CN117916593A - 用于筛选镰状细胞病、β-地中海贫血、或镰状细胞β-地中海贫血或其表型的抑制剂的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本披露涉及鉴定用于治疗镰状细胞病(SCD)、β‑地中海贫血(BT)或镰状细胞BT的测试化合物的方法。这些方法涉及将包括细胞的测试样品与血红素、血清和测试化合物接触，并且测量生物现象，其包括(1)该测试样品中的这些细胞上补体因子的沉积；或(2)(1)的补体因子沉积对靶效应细胞的一种或多种效应，其中与参考标准中的这些生物现象相比，该测试样品中的这些生物现象的减弱表明该测试化合物有效治疗镰状细胞病(SCD)、‑地中海贫血(BT)或镰状细胞BT。
Description
背景技术
镰状细胞病(SCD)是一组血液障碍，其特征是在红细胞中发现的携氧蛋白血红蛋白异常，导致红细胞僵硬、镰状。目前批准用于治疗SCD的治疗性药物可减轻SCD的一种或多种症状，例如疼痛和贫血，但不能解决根本原因。本领域需要改进的筛选SCD抑制剂的方法。
发明内容
本披露涉及鉴定用于治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)或镰状细胞BT的测试化合物的方法。
本披露涉及用于在细胞、组织和/或生理水平上分析镰状细胞病(SCD)的病理生理学的一个或多个模型系统和一个或多个测定。本披露部分基于以下发现：血红素诱导补体途径的激活，特别是细胞(例如，镰状细胞RBC、内皮细胞)上的补体C3和/或C5b9沉积。补体途径的激活引起直接细胞损伤和/或诱导下游过程，例如表面蛋白的细胞表达的变化和/或组织因子(TF)的募集。本模型系统和测定方法可用于检查原位补体激活对红细胞(例如，使用ssRBC或诱导的ssRBC)、内皮细胞(EC)和血细胞(例如，单核细胞、中性粒细胞和血小板)的影响，其可用于衡量补体途径抑制剂如C3抑制剂、C5抑制剂、FD抑制剂、FB抑制剂、备解素抑制剂和其他补体调节剂在改善镰状细胞表型中的潜在效用。本披露的测定方法提供了用于分析各种标志物(例如，iC3b和/或C5b9沉积，包括EC标志物表达和TF募集)的调节的简单但稳健且高通量的方法。
在本文开发的模型系统下，旁路途径(AP)抑制剂，包括因子P抑制剂(例如抗备解素抗体，如ALXN1820)、口服因子B抑制剂如伊普可泮(LNP023)、口服因子D抑制剂如ALXN2050、补体C3抑制剂(例如，肽抑制剂)和补体C5抑制剂(例如，抗C5抗体，例如N19/8)被认为在SCD的治疗中具有治疗作用，因为它们能够显著抑制SCD的病理生理学，例如补体靶向RBC进行破坏、内皮激活和组织因子募集。补体系统的其他调节剂，例如靶向补体C1q、补体C1、补体C1s、补体C2、MASP-2、MASP-3、因子H、补体C5a/C5aR(受体)、补体C3a/C3aR(受体)、补体C6和/或CD59等的药物也可以研究其作为治疗SCD的药物/药剂的潜在用途。
在一些实施例中，本披露涉及通过测量细胞响应血红素和血清的生物现象的变化来诊断SCD的方法。所测量的生物现象的变化可以包括，例如，在血红素和血清存在下，细胞上的补体激活增加，例如，RBC或内皮细胞(EC)中的C3和/或C5b9沉积增加；或补体沉积增加对靶效应细胞的间接影响，例如EC或血细胞如单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板的激活增加。补体蛋白活性和/或水平的变化表明了SCD的病理生理学。特别地，本披露涉及诊断SCD的方法，其包括在补体调节剂例如补体旁路途径(AP)的抑制剂存在下对补体沉积进行成像或测量其活性或其下游效应。可以使用荧光测定(FACS)或酶联免疫吸附测定(ELISA)以高通量形式进行组合物沉积和/或补体活性或其下游效应的测量。
在一些实施例中，本披露涉及通过测量测试化合物逆转或减弱由血红素和血清引起的细胞中生物现象的变化的能力来筛选可用于SCD治疗的测试化合物的方法。生物现象的变化的逆转或减弱可以包括例如在血红素和血清存在下逆转或抑制细胞上补体激活的增加，特别是逆转或抑制RBC或内皮细胞(EC)中C3和/或C5b9沉积的增加；或逆转或抑制EC或血细胞例如单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板的激活的增加。如上所述，可以使用FACS或ELISA测定以高通量形式测量测试化合物逆转或减弱生物现象的能力。
在一些实施例中，本披露涉及鉴定对补体抑制剂(例如AP抑制剂)治疗有响应的SCD患者亚群的方法。该方法包括使包含来自患有或疑似患有SCD的患者的细胞(例如，RBC或内皮细胞)的生物样品与血红素和血清，任选地与补体抑制剂一起接触；测量补体抑制剂存在下细胞中生物现象的变化；选择含有响应补体抑制剂而发生生物现象变化的细胞的样品；并根据所选样品鉴定对补体抑制剂治疗有响应的SCD亚群。
在一些实施例中，本披露涉及治疗患有或疑似患有SCD的患者的方法。该方法可以涉及对患者的SCD状态进行评估，如上文所提供的，例如，测量细胞中响应血红素和血清的生物现象的变化，例如细胞中补体沉积的增加或血红素诱导的补体沉积对靶效应细胞的下游效应方面的干扰；通过施用使改变的生物现象正常化的化合物来治疗患者。在一些实施例中，化合物是补体抑制剂，特别是AP抑制剂。
在一些实施例中，本披露涉及细胞(例如，RBC、EC或血细胞)中响应于血红素和血清而引发的生物现象(这种现象是体内SCD病理生理学的代表)在筛选用于治疗SCD的测试化合物中的用途。具体地，该用途涉及鉴定补体抑制剂，例如AP抑制剂，其可以减弱细胞中的补体沉积，包括激活补体沉积对效应细胞例如EC和血细胞(例如，单核细胞、嗜中性粒细胞和血小板)的下游效应。在一些实施例中，本披露涉及细胞(例如，RBC、EC或血细胞)中响应于血红素和血清而引发的生物现象在患有SCD的患者的诊断、分类、监测和治疗中的用途。
在一些实施例中，本发明涉及鉴定用于治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)或预期的镰状细胞BT的测试化合物的方法，该方法包括使包含细胞的测试样品与血红素、血清和测试化合物接触；以及测量生物现象，包括(1)测试样品中的细胞上补体因子的沉积；或(2)(1)的补体因子沉积对靶效应细胞的一种或多种效应；其中与参考标准中的生物现象相比，测试样品中的生物现象的减弱表明测试化合物有效治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)或镰状细胞BT。
在一些实施例中，测试样品包括红细胞(RBC)、内皮细胞、或血细胞、或其组合。在一些实施例中，血细胞是单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板。在一些实施例中，测量RBC和/或内皮细胞上补体因子的沉积。在一些实施例中，靶效应细胞是内皮细胞或血细胞。在一些实施例中，血细胞是单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板。
在一些实施例中，参考标准包括在不含测试化合物的对照样品中生物现象的信号的实验测量的或预定的水平。在一些实施例中，生物现象的信号是内皮细胞群体中约或大于20％的基线C3阳性水平和/或基线C5b9阳性水平。在一些实施例中，内皮细胞群体中的基线C3阳性水平和/或基线C5b9阳性水平大于30％。在一些实施例中，内皮细胞群体中的基线C3阳性水平和/或基线C5b9阳性水平大于50％。在一些实施例中，生物现象的信号是单核细胞中约或大于10％的基线组织因子(TF)阳性水平。在一些实施例中，单核细胞中的基线TF阳性水平大于15％。在一些实施例中，单核细胞中的基线TF阳性水平大于20％。
在一些实施例中，本发明涉及鉴定用于治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)或镰状细胞BT的测试化合物的方法，该方法包括，(a)使包含细胞的第一样品与血红素和血清接触；(b)使包含这些细胞的第二样品与测试化合物、血红素和血清接触，并且(c)测量生物现象，其包括(1)所述第一和第二样品中的细胞上补体因子的沉积；或(2)所述第一和第二样品的细胞中的补体沉积对靶效应细胞的一种或多种效应；其中与第一样品中的(c)的生物现象相比，第二样品中的(c)的生物现象的减弱表明测试化合物有效治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)、或镰状细胞BT。
在一些实施例中，第一样品包括红细胞(RBC)或内皮细胞、或其组合。在一些实施例中，血细胞是单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板。在一些实施例中，第二样品包括RBC或内皮细胞、或其组合。在一些实施例中，血细胞是单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板。在一些实施例中，靶效应细胞是内皮细胞或血细胞或其组合。在一些实施例中，血细胞是单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板。
在一些实施例中，生物现象是内皮细胞群体中约或大于20％的基线C3阳性水平和/或基线C5b9阳性水平。在一些实施例中，内皮细胞群体中的基线C3阳性水平和/或基线C5b9阳性水平大于30％。在一些实施例中，内皮细胞群体中的基线C3阳性水平和/或基线C5b9阳性水平大于50％。在一些实施例中，生物现象是单核细胞中约或大于10％的基线组织因子(TF)阳性水平。在一些实施例中，单核细胞中的基线TF阳性水平大于15％。在一些实施例中，单核细胞中的基线TF阳性水平大于20％。
在一些实施例中，本发明涉及鉴定用于治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)或镰状细胞BT的测试化合物的方法，该方法包括，(a)使包含RBC的第一样品与血红素和血清接触；(b)使包含这些RBC的第二样品与测试化合物、血红素和血清接触，并且(c)测量生物现象，其包括(1)所述第一和第二样品中的RBC上补体因子的沉积；其中与第一样品中的(c)的生物现象相比，第二样品中的(c)的生物现象的减弱表明测试化合物有效治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)、或镰状细胞BT。
在一些实施例中，本发明涉及鉴定用于治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)或镰状细胞BT的测试化合物的方法，该方法包括，(a)使包括内皮细胞(EC)的第一样品与血红素和血清接触足以诱导补体沉积在EC上的时间；(b)使包含这些EC的第二样品与测试化合物、血红素和血清接触，并且(c)测量生物现象，其包括(1)所述第一和第二样品中的EC上补体因子的沉积；或(2)第一和第二样品的EC中的补体沉积对包括EC的靶效应细胞的一种或多种效应；其中与第一样品中的(c)的生物现象相比，第二样品中的(c)的生物现象的减弱表明测试化合物有效治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)、或镰状细胞BT。
在一些实施例中，本发明涉及鉴定用于治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)或镰状细胞BT的测试化合物的方法，该方法包括，(a)使包括血细胞例如单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板的第一样品与血红素和血清接触；(b)使包括血细胞的第二样品与测试化合物、血红素和血清接触，并且(c)测量生物现象，其包括所述第一样品和第二样品中的血细胞上补体因子的沉积对靶效应细胞(包括血细胞)的一种或多种效应；其中与第一样品中的(c)的生物现象相比，第二样品中的(c)的生物现象的减弱表明测试化合物有效治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)、或镰状细胞BT。
