 2014-09-25
WO2011057250A1 (en) 2011-05-12
IL219634A0 (en) 2012-07-31
JP2013510325A (ja) 2013-03-21
US20190025293A1 (en) 2019-01-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11112402B2 (en) Reagents and methods for detecting PNH type II white blood cells and their identification as risk factors for thrombotic disorders
Harker et al. Regulation of platelet production and function by megakaryocyte growth and development factor in nonhuman primates
US9085623B2 (en) Therapeutic methods using anti-CD200 antibodies
Melgert et al. Pregnancy and preeclampsia affect monocyte subsets in humans and rats
McCachren et al. Thrombomodulin expression by human blood monocytes and by human synovial tissue lining macrophages
Sleeman et al. Markers for the lymphatic endothelium: in search of the holy grail?
Li et al. Efficient flow cytometric assay for platelet‐leukocyte aggregates in whole blood using fluorescence signal triggering
Briassouli et al. Role of the Urokinase Plasminogen Activator Receptor in Mediating Impaired Efferocytosis of Anti-SSA/Ro–Bound Apoptotic Cardiocytes: Implications in the Pathogenesis of Congenital Heart Block
US11391739B2 (en) Compositions and methods for treating multiple myeloma
EP3583425B1 (en) Method for the diagnosis of breast cancer
WO2013107826A2 (en) Use of cellular biomarkers expression to diagnose sepsis among intensive care patients
Llewellyn et al. Focal adhesion kinase (FAK) deficiency in mononuclear phagocytes alters murine breast tumor progression
WO2018019990A1 (en) Methods of treatement of cancer disease by targetting tumor associated macrophage
AU2011218228A1 (en) Compositions and methods for the detection of antibodies to native human leukocyte antigen
EP3875956A1 (en) Quantitative flow cytometry
NOBUHARA et al. Clinical utility of new parameters provided by XE-2100 RET channel
Hubbard Standardisation of protein S in plasma: calibration of the 1st International Standard
ES2340472T3 (es) Procedimiento para estimar la cantidad de tipos celulares de neutrofilos especificos.
CA3228231A1 (en) Assay methods for screening inhibitors of sickle cell disease, .beta.-thalassemia, or sickle cell .beta.-thalassemia, or a phenotype thereof
KR102044679B1 (ko) 이식 거부 반응 예측에 관한 정보제공방법
Abdullah et al. The role of lymphocyte subset in predicting allograft rejections in kidney transplant recipients
CN117916593A (zh) 用于筛选镰状细胞病、β-地中海贫血、或镰状细胞β-地中海贫血或其表型的抑制剂的测定方法
Gabriel et al. Light-Scattering Methods to Characterize Extracellular Vesicles

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150506

Termination date: 20161109

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee