ES2625470T3 - Reactivos y métodos para detectar glóbulos blancos asociados a HPN de tipo II y su identificación como factores de riesgo para trastornos trombóticos - Google Patents

Reactivos y métodos para detectar glóbulos blancos asociados a HPN de tipo II y su identificación como factores de riesgo para trastornos trombóticos Download PDF

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Abstract

Un método para predecir si un paciente aquejado de hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis, comprendiendo el método: la determinación del porcentaje de granulocitos de HPN de tipo II sobre los granulocitos totales en una muestra de sangre entera procedente de un paciente; y la predicción para saber si el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis, en el que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis si el porcentaje de granulocitos de HPN de tipo II es superior o igual a 1,2 %.

Description

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DESCRIPCION
Reactivos y metodos para detectar globulos blancos asociados a HPN de tipo II y su identificacion como factores de riesgo para trastornos tromboticos
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica la prioridad y el beneficio de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos n.° de serie 61/280.897, presentada el 9 de noviembre de 2009 y titulada "Reactivos y metodos para detectar celulas asociadas a HPN de tipo II".
Listado secuencial
La presente solicitud contiene un listado secuencial que se ha presentado a traves de la EFS-Web y se incorpora por la presente por referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 5 de noviembre de 2010, es designada ALXN150wO1.txt, y tiene un tamano de 26.000 bytes.
Campo tecnico
El campo de la invencion es la medicina, la inmunologfa, la biologfa molecular, y la qmmica proteica.
Antecedentes
La hemoglobinuria paroxfstica nocturna (HPN) es una enfermedad rara, debilitante que se caracteriza por, entre otras cosas, hematopoyesis anormal, hemolisis intravascular mediada por el complemento, y una propension a la trombosis. Veanse, por ejemplo, Rosse y Nishimura (2003) Int J Hematol 77(2): 121-124 y Brodsky (2008) Blood Rev 22(2):65-74. La HPN es causada por una mutacion somatica en el gen en el grupo de complementacion del glicano fosfatidilinositol de clase A (PIGA) ligado al cromosoma X, que codifica una enzima que es necesaria para la etapa inicial de la biosmtesis de un anclaje tipo glicosilfosfatidilinositol (GPI). Veanse Miyata et al. (1993) Science 259:1318-1320 y Bessler et al. (1994) EMBO J 13:110-117. Los anclajes GPI unen un numero de protemas a la superficie de las celulas hematopoyeticas. Estas llamadas protemas ancladas a GPI incluyen, entre otros, protemas reguladoras del complemento, tales como CD55 (DAF) y cD59. En funcion del tipo de mutacion que acontece al gen PIGA, puede producirse una perdida parcial o completa de la biosmtesis de un anclaje tipo GPI, que corresponde a una perdida parcial o completa en presencia de protemas ancladas a GPI (por ejemplo, CD55 y CD59 ancladas a GPI) en la superficie celular. Vease Rosse (1997) Medicine 76:63-93. La ausencia parcial o completa de las protemas reguladoras del complemento en la superficie de los globulos rojos (GRs) da lugar a una gran sensibilidad de estas celulas para la lisis mediada por el complemento y los smtomas asociados a HPN en los pacientes afectados. Veanse Nicholson-Weller et al. (1983) Proc Natl Acad Sci EE. UU. 80:5066-5070 y Yamashina et al. (1990) N Engl J Med 323:1184-1189.
Tradicionalmente, el diagnostico de HPN y la supervision de los pacientes con HPN conllevan el analisis de la expresion de CD55 y CD59 en la superficie de los GRs y los granulocitos utilizando citometna de flujo. Sutherland et al. (2009) Am J Clin Pathol 132:564-572. Los metodos de diagnostico desarrollados mas recientemente para HPN han empleado una forma no lttica, recombinante de la protema bacteriana aerolisina, que se une a los anclajes tipo GPI en la superficie de las celulas hematopoyeticas. Vease la patente de Estados Unidos n.° 6.593.095, otorgada a Buckley y Brodsky. Los metodos tanto tradicionales como nuevos han permitido a los profesionales sanitarios clasificar los GRs o los globulos blancos de pacientes con HPN en uno de los tres grupos: celulas de tipo I que tienen una expresion de las protemas ancladas a GPI en la superficie celular normal o casi normal; celulas de HPN de tipo III, que tienen una expresion de las protemas ancladas a GPI en la superficie celular inexistente o completamente ausente; y celulas de HPN de tipo II que tienen un nivel intermedio de la expresion de las protemas ancladas a GPI en la superficie celular. Brodsky et al. (2000) Am J Clin Pathol 114:459-466. La caracterizacion de las celulas de tipo II entre los linajes de globulos blancos no se ha realizado debido a la dificultad de distinguir estas celulas de los globulos blancos de tipo I normal.
Sumario
La divulgacion se basa, al menos en parte, en el descubrimiento por parte de los inventores en que los pacientes que tienen una poblacion de globulos blancos de HPN de tipo II de al menos 1,2 % o una poblacion de globulos rojos de HPN de tipo II de al menos 0,02 % son mas propensos a tener trombocitopenia en comparacion con los pacientes que no tienen poblaciones celulares de HPN de tipo II o que tienen poblaciones celulares de HPN de tipo II que son mas pequenas a 1,2 % o 0,02 % de globulos blancos y rojos, respectivamente. Los pacientes con trombocitopenia resultante de la destruccion de plaquetas son mucho mas propensos a desarrollar trombosis, y entre los pacientes con HPN, la trombosis es la principal causa de muerte. Por consiguiente, la presente invencion proporciona un metodo para predecir si un paciente aquejado de hemoglobinuria paroxfstica nocturna (HPN) corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis, el metodo comprende:
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la determinacion del porcentaje de granulocitos de HPN de tipo II sobre los granulocitos totales en una muestra de sangre entera procedente de un paciente; y
la prediccion para saber si el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis, en el que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis si el porcentaje de granulocitos de HPN de tipo II es superior o igual a 1,2 %.
Se describen metodos para determinar si un paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombocitopenia y/o trombosis basandose en la poblacion relativa de celulas de HPN de tipo II del paciente. Se vio facilitada la identificacion del nexo entre las celulas de HPN de tipo II y la trombocitopenia, en parte, por el desarrollo de metodos mejorados para detectar las celulas de HPN de tipo II.
Se describen reactivos y metodos utiles para la deteccion de celulas de HPN de tipo II (por ejemplo, globulos blancos de tipo II y/o globulos rojos de tipo II), por ejemplo, en muestras biologicas procedentes de pacientes. La divulgacion tambien describe metodos para diagnosticar y tratar a los pacientes basados en la presencia o cantidad de celulas de HPN de tipo II del paciente. Por ejemplo, la divulgacion presenta un metodo para determinar el riesgo de trombocitopenia en un paciente basado en el porcentaje de globulos blancos de HPN de tipo II detectados en una muestra biologica procedente de un paciente sospechoso de tener HPN. Los metodos de diagnostico descritos en la presente memoria tienen una serie de ventajas sobre los metodos de la tecnica anterior. Por ejemplo, los metodos descritos en la presente memoria pueden separar de forma mas efectiva globulos blancos de HPN de tipo II de las celulas de tipo I, lo que permite una medicion mas exacta y precisa del porcentaje de celulas de tipo II en una muestra biologica, asf como una evaluacion mas precisa del tamano total del clon de HPN, que comprende tanto las celulas de tipo II como de tipo III. Ademas, los metodos de diagnostico de HPN que dependen de la expresion de GPI en los GRs de tipo II pueden ser poco fiables debido a un alto recambio de globulos rojos (vida inherente mas corta de los GRs de HPN de tipo III debido a la elevada sensibilidad a la lisis mediada por el complemento) y las frecuentes transfusiones de GRs que reciben los pacientes con HPN. Por lo tanto, los metodos de diagnostico descritos en la presente memoria no solo permiten que un profesional sanitario habilitado cuantifique con exactitud y precision el porcentaje de globulos blancos de tipo II en una muestra biologica, y, por consecuencia, el tamano total anormal del clon en la muestra, sino que los metodos tambien son mas fiables que los metodos anteriores que se basaron en la deteccion de poblaciones relativamente inestables de GRs de HPN de tipo II.
La divulgacion presenta un metodo para predecir si un paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis. El metodo incluye determinar si un paciente corre un mayor riesgo de trombosis basado en el porcentaje de celulas de HPN de tipo II sobre el numero total de celulas del mismo tipo histologico (mismo linaje) en una muestra biologica procedente del paciente, que indica que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis.
La divulgacion presenta un metodo para predecir si un paciente tiene posibilidad de ser trombocitopenico. El metodo incluye determinar si un paciente tiene posibilidad de ser trombocitopenico basado en el porcentaje de celulas de HPN de tipo II (por ejemplo, globulos rojos de tipo II y/o globulos blancos de tipo II) sobre el numero total de celulas del mismo tipo histologico (mismo linaje) en una muestra biologica procedente del paciente, que indica que el paciente tiene posibilidad de ser trombocitopenico.
La divulgacion presenta un metodo para determinar si un paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis. El metodo incluye proporcionar (o recibir) informacion sobre el porcentaje de celulas de HPN de tipo II sobre las celulas totales del mismo tipo histologico (mismo linaje) en una muestra biologica procedente de un paciente; y determinar si un paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis, en el que el porcentaje de celulas de HPN de tipo II sobre el numero total de celulas del mismo tipo histologico en la muestra biologica indica que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis.
La divulgacion presenta un metodo para predecir si un paciente corre el riesgo de desarrollar trombosis, cuyo metodo incluye determinar el porcentaje de celulas de HPN de tipo II en una muestra biologica procedente de un paciente; y proporcionar una prediccion para saber si el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis, en el que el porcentaje de celulas de HPN de tipo II sobre el numero total de celulas del mismo tipo histologico en la muestra biologica indica que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis.
Las celulas de HPN de tipo II pueden ser globulos blancos (por ejemplo, granulocitos o monocitos). Alternativamente, las celulas de HPN de tipo II pueden ser globulos rojos.
En cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, la combinacion de un porcentaje de globulos blancos de HPN de tipo II que es superior o igual a 1,2 % y un porcentaje de globulos rojos de HPN de tipo II que es superior o igual a 0,02 % es predictivo de si el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis o es probable que sea trombocitopenico.
En cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, el paciente puede correr un mayor riesgo de desarrollar trombosis (y/o es probable que sea trombocitopenico) cuando el porcentaje de globulos blancos de HPN de tipo II sea de al menos 1,2 % (por ejemplo, al menos 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1.7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25,
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30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 65,3, o 70 o mas). En cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, el paciente puede correr un mayor riesgo de desarrollar trombosis (y/o es probable que sea trombocitopenico) cuando el porcentaje de globulos rojos de HPN de tipo II sea de al menos 0,02 % (por ejemplo, al menos 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 , 1.9, 2, 2,1,
2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 71,3, o 75 o mas).
En cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, una poblacion de globulos blancos de HPN de tipo II que esta comprendida entre 1,2% y 65%, inclusive de 1,2% y 65%, puede indicar que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis (y/o es probable que sea trombocitopenico). Una poblacion de globulos blancos de HPN de tipo II que es superior o igual al 5% puede indicar que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis (y/o es probable que sea trombocitopenico). Una poblacion de globulos blancos de HPN de tipo II que es superior o igual al 10 %, 20 %, o incluso 50 %, puede indicar que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis (y/o es probable que sea trombocitopenico).
Cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria puede incluir ademas la obtencion de la muestra biologica procedente del paciente. La muestra biologica puede ser, por ejemplo, una muestra de sangre entera.
La divulgacion presenta un metodo para predecir si un paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis (y/o es probable que sea trombocitopenico). El metodo incluye la determinacion del porcentaje de globulos blancos de tipo II sobre los globulos blancos totales del mismo tipo histologico en una muestra biologica procedente de un paciente; y la prediccion para saber si el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis, en el que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis (y/o es probable que sea trombocitopenico) si el porcentaje de globulos blancos de tipo II es superior o igual a 1,2 % (por ejemplo, superior o igual a 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 65,3, o 70 o mas).
La divulgacion presenta un metodo para predecir si un paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis (y/o es probable que sea trombocitopenico). El metodo incluye la determinacion del porcentaje de globulos rojos de tipo II sobre los globulos rojos totales del mismo tipo histologico en una muestra biologica procedente de un paciente; y la prediccion para saber si el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis (y/o es probable que sea trombocitopenico), en el que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis (y/o es probable que sea trombocitopenico) si el porcentaje de globulos rojos de tipo II es superior o igual a 0,02 % (por ejemplo, superior o igual a 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5,
1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 71,3, o 75 o mas).
La divulgacion presenta un metodo para seleccionar una terapia para un paciente, cuyo metodo incluye la seleccion de una terapia anti-trombotica o de una terapia anti-trombocitopenica o las dos para un paciente determinado por tener una poblacion de globulos blancos de HPN de tipo II superior o igual a 1,2 % (por ejemplo, superior o igual a
1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 65,3, o 70 o mas) y/o una poblacion de globulos rojos de HPN de tipo II superior o igual a 0,02 % (por ejemplo, superior o igual a 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 71,3, o 75 o mas).
De acuerdo con un aspecto de la invencion, se proporciona un metodo para seleccionar una terapia para un paciente aquejado de hemoglobinuria paroxfstica nocturna (HPN), el metodo comprende: (a) la determinacion del porcentaje de granulocitos de HPN de tipo II sobre los granulocitos totales en una muestra de sangre entera del paciente segun el metodo de la invencion y (b) la seleccion de una terapia anti-trombotica o de una terapia anti- trombocitopenica o las dos para un paciente determinado por tener un porcentaje de granulocitos de HPN de tipo II superior o igual a 1,2 %.
La divulgacion presenta un metodo para tratar un paciente. El metodo incluye administrar a un paciente en necesidad del mismo una terapia anti-trombotica o una terapia anti-trombocitopenica o las dos si el paciente es determinado por tener una poblacion de globulos blancos de HPN de tipo II superior o igual a 1,2% (por ejemplo, superior o igual a 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2.6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5,
3.6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 65,3, o 70 o mas) y/o una poblacion de globulos rojos de HPN de tipo II superior o igual a 0,02 % (por ejemplo, superior o igual a 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5,
1.6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 71,3, o 75 o mas).
En cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, la terapia anti-trombocitopenica puede ser, por ejemplo, una transfusion de plaquetas.
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La divulgacion presenta un metodo basado en ordenador para determinar si un paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis, cuyo metodo incluye la recepcion de datos que incluyen un perfil medico de un paciente con HPN, el perfil que comprende la informacion sobre el porcentaje de globulos blancos de HPN de tipo II sobre los globulos blancos totales del mismo tipo histologico (mismo linaje) en una muestra biologica procedente del paciente; y el procesamiento de al menos parte de los datos que contienen la informacion para determinar si el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis, en el que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis si el porcentaje de globulos blancos de tipo II es superior o igual a 1,2 % (por ejemplo, superior o igual a 1,3, 1,4, 1,5, 1,6,
I, 7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2,3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
II, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 65,3, o 70 o mas).
La divulgacion presenta un metodo basado en ordenador para determinar si un paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis, cuyo metodo incluye la recepcion de datos que incluyen un perfil medico de un paciente con HPN, el perfil que comprende la informacion sobre el porcentaje de globulos rojos de HPN de tipo II sobre los globulos rojos totales del mismo tipo histologico (mismo linaje) en una muestra biologica procedente del paciente; y el procesamiento de al menos parte de los datos que contienen la informacion para determinar si el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis, en el que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis si el porcentaje de globulos rojos de tipo II es superior o igual a 0,02 % (por ejemplo, superior o igual a 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50,55, 60, 65, 70, 71, 71,3, o 75 o mas).
La divulgacion presenta un metodo basado en ordenador para determinar si un paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis, cuyo metodo incluye proporcionar informacion sobre el porcentaje de globulos blancos de HPN de tipo II sobre los globulos blancos totales del mismo tipo histologico (mismo linaje) en una muestra biologica procedente del paciente; introducir la informacion en un ordenador; y calcular un parametro que indica si el paciente corre un mayor riesgo de trombosis utilizando el ordenador y la informacion de entrada, en el que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis si el porcentaje de globulos blancos de tipo II es superior o igual a 1,2 % (por ejemplo, superior o igual a 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2,
3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 65,3, o 70 o mas).
La divulgacion presenta un metodo basado en ordenador para determinar si un paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis, cuyo metodo incluye proporcionar informacion sobre el porcentaje de globulos blancos de HPN de tipo II sobre los globulos blancos totales del mismo tipo histologico (mismo linaje) en una muestra biologica procedente del paciente; introducir la informacion en un ordenador; y calcular un parametro que indica si el paciente corre un mayor riesgo de trombosis utilizando el ordenador y la informacion de entrada, en el que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis si el porcentaje de globulos blancos de tipo II es superior o igual a 0,02 % (por ejemplo, superior o igual a 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 71,3, o 75 o mas).
Cualquiera de los metodos basados en ordenador descritos en la presente memoria puede incluir ademas el almacenamiento del parametro en un medio legible por ordenador y/o la salida del parametro.
En algunas realizaciones, cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria puede incluir la etapa de supervision del paciente con respecto al desarrollo de al menos un smtoma de trombosis si el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis. Cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria puede incluir la administracion al paciente de una terapia anti-trombotica si el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis. La terapia anti-trombotica puede ser, por ejemplo, un anticoagulante o un agente trombolttico. El anticoagulante puede ser, por ejemplo, coumadina, heparina o derivados de los mismos. El agente trombolttico puede ser, por ejemplo, un activador del plasminogeno tisular, estreptoquinasa, o un activador del plasminogeno de tipo uroquinasa.
En cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, una forma de variante no lttica de protema aerolisina se puede utilizar para determinar el porcentaje de globulos blancos de HPN de tipo II en la muestra biologica.
Cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria puede incluir el registro del porcentaje determinado de las celulas de HPN de tipo II en la muestra biologica.
Cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria puede incluir el registro de la prediccion para saber si el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis o si el paciente no corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis. El registro puede realizarse en un medio legible por ordenador. El registro tambien puede estar, por ejemplo, en un medio tangible (por ejemplo, archivo ffsico o grafica de un paciente).
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La divulgacion presenta un metodo para clasificar globulos blancos. El metodo pone en contacto una pluralidad de globulos blancos con un reactivo que se une a: (i) GPI o (ii) una protema anclada a GPI; y clasifica uno o mas de los globulos blancos como celulas de HPN de tipo II basandose en la cantidad de reactivo unido a las celulas.
La divulgacion presenta un metodo para clasificar globulos blancos, cuyo metodo incluye poner en contacto una pluralidad de globulos blancos con un reactivo que se une a: (i) GPI o (ii) una protema anclada a GPI; interrogar al menos una parte de los globulos blancos en contacto con el reactivo basandose en la cantidad de reactivo unido a las celulas; y clasificar una o mas de las celulas interrogadas como celulas de HPN de tipo II.
La divulgacion presenta un metodo para distinguir entre diferentes poblaciones de globulos blancos. El metodo incluye poner en contacto una pluralidad de globulos blancos con un reactivo que se une a: (i) GPI o (ii) una protema anclada a GPI; y distinguir al menos una parte de los globulos blancos de otros globulos blancos de la pluralidad basandose en la cantidad de reactivo unido a las celulas, en el que los globulos blancos de HPN de tipo II, si estan presentes, se distinguen lo suficiente de los globulos blancos de tipo I y de las celulas de HPN de tipo III del mismo tipo histologico (mismo linaje) para permitir que el porcentaje de los globulos blancos de HPN de tipo II sobre los globulos blancos totales del mismo tipo histologico en la pluralidad se determine. El metodo tambien puede incluir la determinacion del porcentaje de globulos blancos de HPN de tipo II.
La divulgacion presenta un metodo para determinar el porcentaje de globulos blancos de HPN de tipo II en una muestra, cuyo metodo incluye interrogar una pluralidad de globulos blancos en contacto con un reactivo basandose en la cantidad de reactivo unido a las celulas, en el que el reactivo se une a: (i) GPI o (ii) una protema anclada a GPI, en el que la interrogacion distingue suficientemente los globulos blancos de HPN de tipo II, si estan presentes, de los globulos blancos de tipo I y las celulas de HPN de tipo III del mismo tipo histologico para permitir que el porcentaje de los globulos blancos de HPN de tipo II sobre los globulos blancos totales del mismo tipo histologico en la pluralidad se determine; y determinar el porcentaje de globulos blancos de HPN de tipo II.
En cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, la pluralidad de globulos blancos puede ponerse en contacto con un reactivo que se une a GPI y un reactivo que se une a una protema ligada a GPI.
En cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, la distincion o interrogacion de los globulos blancos (y/o la determinacion del porcentaje de globulos blancos de HPN de tipo II) incluye una citometna de flujo.
En cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, la pluralidad de globulos blancos a interrogar se puede obtener de un paciente que tiene, que se sospecha que tiene, o que corre el riesgo de desarrollar HPN. El paciente puede ser uno para el que un porcentaje de globulos rojos de HPN de tipo II se ha determinado previamente, pero era sospechoso y/o no concluyente.
Cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria puede incluir ademas el registro del porcentaje de globulos blancos de HPN de tipo II. El registro puede realizarse en un medio legible por ordenador o en un medio tangible (por ejemplo, una grafica o registro del paciente).
En algunas realizaciones de cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, el reactivo puede unirse a una fraccion de GPI humano. El reactivo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno del mismo, o una protema aerolisina. La protema aerolisina puede ser, por ejemplo, una forma de variante de protema aerolisina que es no lttica o es sustancialmente no lftica en comparacion con la forma de tipo natural de la protema. La protema aerolisina no lftica o sustancialmente no lftica puede comprender la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 2 o 7, en el que la treonina en la posicion 253 esta sustituida con una cistema y la alanina en la posicion 300 esta sustituida con una cistema.
En algunas realizaciones de cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, el reactivo puede unirse a una protema anclada a GPI. Por ejemplo, el reactivo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno del mismo que se une a una protema anclada a GPI. La protema anclada a GPI puede ser, por ejemplo, fosfatasa alcalina, 5' nucleotidasa acetilcolinesterasa, dipeptidasa, LFA-3, NCAM, PH-20, CD55, CD59, Thy-1, Qa-2, CD14, CD33, CD16 (el receptor Fcy III), antfgeno carcinoembrionario (ACE), CD24, CD66b, CD87, CD48, CD52, o cualquier otra protema anclada a gPi que se conoce en la tecnica y/o se expone en la presente memoria.
Un paciente determinado por tener una poblacion de globulos blancos de HPN de tipo II superior o igual a 1,2 % o una poblacion de globulos rojos de HPN de tipo II superior o igual a 0,02 % puede ser diagnosticado de HPN.
Un paciente diagnosticado de HPN o un paciente diagnosticado previamente de HPN que esta determinado por tener una poblacion de globulos blancos de HPN de tipo II superior o igual a 1,2 % o una poblacion de globulos rojos de HPN de tipo II que es superior o igual a 0,02 % puede ser prescrito y/o tratado con un inhibidor del complemento, tal como, pero no limitado a, eculizumab.
La divulgacion presenta un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno del mismo que se une a una fraccion de GPI humano. El anticuerpo o fragmento de union al antfgeno del mismo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo
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recombinante, un diacuerpo, un anticuerpo quimerizado o quimerico, un anticuerpo humano no inmunizado, un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento Fv, un fragmento Fd, un fragmento Fab, un fragmento Fab', y un fragmento F(ab')2.
Salvo que se haya definido lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado entendido comunmente por un experto en la materia a la que pertenece esta divulgacion. En caso de conflicto, el presente documento, incluyendo las definiciones, prevalecera. Los metodos y materiales preferentes se describen en lo sucesivo, aunque los metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria tambien se pueden utilizar en la practica o ensayo de los metodos y composiciones divulgados actualmente.
Otras caractensticas y ventajas de la presente divulgacion, por ejemplo, los metodos para determinar el riesgo de desarrollar trombocitopenia o trombosis en un sujeto, resultaran evidentes a partir de la siguiente descripcion, los ejemplos, y a partir de las reivindicaciones.
Breve descripcion de los dibujos
La Fig. 1 es un grafico de puntos de dos colores que representa una poblacion de granulocitos de sangre periferica humana que se incubaron con una solucion que contema tanto una variante no lttica de aerolisina conjugada con Alexa Fluor® 488 como un anticuerpo que se une a CD24 conjugado con ficoeritrina (FE). La aerolisina no lttica se une espedficamente al anclaje de tipo GPI, y por lo tanto, las celulas que expresan cualquiera de las protemas ancladas a GPI se marcan con esta protema fluorescente. CD24 es una protema ligada a GPI expresada en los granulocitos, por lo que las celulas que expresan CD24 se uniran por tanto al anticuerpo anti-CD24 como a la aerolisina no lttica. El eje X representa la intensidad log de la senal detectable producida a partir del conjugado de aerolisina unido a las celulas y el eje Y representa la intensidad log de la senal detectable producida a partir del conjugado de anticuerpo anti-CD24 unido a las celulas. Se revelan tres poblaciones de granulocitos por este analisis: celulas de tipo III, que carecen de las protemas ligadas a GPI y por consiguiente aparecen sin marcar con el anticuerpo anti-CD24 y con la aerolisina no lttica; granulocitos de tipo I, que expresan altos niveles de protemas ligadas a GPI en relacion con las celulas deficientes de anclajes de tipo GPI; y granulocitos de tipo II, que expresan niveles intermedios de protemas ligadas a GPI y por consiguiente se marcan tanto con anti-CD24 y aerolisina no lttica en niveles inferiores a los apreciados en los granulocitos (tipo I) normales.
La Fig. 2 es un diagrama de dispersion que representa el recuento de plaquetas absoluto frente al porcentaje de granulocitos de HPN de tipo II en la sangre de pacientes con HPN. El eje Y representa el recuento de plaquetas en 1 |jl de sangre del paciente (x 10"3) y el eje X representa el porcentaje de granulocitos de HPN de tipo II en la poblacion total de granulocitos. La mitad izquierda del grafico es una distribucion de los recuentos de plaquetas observados entre los pacientes con HPN (N=141) que no tienen poblaciones de granulocitos de HPN de tipo II detectables. La mitad derecha del grafico es una distribucion de los recuentos de plaquetas observados entre pacientes con HPN (N=19) que tienen poblaciones de granulocitos de HPN de tipo II detectables.
Descripcion detallada
La presente divulgacion presenta una variedad de aplicaciones de diagnostico y terapeuticas que son utiles para, entre otras cosas, determinar si un paciente tiene una poblacion celular de HPN de tipo II y/o corre un mayor riesgo de desarrollar trombocitopenia y/o trombosis. La divulgacion tambien presenta reactivos que se pueden utilizar en los metodos. Mientras que no pretende de manera alguna ser limitante, los reactivos a modo de ejemplo, conjugados y metodos para el uso de cualquiera de los anteriores se elaboran a continuacion y se ejemplifican en los Ejemplos practicos.
Reactivos
La divulgacion presenta un numero de reactivos que son utiles en los metodos de diagnostico y terapeuticos descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, el reactivo se une a una fraccion de glicosilfosfatidilinositol (GPI), que ancla numerosas protemas de la superficie celular a la membrana celular. Las fracciones de GPI contienen generalmente un nucleo de etanolamina-HPO4-6Mana1-2Mana1-6Mana1-4GlcNH2l- 6myo-inositol-1HPO4-diacil-glicerol (o alquilacilglicerol o ceramida). Vease, por ejemplo, Paulick y Bertozzi (2008) Biochemistry 47(27):6991-7000. Sin embargo, se ha notificado una serie de variaciones sobre esta estructura central. Por ejemplo, el nucleo de glicano puede ser modificado con cadenas laterales, tales como, pero no se limitan a, fosfoetanolamina, manosa, galactosa, acido sialico, u otros azucares. Id.
En algunas realizaciones, el reactivo puede ser una protema aerolisina, por ejemplo, una protema aerolisina no lftica. La aerolisina es una protema citolftica de formacion de canales que es expresada por las especies virulentas de Aeromonas, tales como, pero no se limita a, Aeromonas hydrophila y Aeromonas salmonicida. La aerolisina se secreta de la celula bacteriana como un precursor de 52 kDa que se convierte en la forma activa (activada) por eliminacion proteolftica de un peptido C-terminal. El precursor de aerolisina puede ser activado por proteasas del
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huesped, asf como las proteasas secretadas por una bacteria que expresa aerolisina. Una vez unida a una celula, la aerolisina se oligomeriza para producir canales, y en ultima instancia lisar, la celula (Howard y Buckley (1985) J Bacteriol 163:336-340).
Las secuencias de aminoacidos del polipeptido de aerolisina producido por cada uno de los varios miembros de la familia Aeromonas estan altamente conservadas. En consecuencia, un polipeptido de aerolisina, como se utiliza en la presente memoria, puede proceder de cualquier especie de Aeromonas, tal como, pero no se limita a, A. hydrophila, A. caviae, A. veronii (biotipo sobria), A veronii (biotipo veronii), A. jandaei, A. salmonicida y A. schubertii.
El polipeptido de aerolisina puede proceder de A. hydrophila o A. salmonicida. El polipeptido de aerolisina puede ser una proforma que contiene un peptido senal de 24 aminoacidos. La proforma del polipeptido de aerolisina puede tener, o consistir en, un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 6.
En algunas realizaciones, el polipeptido de aerolisina es una forma de la protema en la que la secuencia de senal se ha eliminado. Por ejemplo, el polipeptido de aerolisina puede tener, o consistir en, un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 7.
El polipeptido de aerolisina puede ser una forma activa de la protema. Por ejemplo, el polipeptido de aerolisina puede tener, o consistir en, un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NO: 3.
Como se utiliza en la presente memoria, "polipeptido", "peptido" y "protema" se utilizan indistintamente y significan cualquier cadena de aminoacidos ligada al peptido, independientemente de la longitud o modificacion post- traduccional. Los polipeptidos de aerolisina descritos en la presente memoria pueden contener o ser protemas de tipo natural o pueden ser variantes de los polipeptidos de tipo natural que tienen no mas de 50 (por ejemplo, no mas de una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, o 50) sustituciones aminoacidas conservadoras. Las sustituciones conservadoras incluyen normalmente sustituciones en los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina, y leucina; acido aspartico y acido glutamico; asparagina, glutamina, serina y treonina; lisina, histidina y arginina; y fenilalanina y tirosina.
Los polipeptidos de aerolisina descritos en la presente memoria tambien incluyen "fragmentos de union a GPI" de los polipeptidos, que son mas cortos que los polipeptidos en proforma de longitud completa, pero retienen al menos el 10 % (por ejemplo, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, o 100 % o mas) de la capacidad del polipeptido activo para unirse a una fraccion de GPI. Los fragmentos de union a GPI de un polipeptido de aerolisina incluyen variantes terminales, asf como variantes de delecion interna de la protema. Las variantes de delecion pueden carecer de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 segmentos de aminoacidos (de dos o mas aminoacidos) o aminoacidos individuales no contiguos. Los fragmentos de union a GPI pueden ser de al menos 40 (por ejemplo, al menos 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65,
70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, o 325 o mas) residuos de aminoacidos de longitud (por ejemplo, al menos 40 residuos de aminoacidos contiguos de la SEQ ID Nos: 1-3).
El fragmento de union a GPI de un polipeptido de aerolisina puede ser inferior a 400 (por ejemplo, inferior a 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 60, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, o 40) residuos de aminoacidos de longitud (por ejemplo, menos de 400 residuos de aminoacidos contiguos de la SEQ ID NOs: 1-3). El fragmento de union a GPI de un polipeptido de aerolisina puede ser de al menos 40, pero menos de 400 residuos de aminoacidos de longitud.
El fragmento de union a GPI de un polipeptido de aerolisina puede incluir, o consistir en, un polipeptido que tiene la siguiente secuencia de aminoacidos: L D P D S F K H G D V T Q S D R Q L V K T V V G W A V N D S D T P Q S G
Y D V T L R Y D T A T N W S K T N T Y G L S E K V T T KN K F K W P L V G E T E L S I E I A A N Q S W A S Q N
G G S T T T S L S Q S V R P T V P A R S K I P V K I E L Y K A D I S Y P Y (SEQ ID NO: 4).
El fragmento de union a GPI de un polipeptido de aerolisina puede incluir, o consistir en, un polipeptido que tiene la siguiente secuencia de aminoacidos: L D P D S F K H G D V T Q S D R Q L V K T V V G W A V N D S D T P Q S G
Y D V T L R Y D T A T N W S K T N T Y G L S E K V T T K N K F K W P L V G E C E L S I E I A A N Q S W A S Q N
G G S T T T S L S Q S V R P TV P A R S K I P V K I E L Y KC D I S Y P Y (SEQ ID NO: 5).
El polipeptido de aerolisina puede tener una secuencia de aminoacidos que es, o es superior al, 70 % (por ejemplo,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100) identica a la secuencia de aerolisina que tiene la secuencia de aminoacidos representada en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3, 6, o 7 (vease a continuacion).
El porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoacidos se define como el porcentaje de aminoacidos en una secuencia candidata que son identicos a los aminoacidos en una secuencia de referencia, tras alinear las
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secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr un porcentaje maximo de identidad de secuencias. La alineacion con fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencias puede lograrse de diversas formas que se encuentran en la capacidad de la tecnica, por ejemplo, utilizando el software informatico disponible publicamente, tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los parametros apropiados para medir la alineacion, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir una alineacion maxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan, se pueden determinar por metodos conocidos.
Dependiendo de la aplicacion prevista, en algunas realizaciones, puede ser preferible utilizar una variante de polipeptido de aerolisina que carece de la capacidad para lisar celulas. Tales formas de variantes del polipeptido de aerolisina son conocidas en la materia y se describen, por ejemplo, en Brodsky et al. (2000) Am J Clin Pathol 114:459-466. La forma de variante no lftica de aerolisina contiene, o consiste en, la secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 7, en el que uno o mas de: la histidina en la posicion 132 esta sustituida con una asparagina (Hisl32Asn); la glicina en la posicion 202 es una cistema; la treonina en la posicion 253 es una cistema y la alanina en la posicion 300 es una cistema; y la treonina en la posicion 225 es una glicina. Una variante no lftica de aerolisina a modo de ejemplo comprende la secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NOs: 2 o 7, en el que la treonina en la posicion 253 es una cistema y la alanina en la posicion 300 es una cistema. Como se ha descrito anteriormente, las formas de variantes retendran la capacidad de union a las fracciones de GPI.
La variante del polipeptido de aerolisina puede tener menos de 10 % (por ejemplo, menos de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1) de la capacidad del homologo no variante del polipeptido de aerolisina para lisar celulas diana. La variante del polipeptido de aerolisina puede no tener una actividad citolftica detectable.
Los metodos para determinar si una variante del polipeptido de aerolisina se une a una fraccion de GPI son conocidos en la materia y se ejemplifican en los ejemplos practicos. Por ejemplo, los metodos basados en celulas para detectar la union entre una variante del polipeptido de aerolisina y una fraccion de GPI en una superficie celular se pueden determinar utilizando tecnicas de citometna de flujo y una variante del polipeptido de aerolisina marcada de forma detectable (por ejemplo, marcado con fluoroforo). Vease, por ejemplo, Hong et al. (2002) EMBO J 21(19):5047-5056.
Del mismo modo, los metodos para detectar y/o cuantificar la actividad citolftica de un polipeptido de aerolisina o variante del mismo tambien son conocidos en la materia. Por ejemplo, la actividad hemolftica de una variante del polipeptido de aerolisina se puede determinar poniendo en contacto la variante del polipeptido con los eritrocitos humanos normales y midiendo la cantidad de hemoglobina liberada de los eritrocitos. Veanse, por ejemplo, Howard y Buckley (1982) Biochemistry 21(7):1662-1667; Avigad y Bernheimer (1976) Infection and Immunity 13(5):1378- 1381; Garland y Buckley (1988) Infection and Immunity 56(5):1249-1253; y Bernheimer y Avigard (1974) Infection and Immunity 9:1016-1021. Una disminucion en la cantidad, o ausencia de actividad citolftica por la variante en comparacion con la cantidad de actividad citolftica posefda por el homologo no variante del polipeptido, es una indicacion de que la variante del polipeptido se ha reducido o la actividad citolftica es ausente.
Los metodos para obtener un polipeptido de aerolisina, o producir una variante del polipeptido como se describe en la presente memoria, son conocidos en la materia de la biologfa molecular y se ejemplifican en los Ejemplos practicos. Veanse, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edicion", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York y Ausubel et al. (1992) "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Associates. El molde de ADN que codifica un polipeptido de aerolisina puede obtenerse a partir de cualquiera de las especies de Aeromonas descritas en la presente memoria utilizando tecnicas convencionales (vease, por ejemplo, Sambrook et al. (1989), supra). Por ejemplo, Howard et al. describen el aislamiento y la caracterizacion de una secuencia de acidos nucleicos que codifica un polipeptido de aerolisina de Aeromonas hydrophila (Howard et al. (1987) J Bacteriol 169(6):2869-2871). Un polipeptido de aerolisina aislado de Aeromonas salmonicida se describe en Buckley (1990) Biochem. Cell Biol. 68:221-224 y Wong et al. (1989) J Bacteriol. 171:2523-2527.
Un polipeptido de aerolisina puede contener secuencias de aminoacidos irrelevantes o heterologas internas o terminales (carboxi o amino-terminal) (por ejemplo, secuencias derivadas de otras protemas o secuencias sinteticas que no corresponden a cualquier protema de origen natural). Las secuencias pueden ser, por ejemplo, una etiqueta antigenica (por ejemplo, FLAG, polihistidina, hemaglutinina (HA), glutation-S-transferasa (GST), o protema de union a maltosa (PUM)). Las secuencias heterologas tambien pueden incluir protemas utiles como marcadores de diagnostico o detectables, por ejemplo, luciferasa, protema verde fluorescente (PVF), o cloranfenicol acetil transferasa (CAT).
Los polipeptidos de aerolisina a modo de ejemplo, asf como metodos para preparar y purificar los polipeptidos se describen en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos n.° de serie 61/200.655.
En algunas realizaciones, el reactivo puede ser un anticuerpo que se une a una fraccion de GPI. Los anticuerpos que se unen a fracciones de GPI no humano se han identificado y aislado. Vease, por ejemplo, Naik et al. (2006) Infection and Immunity 74(2):1412 (aislamiento de un anticuerpo de origen natural que se une a las fracciones de
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GPI de Plasmodium falciparum). Como se describe con detalle en la presente memoria, esta dentro de la capacidad de un experto generar un anticuerpo que se una a una fraccion de GPI humano.
Como se utiliza en la presente memoria, el termino "anticuerpo" se refiere a una molecula de anticuerpo completa o intacta (por ejemplo, IgM, IgG (incluyendo IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA, IgD, o IgE) o cualquier fragmento de union al antigeno del mismo. El termino anticuerpo incluye, por ejemplo, un anticuerpo quimerizado o quimerico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo no inmunizado, y un anticuerpo completamente humano. Los fragmentos de union al antigeno de un anticuerpo incluyen, por ejemplo, un anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv), un fragmento Fd, un fragmento Fab, un fragmento Fab', o un fragmento F(ab')2. Un fragmento scFv es una cadena polipeptfdica sencilla que incluye tanto las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo de las cuales se deriva scFv. Ademas, los intracuerpos, minicuerpos, triacuerpos, y diacuerpos (veanse, por ejemplo, Todorovska et al. (2001) J Immunol Methods 248(1):47-66; Hudson y Kortt (1999) J Immunol Methods 231(1):177-189; Poljak (1994) Structure 2(12):1121-1123; Rondon y Marasco (1997) Annual Review of Microbiology 51:257-283) estan incluidos asimismo en la definicion de anticuerpo y son compatibles para su uso en los metodos descritos la presente memoria. Los anticuerpos biespedficos tambien son abarcados por el termino "anticuerpo". Los anticuerpos biespedficos son anticuerpos monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de union para al menos dos antfgenos diferentes. Los metodos para generar un anticuerpo o un fragmento del mismo se discuten en la presente memoria.
En algunas realizaciones, el reactivo puede unirse a una protema anclada a GPI. Por ejemplo, el reactivo puede ser un anticuerpo que se une a una protema anclada a GPI. El reactivo puede ser un ligando para una protema anclada a GPI. Las protemas ancladas a GPI son innumerables e incluyen, sin limitacion, fosfatasa alcalina, 5' nucleotidasa acetilcolinesterasa, dipeptidasa, LFA-3, NCAM, PH-20, CD55, CD59, Thy-1, Qa-2, CD14, CD33, CD16 (el receptor Fcy III), antfgeno carcinoembrionario (ACE), y CD52. Los anticuerpos que se unen a las protemas ancladas a GPI se conocen bien en la materia y se describen, por ejemplo, en Hall y Rosse (1996) supra, Richards et al. (2008) Cytometry B Clin Cytom 76B(1):47-55; Richards y Barnett (2007) Clin Lab Med 27(3):577-590; Luzzatto et al. (2006) Int J Hematol 84(2):104-112; y Thomason et al. (2004) Am J Clin Pathol 122(1):128-134. Tales anticuerpos tambien estan disponibles comercialmente en, por ejemplo, Santa Cruz Biotechology, Inc. (Santa Cruz, California), Novus Biologicals, (Littleton, Colorado), y R&D Systems (Minneapolis, MN).
Los metodos adecuados para generar un anticuerpo que se une a una protema anclada a GPI o una fraccion de GPI para su uso en metodos de diagnostico y/o terapeuticos son bien conocidos en la materia y se describen en la siguiente seccion.
Metodos para generar un anticuerpo
Los metodos adecuados para producir un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo que se une a una fraccion de GPI o una protema anclada a GPI), o fragmentos de union al antigeno de los mismos, de acuerdo con la divulgacion son conocidos en la materia y se describen en la presente memoria. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD55 monoclonales pueden generarse utilizando celulas que expresan CD55 humano, un polipeptido CD55, o un fragmento antigenico de polipeptido CD55, como un inmunogeno, elevando asf una respuesta inmunitaria en animales de los que las celulas que producen anticuerpos y, a su vez, anticuerpos monoclonales pueden aislarse. La secuencia de tales anticuerpos puede determinarse y los anticuerpos o variantes de los mismos se producen por tecnicas recombinantes. Las tecnicas recombinantes se pueden utilizar para producir anticuerpos quimericos, injertados a RDC, humanizados y completamente humanos basandose en la secuencia de los anticuerpos monoclonales asf como los polipeptidos capaces de unirse a una protema anclada a GPI o a una fraccion de GPI.
Ademas, los anticuerpos derivados de bibliotecas recombinantes ("anticuerpos de fago") pueden seleccionarse utilizando, por ejemplo, celulas que expresan una fraccion de GPI o una protema anclada a GPI, protemas ligadas a GPI recombinante, o fracciones de GPI libre, como cebo para aislar los anticuerpos o polipeptidos sobre la base de la especificidad de la diana. La produccion y aislamiento de anticuerpos no humanos y quimericos estan adecuadamente comprendidos en el ambito del experto.
La tecnologfa de ADN recombinante se puede utilizar para modificar una o mas caractensticas de los anticuerpos producidos en celulas no humanas. De este modo, los anticuerpos quimericos pueden construirse a efectos de disminuir su inmunogenicidad de los mismos en aplicaciones de diagnostico o terapeuticas. Ademas, la inmunogenicidad puede minimizarse humanizando los anticuerpos mediante injerto a RDC y, opcionalmente, modificacion del armazon. Veanse, las patentes de EE. UU. n.° 5.225.539 y 7.393.648.
Los anticuerpos pueden obtenerse a partir de suero animal, o, en el caso de anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, pueden producirse en un cultivo celular. La tecnologfa de ADN recombinante se puede utilizar para producir los anticuerpos de acuerdo con procedimientos establecidos, incluyendo procedimientos en cultivo de celulas bacterianas o preferentemente cultivo de celulas de mairnferos. El sistema de cultivo celular seleccionado secreta preferentemente el producto de anticuerpo.
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Un proceso para la produccion de un anticuerpo divulgado en la presente memoria incluye el cultivo de una celula huesped, por ejemplo una celula de E. coli o de mairnfero, que se ha transformado con un vector hforido. El vector incluye uno o mas casetes de expresion que contienen un promotor unido operativamente a una primera secuencia de ADN que codifica un peptido senal ligado en el marco de lectura apropiado a una segunda secuencia de ADN que codifica la protema de anticuerpo. La protema de anticuerpo se recoge entonces y se afsla. Opcionalmente, el casete de expresion puede incluir un promotor unido operativamente a secuencias de ADN policistronico (por ejemplo, bicistronico), que codifican protemas de anticuerpo cada una capaz de unirse operativamente a un peptido senal en el marco de lectura apropiado.
La multiplicacion de celulas del hibridoma o celulas del huesped de mamfferos in vitro se lleva a cabo en medios de cultivo adecuados, que incluyen los medios de cultivo convencionales habituales (tales como, por ejemplo medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) o medio RPMI 1640), repuesto opcionalmente con un suero de marnffero (por ejemplo, suero de ternera fetal), o elementos traza y suplementos de mantenimiento del crecimiento (por ejemplo, celulas alimentadoras, tales como celulas de exudado peritoneal de raton normal, celulas de bazo, macrofagos de medula osea, 2-aminoetanol, insulina, transferrina, lipoprotema de baja densidad, acido oleico, o similares). La multiplicacion de las celulas huesped que son celulas bacterianas o celulas de levadura se lleva a cabo igualmente en medio de cultivo adecuado conocido en la materia. Por ejemplo, para las bacterias, los medios de cultivo adecuados incluyen medio LE, NZCYM, NZYM, NZM, Caldo de cultivo Terrific, SOB, SOC, 2 xYT, o medio mmimo M9. Para las levaduras, los medios de cultivo adecuados incluyen medio YPD, YEPD, medio mmimo o medio selectivo deficiente en algun aminoacido mmimo completo.
La produccion in vitro proporciona preparaciones de anticuerpos relativamente puras y permite la ampliacion de la produccion para dar grandes cantidades de los anticuerpos deseados. Las tecnicas para el cultivo de celulas bacterianas, levaduras, plantas, o marnfferos son conocidas en la tecnica e incluyen un cultivo en suspension homogeneo (por ejemplo, en un fermentador de agitacion por aire o en un reactor de agitacion continua), y un cultivo de celulas inmovilizadas o atrapadas (por ejemplo, en fibras huecas, microcapsulas, en microperlas de agarosa o cartuchos de ceramica).
Grandes cantidades de los anticuerpos deseados pueden obtenerse tambien multiplicando celulas de mamfferos in vivo. A tal fin, las celulas del hibridoma que producen los anticuerpos deseados se inyectan en mai^eras histocompatibles para provocar el crecimiento de tumores que producen anticuerpos. Opcionalmente, los animales son sometidos a un tratamiento previo con un hidrocarburo, especialmente aceites minerales, tales como pristano (tetrametil-pentadecano), antes de la inyeccion. Despues de una a tres semanas, los anticuerpos se afslan a partir de los fluidos corporales de esos marnfferos. Por ejemplo, las celulas del hibridoma obtenidas por fusion de celulas de mieloma adecuadas con celulas de bazo productoras de anticuerpos procedentes de ratones Balb/c, o celulas transfectadas derivadas de la estirpe celular de hibridoma Sp2/0 que produce los anticuerpos deseados se inyecta intraperitonealmente en ratones Balb/c opcionalmente pre-tratados con pristano. Despues de una a dos semanas, se extrae fluido ascftico de los animales.
Las tecnicas anteriores, y otras tecnicas se discuten, por ejemplo, en Kohler y Milstein, (1975) Nature 256:495-497; patente de Estados Unidos n.° 4.376.110; Harlow y Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor.
Las tecnicas para la preparacion de moleculas de anticuerpos recombinantes se describen en las referencias anteriores y tambien en, por ejemplo: el documento WO97/08320; patente de Estados Unidos n.° 5.427.908; patente de Estados Unidos n.° 5.508.717; Smith (1985) Science 225:1315-1317; Parmley y Smith (1988) Gene 73:305-318; De La Cruz et al. (1988) Journal of Biological Chemistry 263:4318-4322; patente de Estados Unidos n.° 5.403.484; patente de Estados Unidos n.° 5.223.409; documento WO88/06630; documento WO92/15679; patente de Estados Unidos n.° 5.780.279; patente de Estados Unidos n.° 5.571.698; patente de Estados Unidos n.° 6.040.136; Davis et al. (1999) Cancer Metastasis Rev. 18(4):421-5; y Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 97(2): 722-727.
Los sobrenadantes del cultivo celular se identifican sistematicamente para los anticuerpos deseados, preferentemente por tincion inmunofluorescente de GPI o celulas que expresan la protema anclada a GPI, por inmunotransferencia, mediante un inmunoensayo enzimatico, por ejemplo, un ensayo tipo sandwich o un ensayo de aplicacion puntual, o un radioinmunoensayo.
Para el aislamiento de los anticuerpos, las inmunoglobulinas en los sobrenadantes del cultivo o en el fluido ascftico pueden concentrarse, por ejemplo mediante precipitacion con sulfato de amonio, dialisis con respecto al material higroscopico, tal como polietilenglicol, filtracion a traves de membranas selectivas, o similares. Si es necesario y/o deseado, los anticuerpos se purifican por los metodos cromatograficos habituales, por ejemplo filtracion en gel, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa en DEAE-celulosa y/o cromatograffa de (inmuno)-afinidad, por ejemplo cromatograffa de afinidad con una fraccion de GPI, una celula que expresa anclajes tipo GPI en su superficie, un polipeptido anclado a GPI, una celula que expresa una protema anclada a GPI en su superficie, o con protema A o G.
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Se describe un proceso para la preparacion de una estirpe celular bacteriana secretora de anticuerpos dirigidos contra una fraccion de GPI o una protema anclada a GPI en un mairnfero adecuado. Por ejemplo, un conejo es inmunizado con una fraccion de GPI, una celula que expresa anclajes tipo GPI en su superficie, un polipeptido anclado a GPI, una celula que expresa una protema anclada a GPI en su superficie, o fragmentos de los mismos. Una biblioteca de expresion en fago producida a partir del conejo inmunizado se construye y se extrae de los anticuerpos deseados de acuerdo con metodos bien conocidos en la materia (tal como, por ejemplo, los metodos desvelados en las distintas referencias enumeradas en la presente memoria).
Tambien se divulgan celulas del hibridoma que secretan los anticuerpos monoclonales. Las celulas del hibridoma preferentes son geneticamente estables, secretan anticuerpos monoclonales descritos en la presente memoria de la especificidad deseada, y se pueden ampliar a partir de cultivos ultracongelados por descongelacion y propagacion in vitro o como ascitis in vivo.
Asimismo se describe un proceso que se proporciona para la preparacion de una estirpe celular de hibridoma que secreta anticuerpos monoclonales contra una fraccion de GPI o una protema anclada a GPI. En ese proceso, un mai^ero adecuado, por ejemplo un raton Balb/c, se inmuniza con uno o mas polipeptidos o fragmentos antigenicos de, por ejemplo, CD55 o CDl4 o con uno o mas polipeptidos o fragmentos antigenicos derivados de una celula que expresa CD55, la propia celula que expresa CD55, o un vehnculo antigenico que contiene un polipeptido purificado como se ha descrito. Del mismo modo, el marnffero puede ser inmunizado con una fraccion de GPI humano, un fragmento del mismo, o celulas que expresan la fraccion de GPI humano, tal vez en una alta cantidad. Las celulas productoras de anticuerpos del mamffero inmunizado se cultivan brevemente en un cultivo o se fusionan con celulas de una estirpe celular de mieloma adecuada. Las celulas hnbridas obtenidas en la fusion se clonan, y se seleccionan los clones celulares que secretan los anticuerpos deseados. Por ejemplo, las celulas de bazo de ratones Balb/c inmunizados con, por ejemplo, una protema anclada a GPI o una fraccion de GPI se fusionan con celulas de la estirpe celular de mieloma, PAI, o la estirpe celular de mieloma Sp2/0-Ag 14. Las celulas fnbridas obtenidas se identifican sistematicamente para la secrecion de los anticuerpos deseados y las celulas del hibridoma positivas se clonan.
Los metodos preparar una estirpe celular de hibridoma incluyen la inmunizacion de ratones Balb/c mediante la inyeccion por via subcutanea y/o intraperitoneal de un antfgeno de interes varias veces, por ejemplo, de cuatro a seis veces, durante varios meses, por ejemplo, entre dos y cuatro meses. Las celulas de bazo de los ratones inmunizados se recogen dos a cuatro dfas despues de la ultima inyeccion y se fusionan con las celulas de la estirpe celular de mieloma, PAI, en presencia de un promotor de fusion, preferentemente polietilenglicol. Preferentemente, las celulas de mieloma se fusionan con un exceso de tres a veinte veces de celulas de bazo de los ratones inmunizados en una solucion que contiene aproximadamente polietilenglicol al 30 % a aproximadamente 50 % de un peso molecular alrededor de 4.000. Despues de la fusion, las celulas se expanden en medios de cultivo apropiados como se ha descrito supra, se suplementan con un medio de seleccion, por ejemplo medio HAT, a intervalos regulares a efectos de evitar que las celulas de mieloma normales presenten un crecimiento excesivo con respecto a las celulas del hibridoma deseadas.
Los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden ser "quimericos". Los anticuerpos quimericos y fragmentos de union al antfgeno de los mismos comprenden partes de dos o mas especies diferentes (por ejemplo, raton y humano). Los anticuerpos quimericos se pueden producir con las regiones variables de raton de especificidad deseada con corte y empalme en segmentos genicos de dominio constante humano (por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 4.816.567). De esta manera, los anticuerpos no humanos pueden ser modificados para hacerlos mas adecuados para la aplicacion clmica en seres humanos (por ejemplo, metodos para la deteccion de celulas de HPN de tipo II).
Los anticuerpos monoclonales descritos en la presente memoria incluyen formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, raton). Los AMs humanizados o injertados a RDC son particularmente utiles como agentes terapeuticos para seres humanos debido a que no se eliminan de la circulacion tan rapidamente como los anticuerpos de raton y normalmente no provocan una reaccion inmunitaria adversa. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o mas residuos de aminoacidos introducidos en el mismo a partir de una fuente no humana. Estos residuos de aminoacidos no humanos se denominan frecuentemente como residuos "de importacion", que se recogen normalmente de un dominio variable "de importacion". Los metodos para preparar anticuerpos humanizados son generalmente bien conocidos en la materia. Por ejemplo, la humanizacion puede realizarse esencialmente siguiendo el metodo de Winter y colaboradores (veanse, por ejemplo, Jones et al (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; y Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), mediante la sustitucion de RDCs o secuencias de RDC de roedor con las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Vease tambien, por ejemplo, Staelens et al. (2006) Mol Immunol 43:1243-1257. En algunas realizaciones, las formas humanizadas de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, de raton) son anticuerpos humanos (anticuerpo receptor) en las que los residuos de region hipervariable (RDC) del anticuerpo receptor se reemplazan con residuos de region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como un raton, rata, conejo o primate no humano que tengan la especificidad, afinidad, y capacidad de union deseadas. En algunos casos, los residuos de la region marco de la inmunoglobulina humana tambien se reemplazan con los correspondientes residuos no humanos (los llamados "mutaciones de retroceso"). Ademas, las bibliotecas de
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expresion en fagos se pueden utilizar para variar los aminoacidos en las posiciones elegidas dentro de la secuencia del anticuerpo. Las propiedades de un anticuerpo humanizado tambien se ven afectadas por la eleccion de la estructura humana. Ademas, los anticuerpos humanizados y quimerizados pueden ser modificados para comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante con el fin de mejorar adicionalmente las propiedades de los anticuerpos, tales como, por ejemplo, afinidad o funcion efectora.
Los anticuerpos completamente humanos tambien se describen en la divulgacion. La expresion "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes (si estan presentes) derivadas de secuencias de inmunoglobulina de lmea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoacidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de lmea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagenesis aleatoria o espedfica de sitio in vitro o por mutacion somatica in vivo). Sin embargo, la expresion "anticuerpo humano" no incluye anticuerpos en los que las secuencias de RDC derivadas de la lmea germinal de otra especie de mairnfero, tal como un raton, han sido injertadas en secuencias de estructura humana (es decir, anticuerpos humanizados). Los anticuerpos completamente humanos o humanos pueden derivarse de ratones transgenicos que llevan genes de anticuerpos humanos (que llevan exones de variable (V), diversidad (D), de union (U) y constante (C)) o de celulas humanas. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgenicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunizacion, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la produccion de inmunoglobulina endogena. (Veanse, por ejemplo, Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 90:2551; Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255-258; Bruggemann et al. (1993) Year in Immunol. 7:33; y Duchosal et al. (1992) Nature 355:258). Las cepas de ratones transgenicos pueden ser modificadas por ingeniena genetica para contener secuencias genicas de genes de inmunoglobulina humana no reordenados. Las secuencias humanas pueden codificar tanto las cadenas pesada como ligera de los anticuerpos humanos y funcionanan correctamente en los ratones, soportando la reordenacion para proporcionar un amplio repertorio de anticuerpos similar al de los seres humanos. Los ratones transgenicos pueden inmunizarse con la protema diana (por ejemplo, una fraccion de GPI o una protema anclada a GPI, tal como CD55 o CD14) para crear una matriz diversa de anticuerpos espedficos y su ARN codificante. Los acidos nucleicos que codifican los componentes de la cadena del anticuerpo de dichos anticuerpos pueden entonces ser clonados del animal en un vector de expresion. Normalmente, las poblaciones distintas de acidos nucleicos que codifican las secuencias de la cadena pesada y ligera se clonan, y las poblaciones distintas se recombinan en la insercion en el vector, de tal manera que cualquier copia dada del vector recibe una combinacion aleatoria de una cadena pesada y ligera. El vector esta disenado para expresar cadenas de anticuerpo de modo que puedan ser montadas y expresadas en la superficie exterior de un paquete de expresion que contiene el vector. Por ejemplo, las cadenas de anticuerpos se pueden expresar como protemas de fusion con una protema de recubrimiento de fago de la superficie exterior del fago. A partir de entonces, los paquetes de expresion se pueden identificar sistematicamente para la expresion de los anticuerpos que se unen a una diana.
Ademas, los anticuerpos humanos se pueden derivar de las bibliotecas de expresion en fagos (Hoogenboom et al. (1991) J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597; y Vaughan et al. (1996) Nature Biotech 14:309 (1996)). Las bibliotecas de fagos sinteticos que pueden ser creadas utilizan combinaciones aleatorias de regiones V de anticuerpos humanos sinteticos. Por medio de la seleccion, se pueden fabricar anticuerpos completamente humanos de antfgeno en los que las regiones V son muy similares a la naturaleza humana. Vease, por ejemplo, patentes de Estados Unidos n.° 6.794.132, 6.680.209, 4.634.666, y Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2:361-367.
Para la generacion de anticuerpos humanos, veanse tambien Mendez et al. (1998) Nature Genetics 15:146-156, Green y Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188:483-495.
Los anticuerpos humanos se discuten y definen adicionalmente en las patentes de Estados Unidos n.°: 5.939.598; 6.673.986; 6.114.598; 6.075.181; 6.162.963; 6.150.584; 6.713.610; y 6.657.103, asf como la publicacion de patentes de Estados Unidos n.° 20030229905 A1, 20040010810 A1, US 20040093622 A1, 20060040363 A1, 20050054055 A1, 20050076395 A1, 20050287630 A1. Vease tambien las publicaciones internacionales n.° WO 94/02602, WO 96/34096, y WO 98/24893, y la patente europea n.° EP 0 463 151 B1.
En un enfoque alternativo, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado un enfoque de "minilocus". En el enfoque minilocus, un locus Ig exogeno es mimetizado a traves de la inclusion de piezas (genes individuales) del locus Ig. De este modo, uno o mas genes Vh, uno o mas genes Dh, uno o mas genes Jh, una region constante mu, y una segunda region constante (preferentemente una region constante gamma) se forman en una construccion para la insercion en un animal. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.°: 5.545.807; 5.545.806; 5.625.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; 5.770.429; 5.789.650; y 5.814.318; 5.591.669; 5.612.205; 5.721.367; 5.789.215; 5.643.763; 5.569.825; 5.877.397; 6.300.129; 5.874.299; 6.255.458; y 7.041.871. Patente Europea n.° 0 546 073 B1, publicaciones de patentes internacionales n.° WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884.
Veanse a continuacion Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 6287; Chen et al. (1993) Int. Immunol. 5: 647; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. Ee. UU. 90: 3720-4; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117; Lonberg et al. (1994) Nature 368: 856-859; Taylor et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; Tuaillon et al. (1995) J.
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Immunol. 154: 6453-65; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845; y Tuaillon et al. (2000) Eur. J. Immunol. 10: 2998-3005.
Se describen anticuerpos no inmunizados (por ejemplo, anticuerpos que se unen a una fraccion de GPI humano o una protema anclada a GPI) o fragmented de union al antigeno de los mismos. Los anticuerpos no inmunizados o fragmented de union al antigeno de los mismos pueden ser modificados con el fin de hacer que el anticuerpo o el fragmento de union al antigeno del mismo no sea inmunogenico, o sea menos inmunogenico, para una especie dada. La no inmunizacion puede conseguirse mediante la modificacion del anticuerpo o fragmento de union al antigeno del mismo utilizando cualquiera de una diversidad de tecnicas conocidas por los expertos en la materia (veanse, por ejemplo, las publicaciones PCT n.° WO 04/108158 y WO 00/34317). Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de union al antigeno del mismo puede ser no inmunizado mediante la identificacion de epftopos de linfocitos T y/o epftopos de linfocitos B potenciales dentro de la secuencia de aminoacidos del anticuerpo o fragmento de union al antfgeno del mismo y retirando uno o mas de los epftopos de linfocitos T y/o epftopos de linfocitos B potenciales del anticuerpo o fragmento de union al antfgeno del mismo, por ejemplo, utilizando tecnicas recombinantes. El anticuerpo modificado o fragmento de union al antfgeno del mismo puede entonces ser producido opcionalmente y ensayado para identificar anticuerpos o fragmentos de union al antfgeno de los mismos que hayan retenido una o mas actividades biologicas deseadas, tales como, por ejemplo, afinidad de union, pero que tengan una reduccion de la inmunogenicidad. Los metodos para la identificacion de epftopos de linfocitos T y/o epftopos de linfocitos B potenciales pueden llevarse a cabo utilizando tecnicas conocidas en la materia, tales como, por ejemplo, tecnicas de metodos computacionales (vease, por ejemplo, la publicacion PCT n.° WO 02/069232), tecnicas in vitro o in silico y ensayos biologicos o metodos ffsicos (tales como, por ejemplo, determinacion de la union de peptidos a moleculas de CMH, determinacion de la union de complejos de peptido:CMH a los receptores de linfocitos T de las especies para recibir el anticuerpo o fragmento de union al antfgeno del mismo, ensayar las partes de protema o peptidos de la misma utilizando animales transgenicos con las moleculas de CMH de las especies para recibir el anticuerpo o fragmento de union al antfgeno del mismo, o ensayar con animales transgenicos reconstituidos con celulas del sistema inmunitario de las especies para recibir el anticuerpo o fragmento de union al antfgeno del mismo, etc.). Los anticuerpos no inmunizados descritos en la presente memoria incluyen fragmentos de union al antfgeno no inmunizados, Fab, Fv, scFv, Fab' y F(ab')2, anticuerpos monoclonales, anticuerpos murinos, anticuerpos modificados por ingeniena genetica (tales como, por ejemplo, anticuerpos quimericos, de cadena sencilla, injertados a RDC, humanizados, completamente humanos, y anticuerpos seleccionados de manera artificial), anticuerpos sinteticos y anticuerpos semisinteticos.