在一些实施例中，测量步骤包括流式细胞术。
在一些实施例中，补体因子包括补体因子C3或其片段，或补体因子C5b9。在一些实施例中，补体因子是补体因子C3。在一些实施例中，补体因子是补体因子C3的蛋白片段。在一些实施例中，补体因子C3的蛋白片段是iC3b。
在一些实施例中，血红素包括以200μM的浓度提供的游离血红素。
在一些实施例中，RBC包括镰状细胞RBC(ssRBC)或被诱导形成ssRBC表型的RBC。
在一些实施例中，被诱导形成ssRBC表型的RBC包括磷脂酰丝氨酸(PS)或磷脂酰乙醇胺(PE)的细胞表面表达。在一些实施例中，RBC包括从镰状细胞患者获得的ssRBC。
在一些实施例中，血清包括自体血清。在一些实施例中，血清来自镰状细胞患者。
在一些实施例中，内皮细胞包括真皮微血管内皮细胞。
在一些实施例中，补体沉积对靶效应细胞的一种或多种效应是通过效应细胞中的补体受体(CR)介导的。在一些实施例中，补体受体是单核细胞中的CR3。在一些实施例中，补体沉积对靶效应细胞的一种或多种效应导致组织因子(TF)的上调。
在一些实施例中，样品包括血液样品。在一些实施例中，血液样品是全血样品。在一些实施例中，血液样品包含抗凝剂。在一些实施例中，抗凝剂是水蛭素。
在一些实施例中，第一和/或第二样品包括血液样品。在一些实施例中，血液样品是全血样品。在一些实施例中，血液样品包含抗凝剂。在一些实施例中，抗凝剂是水蛭素。
在一些实施例中，该方法进一步包括使包括已经与血红素和血液接触的细胞的第三样品与补体旁路途径(CAP)的抑制剂接触。在一些实施例中，细胞是红细胞(RBC)、内皮细胞(EC)或血细胞。在一些实施例中，血细胞是单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板。
在一些实施例中，CAP抑制剂包括C3抑制剂、因子P抑制剂、因子D(FD)抑制剂或C5抑制剂。在一些实施例中，CAP抑制剂包括C3肽抑制剂或口服因子D抑制剂。在一些实施例中，CAP抑制剂包括备解素抑制剂。在一些实施例中，备解素抑制剂是抗备解素抗体。在一些实施例中，抗备解素抗体是双特异性抗体。在一些实施例中，双特异性抗备解素抗体是微型抗体。在一些实施例中，CAP抑制剂包括C5抑制剂。在一些实施例中，C5抑制剂是抗C5抗体。在一些实施例中，抗C5抗体是特异性结合人C5的依库珠单抗(eculizumab)、雷夫利珠单抗(ravulizumab)、抗体8110或抗体N19-8。在一些实施例中，抗C5抗体是双特异性抗体。在一些实施例中，双特异性抗C5抗体是微型抗体。
在一些实施例中，该方法进一步包括使包括已与血红素和血液接触的细胞的对照样品与P-选择素的抑制剂接触。在一些实施例中，细胞是红细胞(RBC)、内皮细胞(EC)、或血细胞、或其组合。在一些实施例中，血细胞是单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板。在一些实施例中，P-选择素的抑制剂是结合P-选择素的抗体。在一些实施例中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，抗体是立赞利珠单抗(Crizanlizumab)或具有立赞利珠单抗的氨基酸序列。
在一些实施例中，接触包括将血红素、血清和测试化合物施用给测试动物。在一些实施例中，动物是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、仓鼠、绵羊、山羊、猴或灵长类动物。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一个彩色附图。本专利或专利申请公开的带有一个或多个彩色附图的副本将根据要求并且并支付必要的费用后由官方提供。
为了更完整地理解本文披露的原理及其优点，现在联合附图参考以下描述。
图1显示了镰状细胞病病理生理学中镰状红细胞的旁路途径激活。
图2A和图2B显示了针对具有立赞利珠单抗序列的抗体(抗P-选择素抗体)在红细胞上血红素诱导的补体沉积中旁路途径抑制剂(包括ALXN1820(抗备解素抗体)、ALXN2050(因子D抑制剂)和N19/8(抗C5抗体))的基准化。图2A显示了对于蛋白C3而言血红素诱导的红细胞补体沉积。图2B显示了对于蛋白C5b-9而言血红素诱导的红细胞补体沉积。图2A及图2B显示了具有立赞利珠单抗序列的抗体对C3调理作用或C5b-9沉积几乎没有影响或没有影响。
图3显示了血红素以剂量依赖性方式诱导C3在SS-RBC上沉积。
图4A和图4B显示了针对具有立赞利珠单抗序列的抗体在内皮细胞上血红素诱导的补体沉积中旁路途径抑制剂(包括ALXN1820、ALXN2050和N19/8)的基准化。图4A显示了对于蛋白C3而言血红素诱导的内皮细胞补体沉积。图4B显示了对于蛋白C5b-9而言血红素诱导的内皮细胞补体沉积。图4A和图4B显示了ALXN1820和ALXN2050阻断血红素诱导的C3和C5b-9。
图5A和图5B显示了使用来自与血红素孵育的全血的单核细胞(具有上调的TF(凝血外源性途径的起始物)表达)的流式细胞术分析，AP抑制剂阻断血红素诱导的全血中单核细胞表达TF。图5A和图5B显示了针对具有立赞利珠单抗序列的抗体对于组织因子(TF)上调，补体抑制剂(包括ALXN1820、LNP023、肽C3抑制剂、N19/8、ALXN2050和小分子因子D(fD)抑制剂)的基准化。图5显示了具有立赞利珠单抗序列的抗体对单核细胞的TF上调没有影响。
图6显示了与血栓炎症全血模型暴露于立赞利珠单抗时相比，当暴露于旁路途径抑制剂(包括ALXN1820和Ec(抗C5))时，血栓炎症全血模型中的IL-8水平。图6显示了具有立赞利珠单抗序列的抗体对血栓炎症全血模型中的IL-8产生没有影响。
图7A和图7B分别显示了用血红素处理的内皮细胞上的P-选择素上调和补体沉积的显微成像。图7A显示了镰状细胞病相关激动剂上调P-选择素。图7B显示了补体沉积是由血红素诱导的。
图8显示了基于流式细胞术的关于镰状RBC上血红素诱导的补体沉积的数据以及抗备解素和抗C5抗体处理的效果。左边是散点图，显示了iC3b在各种条件下的沉积，包括正常、血红素、血红素+抗备解素(ALXN1820)和血红素+抗C5。右侧是量化iC3b沉积的条形图。****P<0.0001；**P<0.01。
图9显示了基于流式细胞术的关于镰状RBC上血红素诱导的补体沉积的数据以及抗备解素(ALXN1820)和抗C5抗体处理的效果。左侧是散点图，显示了各种条件下的C5b9水平，包括正常、血红素、血红素+抗备解素和血红素+抗C5。右侧是量化C5b9水平沉积的条形图。**P<0.01。
图10显示了条形图，这些条形图显示暴露于血红素的内皮细胞上血红素诱导的补体片段沉积的基于流式细胞术的分析以及抗备解素(ALXN1820)和抗C5单克隆抗体对补体沉积的影响。图中显示了正常、血红素、血红素+抗备解素和血红素+抗C5预处理的补体片段水平(从左到右)的变化。左侧分图显示了C3/C3b/iC3b沉积，而右侧分图显示了C5b9沉积。ns＝不显著。****P<0.0001。
图11显示了在SCD的体内小鼠模型中研究VOC中补体激活的抑制作用的实验概要。Townes SS小鼠被分成五组，并且在血红素处理前十天用PBS(媒剂)、抗备解素单克隆抗体(14E1)或抗C5(BB5.1)单克隆抗体进行四次预防性处理。将动物暴露于50μmol/Kg的血红素中三小时，然后处死动物。在其中一个媒剂处理组中，动物未暴露于血红素，并且作为基线。安乐死后，从动物中收获血液样品和关键器官，以测量RBC上补体沉积水平、血管内溶血和血管闭塞的严重程度。
图12显示了条形图，这些条形图显示抗备解素(14E1)和抗C5(BB5.1)抗体对SCD动物中血红素诱导的血管内溶血的影响。图中显示了正常(对照)、血红素、血红素+14E1和血红素+BB5.1预处理下溶血标志物水平(从左到右)的变化。测量了以下溶血标志物：胆红素(最左侧)；乳酸脱氢酶(LDH)(中心)；和游离血红蛋白(最右侧)。****P<0.0001；***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05；ns：不显著。
图13显示了条形图，这些条形图显示14E1和BB5.1单克隆抗体对SCD动物中血红素诱导的血管内溶血的影响。图中显示了正常、血红素、血红素+14E1和血红素+BB5.1预处理的补体片段水平(从左到右)的变化。左侧分图显示了C3/C3b/iC3b沉积，而右侧分图显示了C5b9沉积。***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05；ns：不显著。
图14显示了血红素诱导的肺血管闭塞和14E1和BB5.1单克隆抗体处理的效果的数据。左边是各种条件下小鼠肺中镰状细胞(SS)RBC的代表性显微照片：正常(对照)、血红素、血红素+14E1和血红素+BB5.1预处理。右侧分图显示了使用标准软件量化图像荧光密度的条形图。****P<0.0001；***P<0.001。
图15显示了血红素诱导的肝血管闭塞和BB5.1单克隆抗体处理的效果的数据。左边是各种条件下小鼠肺中镰状细胞(SS)RBC的代表性显微照片：正常(对照)、血红素、血红素+14E1和血红素+BB5.1预处理。右侧分图显示了使用标准软件量化图像荧光密度的条形图。****P<0.0001；***P<0.001；*P<0.05。
具体实施方式
本披露部分基于以下发现，即补体蛋白例如补体C5和备解素在镰状细胞病(SCD)的发展和/或表现中的作用，该病是一种危及生命的疾病，患者的生活质量较差。
为了评估补体旁路途径中的近端和末端补体抑制，开发了体外测定法，以研究镰状细胞红细胞(SS-RBC)和内皮细胞系、HMEC-1上血红素诱导的沉积的补体阻断。用近端AP抑制剂预处理细胞可有效抑制调理作用和膜攻击复合物(MAC)在暴露于血红素的SS-RBC中和内皮培养物上的沉积。阻断C5可有效抑制MAC沉积，但不能抑制C3沉积。值得注意的是，立赞利珠单抗(抗P-选择素抗体)对补体沉积没有影响。
还开发了血栓炎症的全血模型，其中血红素和补体协同作用诱导单核细胞上的组织因子(TF)表达。实例中提供的数据表明补体抑制阻止了TF表达，而立赞利珠单抗则没有。
定义
在详细描述本披露之前，应当理解，本披露不限于特定的组合物或生物系统，这些当然可以改变。还应理解的是，本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而并不意图进行限制。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非内容另有明确指示，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“分子”任选地包括两个或多个此类分子的组合，诸如此类。
术语“和/或”包括一个或多个相关列出项目的任何和所有可能组合，以及在备选方案(“或”)中解释时组合的缺少。
应当理解，本文所述的本披露的方面和实施例包括“包含”、“由……组成”和“基本上由……组成”方面和实施例。
术语“约”是指该值的正负10％的范围，例如，“约5”是指4.5至5.5，除非本披露的上下文另有指示或与这种解释不一致。例如，在诸如“约49、约50、约55”之类的数值列表中，“约50”是指延伸到前一个和后一个数值之间的一个或多个间隔的一半以下的范围，例如，超过49.5到低于52.5。
术语“基本上”意味着足以达到预期目的。因此，术语“基本上”允许相对于绝对或完全状态、尺寸、测量值、结果等诸如此类如本领域普遍技术人员所预料的微小、不明显的变化，但不会明显影响整体性能(例如，+/-10％)。
在本披露提供数值范围的情况下，意图是该范围的上限和下限之间的每个中间值以及该所述范围内的任何其他所述值或中间值均包含在本披露中。例如，如果规定了1mM到8mM的范围，则意在明确披露2mM、3mM、4mM、5mM、6mM和7mM。
