JP5635617B2 - Ｐｎｈｉｉ型白血球を検出するための試薬および方法、ならびに血栓障害の危険因子としてのそれらの同定 - Google Patents

Ｐｎｈｉｉ型白血球を検出するための試薬および方法、ならびに血栓障害の危険因子としてのそれらの同定 Download PDF

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Description

関連出願の引用
本願は、２００９年１１月９日に出願された「Ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＰＮＨ ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｅｌｌｓ」とのタイトルの米国仮特許出願第６１／２８０，８９７号に対する優先権およびその利益を主張する。米国仮特許出願第６１／２８０，８９７号の内容全体は、本明細書中に参考として援用される。
配列表
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通して提出され。その全体がここに参考として援用される配列表を含む。２０１０年１１月５日に作成されたそのＡＳＣＩＩコピーは、ＡＬＸＮ１５０ＷＯ１．ｔｘｔと名付けられており、そのサイズは２６，０００バイトである。
技術分野
本発明の分野は、医学、免疫学、分子生物学およびタンパク質化学である。
背景
発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）は、中でも特に、造血異常、補体介在性血管内溶血および血栓症の傾向を特徴とするまれな消耗性疾患である。例えば、非特許文献１および非特許文献２参照。ＰＮＨは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー生合成の初期段階に必要な酵素をコードする、Ｘ連鎖性ホスファチジルイノシトールグリカン相補性クラスＡ（ＰＩＧＡ）遺伝子における体細胞突然変異によって引き起こされる。非特許文献３および非特許文献４参照。ＧＰＩアンカーは、多くのタンパク質を造血細胞の表面に付着させる。これらのいわゆるＧＰＩアンカー型タンパク質は、中でも特に、ＣＤ５５（ＤＡＦ）およびＣＤ５９などの補体調節タンパク質を包含する。ＰＩＧＡ遺伝子に起こる突然変異の種類に依存して、ＧＰＩアンカー生合成の部分的または完全な喪失が生じることがあり、これは細胞表面でのＧＰＩアンカー型タンパク質（例えば、ＧＰＩアンカー型ＣＤ５５およびＣＤ５９）の存在の部分的または完全な喪失に対応する。非特許文献５参照。赤血球（ＲＢＣ）の表面に補体調節タンパク質が部分的にまたは完全に存在しないことは、罹患患者において補体介在性溶解およびＰＮＨの付随症状に対するこれらの細胞の感受性上昇を生じさせる。非特許文献６および非特許文献７参照。
伝統的に、ＰＮＨの診断およびＰＮＨ患者のモニタリングは、フローサイトメトリを使用したＲＢＣおよび顆粒球の表面のＣＤ５５およびＣＤ５９発現の分析を含んだ。非特許文献８。最近開発されたＰＮＨの診断方法は、造血細胞の表面のＧＰＩアンカーに結合する、組換え非溶解型の細菌タンパク質アエロリシン（ａｅｒｏｌｙｓｉｎ）を使用している。ＢｕｃｋｌｅｙとＢｒｏｄｓｋｙに対する特許文献１参照。伝統的および新規方法はどちらも、医師が、ＰＮＨ患者からのＲＢＣまたは白血球を３つの群の１つに分類することを可能にした：ＧＰＩアンカー型タンパク質の正常またはほぼ正常な細胞表面発現を有するＩ型細胞；ＧＰＩアンカー型タンパク質の細胞表面発現が皆無または完全に不在であるＰＮＨ ＩＩＩ型細胞；およびＧＰＩアンカー型タンパク質の中間的なレベルの細胞表面発現を有するＰＮＨ ＩＩ型細胞。非特許文献９。白血球系統の中でＩＩ型細胞の特性づけは、これらの細胞を正常なＩ型白血球と区別することの困難さのために実施されていない。
米国特許第６，５９３，０９５号明細書
ＲｏｓｓｅとＮｉｓｈｉｍｕｒａ（２００３）Ｉｎｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ７７（２）：１２１−１２４ Ｂｒｏｄｓｋｙ（２００８）Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ ２２（２）：６５−７４ Ｍｉｙａｔａら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１３１８−１３２０ Ｂｅｓｓｌｅｒら（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ １３：１１０−１１７ Ｒｏｓｓｅ（１９９７）Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７６：６３−９３ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ−Ｗｅｌｌｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：５０６６−５０７０ Ｙａｍａｓｈｉｎａら（１９９０）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３２３：１１８４−１１８９ Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら（２００９）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １３２：５６４−５７２ Ｂｒｏｄｓｋｙら（２０００）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １１４：４５９−４６６
概要
本開示は、少なくとも一部には、少なくとも１．２％のＰＮＨ ＩＩ型白血球集団または少なくとも０．０２％のＰＮＨ ＩＩ型赤血球集団を有する患者は、ＰＮＨ ＩＩ型細胞集団を有さない、または白血球および赤血球についてそれぞれ１．２％未満もしくは０．０２％未満であるＰＮＨ ＩＩ型細胞集団を有する患者と比較して、血小板減少症を有する可能性がより高いという本発明者らによる発見に基づく。血小板破壊から生じる血小板減少症を有する患者は、血栓症を発症する可能性がはるかに高く、ＰＮＨ患者の中で、血栓症は主たる死亡原因である。したがって、本開示は、患者におけるＰＮＨ ＩＩ型細胞の相対的存在率に基づき、患者が血小板減少症および／または血栓症についての危険度がより高いかどうかを決定するための方法を提供する。ＰＮＨ ＩＩ型細胞と血小板減少症の間の関係の同定は、一部には、ＰＮＨ ＩＩ型細胞を検出するための改善された方法の開発によって支援された。
したがって、本開示はまた、例えば、患者からの生物学的試料において、ＰＮＨ ＩＩ型細胞（例えば、ＩＩ型白血球および／またはＩＩ型赤血球）を検出するために有用な試薬および方法を提供する。本開示はまた、患者におけるＰＮＨ ＩＩ型細胞の存在または量に基づいて患者を診断し、処置するための方法を提供する。例えば、本開示は、ＰＮＨを有することが疑われる患者からの生物学的試料中で検出されたＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージに基づいて患者における血小板減少症についての危険度を決定するための方法を特徴とする。本明細書で述べる診断方法は、先行技術の方法に比べて多くの利点を有する。例えば、本明細書で述べる方法は、ＰＮＨ ＩＩ型白血球をＩ型細胞からより有効に分離することができ、これは、生物学的試料中のＩＩ型細胞のパーセンテージのより正確で厳密な測定、ならびにＩＩ型およびＩＩＩ型細胞の両方を含む、全ＰＮＨクローンのサイズのより正確な評価を可能にする。加えて、ＩＩ型ＲＢＣ上のＧＰＩ発現に基づくＰＮＨ診断方法は、赤血球の高い代謝回転（補体介在性溶解に対する上昇した感受性によるＰＮＨ ＩＩＩ型ＲＢＣの固有のより短い生存期間）およびＰＮＨ患者が受ける頻繁なＲＢＣ輸血のために、信頼できないことがある。それゆえ、本明細書で述べる診断方法は、医師が生物学的試料中のＩＩ型白血球のパーセンテージを、したがって試料中の全異常クローンのサイズを正確かつ厳密に定量することを可能にするだけでなく、前記方法はまた、ＰＮＨ ＩＩ型ＲＢＣの比較的不安定な集団を検出することに基づく先行技術の方法よりも信頼性がある。
１つの態様では、本開示は、患者が血栓症についての危険度が増大しているかどうかを予測するための方法を特徴とする。前記方法は、患者からの生物学的試料中の同じ組織型（同じ系統）の細胞の総数に対するＰＮＨ ＩＩ型細胞のパーセンテージに基づき、患者が血栓症について危険度が増大しているかどうかを決定することを含み、前記パーセンテージは、患者が血栓症についての危険度が増大していることを示す。
別の態様では、本開示は、患者が血小板減少症である可能性が高いかどうかを予測するための方法を特徴とする。前記方法は、患者からの生物学的試料中の同じ組織型（同じ系統）の細胞の総数に対するＰＮＨ ＩＩ型細胞（例えば、ＩＩ型赤血球および／またはＩＩ型白血球）のパーセンテージに基づき、患者が血小板減少症である可能性が高いかどうかを決定することを含み、前記パーセンテージは、患者が血小板減少症である可能性が高いことを示す。
別の態様では、本開示は、患者が血栓症についての危険度が増大しているかどうかを決定するための方法を特徴とする。前記方法は、患者からの生物学的試料中の同じ組織型（同じ系統）の全細胞に対するＰＮＨ ＩＩ型細胞のパーセンテージに関する情報を提供する（または受け取る）こと；および患者が血栓症についての危険度が増大しているかどうかを決定することであって、生物学的試料中の同じ組織型の細胞の総数に対するＰＮＨ ＩＩ型細胞のパーセンテージは、患者が血栓症についての危険度が増大していることを示すことを含む。
別の態様では、本開示は、患者が血栓症を発症する危険があるかどうかを予測するための方法を特徴とし、前記方法は、患者からの生物学的試料中のＰＮＨ ＩＩ型細胞のパーセンテージを決定すること；および患者が血栓症についての危険度が増大しているかどうかの予測を提供することであって、生物学的試料中の同じ組織型の細胞の総数に対するＰＮＨ ＩＩ型細胞のパーセンテージは、患者が血栓症についての危険度が増大していることを示すことを含む。
一部の実施形態では、ＰＮＨ ＩＩ型細胞は白血球（例えば、顆粒球または単球）である。一部の実施形態では、ＰＮＨ ＩＩ型細胞は赤血球である。
本明細書で述べる方法のいずれかの一部の実施形態では、１．２％以上のＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージと０．０２％以上のＰＮＨ ＩＩ型赤血球のパーセンテージの組合せは、患者が血栓症を発症する危険度が増大しているかまたは血小板減少症である可能性が高いことを予測する。
本明細書で述べる方法のいずれかの一部の実施形態では、ＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージが少なくとも１．２％（例えば、少なくとも１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６５．３または７０％以上）である場合、患者は血栓症を発症する危険度が増大している（および／または血小板減少症である可能性が高い）。本明細書で述べる方法のいずれかの一部の実施形態では、ＰＮＨ ＩＩ型赤血球のパーセンテージが少なくとも０．０２％（例えば、少なくとも０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７１、７１．３または７５％以上）である場合、患者は血栓症を発症する危険度が増大している（および／または血小板減少症である可能性が高い）。