Se puede producir ADN recombinante que comprende una insercion que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena ligera de una estirpe celular que expresa un anticuerpo. El termino ADN incluye ADN monocatenario codificante, ADN bicatenario que consiste en dichos ADN codificantes y de ADNs complementarios al mismo, o estos ADNs complementarios (monocatenarios) por sf mismos.
Ademas, un ADN que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo anti-GPI o una protema anclada a GPI) puede ser sintetizado enzimatica o qmmicamente para contener la secuencia de ADN autentica que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena ligera, o un mutante del mismo. Un mutante del ADN autentico es un ADN que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena ligera de los anticuerpos mencionados anteriormente en los que uno o mas aminoacidos se delecionan, se insertan, o intercambian, con uno u otros aminoacidos. Preferentemente, dicha modificacion o modificaciones estan fuera de las RDC del dominio variable de cadena pesada y/o del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo en aplicaciones de optimizacion de la humanizacion y de la expresion. La expresion ADN mutante tambien abarca mutantes silenciosos en los que uno o mas nucleotidos se reemplazan con otros nucleotidos con los nuevos codones que codifican el mismo aminoacido o los mismos aminoacidos. La expresion secuencia mutante tambien incluye una secuencia degenerada. Las secuencias degeneradas estan degeneradas dentro del significado del codigo genetico en el que un numero ilimitado de nucleotidos se reemplazan con otros nucleotidos sin producir un cambio de la secuencia de aminoacidos codificada originalmente. Dichas secuencias degeneradas pueden ser utiles debido a sus diferentes sitios de restriccion y/o frecuencia de codones particulares que son preferentes por el huesped espedfico, particularmente E. coli, para obtener una expresion optima del dominio variable de cadena pesada de murino y/o dominio variable de cadena ligera de murino.
El termino mutante tiene por objeto incluir un mutante de ADN obtenido por mutagenesis in vitro del ADN autentico de acuerdo con metodos conocidos en la materia.
Para el ensamblaje de moleculas de inmunoglobulina tetramericas completas y la expresion de anticuerpos quimericos, las inserciones de ADN recombinante que codifican los dominios variables de cadena pesada y ligera se fusionan con los ADN correspondientes que codifican los dominios constantes de cadena pesada y ligera, despues se transfirieren en celulas huesped apropiadas, para ejemplo despues de su incorporacion en vectores hteridos.
Los ADN recombinantes que incluyen una insercion que codifica un dominio variable de cadena pesada de murino de un anticuerpo de interes fusionado a una IgG de dominio constante humano, por ejemplo y1, y2, y3 o y4, en particular, y1 o y4, pueden utilizarse. Tambien se proporcionan ADN recombinantes que incluyen una insercion que
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codifica un dominio variable de cadena ligera de murino de un anticuerpo fusionado con un dominio constante humano k o A, preferentemente k.
En la presente memoria se describen ADN recombinantes que codifican un polipeptido recombinante en el que el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera estan ligados por medio de un grupo espaciador, que comprende opcionalmente una secuencia senal que facilita el procesamiento del anticuerpo en la celula huesped y/o una secuencia de ADN que codifica un peptido que facilita la purificacion del anticuerpo y/o un sitio de escision y/o un espaciador peptfdico y/o un agente. El ADN que codifica un agente tiene por objeto ser un ADN que codifica el agente util en aplicaciones de diagnostico o terapeuticas. Por consiguiente, las moleculas de agente que son toxinas o enzimas, concretamente enzimas capaces de catalizar la activacion de profarmacos, son particularmente indicadas. El ADN que codifica dicho agente tiene la secuencia de una enzima o toxina que codifica ADN de origen natural, o un mutante de las mismas, y puede prepararse por metodos bien conocidos en la materia.
En consecuencia, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de union al antfgeno de la divulgacion pueden ser anticuerpos o fragmentos de union al antfgeno desnudos que no estan conjugados con otros agentes, por ejemplo, un agente terapeutico o marcador detectable. Alternativamente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de union al antfgeno puede conjugarse con un agente tal como, por ejemplo, un agente citotoxico, una molecula pequena, una hormona, una enzima, un factor de crecimiento, una citoquina, una ribozima, un peptidomimetico, un producto qmmico, un profarmaco, una molecula de acido nucleico que incluye secuencias de codificacion (tales como construcciones antisentido, ARNi, construcciones de orientacion selectiva al gen, etc.), o un marcador detectable (por ejemplo, un agente de contraste por RMN o rayos X, molecula fluorescente, etc.). Un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno del mismo (por ejemplo, Fab, Fv, scFv de cadena sencilla, Fab' y F(ab')2) puede ligarse a una molecula que aumenta la semivida del anticuerpo o fragmento de union al antfgeno (vease la seccion titulada "Conjugados").
Varios sistemas de vectores posibles estan disponibles para la expresion de genes de cadena pesada y cadena ligera clonados en celulas de mairnfero. Una clase de vectores se basa en la integracion de las secuencias genicas deseadas en el genoma de la celula huesped. Las celulas que han integrado el ADN de forma estable se pueden seleccionar mediante introduccion de forma simultanea de genes de resistencia a farmacos, tales como gpt de E. coli (Mulligan y Berg (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 78:2072) o Tn5 neo (Southern y Berg (1982) Mol. Appl. Genet. 1:327). El gen marcador seleccionable puede ligarse a las secuencias genicas de ADN a expresar, o introducirse en la misma celula mediante co-transfeccion (Wigler et al. (1979) Cell 16:77). Una segunda clase de vectores utiliza elementos de ADN que confieren capacidades de replicacion autonoma a un plasmido extracromosomico. Estos vectores se pueden derivar de virus de animales, tales como virus del papiloma bovino (Sarver et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 79:7147), virus del polioma (Deans et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 81:1292), o virus SV40 (Lusky y Botchan (1981) Nature 293:79).
Puesto que un ADNc de inmunoglobulina esta formado solamente por secuencias que representan el ARNm maduro que codifica una protema de anticuerpo, se requieren elementos de expresion genica adicionales que regulen la transcripcion del gen y el procesamiento del ARN para la smtesis del ARNm de inmunoglobulina. Estos elementos pueden incluir senales de corte y empalme, promotores de transcripcion, incluyendo potenciadores de promotores inducibles, y senales de terminacion. Los vectores de expresion de ADNc que incorporan tales elementos incluyen los que se describen en Okayama y Berg (1983) Mol. Cell Biol. 3:280; Cepko et al. (1984) Cell 37:1053; y Kaufman (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 82:689.
Como resulta aparente a partir de la divulgacion, los anticuerpos de la fraccion anti-GPI o anticuerpos de la protema anclada a anti-GPI se pueden utilizar en metodos para el diagnostico de la enfermedad (por ejemplo, diagnosticar HPN o un mayor riesgo de desarrollar trombocitopenia), la supervision de la progresion de la enfermedad, y la seleccion de terapias apropiadas, incluyendo terapias de combinacion para el tratamiento de HPN, trombocitopenia, o trombosis en un sujeto.
En la presente divulgacion, se contemplan anticuerpos biespedficos. Los anticuerpos biespedficos son anticuerpos monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de union para al menos dos antfgenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de union es para una fraccion de GPI o una protema anclada a GPI en una celula (tales como, por ejemplo, un globulo blanco o un globulo rojo), la otra es para cualquier otro antfgeno, y preferentemente para una protema o receptor de la superficie celular o subunidad receptora.
Los metodos para fabricar anticuerpos biespedficos estan dentro del alcance de los expertos en la materia. Tradicionalmente, la produccion recombinante de anticuerpos biespedficos se basa en la co-expresion de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en los que las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello (1983) Nature 305:537-539). Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de union deseadas (sitios de combinacion de anticuerpo-antfgeno) pueden fusionarse con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusion se realiza preferentemente con un dominio constante de cadenas pesadas de inmunoglobulina, incluyendo al menos parte de las regiones bisagra, Ch2 y Ch3. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de
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inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresion distintos y se co-transfectan en un organismo huesped adecuado. Para detalles adicionales de metodos ilustrativos conocidos en la actualidad para la generacion de anticuerpos biespedficos vease, por ejemplo, Suresh et al. (1986) Methods in Enzymology 121:210; publicacion PCT n.° WO 96/27011; Brennan et al. (1985) Science 229:81; Shalaby et al., J. Exp. Med. (1992) 175:217-225; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148(5):1547-1553; Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 90:6444-6448; Gruber et al. (1994) J. Immunol. 152:5368; y Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60. Los anticuerpos biespedficos tambien incluyen anticuerpos reticulados o heteroconjugados. Los anticuerpos heteroconjugados se pueden fabricar utilizando cualquier metodo de reticulacion conveniente. Los agentes de reticulacion adecuados son bien conocidos en la materia, y se divulgan en la patente de Estados Unidos n.° 4.676.980, junto con una serie de tecnicas de reticulacion.
Tambien se han descrito diversas tecnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos biespedficos directamente a partir de cultivos de celulas recombinantes. Por ejemplo, los anticuerpos biespedficos han sido producidos utilizando cremalleras de leucina. (Vease, por ejemplo, Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148(5):1547- 1553). Los peptidos de cremallera de leucina de las protemas Fos y Jun pueden estar ligados a las partes de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusion genica. Los homodfmeros de anticuerpo se pueden reducir a la region bisagra para formar monomeros y luego se vuelven a oxidar para formar los heterodfmeros de anticuerpo. Este metodo tambien puede utilizarse para la produccion de homodfmeros de anticuerpo. La tecnologfa de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 90:6444-6448 ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespedficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios VH y VL de un fragmento se ven forzados a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando asf dos sitios de union al antfgeno. Otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpos biespedficos mediante el uso de dfmeros de Fv de cadena sencilla (scFv) tambien ha sido notificada. (Vease, por ejemplo, Gruber et al. (1994) J. Immunol 152:5368). Alternativamente, los anticuerpos pueden ser "anticuerpos lineales" como se describe, por ejemplo, en Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062. Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos de Fd en tandem (Vh-Ch1-Vh-Ch1) que forman un par de regiones de union al antfgeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespedficos o monoespedficos.
Conjugados
Un reactivo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un polipeptido de aerolisina no lttica o un anticuerpo que se une a una fraccion de GPI o una protema anclada a GPI) se puede conjugar a una fraccion heterologa. La fraccion heterologa puede ser, por ejemplo, una protema heterologa (vease previamente), un agente terapeutico (por ejemplo, una toxina o un farmaco), o un marcador detectable tal como, pero no se limita a, un marcador radiactivo, un marcador enzimatico, un marcador fluorescente, o un marcador luminiscente. Los marcadores radiactivos adecuados incluyen, por ejemplo, P, P, C, I, I, S, y H. Los marcadores fluorescentes adecuados incluyen, sin limitacion, fluorescema, fluorescema isotiocianato (FITC), Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 647, PVF, DyLight 488, ficoeritrina (PE), yoduro de propidio (PI), PerCP, PE-Alexa Fluor® 700, Cy5, aloficocianina, Cy7, y PE- Alexa Fluor® 750. Los marcadores luminiscentes incluyen, por ejemplo, cualquiera de una variedad de quelatos de lantanido luminiscente (por ejemplo, europio o terbio). Por ejemplo, los quelatos de europio adecuados incluyen el quelato de europio de acido dietilentriaminopentaacetico (DTPA). Los marcadores enzimaticos incluyen, por ejemplo, fosfatasa alcalina, CAT, luciferasa, y peroxidasa de rabano picante.
Los metodos adecuados para conjugar una fraccion heterologa al reactivo son bien conocidos en la materia de la qmmica proteica. Por ejemplo, dos protemas pueden ser reticuladas utilizando cualquiera de una serie de agentes de reticulacion qmmica conocidos. Ejemplos de tales agentes de reticulacion son aquellos que enlazan dos residuos de aminoacidos mediante un enlace que incluye un enlace disulfuro "obstaculizado". En estos enlaces, un enlace disulfuro en la unidad de reticulacion esta protegido (por grupos obstaculizantes a cada lado del enlace disulfuro) de la reduccion por la accion, por ejemplo, de glutation reducido o de la enzima disulfuro reductasa. Un reactivo adecuado, 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a (2-piridilditio) tolueno (SMPT), forma un enlace entre dos protemas que utilizan una lisina terminal en una de las protemas y una cistema terminal en la otra. Los reactivos heterobifuncionales que se reticulan por una fraccion de acoplamiento diferente en cada protema tambien se pueden utilizar. Otros agentes de reticulacion utiles incluyen, sin limitacion, reactivos que enlazan dos grupos amino (por ejemplo, N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida), dos grupos sulfhidrilo (por ejemplo, 1,4-bis-maleimidobutano) un grupo amino y un grupo sulfhidrilo (por ejemplo, ester de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida), un grupo amino y un grupo carboxilo (por ejemplo, 4-[p-azidosalicilamido]butilamina), un grupo amino y un grupo guanidinio que esta presente en la cadena lateral de arginina (por ejemplo, p-azidofenil glioxal monohidrato).
Los marcadores radiactivos se pueden conjugar con el reactivo por enlaces covalentes o no covalentes (por ejemplo, ionico o hidrofobo). Estos pueden unirse a cualquier parte de la protema siempre que la conjugacion no interfiera con la capacidad del reactivo para unirse a una fraccion de GPI o una protema anclada a GPI. Cuando el reactivo es una protema, el marcador radiactivo se puede conjugar directamente al esqueleto de aminoacidos del reactivo. Alternativamente, el marcador radiactivo puede ser incluido como parte de una molecula mas grande (por ejemplo, 125I en meta-[125I]yodofenil-N-hidroxisuccinimida ([125I]mIPNHS) que se une a los grupos amino libres para formar
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derivados de meta-yodofenil (MIP) de protemas relevantes (vease, por ejemplo, Rogers et al. (1997). J. Nucl. Med. 38: 1221-1229) o quelato (por ejemplo, DOTA o DTP) que, a su vez, se une al esqueleto proteico. Los metodos de conjugacion de los marcadores radiactivos o moleculas mas grandes/quelatos que los contienen a los reactivos descritos en la presente memoria tambien son conocidos en la materia. Dichos metodos implican incubar el reactivo con el marcador radioactivo en condiciones (por ejemplo, pH, concentracion de sal, y/o temperatura) que faciliten la union del marcador radiactivo o quelato al reactivo (vease, por ejemplo patente de Estados Unidos n.° 6.001.329).