术语“受试者”可以是任何动物，例如，哺乳动物。受试者可以是例如人、非人灵长类动物(例如，猴、狒狒或黑猩猩)、马、母牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠或小鼠。包括例如，转基因动物或基因改变(例如，敲除或敲入)的动物。
如本文所用，“需要预防”、“需要治疗”或“有需要”的受试者是指根据适当的医务工作者(例如，就人而言，是医生、护士或护理工作者；在非人哺乳动物的情况下，则是兽医)的判断将从给定的治疗(例如用于治疗补体介导的疾病或障碍的特定治疗剂或预防剂或诊断剂)中合理获益的人。
如本文所用，术语“检测”是指通过样品中的一个或多个参数的测量值来确定与样品相关的一个值或一组值的过程，并且可以进一步包括将测试样品与参考样品进行比较。根据本披露，SCD的检测包括鉴定、测定、测量和/或定量一种或多种标志物。
本文使用的术语“样品”是指从目的受试者获得或衍生的组合物，其包含待表征和/或鉴定(例如基于物理、生物化学、化学和/或生理特征)的细胞和/或其他分子实体。优选地，样品是“生物样品”，其是指衍生自活体的样品，例如细胞、组织、器官、体外工程改造的器官等。在一些实施例中，组织样品的来源可以是血液或任何血液成分；体液；来自新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样品或活检或抽吸的实体组织；以及受试者妊娠或发育期间任何时间的细胞，或血浆。样品包括但不限于原代或2D和3D培养的细胞或细胞系、细胞上清液、细胞裂解物、血小板、血清、血浆和组织培养基，以及组织提取物例如均质组织和细胞提取物。样品还包括在获得后以任何方式进行操作的生物样品，例如通过用试剂处理(例如，Ca2+负载)。
本文所用的术语“标记”是指例如可直接或间接检测的化合物。该术语包括比色(例如，发光)标记、光散射标记或放射性标记。荧光标记尤其包括可商购的荧光素亚磷酰胺，例如FLUOREPRIMETM(PharmaciaTM)、FLUOREDITETM(MilliporeTM)和FAMTM(ABITM)(参见例如美国专利号6,287,778)。
如本文所用，术语“标志物”是指可以作为正常生物过程、致病过程或对治疗干预(例如，用SCD药物/药剂治疗)的药理学反应的指标而被客观测量的特征。标志物的代表性类型包括例如结构的分子变化(例如蛋白质如C3或C5中的氨基酸长度，例如由于蛋白水解)或标志物的数量，包括例如细胞中沉积的量，或多个差异，如目的标志物的水平和活性。术语“标志物”包括直接现象和间接现象。例如，其中分析物是C3，标志物可以是C3本身或C3的下游效应，例如末端补体途径蛋白如C5及其效应，例如C5切割和C5b9沉积。
本文所用的术语“生物现象”是指在疾病状态下可能受到干扰的任何过程，包括其中响应于测试化合物或实际药物的可测量的变化。
本文所用术语“筛选”是指评估细胞的基因型或表型或细胞产物的测定，包括但不限于蛋白质的量或结构或活性的变化(例如，切割的C3的水平，特别是切割的C3，更特别是C3的转化酶活性)。这些测定包括基于ELISA的测定、BIACORE测定、活性测定(例如，测量C3转化酶活性)等。
本文所用的术语“阳性”是指参数(例如标志物蛋白的表达或其活性)的鉴定，其比对照(例如在对照细胞(例如未处理的细胞)中表达相同的蛋白质或其活性)高至少5％(例如10％、20％、30％、50％、75％、100％、200％、300％、500％或更多，例如10倍、20倍或50倍)。
本文所用的术语“阴性”是指参数(例如蛋白的表达或其活性)的鉴定，其比对照(例如在对照细胞(例如未处理的细胞)中表达相同的蛋白质或其活性)低5％(例如4％、3％、2％、1％)。如本文所用，术语“治疗(“treat”或“treating”)”是指提供干预，例如，为受试者提供任何类型的医疗或外科管理。可以提供治疗以逆转、缓解、抑制障碍或病症的进展，预防或降低障碍或病症的可能性；或逆转、缓解、抑制或预防障碍或病症的一种或多种症状或表现(例如，病理生理学)的进展，预防或降低该障碍或病症的一种或多种症状或表现的可能性。“预防”是指使得在至少一些个体中至少在一段时间内不发生障碍或病症，或其症状或表现。治疗可以包括在出现指示补体介导的病症的一种或多种症状或表现后，向受试者施用补体抑制剂(例如，补体C5抑制剂)，例如以逆转、缓解、降低病症严重程度和/或抑制或预防病症进展和/或逆转、缓解、降低病症的一种或多种症状或表现的严重程度和/或抑制病症的一种或多种症状或表现。根据本文所述的方法，可以将补体抑制剂(例如，C3抑制剂、因子P抑制剂、因子D(FD)抑制剂或C5抑制剂)施用于已患补体介导的疾病的受试者或相对于普通人群成员而言患这种障碍的风险增加的受试者。这种抑制剂(例如，C3抑制剂、因子P抑制剂、因子D(FD)抑制剂或C5抑制剂)可以预防性施用，即在病症的任何症状或表现出现之前施用。典型地，在这种情况下，例如，当暴露于补体激活状况(例如，缺氧)时，该受试者将面临发展该病症的风险。
术语“症状”是指疾病、疾患、损伤或某些在体内不正常的指示。症状由经历症状的个体感觉到或注意到，但可能不容易被其他人(例如，非卫生保健专业人员)注意到。术语“体征”也指某些在体内不正常的指示，其可以被医生、护士或其他卫生保健专业人员看到。
当与药剂(例如，药物)联合使用时，术语“施用(“administration”或“administering”)”是指将该药剂直接递送到细胞或靶组织中或其上，或将该药剂提供给患者，从而影响它靶向的组织。
术语“接触”是指使药剂(例如，抗体、核酸分子、肽、小分子或适配体)和靶标(例如，C3、因子P、因子D或C5)彼此足够接近，以便一方对另一方施加生物效应(例如，抑制靶标)。在一些实施例中，术语接触意味着药剂与靶标的结合。
如本文所用，术语“抑制剂”或“拮抗剂”是指抑制另一种物质(例如，补体C3、因子P、因子D或C5)的表达、活性和/或水平的物质，诸如抗体、核酸、适配体和小分子。当两种物质对同一生理功能产生相反的影响时，就会发生功能或生理对抗。化学拮抗或灭活是两种物质之间中和它们的作用的反应，例如，抗体与抗原的结合，其防止抗原作用于其靶标。处置拮抗是指改变物质的处置(其吸收、生物转化、分布或排泄)，使得较少药剂到达靶标或它在那里的持久性被降低。术语“抑制”或“降低”或其语法变体是指靶标的特定水平或活性的降低或减弱，例如，靶标的水平或活性很少或基本上不可检测到(最多是微不足道的量)。这种类型的抑制剂的实例是抗体、干扰RNA分子，诸如siRNA、miRNA和shRNA。术语“补体途径抑制剂”是指阻遏补体途径的激活或响应的抑制剂。
术语“P-选择素的抑制剂”是指阻遏P-选择素(细胞粘附分子(CAM))与白细胞相互作用的能力的抑制剂。P-选择素的抑制剂可以是抗体，例如单克隆抗体(例如立赞利珠单抗)。
如本文所用，术语“内源性”描述了在特定生物体(例如，人)或生物体内特定位置(例如，器官、组织或细胞，诸如人细胞)中天然发现的分子(例如，代谢物、多肽、核酸或辅因子)。
如本文所用，术语“抗体”是指对抗原例如补体蛋白具有高结合亲和力的抗体或其功能部分或片段。该术语以最广泛的意义使用，包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab’)2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段，包括单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。该术语涵盖任何类别或亚类的天然的、基因工程改造的和/或以其他方式修饰的抗体，包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指对特定表位显示单一结合特异性和亲和力的抗体。因此，术语“人单克隆抗体”或“HuMab”是指显示单一结合特异性并且具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。
术语“单结构域抗体”，也称为结构域抗体、VHH、VNAR或sdAb，是一种由单个单体可变抗体结构域组成并且在常规Fab区中缺少轻链以及重链的CH结构域的抗体。sdAb可以从例如骆驼科(例如，单峰骆驼、骆驼、美洲驼和羊驼)重链抗体的VHH结构域和软骨鱼(例如，鲨鱼)重链抗体的VNAR结构域(称为免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR))产生。可替代地，sdAb可以通过将人或小鼠的正常IgG的二聚体可变结构域通过骆驼化几个关键残基而分裂成单体来产生。
术语“双特异性”是指本披露的能够结合两种抗原的融合蛋白。术语“多价融合蛋白”是指包含两个或更多个抗原结合位点的融合蛋白。
术语“小分子”是指分子量小于约2500amu、小于约2000amu、小于约1500amu、小于约1000amu或小于约750amu的有机分子。在一些实施例中，小分子包含一个或多个杂原子。
本文中使用的术语“适配体”是指连接到特定靶标的寡核苷酸(通常是RNA分子)。“适配体”可以指寡核苷酸适配体(例如，RNA适配体)。如本文所用，术语“适配体”是指基于其结合其他分子的能力从随机池中选择的DNA或RNA分子。已经选择了结合核酸、蛋白质、小有机化合物甚至整个生物体的适配体。适配体数据库保存在aptamer(dot)icmb(dot)utexas(dot)edu/的万维网上。
如本文所用，术语“补体C5”涵盖全长、未加工的补体C5，以及由细胞中的加工产生的任何形式的补体C5，以及补体C5的任何天然存在的变体(剪接变体或等位基因变体)。人补体C5具有NCBI基因ID NO 727。示例性野生型人补体C5核酸序列提供于NCBI RefSeq登录号NM_001317163.1和NM_001735.2中，并且相应的示例性野生型补体C5氨基酸序列提供于NCBI RefSeq登录号NP_001304092.1和NP_001726.2中。
如本文所用，术语“补体C3”涵盖全长、未加工的补体C3，以及由细胞中的加工产生的任何形式的补体C3，以及补体C3的任何天然存在的变体(剪接变体或等位基因变体)。人补体C5具有NCBI基因ID NO 718。
如本文所用，术语“人备解素”或“因子P”是指在血浆中发现的一种469个氨基酸的可溶性糖蛋白，其具有七个血小板应答蛋白I型重复序列(TSR)，N末端结构域TSR0是截短结构域。人备解素是一种53kDa的蛋白质，包括一个信号肽(氨基酸1-28)和六个不相同的TSR重复序列，每个TSR重复序列约60个氨基酸，如下所示：氨基酸80-134(TSR1)、氨基酸139-191(TSR2)、氨基酸196-255(TSR3)、氨基酸260-313(TSR4)、氨基酸318-377(TSR5)和氨基酸382-462(TSR6)。备解素是通过将棒状单体寡聚成环状二聚体、三聚体和四聚体而形成的。在GenBank数据库中，人备解素的氨基酸序列的登录号如下：对于人备解素，参见，例如，GenBank登录号AAA36489、NP—002612、AAH15756、AAP43692、S29126和CAA40914。备解素是旁路补体激活级联的正调节因子。备解素的已知结合配体包括C3b、C3bB和C3bBb(Blatt,A.等人,Immunol.Rev.[免疫学评论],274:172-90,2016)。
如本文所用，术语“小鼠备解素”是指血浆中发现的457个氨基酸的可溶性糖蛋白，其具有七个TSR，N末端结构域TSR0被截短。小鼠备解素是一种50kDa的蛋白质，包括一个信号肽(氨基酸1-24)和六个不相同的TSR，每个TSR约60个氨基酸，如下所示：氨基酸73-130(TSR1)、氨基酸132-187(TSR2)、氨基酸189-251(TSR3)、氨基酸253-309(TSR4)、氨基酸311-372(TSR5)和氨基酸374-457(TSR6)。小鼠备解素是通过棒状单体低聚成环状二聚体、三聚体和四聚体而形成的。例如，在GenBank数据库(GenBank登录号P11680和S05478)中发现小鼠备解素的氨基酸序列。