本明細書で述べる方法のいずれかの一部の実施形態では、１．２％〜６５％（１．２％および６５％を含む）であるＰＮＨ ＩＩ型白血球集団は、患者が血栓症についての危険度が増大している（および／または血小板減少症である可能性が高い）ことを示す。一部の実施形態では、５％以上であるＰＮＨ ＩＩ型白血球集団は、患者が血栓症についての危険度が増大している（および／または血小板減少症である可能性が高い）ことを示す。一部の実施形態では、１０％、２０％、さらには５０％以上であるＰＮＨ ＩＩ型白血球集団は、患者が血栓症についての危険度が増大している（および／または血小板減少症である可能性が高い）ことを示す。
一部の実施形態では、本明細書で述べる方法のいずれかは、患者から生物学的試料を得ることをさらに含み得る。生物学的試料は、例えば全血試料であり得る。
別の態様では、本開示は、患者が血栓症を発症する危険度が増大している（および／または血小板減少症である可能性が高い）かどうかを予測するための方法を特徴とする。前記方法は、患者からの生物学的試料中の同じ組織型の全白血球に対するＩＩ型白血球のパーセンテージを決定すること；および患者が血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを予測することであって、ＩＩ型白血球のパーセンテージが１．２％以上（例えば、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６５．３または７０％以上）である場合、患者は血栓症を発症する危険度が増大している（および／または血小板減少症である可能性が高い）ことを含む。
別の態様では、本開示は、患者が血栓症を発症する危険度が増大している（および／または血小板減少症である可能性が高い）かどうかを予測するための方法を特徴とする。前記方法は、患者からの生物学的試料中の同じ組織型の全赤血球に対するＩＩ型赤血球のパーセンテージを決定すること；および患者が血栓症を発症する危険度が増大している（および／または血小板減少症である可能性が高い）かどうかを予測することであって、ＩＩ型赤血球のパーセンテージが０．０２％以上（例えば、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７１、７１．３または７５％以上）である場合、患者は血栓症を発症する危険度が増大している（および／または血小板減少症である可能性が増大している）ことを含む。
さらに別の態様では、本開示は、患者のために療法を選択するための方法を特徴とし、前記方法は、１．２％以上（例えば、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６５．３もしくは７０％以上）のＰＮＨ ＩＩ型白血球集団および／または０．０２％以上（例えば、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７１、７１．３もしくは７５％以上）のＰＮＨ ＩＩ型赤血球集団を有すると決定された患者のために抗血栓症療法および抗血小板減少症療法の一方または両方を選択することを含む。
別の態様では、本開示は患者を処置するための方法を特徴とする。前記方法は、患者が１．２％以上（例えば、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６５．３もしくは７０％以上）のＰＮＨ ＩＩ型白血球集団および／または０．０２％以上（例えば、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７１、７１．３もしくは７５％以上）のＰＮＨ ＩＩ型赤血球集団を有すると決定された場合、抗血栓症療法および抗血小板減少症療法の一方または両方を、処置を必要とする患者に投与することを含む。
本明細書で述べる方法のいずれかの一部の実施形態では、抗血小板減少症療法は、例えば血小板輸血であり得る。
さらに別の態様では、本開示は、患者が血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを決定するためのコンピュータベースの方法を特徴とし、前記方法は、ＰＮＨ患者の医学的プロフィールを含むデータを受け取ること、前記プロフィールは、患者からの生物学的試料中の同じ組織型（同じ系統）の全白血球に対するＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージに関する情報を含むこと；および患者が血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを決定するための情報を含むデータの少なくとも一部を処理することであって、ＩＩ型白血球のパーセンテージが１．２％以上（例えば、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６５．３または７０％以上）である場合、患者は血栓症を発症する危険度が増大していることを含む。
さらに別の態様では、本開示は、患者が血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを決定するためのコンピュータベースの方法を特徴とし、前記方法は、ＰＮＨ患者の医学的プロフィールを含むデータを受け取ること、前記プロフィールは、患者からの生物学的試料中の同じ組織型（同じ系統）の全赤血球に対するＰＮＨ ＩＩ型赤血球のパーセンテージに関する情報を含むこと；および患者が血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを決定するための情報を含むデータの少なくとも一部を処理することであって、ＩＩ型赤血球のパーセンテージが０．０２％以上（例えば、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７１、７１．３または７５％以上）である場合、患者は血栓症を発症する危険度が増大していることを含む。