Los metodos para conjugar un marcador fluorescente (conocido a veces como un "fluoroforo") con un reactivo (por ejemplo, una protema aerolisina no lttica o un anticuerpo) son conocidos en la materia de la qmmica proteica. Por ejemplo, los fluoroforos se pueden conjugar con los grupos amino libres (por ejemplo, de lisinas) o grupos sulfhidrilo (por ejemplo, cistemas) de protemas utilizando ester succinimidil (NHS) o fracciones de ester TFP fijadas a los fluoroforos. En algunas realizaciones, los fluoroforos se pueden conjugar a una fraccion de agente reticulante heterobifuncional, tal como sulfo-SMCC. Los metodos de conjugacion adecuados implican la incubacion del reactivo con el fluoroforo en condiciones que faciliten la union del fluoroforo al reactivo. Veanse, por ejemplo, Welch y Redvanly (2003) "Handbook of Radiopharmaceuticals: Radiochemistry and Applications", John Wiley y Sons (ISBN: 0471495603). Diversos kits estan disponibles comercialmente para su uso en la conjugacion de un fluoroforo a una protema, por ejemplo, kit de marcado proteico Alexa Fluor® 488 y kit de marcado proteico Alexa Fluor® 647 (Molecular Probes, Invitrogen™).
El fluoroforo se puede conjugar con un reactivo en 1-2 mol de colorante por mol de protema.
Los reactivos descritos en la presente memoria (por ejemplo, una protema aerolisina o un anticuerpo que se une a una fraccion de GPI o una protema anclada a GPI) se pueden modificar, por ejemplo, con una fraccion que mejora la estabilizacion y/o retencion de los propios anticuerpos en la circulacion, por ejemplo, en sangre, suero, u otros tejidos. Por ejemplo, un reactivo descrito en la presente memoria puede ser PEGilado como se describe, por ejemplo, en Lee et al. (1999) Bioconjug. Chem 10(6): 973-8; Kinstler et al. (2002) Advanced Drug Deliveries Reviews 54:477-485; y Roberts et al. (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476. La fraccion de estabilizacion puede mejorar la estabilidad, o la retencion del reactivo en el cuerpo de un sujeto (por ejemplo, sangre o tejido) en al menos 1,5 veces (por ejemplo, al menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, o 50 o mas).
Muestras biologicas y de recogida de muestras
Las muestras biologicas adecuadas para su uso en los metodos descritos en la presente memoria incluyen cualquier fluido biologico, poblacion de celulas, o tejido o fraccion de los mismos, que incluye uno o mas globulos blancos y/o uno o mas globulos rojos. Una muestra biologica puede ser, por ejemplo, un especimen obtenido de un sujeto (por ejemplo, un mairnfero, tal como un ser humano) o puede derivarse de dicho sujeto. Por ejemplo, una muestra puede ser una seccion de tejido obtenido por biopsia, o celulas que se colocan o adaptan para el cultivo tisular. Una muestra biologica tambien puede ser un fluido biologico, tal como orina, sangre entera o una fraccion de las mismas (por ejemplo, plasma), saliva, semen, esputo, lfquido cefalorraqrndeo, lagrimas, o mocos. Una muestra biologica puede fraccionarse adicionalmente, si se desea, en una fraccion que contiene tipos de celulas particulares. Por ejemplo, una muestra de sangre entera puede fraccionarse en suero o en fracciones que contienen tipos particulares de celulas de sangre, tales como globulos rojos o globulos blancos (leucocitos). Si se desea, una muestra biologica puede ser una combinacion de diferentes muestras biologicas de un sujeto, tal como una combinacion de una muestra de tejido y fluido.
Las muestras biologicas pueden obtenerse a partir de un sujeto, por ejemplo, un sujeto que tiene, se sospecha que tiene, o corre el riesgo de desarrollar hemoglobinuria paroxfstica nocturna (HPN). Cualquier metodo adecuado para obtener las muestras biologicas se puede emplear, aunque los metodos a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, flebotomna, hisopo (por ejemplo, un hisopo bucal), lavado, o procedimiento de biopsia y aspirado con aguja fina. Los ejemplos no limitantes de tejidos susceptibles al aspirado con aguja fina incluyen los ganglios linfaticos, pulmones, tiroides, mama, e hfgado. Las muestras biologicas tambien pueden ser obtenidas de la medula osea. Las muestras tambien se pueden recoger, por ejemplo, por microdiseccion (por ejemplo, microdiseccion de captura por laser (MCL) o microdiseccion por laser (MDL)), lavado de vejiga, frotis cervical (frotis cervical PAP), o lavado ductal.
Los metodos para obtener y/o almacenar muestras que preservan la actividad o la integridad de las celulas en la muestra biologica son bien conocidos por los expertos en la materia.
Por ejemplo, una muestra biologica puede ponerse en contacto ademas con uno o mas agentes adicionales, tales como tampones y/o inhibidores apropiados, incluyendo inhibidores de la proteasa, los agentes destinados a preservar o minimizar cambios en las celulas (por ejemplo, cambios en la osmolaridad o pH) o desnaturalizacion de las protemas de la superficie celular (por ejemplo, protemas ligadas a GPI) o fracciones de GPI en la superficie de las celulas. Tales inhibidores incluyen, por ejemplo, quelantes, tales como acido etilendiaminatetraacetico (EDTA), acido de etileno glicol tetraacetico (EGTA), inhibidores de la proteasa, tales como fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), aprotinina, y leupeptina. Los tampones y condiciones apropiados de almacenamiento o de otra manera de manipulacion de celulas enteras se describen, por ejemplo, en Pollard y Walker (1997), "Basic Cell Culture Protocols", volumen 75 de Methods in Molecular Biology, Humana Press; Masters (2000) "Animal cell culture: a
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practical approach", volumen 232 de Practical approach series, Oxford University Press; y Jones (1996) "Human cell culture protocols", volumen 2 de Methods in molecular medicine, Humana Press".
Una muestra tambien puede ser procesada para eliminar o minimizar la presencia de sustancias interferentes. Por ejemplo, una muestra biologica se puede fraccionar o purificar para extraer uno o mas materiales (por ejemplo, celulas) que no son de interes. Los metodos de fraccionamiento o purificacion de una muestra biologica incluyen, entre otros, citometna de flujo, clasificacion de celulas activadas por fluorescencia, y sedimentacion.
Metodos de diagnostico y terapeuticos
Como se ha senalado previamente y elaborado en los ejemplos practicos, los inventores han descubierto una relacion clmica entre la presencia o la cantidad de celulas hematopoyeticas de HPN de tipo II (por ejemplo, globulos blancos de tipo II y/o globulos rojos de tipo II) y trombocitopenia en un paciente. Por ejemplo, los inventores han determinado que un paciente con una poblacion celular de globulos blancos de HPN de tipo II de al menos 1,2 % (por ejemplo, al menos 1,2, 1,5, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 22, 25, 27, 30, 32, 35, 37, 40, 42, 45, 47, 50, 52, 55, 57, 60, 62, 65, o 65,3 o mas) en comparacion con los globulos blancos totales del mismo tipo histologico (el mismo linaje) en la muestra biologica ensayada sea posiblemente trombocitopenico que un paciente que no tiene una poblacion de globulos blancos de HPN de tipo II detectable o un paciente con una poblacion de globulos blancos de HPN de tipo II inferior a 1,2%. Las muestras de pacientes con poblaciones de granulocitos de HPN de tipo II tuvieron recuentos similares de globulos blancos perifericos, recuentos de globulos rojos perifericos, recuentos de neutrofilos absolutos, y niveles de hemoglobina (HGB), en comparacion con las muestras de pacientes sin poblaciones de granulocitos de tipo II detectables, lo que indica que las diferencias en los recuentos de plaquetas no son probables debido a las diferencias en la produccion de la medula osea subyacente. En otras palabras, la disminucion de los recuentos de plaquetas en pacientes con clones de granulocitos de HPN de tipo II detectables puede ser debida a un mayor consumo o destruccion de plaquetas mediada por el complemento terminal, que puede estar asociado con la trombosis, la causa principal de muerte entre los pacientes con HPN. Vease, por ejemplo, Franchini (2006) Hematology 11(3):139-146. En consecuencia, la presente divulgacion presenta metodos para utilizar la informacion relacionada con el porcentaje de globulos blancos de HPN de tipo II en una muestra del paciente para determinar si el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombocitopenia y/o trombosis. Del mismo modo, los inventores han determinado que un paciente con una poblacion de GRs de hPn de tipo II de al menos 0,02 % (por ejemplo, al menos 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 71,3, o 75 o mas) es probable que sea trombocitopenico que un paciente que no tiene una poblacion de GRs de HPN de tipo II detectable o un paciente con una poblacion de GRs de HPN de tipo II a 0,02 %. Asf, la presente divulgacion tambien presenta metodos para utilizar la informacion relacionada con el tamano del clon de GRs de HPN de tipo II en un paciente para determinar si el paciente corre el riesgo de desarrollar trombocitopenia y/o trombosis.
Los siguientes metodos pueden ser empleados para detectar la presencia, o para determinar el porcentaje de celulas hematopoyeticas de HPN de tipo II (por ejemplo, globulos blancos de HPN de tipo II) en comparacion con la cantidad total de celulas del mismo tipo histologico (mismo linaje) en una muestra biologica procedente del paciente. Cuando se interroga una pluralidad de globulos blancos, los metodos pueden ser utiles para permitir a un profesional sanitario habilitado distinguir entre poblaciones de globulos blancos de HPN de tipo I, tipo II y tipo III del mismo tipo histologico (mismo linaje) a fin de determinar con precision el tamano de la poblacion de HPN anormal total (es decir, celulas de tipo II mas tipo III) en comparacion con el numero total de globulos blancos del mismo tipo histologico en la pluralidad (y/o permitir que el profesional sanitario habilitado determine el porcentaje de globulos blancos de HPN de tipo II en la pluralidad). En primer lugar, una poblacion de celulas (por ejemplo, globulos blancos, globulos rojos, o una combinacion de globulos blancos y rojos) se pone en contacto con un reactivo que se une a: (i) una fraccion de GPI o (ii) a una protema ligada a GPI durante un periodo de tiempo y en condiciones que permitan la union del reactivo a la fraccion de GPI o a la protema unida a GPI si esta presente en la superficie de las celulas presentes en la muestra. La poblacion de celulas puede estar presente en una muestra biologica (por ejemplo, una muestra de sangre entera; vease la seccion titulada "Muestras biologicas y recogida de muestras"), por ejemplo, una muestra biologica obtenida de un paciente. Por ejemplo, las celulas presentes en una muestra de sangre entera procedente de un paciente pueden ponerse en contacto con una protema aerolisina (por ejemplo, una forma no lttica de aerolisina) o un anticuerpo que se une a una fraccion de GPI o una protema anclada a GPI, tal como CD59. Veanse, por ejemplo, Hall y Rosse (1996) Blood 87(12):5332- 5340 y la patente de Estados Unidos n.° 6.593.095. Al menos una parte de las celulas (por ejemplo, globulos blancos o GRs) en contacto con el reactivo se puede distinguir basandose en la cantidad de reactivo unido a la superficie de las celulas. Por ejemplo, cuando se utilizo un reactivo marcado de forma detectable, la cantidad de reactivo unido a la superficie se puede determinar como una funcion de la cantidad total de la senal producida a partir de un reactivo marcado de manera detectable unido a la superficie de la celula. Como se ha descrito anteriormente, la cantidad de union del reactivo a la celula refleja la cantidad de expresion de fracciones de GPI y/o protemas ancladas a GPI, que son indicativas de si las celulas son celulas de HPN de tipo III (expresion escasa o nula de GPI y protemas ancladas a GPI), celulas normales (celulas de tipo I; que tienen un nivel relativamente alto de expresion de GPI y protemas ancladas a GPI en comparacion con las celulas de tipo III) y las celulas de HPN de tipo II (que tienen un nivel intermedio de expresion de GPI y protemas ancladas a
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GPI en comparacion con las celulas de tipo I y las celulas de tipo III). El proceso de distincion o interrogacion puede implicar, por ejemplo, una citometna de flujo.
Los metodos pueden utilizarse para detectar la cantidad de union de un reactivo en los GRs de una muestra procedente del paciente. Los metodos pueden utilizarse para detectar la cantidad de union de un reactivo en los globulos blancos de una muestra procedente del paciente. Los globulos blancos que son particularmente susceptibles de evaluacion en los metodos de diagnostico descritos en la presente memoria incluyen, por ejemplo, granulocitos y monocitos (por ejemplo, macrofagos).
Las muestras pueden ser de los pacientes que han tenido, se sospecha que tienen, o corren el riesgo de desarrollar hemoglobinuria paroxfstica nocturna (HPN). Los pacientes pueden tener uno o mas smtomas que incluyen, por ejemplo, hemolisis intravascular de Coombs negativa, niveles de LC elevados, anemia por deficiencia de hierro recurrente, trombosis en sitios inusuales, disfagia episodica, o dolor abdominal.
Para ayudar en la identificacion de celulas normales o celulas de HPN, un conjunto de poblaciones de celulas de control tambien puede ser sometido al metodo de deteccion. Las poblaciones de control pueden ser evaluadas antes, simultaneamente, o despues de la evaluacion de la poblacion celular de interes. Como se discute con mas detalle a continuacion, un profesional sanitario habilitado puede elegir someter una poblacion de control de celulas conocidas por ser celulas de HPN de tipo II, una poblacion de control de celulas conocidas por ser celulas de HPN de tipo III, y/o una poblacion de control de celulas conocidas por ser celulas normales o de tipo I para los metodos para determinar la cantidad tfpica, o cantidad media de union del reactivo utilizado para un tipo particular de celula. Esta informacion de control se puede utilizar para clasificar o identificar las celulas (por ejemplo, globulos blancos o globulos rojos) de interes como celulas normales, celulas de HPN de tipo II, y/o celulas de HPN de tipo III.
Dependiendo de la composicion particular de la poblacion de celulas en la muestra biologica, al menos algunas celulas de la poblacion pueden distinguirse de otras celulas sobre la base de una alta cantidad de reactivo unido, una baja cantidad de reactivo unido, o un nivel intermedio de reactivo unido. En algunos casos, solo las celulas con una alta cantidad de reactivo unido estaran presentes (por ejemplo, las celulas de un paciente sano o un paciente que no tiene HPN). En algunos casos, un mayor porcentaje de celulas tendra poco, o ningun, reactivo unido a su superficie (por ejemplo, globulos blancos o GRs de un paciente con HPN que tiene un alto porcentaje de celulas de HPN de tipo III).
Una poblacion de celulas en contacto con el reactivo se puede clasificar en las categonas alta, baja, e intermedia en base a la cantidad de reactivo unido a las celulas.
Una o mas celulas (por ejemplo, uno o mas celulas interrogadas o distinguidas) se pueden clasificar en base a la cantidad de reactivo unido a su superficie celular. Como se ejemplifica en los ejemplos practicos y se representa en la Fig. 1, las celulas individuales en una poblacion se pueden clasificar con facilidad como reactivo altamente unido, reactivo bajo o mal unido, y reactivo unido de forma intermedia utilizando metodos de citometna de flujo. Por ejemplo, los globulos blancos obtenidos de un paciente con HPN se ponen en contacto con dos reactivos diferentes: un primer reactivo que se une a una fraccion de GPI (por ejemplo, una protema aerolisina no lttica, marcada de manera detectable) y un segundo reactivo que se une a una protema anclada a GPI (por ejemplo, un anticuerpo marcado de manera detectable que se une a CD24 humano). El primer reactivo y el segundo reactivo se marcan con diferentes marcadores detectables. Las celulas en contacto se someten entonces a citometna de flujo. Un experto en la materia en la materia de citometna de flujo sera capaz de utilizar con facilidad los metodos para distinguir entre las celulas basadas en la cantidad de union de cada reactivo en las celulas. Veanse, por ejemplo, Macey (2007) "Flow Cytometry: principles and applications", Humana Press (ISBN: 1588296911) y Brodsky et al. (2000) Am J Clin Pathol 114:459-466. Como se muestra en la Fig. 1, los metodos de citometna de flujo se pueden utilizar con facilidad para clasificar granulocitos obtenidos de un paciente con HPN que tiene una alta cantidad de union de cada uno de los reactivos (poblacion celular en la parte superior derecha; celulas normales o de tipo I), una baja cantidad de union de cada reactivo (poblacion celular en la parte inferior izquierda; celulas de tipo III), y una cantidad intermedia de union de cada reactivo (poblacion de celulas en la parte inferior central; celulas de tipo II).