术语“P-选择素”是指1型跨膜蛋白，其在人中由SELP基因编码作为在激活的内皮细胞和激活的血小板表面的细胞粘附分子(CAM)，内皮细胞排列在血管内表面。P-选择素在炎症期间将白细胞(白血细胞)最初募集到损伤部位方面发挥着重要作用。
术语“红细胞”或“RBC”是指通过循环系统循环、负责携带氧的细胞。红细胞可能被诱导形成镰状细胞表型，包括通过Ca2+负载在细胞表面表达磷脂酰丝氨酸(PS)或磷脂酰乙醇胺(PE)。
如本文所用，术语“旁路补体途径”是指补体激活的三种途径之一(其他途径是经典途径和凝集素途径)。该旁路补体途径通常被细菌、寄生虫、病毒或真菌激活，尽管IgA Ab和某些IgL链也被报道激活了这一途径。
如本文所用，术语“旁路补体途径失调”是指旁路补体途径提供宿主对病原体的防御且清除免疫复合物和受损细胞以及进行免疫调节的能力的任何异常。旁路补体途径失调可发生在液相中以及细胞表面，并且可导致补体过度激活或调节不足，两者都会导致组织损伤。
术语“细胞”是指组织的基本组成部分，诸如人、猴、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、山羊、猪、狗、猫、雪貂、母牛、绵羊、马等的细胞。这些细胞可以是二倍体或单倍体(即，性细胞)。这些细胞也可以是多倍体、非整倍体或无核细胞。该细胞可以来自特定组织或器官，诸如血液、心脏、肺、肾、肝、骨髓、胰腺、皮肤、骨、静脉、动脉、角膜、血液、小肠、大肠、脑、脊髓、平滑肌、骨骼肌、卵巢、睾丸、子宫、脐带等。该细胞还可以是血小板、骨髓细胞、红细胞、淋巴细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、心肌、骨骼肌细胞、内分泌细胞、神经胶质细胞、神经元、分泌细胞、屏障功能细胞、收缩细胞、吸收细胞、粘膜细胞、角膜缘细胞、干细胞(全能、多能(pluripotent或multipotent))、未受精或受精卵母细胞、精子等。包括正常细胞和转化细胞。
术语“镰状细胞病”或“SCD”在本领域中具有其一般含义，并且指的是一种遗传性血液障碍，其中红细胞呈现异常、僵硬的镰刀状。红细胞镰变降低细胞的灵活性，并且导致各种危及生命的并发症的风险。术语包括镰状细胞贫血、血红蛋白SC病和镰状细胞β地中海贫血。
如本文所用的“β地中海贫血(“beta thalassemia”或“βthalassemia”)”是指一种由于血红蛋白β链合成减少或缺失而导致的遗传性血液障碍。这是β珠蛋白基因中或附近的一个或多个突变的结果。
术语“静脉内”通常意味着“在静脉内”，指的是通过脉管系统进入受试者的靶细胞或组织。在静脉内(IV)疗法中，将液体物质直接施用至静脉中。与其他施用途径相比，静脉内途径可能是全身递送药剂的最快途径。一些药物、输血和非肠道(例如，非消化性)营养物使用标准递送系统静脉内施用。
术语“血管闭塞”或“VOC”在本领域中具有其一般含义，例如，与SCD的常见并发症有关，该SCD导致毛细血管闭塞和流向器官的血流受限，从而导致缺血、血管功能障碍、组织坏死和/或器官损害。VOC通常是血管闭塞性危象的一个组成部分，但也可能更为有限，临床上无症状，并且不会导致血管闭塞性危机住院。如本文所用，术语“血管闭塞性危象”是指SCD的疼痛并发症，导致住院，与毛细血管闭塞和器官血流受限相关，导致缺血、严重疼痛、坏死和器官损害。
术语“急性胸腔综合征”是一种通常以发热、胸痛和胸片上出现新浸润为特征的病症。在SCD上下文中，术语“慢性肺病”通常表现为影像学间质异常、肺功能受损，最严重的表现为肺动脉高压。
术语“溶血性疾病”是指细胞裂解、细胞损害和炎症在疾病病理中起作用的任何障碍或疾病。溶血性疾病也是一种炎症性障碍或疾病，其中旁路途径(AP)激活导致细胞裂解、细胞损害和炎症。溶血性疾病包括以红细胞和/或血小板的病理性裂解为特征的疾病。无核细胞诸如红细胞和血小板受到充分裂解。红细胞的裂解会释放许多标志物，例如，血红素、血红蛋白、LDH、胆红素，其中一些标志物可能会产生血液和器官的病理结果。有核细胞诸如中性粒细胞、单核细胞、T淋巴细胞可以被MAC攻击，但不会完全裂解。术语“血管内溶血”是指无核细胞和有核细胞的裂解，这是由AP激活以及细胞表面上相关的C5b-9的产生和沉积引起的。术语“血管外溶血”是指C3b沉积导致的细胞裂解和通过补体受体清除。C3b通过激活经典途径和旁路途径产生。本披露涉及经由旁路补体途径产生的C3b。
如本文所用，术语“溶血性贫血”是指红细胞数(RBC)/mm或100mL血液中血红蛋白的量低于正常值的任何情况，例如，由于红细胞的破坏。如本文所用，术语“血小板减少症”是指血液中循环的血小板数量低于血小板正常范围的病症。
术语“补体沉积”是指导致补体组分(例如，C5b9和/或C3)沉积在靶细胞(例如，RBC或内皮细胞)上的活性或事件，以此方式触发血液中含有补体相关蛋白组的一系列级联(补体激活途径)。此外，补体激活产生的蛋白质片段可以诱导免疫细胞的迁移、吞噬和激活。相关的下游事件包括，例如，(a)靶细胞溶血，导致血细胞中血红素释放和/或贫血；或(b)C3调理作用，其可能导致吞噬作用和血管外溶血(EVH)；调理细胞与激活的内皮细胞的粘附；和/或中性粒细胞和血小板的激活。
在SCD上下文中，术语“触发”包括引发、传播或加剧疾病症状或病理(诸如血管闭塞性危象)的任何事件或现象。代表性的实例包括例如酸中毒、缺氧和脱水，所有这些都增强了SS血红蛋白的细胞内聚合(J.H.Jandl,Blood:Textbook of Hematology[血液：血液学教科书],第2版,利特尔&布朗出版社(Little,Brown and Company),波士顿,1996,第544-545页)。
如本文所用，术语“标志物”是指可以作为正常生物过程、致病过程或对治疗干预(例如，用补体抑制剂治疗)的药理学反应的指标而被客观测量的特征。标志物的代表性类型包括，例如标志物的结构(例如，序列或长度)或数量的分子变化，包含，例如标志物的水平、浓度、活性或特性的变化。
如本文所用，术语“对照”或“参考标准”是指测试样品的参考，如对照健康受试者或未经治疗的受试者，诸如此类。如本文所用，“参考样品”是指用于比较的可能患有或可能不患有疾病的组织或细胞的样品。因此，“参考”样品因此提供了一个基础，另一个样品(例如，来自SCD患者的血液)可以与之进行比较。相反，“测试样品”是指与参考样品相比较的样品。参考样品不必是无病的，诸如当参考样品和测试样品取自按时间分开的同一患者时。
术语“水平”可以指二元(例如，不存在/存在)、定性(例如，不存在/低/中/高)或表明特定分子种类的存在的定量信息(例如，与数量、频率或浓度成比例的值)。蛋白质或核酸(例如，mRNA)的“水平降低”或“水平增加”是指与参考相比蛋白质或核酸(例如，mRNA)水平的降低或增加(例如，与参考相比，降低或增加了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约150％、约200％、约300％、约400％、约500％或更多；降低或增加了超过约10％、约15％、约20％、约50％、约75％、约100％或约200％；降低或增加了低于约0.01倍、约0.02倍、约0.1倍、约0.3倍、约0.5倍、约0.8倍或更低；或增加了超过约1.2倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.8倍、约2.0倍、约3.0倍、约3.5倍、约4.5倍、约5.0倍、约10倍、约15倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约100倍、约1000倍或更多)。可以将样品中的蛋白质水平以相对于总蛋白质或核酸(例如，mRNA)的质量/体积(例如，g/dL、mg/mL、μg/mL、ng/mL)或百分比表示。
筛选中所用的术语“化合物”包括任何小分子或大分子化合物。术语“小分子”包括通常小于5KDa的化合物，例如有机化合物、肽、适配体等。术语“大分子”包括通常大于5KDa的化合物，例如蛋白质和抗体。化合物可包括已知具有所期望生物效应的药剂，例如减少SCD中的血管闭塞。
术语“药物组合物”是指呈使得其中含有的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对施用该配制品的受试者具有不可接受的毒性的其他组分的制剂。
术语“减弱”是指与参考相比，力、效果或值的减少(例如与参考相比减少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％，)。
病理学中的补体系统
补体系统与机体的其他免疫系统共同作用以抵御细胞病原体和病毒病原体的入侵。尽管功能正常的补体系统提供强大防御力来抵御微生物感染，但补体途径的不当调控或激活已牵涉到多种障碍的发病机制。
例如，1967年首次发表了第一份补体激活可能与SCD有关的报告(Francis和Womack.Am.J.Med.Technol.[美国医学技术杂志]1967；33(2):77-86)。从那时起，研究报告了SCD患者血液中补体衍生片段水平的增加，表明SCD中补体被激活，并且表明补体可能在该疾病的病理生理学中发挥重要作用。
已知SCD病理是由β珠蛋白基因的错义突变引起的，导致珠蛋白分子外表面的谷氨酸被缬氨酸取代。这种氨基酸取代使得镰状细胞血红蛋白(HbS)不易溶解，并且在脱氧时易于聚合。因此，携带聚合HbS的红细胞(例如，红细胞；RBC)不易变形，并且可能阻塞微血管。这种血管闭塞导致组织缺血和梗死，代表SCD患者发病和死亡的主要原因。SCD的临床表现远远超出纯合子珠蛋白突变。研讨会发现，镰状(SS)RBC与正常RBC不同，可以在体外粘附于受刺激的内皮细胞，并且SS-RBC的粘附与SCD的临床严重程度相关。随后的研究已经认识到血浆因子(诸如补体蛋白)在SS-RBC粘附到内皮中的重要性。在SCD的模型系统中，已经表明补体蛋白之一C5a在缺氧/再氧合诱导后被激活(例如，参见Vercellotti等人,Am.J.Hematol[美国血液学杂志],94:3(2019),327-338)，进一步表明补体蛋白可能直接参与该障碍的发病机制。然而，重要的是，补体系统在SCD发病机制或其模型中的直接因果作用尚未得到证实。
β珠蛋白基因的突变也会导致其他疾病，包括，例如，β地中海贫血(BT)。然而重型BT是由含有导致β珠蛋白产生完全缺失的突变的β珠蛋白基因的两个等位基因引起的，中间型BT是归因于β珠蛋白链产生的减少和/或突变β珠蛋白链的产生。BT是一种导致慢性贫血(例如，RBC缺乏)的疾病，这可能表明补体蛋白在遗传相关障碍BT的发病机制中发挥了额外的作用。
病理学中的补体系统
补体系统与机体的其他免疫系统共同作用以抵御细胞病原体和病毒病原体的入侵。尽管功能正常的补体系统提供强大防御力来抵御微生物感染，但补体途径的不当调控或激活已牵涉到多种病症的发病，包括例如，类风湿性关节炎(RA)；狼疮性肾炎；哮喘；缺血再灌注损伤；非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)；致密物沉积病(DDD)；阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)；黄斑变性(例如，年龄相关性黄斑变性(AMD))；溶血、肝酶升高和血小板减少(HELLP)综合征；格林-巴利综合征(GBS)；蛋白质丢失性肠病(例如CHAPLE综合征)；重症肌无力(MG)；视神经脊髓炎(NMO)；造血干细胞移植后血栓性微血管病(HSCT后TMA)；骨髓移植后TMA(BMT后TMA)；德戈斯病(Degos disease)；戈谢病(Gaucher’s disease)；肾小球肾炎；血栓性血小板减少性紫癜(TTP)；自发性流产；免疫沉积性血管炎；大疱性表皮松解；反复流产；多发性硬化症(MS)；创伤性脑损伤；以及心肌梗塞、心肺转流和血液透析引起的损伤(Holers,V.,Immunol.Rev.[免疫学综述],223:300-16,2008)。