別の態様では、本開示は、患者が血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを決定するためのコンピュータベースの方法を特徴とし、前記方法は、患者からの生物学的試料中の同じ組織型（同じ系統）の全白血球に対するＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージに関する情報を提供すること；前記情報をコンピュータに入力すること；およびコンピュータと入力情報を使用して、患者が血栓症についての危険度が増大しているかどうかを示すパラメータを計算することであって、ＩＩ型白血球のパーセンテージが１．２％以上（例えば、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６５．３または７０％以上）である場合、患者は血栓症を発症する危険度が増大していることを含む。
別の態様では、本開示は、患者が血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを決定するためのコンピュータベースの方法を特徴とし、前記方法は、患者からの生物学的試料中の同じ組織型の全白血球に対するＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージに関する情報を提供すること；前記情報をコンピュータに入力すること；およびコンピュータと入力情報を使用して、患者が血栓症についての危険度が増大しているかどうかを示すパラメータを計算することであって、ＩＩ型白血球のパーセンテージが０．０２％以上（例えば、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７１、７１．３または７５％以上）である場合、患者は血栓症を発症する危険度が増大している、ことを含む。
一部の実施形態では、本明細書で述べるコンピュータベースの方法のいずれかは、コンピュータ読取り可能媒体にパラメータを保存することおよび／またはパラメータを出力することをさらに含み得る。
一部の実施形態では、本明細書で述べる方法のいずれかは、患者が血栓症を発症する危険度が増大している場合、血栓症の少なくとも１つの症状の発症に関して患者をモニタリングする段階を含み得る。一部の実施形態では、本明細書で述べる方法のいずれかは、患者が血栓症を発症する危険度が増大している場合、患者のための抗血栓症療法を選択することを含み得る。一部の実施形態では、本明細書で述べる方法のいずれかは、患者が血栓症を発症する危険度が増大している場合、患者に抗血栓症療法を投与することを含み得る。抗血栓症療法は、例えば抗凝固薬または血栓溶解剤であり得る。抗凝固薬は、例えばクマジン、ヘパリンまたはそれらの誘導体であり得る。血栓溶解剤は、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼまたはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子であり得る。
本明細書で述べる方法のいずれかの一部の実施形態では、生物学的試料中のＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージを決定するために非溶解型のアエロリシンタンパク質を使用し得る。
一部の実施形態では、本明細書で述べる方法のいずれかは、生物学的試料中のＰＮＨ ＩＩ型細胞の決定されたパーセンテージを記録することを含み得る。一部の実施形態では、本明細書で述べる方法のいずれかは、患者が血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかまたは患者が血栓症を発症する危険度が高くないかどうかの予測を記録することを含み得る。前記記録は、コンピュータ読取り可能媒体においてであり得る。記録はまた、例えば有形的表現媒体（例えば患者の身体記録またはカルテ）であり得る。
さらに別の態様では、本開示は、白血球を分類するための方法を特徴とする。前記方法は、複数の白血球を、（ｉ）ＧＰＩまたは（ｉｉ）ＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する試薬と接触させること；および前記白血球に結合した試薬の量に基づき白血球の１以上をＰＮＨ ＩＩ型細胞として分類することを含む。
別の態様では、本開示は、白血球を分類するための方法を特徴とし、前記方法は、複数の白血球を、（ｉ）ＧＰＩまたは（ｉｉ）ＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する試薬と接触させること；前記白血球に結合した試薬の量に基づき、試薬と接触させた白血球の少なくとも一部を調べること；および調べた細胞の１以上をＰＮＨ ＩＩ型細胞として分類することを含む。
別の態様では、本開示は、種々の白血球集団を区別するための方法を特徴とする。前記方法は、複数の白血球を、（ｉ）ＧＰＩまたは（ｉｉ）ＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する試薬と接触させること；ならびに前記白血球に結合した試薬の量に基づいて複数のうちの少なくとも一部の白血球を他の白血球から区別し、複数の白血球中の同じ組織型の全白血球に対するＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージを決定することを可能にするために、ＰＮＨ ＩＩ型白血球が、存在する場合、同じ組織型（同じ系統）のＩ型白血球およびＰＮＨ ＩＩＩ型細胞から十分に区別されることを含む。前記方法はまた、ＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージを決定することを含み得る。