La clasificacion de una celula se puede realizar mediante la comparacion de la cantidad del reactivo unido a la celula con una cantidad de control (por ejemplo, una cantidad de control de la union del reactivo a las celulas de HPN de tipo I, celulas de HPN de tipo II, y/o celulas de HPN de tipo III). La cantidad de control de la union del reactivo a las celulas de HPN de tipo I se puede basar en, por ejemplo, la cantidad promedia de union observada del reactivo a las celulas del mismo tipo histologico obtenido a partir de uno o mas (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 15, 20, 25, 30, 35, o 40 o mas) individuos sanos. La cantidad de control de la union del reactivo a las celulas de HPN de tipo III puede basarse, por ejemplo, en la cantidad media de union observada a las celulas del mismo tipo obtenido a partir de uno o mas (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 15, 20, 25, 30, 35, o 40 o mas) pacientes con HPN. La cantidad de control de la union del reactivo a celulas de HPN de tipo II se puede basar, por ejemplo, en la cantidad media de union observada a las celulas del mismo tipo obtenido a partir de uno o mas (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 15, 20, 25, 30, 35, o 40 o mas) pacientes con HPN y que tienen una poblacion de celulas de HPN de tipo II detectable del mismo tipo histologico (mismo linaje). Por ejemplo, para clasificar un globulo blanco de interes basado en la cantidad de reactivo unido a la superficie de la celula, un profesional sanitario habilitado puede comparar la cantidad de reactivo unido a la celula
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con la cantidad tfpica, o la cantidad media de reactivo unido a un globulo blanco conocido por ser un globulo blanco de HPN de tipo I, un globulo blanco conocido por ser un globulo blanco de HPN de tipo II, y/o un globulo blanco conocido por ser un globulo blanco de HPN de tipo III.
La distincion o clasificacion de una celula (por ejemplo, un globulo blanco o GR) de interes se puede realizar determinando si la cantidad de un reactivo unido a la celula cae dentro de un intervalo predeterminado indicativo de celulas de HPN de tipo I, celulas de HPN de tipo II, o celulas de HPN de tipo III del mismo tipo histologico.
La distincion o clasificacion de una celula hematopoyetica de interes puede incluir determinar si la cantidad de reactivo unido a la superficie de la celula cae por encima o por debajo de un valor de corte predeterminado. Un valor de corte es normalmente la cantidad de reactivo unido a la superficie de una celula (o la cantidad de senal detectada de una celula) por encima o por debajo de lo que se considera indicativo de una cierta clase de celulas, a saber, celulas de HPN de tipo I, celulas de HPN de tipo II, o celulas de HPN de tipo III.
Algunos valores de corte no son absolutos puesto que las correlaciones de diagnostico (por ejemplo, una cantidad de reactivo unido a la superficie de la celula y la probabilidad de que la celula sea una celula de hPn de tipo II) aun pueden mantenerse significativos sobre un intervalo de valores en cada lado del corte. Se entiende que los refinamientos en los valores de corte optimos pudieron determinarse en funcion de la calidad de los reactivos utilizados, la sofisticacion de los metodos estadfsticos y del dispositivo de deteccion (por ejemplo, citometna de flujo) utilizados, y en el numero y la fuente de muestras interrogadas. Por lo tanto, los valores de corte se pueden ajustar hacia arriba o hacia abajo sobre la base de las reevaluaciones o cambios periodicos en la metodologfa o en la distribucion de muestras.
Como se utiliza en la presente memoria, "trombocitopenia" se refiere a una condicion en la que un paciente tiene un recuento de plaquetas inferior a 200.000 (por ejemplo, inferior a 150.000; inferior a 140.000; inferior a 130.000; inferior a 120.000; inferior a 110.000; inferior a 100.000; o inferior a 90.000) plaquetas por pi de sangre. Un paciente con trombocitopenia tiene un recuento de plaquetas inferior a 100.000 plaquetas por pl de sangre.
Como se ha descrito anteriormente, la informacion relacionada con el porcentaje de celulas de HPN de tipo II se puede utilizar en metodos para determinar si un paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis. La informacion relacionada con el porcentaje de celulas de HPN de tipo II (por ejemplo, globulos blancos de tipo II y/o globulos rojos de tipo II) en una muestra biologica procedente de un paciente puede ser comunicada (por ejemplo, en forma, electronica o impresa) a un profesional sanitario para que sea utilizado por el profesional sanitario habilitado para la seleccion de un regimen terapeutico apropiado para el paciente. Basado en una poblacion de globulos blancos de HPN de tipo II de al menos 1,2 % (por ejemplo, al menos 1,2, 1,5, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 22, 25, 27, 30, 32, 35, 37, 40, 42, 45, 47, 50, 52, 55, 57, 60, 62, 65, o 65,3 o mas) en comparacion con el numero total de globulos blancos del mismo tipo histologico en la muestra biologica ensayada, el profesional sanitario habilitado puede determinar que el paciente corre el riesgo de desarrollar trombocitopenia, o que puede ser trombocitopenico. Del mismo modo, un paciente con una poblacion de GRs de HPN de tipo II de al menos 0,02 % (por ejemplo, al menos 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8. 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 71,3, o 75 o mas) de GRs totales en la muestra biologica ensayada es probable que sea trombocitopenico que un paciente que no tiene una poblacion de GRs de HPN de tipo II detectable o un paciente que tiene una poblacion de GRs de HPN de tipo II inferior a 0,02 %. Un paciente con una poblacion de globulos blancos de HPN de tipo II de al menos 1,2 % o una poblacion de globulos rojos de HPN de tipo II de al menos 0,02 % puede ser, por ejemplo, al menos 1,5 veces (por ejemplo, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 15, 20, 30, o incluso 40 o mas) probable de desarrollar un trombo que un individuo normal o un paciente que no tiene ese porcentaje de celulas de HPN de tipo II.
El profesional sanitario puede solicitar ensayos adicionales para determinar los recuentos de plaquetas en el paciente. Los metodos para determinar los recuentos de plaquetas en una muestra derivada de sangre procedente de un sujeto son bien conocidos en el materia de la medicina y se describen, por ejemplo, en Sallah et al. (1998) Postgraduate Medicine 103:209-210; Kottke-Marchant (1994) Hematol Oncol Clin North Am. 8:809-853; Redei et al. (1995) J Crit illn 10:133-137; Butkiewicz et al. (2006) Thrombosis Research 118(2)199-204; Tomita et al. (2000) Am J Hematol 63(3):131-135; y Schrezenmeier et al. (1998) Br J Haematol 100(3):571-576.
Si el paciente es determinado por el profesional sanitario por ser trombocitopenico o es probable que sea trombocitopenico, el profesional sanitario habilitado puede seleccionar, prescribir o administrar al paciente una terapia anti-trombocitopenica. La terapia anti-trombocitopenica puede ser, por ejemplo, un corticosteroide, una transfusion de plaquetas, una esplenectoirna, o un agente estimulante de la produccion de plaquetas. El agente estimulante de la produccion de plaquetas puede ser, por ejemplo, trombopoyetina (TPO) o un mimetico de trombopoyetina. Veanse, por ejemplo, Kuter y Begley (2002) Blood 100:3457-3469; Li et al. (2001) Blood 98:32413248; y Vadhan-Raj et al. (2000) Ann Intern Med 132:364-368. Un peptido mimetico de TPO puede tener la secuencia de aminoacidos representada en la Figura 5 de la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20030049683.
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Si el porcentaje de globulos blancos de HPN de tipo II en una muestra biologica de un paciente es de aproximadamente 1,2 %, el profesional sanitario tambien puede determinar que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis. El profesional medico puede entonces seleccionar una terapia anti-trombotica apropiada para el paciente. Por ejemplo, el profesional sanitario habilitado puede seleccionar, prescribir o administrar al paciente un anticoagulante o un agente trombolttico. El anticoagulante puede ser, por ejemplo, coumadina, heparina o derivados de los mismos. El agente trombolttico puede ser, por ejemplo, un activador del plasminogeno tisular (por ejemplo, Retavase™, Rapilysin™), estreptoquinasa, o un activador del plasminogeno de tipo uroquinasa.
Un paciente determinado por tener una poblacion de globulos blancos de HPN de tipo II superior o igual a 1,2 % o una poblacion de globulos rojos de HPN de tipo II superior o igual a 0,02 % puede ser diagnosticado con tener HPN. Un paciente diagnosticado con HPN o un paciente diagnosticado previamente con HPN esta determinado a tener una poblacion de globulos blancos de HPN de tipo II superior o igual a 1,2 % o una poblacion de globulos rojos de HPN de tipo II que es superior o igual a 0,02 %, puede ser prescrito y/o tratado con un inhibidor del complemento.
Cualquiera de los compuestos que se unen o de otro modo bloquean la generacion y/o actividad de cualquiera de los componentes del complemento humano puede ser utilizado de acuerdo con la presente divulgacion. Por ejemplo, un inhibidor del complemento puede ser, por ejemplo, una pequena molecula, un acido nucleico o analogo de acido nucleico, un peptidomimetico, o una macromolecula que no es un acido nucleico o una protema. Estos agentes incluyen, entre otros, moleculas organicas pequenas, aptameros de ARN, aptameros de L-ARN, Spiegelmers, compuestos antisentido, ARN bicatenario, ARN de interferencia pequeno, inhibidores de acido nucleicos bloqueados, e inhibidores de acidos nucleicos peptfdicos. Un inhibidor del complemento puede ser una protema o fragmento de protema.
Los anticuerpos espedficos a un componente del complemento humano son utiles en la presente memoria. Algunos compuestos incluyen anticuerpos dirigidos contra componentes del complemento C1, C2, C3, C4, C5 (o un fragmento del mismo; vease mas adelante), C6, C7, C8, C9, Factor D, Factor B, Factor P, MBL, MASP-1, y MASP-2, evitando asf la generacion de la actividad anafilatoxica asociada con C5a y/o prevencion del ensamblaje del complejo de ataque a la membrana asociado con C5b.
Tambien son utiles en los presentes metodos formas de origen natural o solubles de los compuestos inhibidores del complemento, tales como CR1, LEX-CR1, MCP, DAF, CD59, Factor H, factor de veneno de cobra, FUT-175, complestatina, y K76 COOH. Otros compuestos que se pueden utilizar para unirse o de otra manera bloquear la generacion y/o la actividad de cualquiera de los componentes del complemento humano incluyen, entre otros, protemas, fragmentos de protemas, peptidos, moleculas pequenas, aptameros de ARN, incluyendo ARC187 (que esta disponible comercialmente en Archemix Corporation, Cambridge, MA), aptameros L-ARN, Spielgelmers, compuestos antisentido, inhibidores de serina proteasa, moleculas que se pueden utilizar en la interferencia del ARN (ARNi) como el ARN bicatenario incluyendo ARN de interferencia pequenos (ARNis), inhibidores del acido nucleico bloqueado (ANB), inhibidores de acidos nucleicos peptfdicos (ANP), etc.
El inhibidor del complemento inhibe la activacion del complemento. Por ejemplo, el inhibidor del complemento puede unirse e inhibir la actividad de la activacion del complemento de C1 (por ejemplo, C1q, C1r, o C1s) o el inhibidor del complemento puede unirse e inhibir (por ejemplo, inhibir la escision de) C2, C3, o C4.
El inhibidor puede inhibir la formacion o ensamblaje de la convertasa C3 y/o convertasa C5 de las vfas alternativas y/o clasicas del complemento.
El inhibidor del complemento puede inhibir la formacion del complemento terminal, por ejemplo, formacion del complejo de ataque de la membrana C5b-9. Por ejemplo, un inhibidor del complemento del anticuerpo puede incluir un anticuerpo anti-C5. Tales anticuerpos anti-C5 pueden interactuar directamente con C5 y/o C5b, de manera que se inhibe la formacion y/o la funcion fisiologica de C5b. Los anticuerpos anti-C5 a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, eculizumab (Soliris®; Alexion Pharmaceuticals, Inc., Cheshire, CT; veanse, por ejemplo, Kaplan (2002) Curr Opin Investig Drugs 3(7):1017-1023; Hill (2005) Clin adv Hematol Oncol 3 (11):849- 50; y Rother et al. (2007) Nature Biotechnology 25(11):1256-1488) y pexelizumab (Alexion Pharmaceuticals, Inc., Cheshire, CT; veanse, por ejemplo, Whiss (2002) Curr Opin Investig Drugs 3(6):870-7; Patel et al. (2005) Drugs Today (Barc) 41(3):165-70; y Thomas et al. (1996) MoI Immunol. 33(17-18):1389-401).
Los metodos para la administracion de una terapia anti-trombotica y/o una terapia anti-trombocitopenica apropiada a un paciente en necesidad del mismo son bien conocidos en la materia de la medicina.
Los metodos para determinar si un paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombocitopenia o trombosis pueden ser ayudados por ordenador. Por ejemplo, los metodos pueden incluir datos de recepcion que incluyen un perfil medico de un paciente con HPN, el perfil comprende informacion sobre el porcentaje de globulos blancos de HPN de tipo II sobre los globulos blancos totales del mismo tipo histologico (mismo linaje) en una muestra biologica procedente del paciente; y el procesamiento de al menos parte de los datos que contienen la informacion para determinar si el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis. En otro ejemplo, los metodos pueden incluir proporcionar informacion sobre el porcentaje de globulos blancos de HPN de tipo II sobre los globulos blancos totales del mismo tipo histologico en una muestra biologica procedente del paciente; la introduccion de la
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informacion en un ordenador; y el calculo de un parametro que indica si el paciente corre un mayor riesgo de trombosis utilizando el ordenador y la informacion de entrada. El riesgo relativo del paciente a desarrollar trombocitopenia o trombosis puede ser la salida por el ordenador en forma impresa y/o puede ser almacenada en un medio legible por ordenador.
Kits
Asimismo se presentan en la presente memoria kits para su uso en: determinar si una muestra biologica procedente de un paciente contiene una poblacion de globulos blancos de HPN de tipo II y/o determinar si un paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombocitopenia o trombosis. Los kits pueden incluir, por ejemplo, uno o mas conjugados marcados detectablemente seleccionados entre: un conjugado de aerolisina (por ejemplo, un conjugado de variante no lttica de protema aerolisina) o conjugados de anticuerpos que se unen a las protemas ancladas a GPI. Los kits tambien pueden incluir una muestra de control que contiene una celula que expresa GPI o una partmula unida a GPI; y, opcionalmente, instrucciones para detectar la presencia de una celula que expresa GPI. Los kits tambien pueden incluir uno o mas medios para obtener una muestra biologica (por ejemplo, una muestra de sangre) procedente de un ser humano y/o cualquiera de los componentes del kit descritos anteriormente.
Los siguientes ejemplos tienen por objeto ilustrar, no limitar, la invencion.
Ejemplos
Ejemplo 1. Materiales y metodos
Se obtuvieron un total de 2.921 muestras de sangre periferica de pacientes para ensayar la presencia de celulas de HPN de tipo II y celulas de HPN de tipo III. Las muestras de sangre fueron extrafdas en viales esteriles que conteman EDTA.