例如，补体激活可能与镰状细胞病(SCD)有关的第一份报告首次发表于1967年，例如参见Francis和Womack.Am.J.Med.Technol.[美国医学技术杂志]1967；33(2):77-86。从那时起，研究报告了SCD患者血液中补体衍生片段水平的增加，表明SCD中补体被激活，并且表明补体可能在该疾病的病理生理学中发挥重要作用。
已知SCD病理是由β珠蛋白基因的错义突变引起的，导致珠蛋白分子外表面的谷氨酸被缬氨酸取代。这种氨基酸取代使得镰状细胞血红蛋白(HbS)不易溶解，并且在脱氧时易于聚合。因此，携带聚合HbS的红细胞(例如，红细胞；RBC)不易变形，并且可能阻塞微血管。这种血管闭塞导致组织缺血和梗死，代表SCD患者发病和死亡的主要原因。SCD的临床表现远远超出纯合子珠蛋白突变。研讨会发现，镰状(SS)RBC与正常RBC不同，可以在体外粘附于受刺激的内皮细胞，并且SS-RBC的粘附与SCD的临床严重程度相关。随后的研究已经认识到血浆因子(诸如补体蛋白)在SS-RBC粘附到内皮中的重要性。在SCD的模型系统中，已经表明补体蛋白之一C5a在缺氧/再氧合诱导后被激活(例如，参见Vercellotti等人,Am.J.Hematol[美国血液学杂志],94:3(2019),327-338)，进一步表明补体蛋白可能直接参与该障碍的发病机制。然而，重要的是，补体系统在SCD发病机制或其模型中的直接因果作用尚未得到证实。
β-珠蛋白基因突变也已知会导致其他病状，包括β地中海贫血(BT)。然而重型BT是由含有导致β珠蛋白产生完全缺失的突变的β珠蛋白基因的两个等位基因引起的，中间型BT是归因于β珠蛋白链产生的减少和/或突变β珠蛋白链的产生。BT是一种导致慢性贫血(例如，RBC缺乏)的疾病，这可能表明补体蛋白也可能在遗传相关障碍BT的发病机制中发挥了额外的作用。
补体蛋白
有至少25种补体蛋白，它们是血浆蛋白和膜辅因子的复杂集合。血浆蛋白约占脊椎动物血清中球蛋白的10％。补体组分通过一系列复杂但精确的酶促裂解和膜结合事件相互作用，以此实现其免疫防御功能。由此引起的补体级联使得具有调理、免疫调节和溶解功能的产物产生。
补体级联可以通过经典途径(CP)、凝集素途径或旁路途径(AP)进行。CP通常通过抗体识别和结合靶细胞上的抗原位点来引发。凝集素途径通常由甘露糖结合凝集素(MBL)与高甘露糖底物的结合引发。AP可以不依赖于抗体，并且由病原体表面上的某些分子引发。这些途径在C3转化酶处汇聚，在此处补体组分C3被活性蛋白酶切割以产生C3a和C3b。
补体组分C3的自发水解也可导致AP C3转化酶引发，补体组分C3在血液的血浆级分中含量丰富。这个过程称为“怠速运转(tickover)”，通过C3中硫酯键的自发切割形成C3i或C3(H20)。支持激活的C3结合和/或具有中性或正电荷特征的表面(例如，细菌细胞表面)的存在促进了怠速运转。C3(H20)的形成允许血浆蛋白因子B的结合，这反过来又允许因子D将因子B切割成Ba和Bb。Bb片段仍然与C3结合，形成含有C3(H20)Bb的复合物—“液相”或“引发”C3转化酶。虽然只产生少量，但液相C3转化酶可以将多种C3蛋白切割成C3a和C3b，并导致C3b的产生及其随后与表面(例如，细菌表面)的共价结合。与表面结合的C3b结合的因子B被因子D切割，从而形成含有C3b,Bb的与表面结合的AP C3转化酶复合物。
AP C5转化酶((C3b)2,Bb)在向AP C3转化酶添加第二C3b单体后形成。第二C3b分子的作用是结合C5并将其呈递以供Bb切割。AP C3和C5转化酶通过添加三聚体蛋白备解素而稳定化。然而，备解素结合并不是形成功能性旁路途径C3或C5转化酶所必需的。
CP C3转化酶是在补体组分C1(C1q、C1r和C1s的复合物)与结合靶抗原(例如，微生物抗原)的抗体相互作用后形成的。C1的C1q部分与抗体-抗原复合物的结合导致C1的构象变化，从而激活C1r。活性C1r然后切割与C1缔合的C1s，以产生活性丝氨酸蛋白酶。活性C1s将补体组分C4切割成C4b和C4a。与C3b一样，新生成的C4b片段包含高反应性硫醇，它很容易与目标表面(例如，微生物细胞表面)上的合适分子形成酰胺或酯键。C1s还将补体组分C2切割成C2b和C2a。由C4b和C2a形成的复合物是CP C3转化酶，它能够将C3加工成C3a和C3b。CPC5转化酶(C4b、C2a、C3b)是在将C3b单体添加到CP C3转化酶后形成的。
除了在C3和C5转化酶中的作用外，C3b还通过与存在于抗原呈递细胞(如巨噬细胞和树突细胞)表面的补体受体相互作用，发挥调理素的作用。C3b的调理功能通常被认为是补体系统最重要的抗感染功能之一。具有阻断C3b功能的遗传病变的患者容易受到多种病原生物体的感染，而在补体级联序列中的较后具有病变的患者，例如，具有阻断C5功能的病变的患者被发现仅更容易感染奈瑟菌，然后只是稍微更容易。
AP和CP C5转化酶将C5切割成C5a和C5b。C5的切割释放C5b，这允许形成切割末端补体复合物C5b-9。C5b与C6、C7和C8结合以在靶细胞表面形成C5b-8复合物。在结合几个C9分子后，形成膜攻击复合物(MAC，C5b-9，末端补体复合物(“TCC”))。当足够数量的MAC插入靶细胞膜时，它们产生的开口(MAC孔)介导靶细胞的快速渗透裂解。
C5的切割也会释放C5a，这已被证明是一种有效的过敏毒素和趋化因子。
补体途径抑制剂
结合并抑制补体途径组分的化合物可用于治疗SCD、BT或镰状细胞BT。所披露的测定可用于测试结合并抑制补体蛋白(例如，C3、因子P(备解素)、因子D或C5)并且可用于治疗SCD、BT或镰状细胞BT的化合物。
旁路补体途径抑制剂的测试化合物可以选自多种不同模式。测试化合物可以是抗体、核酸分子(例如，DNA分子或RNA分子，例如，mRNA或抑制性RNA分子(例如，短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA))或杂交DNA-RNA分子)、肽、小分子(例如，备解素小分子抑制剂)、信号级联抑制剂、信号级联激活剂或表观遗传修饰剂)或适配体。这些模式中的任何一种都可以是针对以下的补体抑制剂：补体蛋白的靶向(例如，抑制)功能；补体表达；补体结合；或补体信号传导。核酸分子或小分子可以包括修饰。例如，该修饰可以是化学修饰，例如，与标志物(例如，荧光标志物或放射性标志物)缀合。该修饰还可以包括与抗体缀合以将该药剂靶向特定细胞或组织。此外，该修饰可以是化学修饰、包装修饰(例如，包装在纳米颗粒或微粒内)或靶向修饰。
本文所述测定中使用的补体途径抑制剂包括ALXN1820，其是结合备解素和人血清白蛋白的双特异性融合分子；ALXN2050，又名vermincopan，是一种小分子因子D抑制剂；N19/8，其是抗C5抗体(参见，例如，Würzner等人Inhibition of terminal complementcomplex formation and cell lysis by monoclonal antibodies[单克隆抗体抑制末端补体复合物形成和细胞裂解],Complement Inflammation[补体炎症],8:328-3401991)；伊普可泮又名LNP023，是一种小分子因子B抑制剂。伊普可泮的CAS号为1644670-37-0，FDA药品号为8E05T07Z6W。
其他补体抑制剂包括化合物3和4，它们是口服因子D(FD)抑制剂，具有以下结构：
化合物3
化合物4
本文使用的对照是使用Crizanulumab(也称为它是抗P-选择素抗体，并且是FDA批准的用于预防SCD中VOC的产品)的公开序列制造的抗体。Crizanulumab的CAS号为1690318-25-2，FDA药品号为L7451S9126。
抗体8110是人抗C5重组抗体(克隆8110)。该抗体可商购(例如，意生物实验室(Creative Biolabs)编号HPAB-1796LY)。
实例
以下是本披露的方法的实例。应当理解，根据以上提供的一般描述，可以实施各种其他实施例。
在实例部分和其他地方，提供了可用于实施本披露的各种实施例的代表性抗体类型，例如，包含有关特定供应商和/或目录号的信息。应当理解，本披露不限于使用来自特定供应商/制造商的抗体检测试剂的示例性实施例。针对本披露的生物标志物/分析物的抗体可以从任何制造商获得，包括博奇公司(Biolegend)(圣地亚哥，加利福尼亚州)、南方生物技术公司(Southern Biotech)(伯明翰，亚拉巴马州)、美国生物公司(United StatesBiological)(USB；Salem,马萨诸塞州)、生命跨度生物公司(Lifespan Biosciences)(LSBIO；西雅图，华盛顿州)、艾博抗公司(Abcam)(剑桥，英国)，细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology)(丹弗斯，马萨诸塞州)，和西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(圣路易斯，密苏里州)。也可以使用常规技术产生抗体，例如，哺乳动物如小鼠或兔的免疫和/或杂交瘤技术。
实例1-3描述了使用模拟与SCD相关的疾病病理生理学机制的体外测定证明补体抑制功效的实验和结果。在这些实验中，进行了比较分析，包括抗备解素/抗人血清白蛋白双特异性VHH抗体(ALXN1820)、小分子因子D抑制剂(ALXN2050)和C5的单克隆抗体抑制剂(N19/8)。此外，这些抑制剂以具有立赞利珠单抗序列的抗体为基准，立赞利珠单抗是FDA最近批准的用于预防SCD中VOC的治疗药物。
实例1-3的测试品如表1所示。
表1：
*使用立赞利珠单抗序列制造的抗体用于本文所述的实验
实例1：补体诱导的C3和C5b-9沉积测定
血红素对SS-RBC上补体沉积的诱导及对ALXN1820阻断的评估
来自血红蛋白基因(SS)突变纯合子SCD患者的RBC和血清从BioIVT(分别为目录HUMANRBCALSUZN和HMRBC-SCA)和乐天生物科学(Sanguine Biosciences)(研究号24348)获得。明胶弗罗拿缓冲液(GVB)从Boston Bioproducts(目录IBB-300X)获得。Mg-EGTA(目录B106)、C8耗竭的正常人血清(目录A325)和正常人血清(目录NHS)从补体技术公司(Complement Technology)获得。PBS从康宁公司(Corning)(目录21-031-CV)获得。以不同浓度(50uM-800uM)使用猪血红素(西格玛目录51280)来扩大补体激活并且诱导人细胞上的沉积。
所有离心均在4℃下以440xg离心5分钟，并且用多通道移液管抽吸上清液，以避免扰乱松散的RBC团块。
用于在补体抑制测定中使用的血红素的适当浓度的鉴定
将患者SS-RBC在PBS中洗涤三次，重新悬浮在GVB、5mM Mg EGTA中，并且以2x 106个细胞/孔的浓度重新分配至无菌V底96孔板。添加自体血清至20％终浓度。以0μM、100μM、200μM、400μM和800μM使用血红素。在37℃ 5％ CO2下孵育20-30分钟后，加入含有10％EDTA的PBS(康宁公司，目录46-030-CI)以终止补体激活。洗涤RBC并且用iC3b抗体染色，如下所述。
对血红素诱导的SS-RBC上的补体沉积的AP阻断
将患者SS-RBC在PBS中洗涤两次或三次。为了诱导补体沉积，将RBC以5x 107个细胞/mL重新悬浮在GVB、5mM Mg EGTA(测定缓冲液)中，并将30μL添加到无菌V-96孔中。添加自体血清至20％终浓度。可替代地，添加正常人血清至20％终浓度(对于图8和图9中所示的数据)。将补体抑制剂以3.125μM的5X工作储备液在测定缓冲液中稀释，并将10μL添加到含有细胞的孔中。添加猪血红素至400μM，并且将细胞在37℃、5％ CO2下孵育20-30分钟。通过添加150μL/孔的含有10mM EDTA的PBS来终止补体激活。将细胞离心并且用200μL PBS洗涤一次，并且针对以下iC3b和C5b-9沉积进行染色。