さらに別の態様では、本開示は、試料中のＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージを決定するための方法を特徴とし、前記方法は、白血球に結合した試薬の量に基づいて、試薬と接触させた複数の白血球を調べ、その場合、試薬は（ｉ）ＧＰＩまたは（ｉｉ）ＧＰＩアンカー型タンパク質に結合し、調べることは、複数の白血球中の同じ組織型の全白血球に対するＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージを決定することを可能にするために、ＰＮＨ ＩＩ型白血球を、存在する場合、同じ組織型のＩ型白血球およびＰＮＨ ＩＩＩ型細胞から十分に区別すること；ならびにＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージを決定することを含む。
本明細書で述べる方法のいずれかの一部の実施形態では、複数の白血球を、ＧＰＩに結合する試薬およびＧＰＩ連結タンパク質に結合する試薬と接触させる。
本明細書で述べる方法のいずれかの一部の実施形態では、白血球を区別することまたは調べること（および／またはＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージの決定）は、フローサイトメトリを含む。
本明細書で述べる方法のいずれかの一部の実施形態では、調べる複数の白血球は、ＰＮＨを有する、ＰＮＨを有することが疑われる、またはＰＮＨを発症する危険性がある患者から入手する。一部の実施形態では、患者は、ＰＮＨ ＩＩ型赤血球のパーセンテージが以前に決定されているが、疑わしいおよび／または不確定であった患者である。
一部の実施形態では、本明細書で述べる方法のいずれかは、ＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージを記録することをさらに含み得る。記録は、コンピュータ読取り可能媒体または有形的表現媒体（例えば患者のカルテまたは記録）においてであり得る。
本明細書で述べる方法のいずれかの一部の実施形態では、試薬はヒトＧＰＩ部分に結合し得る。試薬は、例えば抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはアエロリシンタンパク質であり得る。アエロリシンタンパク質は、例えば、野生型のアエロリシンタンパク質と比較して非溶解性であるまたは実質的に非溶解性であるバリアント型のアエロリシンタンパク質であり得る。非溶解性または実質的に非溶解性のアエロリシンタンパク質は、２５３位のトレオニンがシステインで置換され、および３００位のアラニンがシステインで置換されている、配列番号２または７に示すアミノ酸配列を含み得る。
本明細書で述べる方法のいずれかの一部の実施形態では、試薬はＧＰＩアンカー型タンパク質に結合し得る。例えば、試薬は、例えばＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。ＧＰＩアンカー型タンパク質は、例えばアルカリホスファターゼ、５’ヌクレオチドアーゼ（５’ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｓｅ）、アセチルコリンエステラーゼ、ジペプチダーゼ、ＬＦＡ−３、ＮＣＡＭ、ＰＨ−２０、ＣＤ５５、ＣＤ５９、Ｔｈｙ−１、Ｑａ−２、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ１６（Ｆｃγ受容体ＩＩＩ型）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ２４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ８７、ＣＤ４８、ＣＤ５２または当分野で公知のおよび／または本明細書で述べる任意の他のＧＰＩアンカー型タンパク質であり得る。
一部の実施形態では、１．２％以上のＰＮＨ ＩＩ型白血球集団または０．０２％以上のＰＮＨ ＩＩ型赤血球集団を有すると決定された患者は、ＰＮＨを有すると診断され得る。一部の実施形態では、ＰＮＨを有すると診断された患者、または１．２％以上のＰＮＨ ＩＩ型白血球集団または０．０２％以上のＰＮＨ ＩＩ型赤血球集団を有すると決定される、以前に診断されたＰＮＨ患者は、エクリズマブなどの、しかしこれに限定されない補体阻害剤を処方され得るおよび／または前記補体阻害剤で処置され得る。
さらに別の態様では、本開示は、ヒトＧＰＩ部分に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを特徴とする。抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、組換え抗体、ダイアボディ、キメラ化またはキメラ抗体、脱免疫ヒト抗体、完全ヒト抗体、一本鎖抗体、Ｆｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントであり得る。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１） 患者が血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを予測するための方法であって、
患者からの生物学的試料中の同じ組織型の全白血球に対するＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージを決定すること；および