Para determinar el porcentaje de globulos blancos normales (celulas de tipo I), los globulos blancos de HPN de tipo II, y de HPN de tipo III presentes en cada una de las muestras de los pacientes, la sangre periferica se mezclo y se tino con uno o mas de los siguientes conjugados: una variante no lttica de protema de aerolisina conjugado con Alexa Fluor® 488 (Protox Biotech FL2-S), un anticuerpo anti-CD24 conjugado con ficoeritrina (FE) (Clon ALB9 Beckman Coulter), un anticuerpo anti-CD15 conjugado con PC5 (Clon 80H5), y un anticuerpo anti-CD45 conjugado con PC7 (Clon J.33). Despues de la incubacion de la sangre con uno o mas de los reactivos anteriores durante 1530 minutos a temperatura ambiente, la sangre se liso con Immunoprep™ (Beckman Coulter) y se lavo dos veces con tampon PBA (solucion salina tamponada con fosfato, seroalbumina bovina al 1 %, y 10 mM de NaN3). Posteriormente, las celulas se volvieron a suspender en tampon PBA y se analizaron utilizando el citometro de flujo FC 500 (Beckman Coulter). Si se identifico una poblacion de granulocitos de HPN de tipo II o tipo III, los monocitos tambien fueron interrogados para una poblacion de tipo II o tipo III utilizando la sangre del paciente en contacto con uno o mas de los siguientes conjugados: una variante no lttica de protema aerolisina conjugada con AlexaFluor® 488 (Protox Biotech FL2-S), un anticuerpo que se une a CD33 conjugado con ficoeritrina (FE) (clon D3HL60.251), un anticuerpo que se une a CD14 conjugado con ECD (Clon RMO52), un anticuerpo que se une a CD64 conjugado con PC5 (Clon 22), y un anticuerpo que se une a CD45 conjugado con PC7 (Clon J.33), lo que permitio la seleccion de poblaciones espedficas para el linaje en monocitos.
Para determinar el porcentaje de globulos rojos normales (celulas de tipo I), se colocaron 20 pl de globulos rojos de HPN de tipo II, y de HPN de tipo III de sangre periferica en EDTA en 3 ml de tampon fosfato salino (TFS) y se mezclaron minuciosamente. 50 pl de sangre diluida del paciente se puso en contacto con uno o mas de los siguientes conjugados: un anticuerpo anti-CD235a conjugado con FITC (clon 11E4B-7-6/KC16 Beckman Coulter) y un anticuerpo anti-CD59 conjugado con FE (Clon MEM-43 Invitrogen). La sangre y los conjugados se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora mientras se agitaban en vortex cada 15 minutos. Despues de la incubacion de una hora, la sangre se lavo dos veces con TFS, se volvio a suspender en TFS, y se analizo en un citometro de flujo FC 500 (Beckman Coulter).
Ejemplo 2.
Las muestras de sangre entera de 2.921 pacientes, cuyas muestras se sometieron a ensayos de diagnostico para HPN, se analizaron utilizando un ensayo basado en citometna de flujo de alta sensibilidad para detectar el nivel de expresion de GPI y las protemas ancladas a GPI en los globulos blancos (en particular granulocitos) para determinar de este modo las poblaciones de globulos blancos (granulocitos) de tipo I, de HPN tipo II y de HPN de tipo III en cada una de las muestras. El ensayo tambien se utilizo para detectar las poblaciones de globulos rojos de tipo I, de HPN de tipo II, y de HPN de tipo III. Los metodos emplearon una variante no lttica de protema aerolisina marcada con fluorescencia junto con anticuerpos contra antfgenos proteicos espedficos de linaje anclados a GPI espedfico. Un analisis de citometna de flujo a modo de ejemplo de una muestra del paciente se representa en la Fig. 1. Las celulas de una muestra de sangre entera se pusieron en contacto con el reactivo de aerolisina marcado con fluorescencia (Alexa Fluor) y un anticuerpo marcado con ficoeritrina (FE) que se une a la protema anclada a GPI CD24. Las celulas de la muestra de sangre entera se sometieron a un analisis de citometna de flujo y los
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granulocitos expresados en este se basaron en la cantidad de senal detectada de cada reactivo unido a la superficie de los granulocitos. Como se muestra en la Fig. 1, los granulocitos con la mayor cantidad de senal detectada de los marcadores con AlexaFluor y FE (parte superior derecha; celulas de tipo l) se separaron de las poblaciones de granulocitos que tuvieron una senal muy baja o ausente (parte inferior izquierda; granulocitos de tipo Ill) y los granulocitos que produjeron una cantidad de senal intermedia (poblacion media; granulocitos de tipo II).
Las poblaciones de globulos rojos de HPN fueron interrogadas utilizando dos reactivos: un anticuerpo marcado de manera detectable que se une a CD235 y un reactivo marcado de forma detectable que se une a CD59. Las poblaciones de globulos blancos de HPN fueron interrogadas mediante la protema aerolisina marcada de forma detectable y varios anticuerpos con respecto a protemas de superficie celular espedficas de linaje ancladas a GPI, incluyendo CD24, CD14, CD16, CD66b y CD55.
216 de las muestras de pacientes tuvieron una poblacion de granulocitos de HPN de tipo Ill detectable que fue >0,01 % del numero total de los granulocitos en la muestra y un recuento absoluto de al menos 50 granulocitos de HPN de tipo Ill. La informacion clmica relacionada con varios parametros (por ejemplo, niveles de hemoglobina, niveles de LC, y recuentos de plaquetas) estaba disponible para 162 de estos pacientes (vease la Tabla 1).
Tabla 1. Caracteristicas clmicas de los pacientes con una poblacion de granulocitos de HPN de tipo Ill o II detectable ____________________________(en la que se dispusieron los datos clmicos).___________________________
Casos de granulocitos con tipo II (N=19) Casos de granulocitos sin tipo II (N=143) Valor de P de Wilcoxon
Poblacion de granulocitos media (intervalo) total de HPN (%)
87,20 (9,2-99,5) 11,40 (0,01-99,9) <0,01
Poblacion de granulocitos media (intervalo) de HPN de tipo II (%)
7,10 (1,2-65,3) n/a n/a
Poblacion de granulocitos media (intervalo) de HPN de tipo Ill (%)
76,0 (4,5-96,4) 0,20 (0-76,20) <0,01
Poblacion de GRs media (intervalo) de HPN de tipo II (%)
3,30 (0,02-71,3) 0,20 (0-76,20) <0,01
Poblacion de GRs media (intervalo) Ill de HPN de tipo (%)
16,10 (0,03-86,70) 2,90 (0-92,9) 0,01
Media de globulos blancos (x109/l)
3,80 4,20 0,44
Media absoluta del recuento de neutrofilos (celulas/pl)
2,07 2,15 0,70
Media de GRs (x1012/l)
3,08 3,14 0,80
Media de hemoglobina (g/dl)
10,6 10,4 0,87
Media de LC (Ul/l)
336 315 0,88
Media de plaquetas (x109/l)
54 116 0,01
Plaquetas <100 x109/l (%)
68,4 (13/19) 44,0 (62/141) 0,05*
Ensayo exacto de Fisher*
De las muestras de pacientes en la que se disporna la informacion clmica, 19 (8,8%) muestras de pacientes conternan poblaciones de granulocitos de tipo II distintas, que oscilan desde 1,2-65,3% de la poblacion total de granulocitos, con un tamano medio del clon de aproximadamente 7 %. En 4 de las 19 muestras de pacientes, la poblacion de granulocitos de tipo II represento >50 % de la poblacion total anormal (por ejemplo, celulas de HPN de tipo II y tipo Ill). En 10 de las 19 muestras de pacientes, tambien se detecto una poblacion de monocitos de HPN de tipo II. Una evaluacion de la capacidad de diversos anticuerpos, espedficos para protemas individuales ligadas a GPI encontradas en granulocitos para detectar granulocitos de HPN de tipo II indico que la poblacion de granulocitos de tipo II era detectable en todos los casos utilizando el reactivo de aerolisina marcado de forma detectable, pero en porcentajes decrecientes se utilizan anticuerpos espedficos para CD66b (88 %), CD55 (50 %), CD24 (47 %), y CD16 (0 %) (vease la Tabla 2). Estos resultados indican que el conjugado basado en aerolisina es particularmente util para detectar con precision poblaciones de granulocitos de HPN de tipo II en muestras de pacientes.
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Tabla 2. Deteccion de granulocitos de tipo II utilizando aerolisina u otros anticuerpos de protema anclada a anti-GPI
Aerolisina
CD24 CD66b CD55 CD16
19/19 (100 %)
9/19 (47%) 8/9 (88 %) 4/8 (50 %) 0/9 (0 %)
Las muestras de pacientes que conteman poblaciones de granulocitos de HPN de tipo II teman una media significativamente mayor de poblacion de granulocitos total de HPN de tipo II y de HPN tipo III combinada que aquellas sin granulocitos de tipo II (87 % frente a 11 %; p = 0,0003), asf como una media mayor de poblaciones de GRs de tipo II y tipo III, lo que refleja un aumento de la capacidad del metodo para detectar poblaciones de globulos blancos de HPN de tipo II en muestras de pacientes con poblaciones de celulas de HPN generalmente mas grandes.
Despues de haberse producido la comparacion con los datos clmicos, se descubrio que las muestras de pacientes con poblaciones de granulocitos de HPN de tipo II tambien teman una media inferior de recuentos de plaquetas (plt) (54 x 109/l; p<0,01). Vease la Fig. 2. Las muestras de pacientes con poblaciones de granulocitos de HPN de tipo II teman recuentos de globulos blancos perifericos, recuentos de globulos rojos perifericos, recuentos de neutrofilos absolutos, y niveles de hemoglobina (Hgb) similares en comparacion con las muestras de pacientes sin poblaciones de granulocitos de tipo II detectables (Tabla 1), lo que indica que las diferencias en los recuentos de plaquetas no se deben probablemente a diferencias en la produccion de medula osea subyacente. En otras palabras, aunque la divulgacion no se limita de modo alguno a teona o mecanismo de accion particular, a medida que los pacientes con HPN han desregulado el control del complemento debido a la falta de protemas reguladoras del complemento ligadas a GPI, CD55 y CD59, la disminucion de recuentos de plaquetas observada en pacientes con clones de granulocitos de HPN de tipo II detectables puede deberse a un aumento del consumo o destruccion de plaquetas mediado por el complemento terminal, que puede, a su vez, estar asociado con la trombosis, la principal causa de muerte entre los pacientes con HPN.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Alexion Pharmaceuticals, Inc.
<120> REACTIVOS Y METODOS PARA DETECTAR CELULAS DE PNH DE TIPO II
<130> ALXN-150-WO1
<140> AUN NO ASIGNADO <141>
<150> 61/280.897 <151>
<160>7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 492 <212> PRT
<213> Aeromonas hydrophila <400> 1

Claims (21)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para predecir si un paciente aquejado de hemoglobinuria parcwstica nocturna (HPN) corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis, comprendiendo el metodo:
    la determinacion del porcentaje de granulocitos de HPN de tipo II sobre los granulocitos totales en una muestra de sangre entera procedente de un paciente; y
    la prediccion para saber si el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis,
    en el que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis si el porcentaje de granulocitos de HPN de tipo II es superior o igual a 1,2 %.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que una poblacion de granulocitos de HPN de tipo II que esta comprendida entre 1,2 % y 65,3 % inclusive, indica que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que una poblacion de granulocitos de HPN de tipo II que es superior o igual a a) 5 %, b) 10 %, c) 20 % o d) 50 % indica que el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis.
  4. 4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende ademas la supervision del paciente con respecto al desarrollo de al menos un smtoma de trombosis si el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis.
  5. 5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende ademas la seleccion de una terapia anti-trombotica para el paciente si el paciente corre un mayor riesgo de desarrollar trombosis.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que la terapia anti-trombotica es un anticoagulante o un agente trombolftico.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 6, en el que el anticoagulante es coumadina, heparina, o derivados de los mismos.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 6, en el que el agente trombolftico es un activador del plasminogeno tisular, estreptoquinasa, o un activador del plasminogeno de tipo uroquinasa.
  9. 9. Un metodo para seleccionar una terapia para un paciente aquejado de hemoglobinuria paroxfstica nocturna (HPN), comprendiendo el metodo: (a) la determinacion del porcentaje de granulocitos de HPN de tipo II sobre los granulocitos totales en una muestra de sangre entera del paciente segun el metodo de la reivindicacion 1 y (b) la seleccion de una terapia anti-trombotica o de una terapia anti-trombocitopenica o las dos para un paciente determinado por tener un porcentaje de granulocitos de HPN de tipo II superior o igual a 1,2 %.
  10. 10. Un anticoagulante o un agente trombolftico para su uso en el tratamiento de un paciente aquejado de hemoglobinuria paroxfstica nocturna (HPN), en el que el paciente tiene una poblacion de granulocitos de HPN de tipo II superior al 1,2 %.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 9, en el que la terapia anti-trombocitopenica es una transfusion de plaquetas.
  12. 12. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 u 11 o el anticoagulante o agente trombolftico para su uso segun la reivindicacion 10, en el que se utiliza una forma de variante no lftica de protema aerolisina para determinar el porcentaje de granulocitos de HPN de tipo II.
  13. 13. El metodo de: (a) una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la etapa de determinacion del porcentaje de granulocitos de hPn de tipo II comprende, o (b) la reivindicacion 9, en el que el porcentaje de granulocitos de HPN de tipo II se determina mediante:
    la puesta en contacto de los globulos blancos con un reactivo que se une a: (i) GPI o (ii) una protema anclada a GPI, en el que los globulos blancos se obtienen a partir de la muestra de sangre entera; la determinacion de la cantidad de union del reactivo;
    la comparacion de la cantidad de union del reactivo entre los granulocitos, en el que los granulocitos que exhiben una cantidad intermedia de union se clasifican como granulocitos de HPN de tipo II; y la determinacion del porcentaje de granulocitos de HPN de tipo II.
  14. 14. El metodo de la reivindicacion 13, que comprende ademas la determinacion del porcentaje de granulocitos de HPN de tipo III.
  15. 15. El metodo de la reivindicacion 13 o 14, en el que la distincion comprende una citometna de flujo.
  16. 16. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el reactivo se une a una fraccion de GPI humano.
  17. 17. El metodo de la reivindicacion 16, en el que el reactivo comprende una protema aerolisina.
  18. 18. El metodo de la reivindicacion 16 o 17, en el que el reactivo comprende una forma de variante de protema aerolisina que es no lttica o es no lftica en comparacion con la forma de tipo natural de la protema.
    5
  19. 19. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que el reactivo comprende la secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NO: 2 o 7, en el que la treonina en la posicion 253 esta sustituida con una cistema y la alanina en la posicion 300 esta sustituida con una cistema.
    10 20. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que el reactivo es un anticuerpo o un
    fragmento de union al antfgeno del mismo.
  20. 21. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 o 20, en el que el reactivo se une a una protema anclada a GPI.
    15
  21. 22. El metodo de la reivindicacion 21, en el que la protema anclada a GPI se selecciona entre el grupo que consiste en fosfatasa alcalina, 5' nucleotidasa acetilcolinesterasa, dipeptidasa, LFA-3, NCAM, PH-20, CD55, CD59, Thy-1, Qa-2, CD14, CD33, CD16 (el receptor Fcy III), antfgeno carcinoembrionario (ACE), CD24, CD66b, CD87, CD48 y CD52.
    20
    CO
    CD
    Inbensidad log de la senal a partlr de un conjugado de antacuerpo anti- CD24 conjugado con ficoeritrlna (FE)
    unido a las celulas
    imagen1
    Intensidad log de la senal a partir de un conjugado de aerolisina no li'tica conjugado con Alexa Fluor® 488 unido a las
    celulas
    Fig. 1
    -fc.
    o
    imagen2
    10
    20
    40
    50
    50
    70
    10
    20
    00
    40
    SO
    BO
    00
    Tamano de granulocitos de tipo II
    Fig. 2
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