对SS-RBC表面上的iC3b和C5b-9沉积的流式细胞术分析
将细胞重新悬浮在50μL/孔iC3b(Quidel，目录A209)或C5b-9抗体(Quidel，目录A239)中，在PBS中稀释至4μg/mL，并且在4℃下孵育20-30分钟(在某些情况下，在鞘液中进行流式细胞术染色)。用150μL-200μL PBS洗涤细胞两次，重新悬浮在50μL山羊抗小鼠IgG(H+L)-AF488(英杰公司(Invitrogen)目录A11029)中，在PBS中稀释至4μg/mL，并且在4℃下孵育20-30分钟。在一些实验中，以4μg/mL的浓度使用山羊抗小鼠IgG2b AF488(英杰公司，目录A21141)。用150μL-200μL PBS洗涤细胞两次，并且在LSR Fortessa上采集用于流式细胞术分析。
结果
为了确定血红素是否在诱导C3沉积中发挥作用并找到用于抑制测定的最佳浓度，SS-RBC与不同浓度的血红素(100-800μM)在含有MgEGTA的GVB中稀释的20％自体血清存在下孵育。如图3和表2所示，流式细胞术分析表明，血红素诱导SS-RBC的有效且剂量依赖性调理作用。如图3所示，在没有血清存在的情况下没有观察到染色，表明抗体与细胞的结合不是细胞损伤的结果，细胞损伤是流式细胞术实验中非特异性抗体染色的常见来源。在GVB/10mM EDTA中进行的类似实验没有导致SS-RBC的调理作用，证实染色是由于补体激活而不是测定条件的人为因素。在RBc和内皮细胞测定中选择进行的血红素浓度为200uM。
表2：
图2A和图2B显示了针对具有立赞利珠单抗序列的抗体在红细胞上血红素诱导的补体沉积中旁路途径抑制剂(包括ALXN1820、ALXN2050和N19/8)的基准化。图2A显示了对于蛋白C3而言血红素诱导的红细胞补体沉积。图2B显示了对于蛋白C5b-9而言血红素诱导的红细胞补体沉积。图2A及图2B显示了具有立赞利珠单抗序列的抗体对C3调理作用或C5b-9沉积几乎没有影响或没有影响。
如图2A、图2B和表3所示，与血红素和自体血清一起孵育的SS-RBC的流式细胞术分析表明C3的显著沉积和C5b-9的少量沉积。添加AP抑制剂ALXN1820和ALXN1850(分别为备解素和因子D抑制剂)将C3沉积减少了90％以上。正如预期的那样，C5抑制剂N19/8对C3沉积没有影响，因为C5位于补体级联中C3的下游。值得注意的是，如图2A及图2B所示，FDA最近批准用于治疗SCD患者的抗P-选择素抗体对C3沉积没有影响。虽然SS-RBC上的C5b-9沉积不如C3沉积稳健，但AP阻断使MAC降低了50％以上。正如所料，如图2A及图2B所示，C5抑制剂N19/8使MAC沉积阻断75％以上，而抗P-选择素抗体则没有效果
表3：
实验表明，近端补体阻断可抑制C3和膜攻击复合物(MAC)沉积，而C5抑制剂N19/8仅阻断MAC沉积。具有立赞利珠单抗序列的抗体(最近批准用于降低SCD患者中VOC发生率的抗P选择素抗体)对沉积没有影响。
在基本上如上所述进行的进一步实验中，如图8和图9所示，镰状细胞患者的红细胞上血红素触发显著水平的iC3b和C5b-9沉积。如通过学生t检验确定，注释了iC3b和C5b-9的显著性水平分别为P<0.0001和<0.01。在存在抗备解素的情况下，iC3b的SCD RBC上的血红素触发补体沉积被阻断了>95％，而C5b-9的被阻断了>85％(分别地，P<0.0001和<0.01)。C5抑制还导致SCD RBC上的iC3b和C5b-9沉积降低(两者都为P<0.01)。
实例2：AP抑制剂阻断HMEC-1细胞上的血红素诱导的补体沉积
内皮细胞系HMEC-1购自ATCC(CRL 3243)，并且在AcCellerate(目录CBA02，批号92-190318FG01)扩增和储备。这是真皮微血管内皮细胞系。细胞在传代<5时用于实验。
所有离心步骤在室温(RT)下在200-300g下进行5-7分钟。将HMEC-1细胞以1.5x105个细胞/孔接种到6孔板中的培养基(内皮细胞生长培养基MV2，Promocell公司，目录22022)中，并且使其达到汇合(72小时)。将正常人血清(补体技术公司，目录NHS)掺入1uM抑制剂，使用含有5mM-10mM MgEGTA的活细胞成像溶液(LCIS)(英杰公司，目录A1429DJ)稀释至20％，并且添加到HMEC-1培养基(以代替培养基)中。可替代地，使用不含MgEGTA的LCIS作为测试缓冲液(对于图10中所示的数据)。添加血红素至400μM，混合并且在37℃下孵育20-30分钟。用2mL PBS(康宁公司，目录21-031-CV)冲洗细胞两次，并且用含有10mM EDTA的PBS(康宁公司，目录46-034-CI)分离细胞。将细胞离心，将团块重新悬浮在400μL鞘液(BD生物科学，目录342003)中，并且转移至V底96孔板，一式两份。离心后，将团块重新悬浮在50μL/孔鞘液中，该鞘液中含有稀释至4μg/mL的iC3b或C5b-9抗体。几次洗涤后，将细胞与50μL山羊抗小鼠IgG(H+L)AF 488(在鞘液中稀释至4μg/mL)一起在4℃下孵育30分钟。几次洗涤后，在LSR Fortessa上采集细胞用于流式细胞术分析。
结果
图4A和图4B显示了针对具有立赞利珠单抗序列的抗体在内皮细胞上血红素诱导的补体沉积中旁路途径抑制剂(包括ALXN1820、ALXN2050和N19/8)的基准化。图4A显示了对于蛋白C3而言血红素诱导的内皮细胞补体沉积。图4B显示了对于蛋白C5b-9而言血红素诱导的内皮细胞补体沉积。图4A及图4B显示ALXN1820和ALXN2050阻断内皮细胞上血红素诱导的C3和C5b-9沉积。
如图4A、图4B和表4所示，用血红素和NHS孵育的HMEC-1细胞的流式细胞术分析表明C3和C5b-9均显著沉积。添加AP抑制剂ALXN1820和ALXN1850可使C3沉积减少90％以上。正如预期的那样，C5抑制剂N19/8对C3沉积没有影响。与用SS-RBC获得的实验结果类似，抗P-选择素抗体对内皮细胞上C3的沉积没有影响，如图4A及图4B所示。出乎意料的是，C5b-9沉积在HMEC-1细胞上比在SS-RBC上更加稳健。据报道，这可能是由于在Weibal Palade小体动员后补体的EC表面调节剂裂解所致(Frimat等人(Frimat,Marie,Fanny Tabarin,JordanD.Dimitrov,等人2013,Complement Activation by Heme as a Secondary Hit forAtypical Hemolytic Uremic Syndrome[血红素激活补体作为非典型溶血性尿毒症综合征的二次打击].Blood[血液]122(2):282–292))使它们更容易沉积。阻断近端(C3)和末端(C5)补体激活导致MAC沉积的90％以上抑制。值得注意的是，如图4A和图4B所示，抗P-选择素对TCC形成没有影响，表明立赞利珠单抗不会保护SCD内皮免受补体介导的激活或损伤。
表4：
图7A和图7B分别显示了用血红素处理的内皮细胞上的p-选择素上调和补体沉积的显微成像。图7A显示了镰状细胞病相关激动剂上调p-选择素。图7B显示了补体沉积是由血红素诱导的。
实验表明，近端补体阻断可抑制C3和膜攻击复合物(MAC)沉积，而C5抑制剂N19/8仅阻断MAC沉积。具有立赞利珠单抗序列的抗体(最近批准用于降低SCD患者中VOC发生率的抗P选择素抗体)对沉积没有影响。
图10显示了基本上如上所述进行的进一步实验的结果。图10的特征是条形图，这些条形图显示暴露于血红素的内皮细胞上血红素诱导的补体片段沉积的基于流式细胞术的分析以及抗备解素和抗C5抗体对补体沉积的影响。图中显示了正常、血红素、血红素+抗备解素和血红素+抗C5预处理的补体片段水平(从左到右)的变化。左侧分图显示了C3/C3b/iC3b沉积，而右侧分图显示了C5b9沉积。如图10所示，血红素有效地触发了HMEC-1细胞上iC3b和C5b-9的沉积(两者的P<0.0001)。
图10显示了在抗备解素抗体存在下，iC3b的HMEC-1上的沉积被阻断了>70％，而C5b-9的被阻断了>85％。虽然C5抑制有效地阻断MAC沉积(P<0.0001)，iC3b沉积不受影响。
实例3：AP抑制剂防止全血中人单核细胞上血红素诱导的组织因子表达的上调
根据机构审查委员会方案，人全血是从健康捐献者内部获得的。将血液抽入从血液技术公司(Haematologic Technologies)获得的定制水蛭素抽血管(目录号SCAT-296-5/5，500ATU/mL)。这种抗凝剂可以同时激活补体和凝血(通过但不超出凝血酶)。将血液等分到流式细胞仪管中(每管0.2mL)，并添加抑制剂至1μM。添加血红素至100μM，并将样品在37℃、5％ CO2下孵育4小时，大约每30分钟混合。为了进行流式细胞术染色，添加10μLTruStain FcX(博奇公司(Biolegend)，目录号422302)，在室温下孵育5-10分钟(以阻断IgG受体)。添加小鼠抗人CD14 PerCP Cy5.5(BD生物科学公司，目录号550787)(每个样品5μL)和小鼠抗人组织因子-PE(BD生物科学公司，目录号550312)(每个样品20μL)，然后将样品混合并在室温下孵育30分钟。为了裂解RBC，将3mL 1X裂解缓冲液(BD生物科学公司目录号555899)添加到每个管中，然后涡旋并在室温下孵育20分钟。将样品在340g下离心5分钟并用PBS洗涤两次。将细胞沉淀重悬于0.5mL PBS中，并在LSR Fortessa上采集以进行流式细胞术分析。通过CD14触发对单核细胞进行门控，数据表示为组织因子(TF)阳性的CD14单核细胞的百分比。
结果
血红素被认为是有效的DAMP(损伤相关分子模式)以及血栓性障碍(如aHUS(非典型溶血性尿毒症综合征))的二次打击。此外，多项报告表明C5a在血栓炎症中发挥作用(Ekdahl等人(Ekdahl,Kristina N.,Teramura,Yuji,Hamad,Osama A.,等人2016DangerousLiasons:Complement,Coagulation,and Kallikrein/Kinin Cross-talk as aLinchpinin the Events Leading to Thromboinflammation.[危险的联系：补体、凝血和激肽释放酶/激肽串扰是导致血栓炎症事件的关键]Immunological Reviews[免疫学综述]274:245-269)、Thomas等人(homas,Anub M.,等人2019Complement Component C5 and TLRMolecule CD14 Mediate Heme-Induced Thromboinflammation in Human Blood.[补体组分C5和TLR分子CD14介导血红素诱导的人血液血栓炎症]J.Immunol[免疫学杂志]203:1571-1578))。为了解决补体在血红素诱导的血栓炎症中的作用问题，利用抗凝剂水蛭素开发了全血模型，水蛭素可以激活补体和凝血酶。将健康捐献者的人血与血红素一起孵育，并分析单核细胞组织因子TF的表达。TF是外源性凝血级联的引发剂，与血栓形成和止血有关。血红素激活补体可诱导单核细胞中TF上调。下游凝血蛋白酶通过蛋白酶激活受体(PAR)放大血小板和炎症。图5A和图5B显示了针对具有立赞利珠单抗序列的抗体对于TF上调，补体抑制剂(包括ALXN1820、LNP023(伊普可泮)、C3肽抑制剂、N19/8、ALXN2050和小分子因子D(fD)抑制剂)的基准化。如图5A、图5B和表5所示，流式细胞术分析与血红素孵育的全血单核细胞上调TF的表达。样品与近端和末端补体途径的抑制剂一起孵育阻断TF上调。如图5A和图5B所示，与具有立赞利珠单抗序列的抗体一起孵育的样品对TF表达没有影响，表明补体疗法将更好地解决SCD中的血栓形成问题。除了具有立赞利珠单抗序列的抗体之外，所有测试的补体抑制剂都防止由血红素诱导的TF上调。
表5：
| 抑制剂 | 样品号 | Q2％母体TF+ |
| 无抑制剂 | 管_008 | 19.8 |