該患者が血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを予測することであって、ここで、ＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージが１．２％以上である場合、該患者は血栓症を発症する危険度が増大していること
を含む、方法。
（項目２） 前記白血球が顆粒球である、項目１に記載の方法。
（項目３） 前記白血球が単球である、項目１に記載の方法。
（項目４） 前記生物学的試料が全血試料である、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５） 前記患者から前記生物学的試料を得ることをさらに含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６） １．２％〜６５．３％（１．２％および６５．３％を含む）であるＰＮＨ ＩＩ型白血球集団は、前記患者が血栓症の危険度が増大していることを示す、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７） ５％以上であるＰＮＨ ＩＩ型白血球集団は、前記患者が血栓症を発症する危険度が増大していることを示す、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８） １０％以上であるＰＮＨ ＩＩ型白血球集団は、前記患者が血栓症の危険度が増大していることを示す、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９） ２０％以上であるＰＮＨ ＩＩ型白血球集団は、前記患者が血栓症の危険度が増大していることを示す、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０） ５０％以上であるＰＮＨ ＩＩ型白血球集団は、前記患者が血栓症の危険度が増大していることを示す、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１） 前記患者が血栓症を発症する危険度が増大している場合、血栓症の少なくとも１つの症状の発症に関して前記患者をモニタリングすることをさらに含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２） 前記患者が血栓症を発症する危険度が増大している場合、前記患者のための抗血栓症療法を選択することをさらに含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３） 前記抗血栓症療法が抗凝固薬または血栓溶解剤である、項目１２に記載の方法。
（項目１４） 前記抗凝固薬がクマジン、ヘパリンまたはそれらの誘導体である、項目１３に記載の方法。
（項目１５） 前記血栓溶解剤が組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼまたはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子である、項目１３に記載の方法。
（項目１６） 前記患者が血栓症を発症する危険度が増大している場合、前記患者に抗血栓症療法を投与することをさらに含む、項目１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７） １．２％以上のＰＮＨ ＩＩ型白血球集団を有すると決定された患者のために抗血栓症療法および抗血小板減少症療法の一方または両方を選択することを含む、患者のために療法を選択するための方法。
（項目１８） 患者を処置するための方法であって、該患者が１．２％より高いＰＮＨ ＩＩ型白血球集団を有する場合、抗血栓症療法および抗血小板減少症療法の一方または両方を、処置を必要とする患者に投与することを含む、方法。
（項目１９） 前記抗血栓症療法が抗凝固薬または血栓溶解剤である、項目１７または１８に記載の方法。
（項目２０） 前記抗血小板減少症療法が血小板輸血である、項目１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１） 患者が血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを決定するためのコンピュータベースの方法であって、
ＰＮＨ患者の医学的プロフィールを含むデータを受け取ることであって、該プロフィールが、該患者からの生物学的試料中の同じ組織型の全白血球に対するＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージに関する情報を含む、こと；および
該患者が血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを決定するための情報を含むデータの少なくとも一部を処理することであって、ＩＩ型白血球のパーセンテージが１．２％以上である場合、該患者は血栓症を発症する危険度が増大している、こと
を含む方法。
（項目２２） 患者が血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを決定するためのコンピュータベースの方法であって、
該患者からの生物学的試料中の同じ組織型の全白血球に対するＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージに関する情報を提供すること；
該情報をコンピュータに入力すること；および
該コンピュータおよび該入力情報を使用して、該患者が血栓症についての危険度が増大しているかどうかを示すパラメータを計算することであって、ＩＩ型白血球のパーセンテージが１．２％以上である場合、該患者は血栓症を発症する危険度が増大している、こと