| ALXN1820 | 管_004 | 3.7 |
| ALXN2050 | 管_005 | 1.4 |
| N19/8 | 管_003 | 5.8 |
| 立赞利珠单抗 | 管_007 | 23.2 |
趋化因子IL-8是嗜中性粒细胞迁移和激活的介质。镰状细胞病患者的IL-8水平升高，并且与VOC相关。血红素触发单核细胞上TF表达(外源性凝血级联的引发剂)的诱导以及炎症细胞因子IL-8的加工。图6显示了当暴露于旁路途径抑制剂(包括ALXN1820和Ec(抗C5))并与具有立赞利珠单抗序列的抗体相比时，血栓炎症全血模型中的IL-8水平。图6显示了具有立赞利珠单抗序列的抗体对血栓炎症全血模型中的IL-8产生没有影响。ALXN1820抑制血栓炎症全血模型中IL-8的产生，而具有立赞利珠单抗序列的抗体则没有效果。
实例4.抑制补体激活在血红素引发的血管闭塞危象中的功效
这项研究使用了129/B6混合遗传背景的雄性Townes S/S小鼠(Wu等人2006)。在Townes S/S小鼠中，小鼠α和β珠蛋白基因座缺失，并且被人α和Aγβs珠蛋白替代。当携带两个拷贝的βS等位基因(hα/hα：：βS/βS)时，小鼠会发展为人镰状病表型，血液涂片中可见镰状红细胞(RBC)。繁殖对是从杰克逊实验室获得的。这些动物被安置在想象研究所(ImagineInstitute)的动物护理设施的常规条件下。
为了证明抑制补体激活在VOC中的功效，Townes SS小鼠被分成五组，并且在血红素处理前十天用PBS(媒介物)、抗备解素mAb或抗C5 mAb进行四次预防性处理(图11)。将这些动物暴露于50μmol/Kg血红素中三小时，然后处死动物(图12)。在其中一个媒介物处理组中，动物未暴露于血红素并且用作基线(图12)。安乐死后，从动物中收获血液样品和关键器官，以测量RBC上补体沉积水平、血管内溶血和血管闭塞的严重程度(图12)。使用内部涂有肝素/EDTA抗凝剂的毛细管通过眼球后出血对小鼠进行静脉切开术。通过颈椎脱位将小鼠安乐死，并且通过左心室灌注1mL盐水溶液。收集肺、肝、肾和脾并且称重。
使用氯化血红素测定试剂盒(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)参考MAK036)测定血浆血红素，通过偶联酶反应确定，得到与血浆中存在的氯化血红素成比例的比色(570nm)产物。将血浆用氯化血红素测定缓冲液1:4稀释至最终体积为50μL。按以下顺序制备反应混合物一式两份：3μL酶混合物、2μL氯化血红素底物、43μL氯化血红素测定缓冲液和2μL氯化血红素探针。血浆中存在的血红素蛋白可以产生背景信号，因此为了控制该变量，通过从反应混合物中省略酶来为每个样品制备空白。将反应混合物添加到96孔板中的样品中，使用水平振动器均匀化，并且在室温下避光孵育30分钟。通过稀释该试剂盒中提供的氯化血红素标准溶液，在96孔板中制备氯化血红素标准溶液。使用Infinite F200 Pro多模式读板仪(帝肯公司(Tecan))在570nm处以动力学模式测量吸光度。通过从每个样品读数中减去空白样品值来去除背景信号，以获得校正的测量值。通过将校正后的测量值绘制成标准曲线来确定该氯化血红素浓度。
通过包括总胆红素、血浆乳酸脱氢酶(LDH)活性和游离血红蛋白在内的多种测量来确定血管内溶血水平。SCD动物暴露于血红素触发血管内溶血，这通过用抗备解素或抗C5抗体预处理而有效防止(图12)。
基于Jendrassik-Grof方法，使用胆红素测定试剂盒(西格玛奥德里奇公司参考MAK126)测量血浆胆红素。该方法基于胆红素与重氮化氨基磺酸的反应，得到在530nm下测得的比色产物，与样品中存在的胆红素成比例。通过添加含有苯甲酸咖啡因的试剂C来测定总胆红素，苯甲酸咖啡因将胆红素从未缀合的胆红素蛋白复合物中分离出来。用PBS以1:2稀释血浆至最终体积为50μL。工作试剂按以下顺序制备：50μL试剂A、20μL试剂B和130μL试剂C。通过从反应混合物中省略试剂B和C(用盐水溶液代替)，为每个样品制备空白。将反应混合物添加到96孔板中的样品中，使用水平振动器均匀化，并且在室温下避光孵育10分钟。使用Infinite F200 Pro多模式读板仪(帝肯公司)在530nm处测量吸光度。通过从每个样品读数中减去空白样品值来去除背景，以获得校正的测量值。通过以下方程式确定胆红素浓度：[(样品-空白)/(校准品-水)]x 5mg/dL。
在K2 EDTA管(Melet Schloesing实验室)上采集全血。使用冷冻离心机以2,000xg离心15分钟，从血浆中去除细胞。该步骤也会耗尽血浆样品中的血小板。将血浆分成50μL等分试样，并且在-80℃下储存。
使用Pierce LDH细胞毒性测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司(ThermofisherScientific)参考88953)测量血浆LDH。通过在15mL锥形管中将0.6mL测定缓冲液与11.4mL基质混合物混合来制备反应混合物。用PBS以1:2稀释血浆至最终体积为50μL。将反应混合物添加到96孔板中的样品中，使用水平振动器均匀化，并且在室温下避光孵育30分钟。通过向每个样品中加入50μL终止溶液来终止反应。使用Infinite F200 Pro多模式读板仪(帝肯公司)在490nm和680nm处测量吸光度。LDH活性确定为[(LDH 490nm)-(LDH 680nm)]。
使用Drabkin试剂(西格玛奥德里奇公司参考D5941)测量血浆血红蛋白。该程序基于在碱性铁氰化钾存在下将血红蛋白及其衍生物(硫血红蛋白除外)氧化为高铁血红蛋白。高铁血红蛋白与氰化钾反应生成氰高铁血红蛋白，其最大吸收波长为540nm。在540nm处测量的颜色强度与总血红蛋白浓度成比例。将血浆转移至96孔板(每个样品20μL)。通过用1,000mL水和0.5mL 30％ Brij L23溶液(西格玛目录号B4184)复溶一小瓶Drabkin试剂来制备Drabkin’s溶液。将Drabkin’s溶液(180μL)添加到96孔板中的样品中，使用水平振动器均匀化，并且在室温下避光孵育15分钟。制备在Drabkin’s溶液中的血红蛋白校准曲线。使用Infinite F200 Pro多模式读板仪(帝肯公司)在540nm处测量吸光度。通过从每个样品读数中减去空白样品值来去除背景，以获得校正的测量值。通过将校正后的测量值绘制成校准曲线来确定血红蛋白浓度。
将血液(45μL)与5μL小鼠FcR阻断试剂(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)参考130-092-575)孵育一起10分钟，并且用50μL细胞染色缓冲液(百进生物科技公司(Biolegend)参考420201)1:2稀释。然后用针对Ter-119 Pacific Blue(百进生物科技公司参考116232；1/100稀释)、小鼠TfR1/CD71 PerCP/Cy5.5(百进生物科技公司参考113816；1/100稀释)、C5b9-FITC(圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnologies)参考sc-66190FITC；1/20稀释)或C3-FITC(塞德林公司(Cedarlane)参考CL7631F；1/50稀释)的抗体对样品进行染色。通过Live-Dead(电子生物科学公司(eBioscience))排除死亡细胞。
使用FlowJo软件(Tree Star)通过流式细胞术(Gallios Beckman Coulter)进一步分析细胞。基于流式细胞术的SS RBC分析揭示了暴露于血红素后SS RBC上C5b9和C3沉积的显著增加(图13)。用BB5.1(抗C5)或14E1(抗备解素)预处理几乎完全防止了C5b9在SSRBC上沉积的增加(图13)。由于C5b9染色代表潜在的膜攻击复合物(MAC)形成，预计防止C5b9沉积可降低补体介导的血管内溶血(图13)。接下来，在SS RBC上测量C3沉积。暴露于血红素后C3沉积的增加被14E1(抗备解素)显著降低，而抗C5没有降低C3调理作用的水平(图13)。
将石蜡包埋的肺、脾、肝或肾切片(5μm)在95℃下使用柠檬酸盐缓冲液处理20分钟，以进行脱亲和、再水合和抗原回收(百进生物科技公司参考928502)。用PAP笔界定样品，用高蛋白IHC/ICC阻断缓冲液(电子生物科学公司参考00-4952-54)阻断15分钟，然后与Ter-119(血管捕获RBC的标志物)的一级抗体一起孵育1小时，与alexa fluor-488(百进生物科技公司参考116215；1/100稀释)偶联。将载玻片用TBS吐温-20 0.05％彻底洗涤3X 10分钟，并且用DAPI(赛默飞世尔科技公司参考P36962)的prolong diamond防褪色封固剂封固。在EVOS M5000成像系统(赛默飞世尔科技公司)上以×200的放大率采集图像，并且使用ImageJ软件分析每个区域的正像素。通过阻塞包括肺和肝在内的重要器官中的血管的RBC(Ter-119)的免疫荧光(IF)染色来可视化和量化血管闭塞的强度(图14和图15)。SCD小鼠暴露于血红素显著增加了肺和肝中血管闭塞的强度。与PBS处理相比，用抗备解素(14E1)或抗C5(BB5.1)预处理以统计学显著的方式有效地降低了血管闭塞水平。BB5.1和14E1处理组之间没有观察到明显差异。
统计分析研究采用单因素方差分析(ANOVA)检验，然后进行图基检验(多重比较检验)或克鲁斯卡尔-沃利斯检验(非参数)，以分析与对照相比的处理效果。所有统计分析均使用GraphPad软件(v6.00，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)得出。鉴定了P<0.05水平的拒绝无效假设的统计显著性。为了说明的目的，还注释了显著性水平P<0.01和P<0.005。
其他实施例
应当理解，贯穿本说明书给出的每个最大数值限制都包括每个较低数值限制，就好像这种较低数值限制在本文中被明确地写出一样。贯穿本说明书给出的每个最小数值限制都将包括每个较高数值限制，就好像这些较高数值限制在本文中被明确写出一样。贯穿本说明书给出的每个数值范围都将包括落入这种更宽的数值范围内的每个较窄数值范围，就好像这些较窄数值范围在本文中被明确写出一样。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文描述了用于本披露的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的并不旨在是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目(例如，PUBMED、NCBI、FDA药物或UNIPROT登录号)和其他参考文献通过引用以其全文并入。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。
尽管已经说明和描述了本披露的特定实施例，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不背离本披露的精神和范围的情况下可以进行各种其他变化和修改。因此，旨在在所附权利要求中涵盖在本披露范围内的所有这些变化和修改。
Claims (74)
1.一种鉴定用于治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)或镰状细胞BT的测试化合物的方法，该方法包括，
将包含细胞的测试样品与血红素、血清和该测试化合物接触；以及
测量生物现象，这些生物现象包括
(1)该测试样品中的细胞上的补体因子的沉积；或者
(2)该补体因子沉积对靶效应细胞的一种或多种效应；
其中与参考标准中的这些生物现象相比，该测试样品中的这些生物现象的减弱表明该测试化合物有效治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)或镰状细胞BT。
2.如权利要求1所述的方法，其中该测试样品包含红细胞(RBC)、内皮细胞、或血细胞、或其组合。
3.如权利要求2所述的方法，其中这些血细胞是单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板。
4.如权利要求1所述的方法，其中测量RBC和/或内皮细胞上该补体因子的沉积。
5.如权利要求1所述的方法，其中这些靶效应细胞是内皮细胞或血细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其中这些血细胞是单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板。
7.如权利要求1所述的方法，其中该参考标准包含不含该测试化合物的对照样品中这些生物现象的信号的实验测量的或预定的水平。
8.如权利要求7所述的方法，其中这些生物现象的信号是内皮细胞群体中约或大于20％的基线C3阳性水平和/或基线C5b9阳性水平。
9.如权利要求8所述的方法，其中该内皮细胞群体中的该基线C3阳性水平和/或基线C5b9阳性水平大于30％。
10.如权利要求8所述的方法，其中该内皮细胞群体中的该基线C3阳性水平和/或基线C5b9阳性水平大于50％。
11.如权利要求7所述的方法，其中这些生物现象的信号是单核细胞中约或大于10％的基线组织因子(TF)阳性水平。
12.如权利要求11所述的方法，其中单核细胞中的该基线TF阳性水平大于15％。
13.如权利要求11所述的方法，其中单核细胞中的该基线TF阳性水平大于20％。
14.一种鉴定用于治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)或镰状细胞BT的测试化合物的方法，该方法包括，
(a)使包含细胞的第一样品与血红素和血清接触；
(b)使包含这些细胞的第二样品与该测试化合物、血红素和血清接触，并且
(c)测量生物现象，这些生物现象包括(1)所述第一和第二样品中的这些细胞上补体因子的沉积；或(2)所述第一和第二样品的细胞中的补体沉积对靶效应细胞的一种或多种效应；
其中与该第一样品中的(c)的这些生物现象相比，该第二样品中的(c)的这些生物现象的减弱表明该测试化合物有效治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)、或镰状细胞BT。
15.如权利要求14所述的方法，其中该第一样品包含红细胞(RBC)或内皮细胞、或其组合。
16.如权利要求15所述的方法，其中这些血细胞是单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板。
17.如权利要求14所述的方法，其中该第二样品包含RBC或内皮细胞、或其组合。
18.如权利要求17所述的方法，其中这些血细胞是单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板。
19.如权利要求14所述的方法，其中这些靶效应细胞是内皮细胞或血细胞、或其组合。
20.如权利要求19所述的方法，其中这些血细胞是单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板。
21.如权利要求14所述的方法，其中这些生物现象是内皮细胞群体中约或大于20％的基线C3阳性水平和/或基线C5b9阳性水平。
22.如权利要求21所述的方法，其中该内皮细胞群体中的该基线C3阳性水平和/或基线C5b9阳性水平大于30％。
23.如权利要求21所述的方法，其中该内皮细胞群体中的该基线C3阳性水平和/或基线C5b9阳性水平大于50％。
24.如权利要求14所述的方法，其中这些生物现象是单核细胞中约或大于10％的基线组织因子(TF)阳性水平。
25.如权利要求24所述的方法，其中单核细胞中的该基线TF阳性水平大于15％。
26.如权利要求24所述的方法，其中单核细胞中的该基线TF阳性水平大于20％。
27.一种鉴定用于治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)或镰状细胞BT的测试化合物的方法，该方法包括，
(a)使包含RBC的第一样品与血红素和血清接触；
(b)使包含这些RBC的第二样品与该测试化合物、血红素和血清接触，并且
(c)测量生物现象，这些生物现象包括(1)所述第一和第二样品中的这些RBC上补体因子的沉积；
其中与该第一样品中的(c)的这些生物现象相比，该第二样品中的(c)的这些生物现象的减弱表明该测试化合物有效治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)、或镰状细胞BT。
28.一种鉴定用于治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)或镰状细胞BT的测试化合物的方法，该方法包括，
(a)使包含内皮细胞(EC)的第一样品与血红素和血清接触足以诱导EC上补体沉积的时间；
(b)使包含这些EC的第二样品与该测试化合物、血红素和血清接触，并且
(c)测量生物现象，这些生物现象包括(1)所述第一和第二样品中的这些EC上补体因子的沉积；或(2)该第一和第二样品的这些EC中的补体沉积对包含EC的靶效应细胞的一种或多种效应；
其中与该第一样品中的(c)的这些生物现象相比，该第二样品中的(c)的这些生物现象的减弱表明该测试化合物有效治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)、或镰状细胞BT。
29.一种鉴定用于治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)或镰状细胞BT的测试化合物的方法，该方法包括，
(a)使包含血细胞例如单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板的第一样品与血红素和血清接触；
(b)使包含这些血细胞的第二样品与该测试化合物、血红素和血清接触，并且
(c)测量生物现象，这些生物现象包括所述第一和第二样品中的这些血细胞上补体因子的沉积对靶效应细胞的一种或多种效应，这些靶效应细胞包含血细胞；
其中与该第一样品中的(c)的这些生物现象相比，该第二样品中的(c)的这些生物现象的减弱表明该测试化合物有效治疗镰状细胞病(SCD)、β-地中海贫血(BT)、或镰状细胞BT。
30.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该测量步骤包括流式细胞术。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该补体因子包含补体因子C3或其片段，或补体因子C5b9。
32.如权利要求31所述的方法，其中该补体因子是补体因子C3。
33.如权利要求31所述的方法，其中该补体因子是补体因子C3的蛋白片段。
34.如权利要求33所述的方法，其中该补体因子C3的蛋白片段是iC3b。
35.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该血红素包含以200μM的浓度提供的游离血红素。
36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些RBC包含镰状细胞RBC(ssRBC)或被诱导形成ssRBC表型的RBC。
37.如权利要求36所述的方法，其中这些被诱导形成ssRBC表型的RBC包含磷脂酰丝氨酸(PS)或磷脂酰乙醇胺(PE)的细胞表面表达。
38.如权利要求36所述的方法，其中这些RBC包含从镰状细胞患者获得的ssRBC。
39.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该血清包含自体血清。
40.如权利要求39所述的方法，其中该血清来自镰状细胞患者。
41.如权利要求2、4、5、15、17、19或28中任一项所述的方法，其中这些内皮细胞包含真皮微血管内皮细胞。
42.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中补体沉积对靶效应细胞的一种或多种效应是通过效应细胞中的补体受体(CR)介导的。
43.如权利要求42所述的方法，其中该补体受体是单核细胞中的CR3。
44.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中补体沉积对靶效应细胞的一种或多种效应导致组织因子(TF)的上调。
45.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中该样品包含血液样品。
46.如权利要求45所述的方法，其中该血液样品是全血样品。
47.如权利要求45或46所述的方法，其中该血液样品包含抗凝剂。
48.如权利要求47所述的方法，其中该抗凝剂是水蛭素。
49.如权利要求14-34中任一项所述的方法，其中该第一和/或该第二样品包含血液样品。
50.如权利要求49所述的方法，其中该血液样品是全血样品。
51.如权利要求49或50所述的方法，其中该血液样品包含抗凝剂。
52.如权利要求51所述的方法，其中该抗凝剂是水蛭素。
53.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括使包含已经与血红素和血液接触的细胞的第三样品与补体旁路途径(CAP)的抑制剂接触。
54.如权利要求53所述的方法，其中这些细胞是红细胞(RBC)、内皮细胞(EC)或血细胞。
55.如权利要求54所述的方法，其中这些血细胞是单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板。
56.如权利要求53-55中任一项所述的方法，其中该CAP抑制剂包含C3抑制剂、因子P抑制剂、因子D(FD)抑制剂或C5抑制剂。
57.如权利要求56所述的方法，其中该CAP抑制剂包含C3肽抑制剂或口服因子D抑制剂。
58.如权利要求56所述的方法，其中该CAP抑制剂包含备解素抑制剂。
59.如权利要求58所述的方法，其中该备解素抑制剂是抗备解素抗体。
60.如权利要求59所述的方法，其中该抗备解素抗体是双特异性抗体。
61.如权利要求59或60所述的方法，其中该双特异性抗备解素抗体是微型抗体。
62.如权利要求56所述的方法，其中该CAP抑制剂包含C5抑制剂。
63.如权利要求62所述的方法，其中该C5抑制剂是抗C5抗体。
64.如权利要求63所述的方法，其中该抗C5抗体是特异性结合人C5的依库珠单抗、雷夫利珠单抗、抗体8110或抗体N19-8。
65.如权利要求64所述的方法，其中该抗C5抗体是双特异性抗体。
66.如权利要求63或65所述的方法，其中该双特异性抗C5抗体是微型抗体。
67.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括使包含已与血红素和血液接触的细胞的对照样品与P-选择素的抑制剂接触。
68.如权利要求67所述的方法，其中这些细胞是红细胞(RBC)、内皮细胞(EC)、或血细胞、或其组合。
69.如权利要求68所述的方法，其中这些血细胞是单核细胞、嗜中性粒细胞和/或血小板。
70.如权利要求67-69中任一项所述的方法，其中该P-选择素的抑制剂是结合P-选择素的抗体。
71.如权利要求70所述的方法，其中该抗体是单克隆抗体。
72.如权利要求70或71所述的方法，其中该抗体是立赞利珠单抗。
73.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该接触包括将血红素、血清和该测试化合物施用给测试动物。
74.如权利要求73所述的方法，其中该测试动物是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、仓鼠、绵羊、山羊、猴或灵长类动物。
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