を含む方法。
（項目２３） ＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージを決定するために非溶解バリアント型のアエロリシンタンパク質を使用する、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４） ＰＮＨ ＩＩ型白血球を同定するための方法であって、
複数の白血球を、（ｉ）ＧＰＩまたは（ｉｉ）ＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する試薬と接触させること；および
該白血球に結合した試薬の量に基づいて該白血球のうちの１以上をＰＮＨ ＩＩ型白血球と同定することであって、ＰＮＨ ＩＩＩ型白血球への該試薬の結合の量およびＩ型白血球への該試薬の結合の量と比較して中間的な量の、白血球への該試薬の結合は、前記白血球がＰＮＨ ＩＩ型白血球であることを示す、こと
を含む方法。
（項目２５） 白血球集団を区別するための方法であって、
複数の白血球を、（ｉ）ＧＰＩまたは（ｉｉ）ＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する試薬と接触させること；ならびに
該白血球に結合した試薬の量に基づいて該複数の白血球のうちの少なくとも一部の白血球を他の白血球から区別することであって、ＰＮＨ ＩＩ型白血球は、存在する場合、該複数の白血球中の同じ組織型の全白血球に対するＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージを決定することを可能にするために、同じ組織型のＩ型白血球およびＰＮＨ ＩＩＩ型白血球から十分に区別されること
を含む方法。
（項目２６） 前記複数の白血球中の同じ組織型の全白血球に対するＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージを決定することをさらに含む、項目２４または２５に記載の方法。
（項目２７） ＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージを決定するための方法であって、
（ｉ）ＧＰＩまたは（ｉｉ）ＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する試薬と接触させた複数の白血球を提供すること；
該白血球に結合した試薬の量に基づいて該複数の白血球のうちの少なくとも一部の白血球を他の白血球から区別することであって、該ＰＮＨ ＩＩ型白血球は、存在する場合、複数の白血球中の同じ組織型の全白血球に対するＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージを決定することを可能にするために、同じ組織型のＩ型白血球およびＰＮＨ ＩＩＩ型白血球から十分に区別されること；ならびに
ＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージを決定すること
を含む方法。
（項目２８） ＰＮＨ ＩＩＩ型白血球のパーセンテージを決定することをさらに含む、項目２６または２７に記載の方法。
（項目２９） 前記区別することがフローサイトメトリを含む、項目２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０） 前記複数の白血球が、ＰＮＨを有するか、ＰＮＨを有することが疑われるか、またはＰＮＨを発症する危険性がある患者から得られる、項目２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１） ＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージを記録することをさらに含む、項目２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２） 前記記録がコンピュータ読取り可能媒体においてである、項目３１に記載の方法。
（項目３３） 前記試薬がヒトＧＰＩ部分に結合する、項目２４〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４） 前記試薬がアエロリシンタンパク質を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５） 前記試薬が、野生型のアエロリシンタンパク質と比較して非溶解性であるかまたは実質的に非溶解性であるバリアント型のアエロリシンタンパク質を含む、項目３３または３４に記載の方法。
（項目３６） 前記試薬が、２５３位のトレオニンがシステインで置換され、および３００位のアラニンがシステインで置換されている、配列番号２または７に示すアミノ酸配列を含む、項目３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７） 前記試薬が抗体またはその抗原結合フラグメントである、項目３３に記載の方法。
（項目３８） 前記試薬がＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する、項目２４〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９） 前記ＧＰＩアンカー型タンパク質が、アルカリホスファターゼ、５’ヌクレオチドアーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ジペプチダーゼ、ＬＦＡ−３、ＮＣＡＭ、ＰＨ−２０、ＣＤ５５、ＣＤ５９、Ｔｈｙ−１、Ｑａ−２、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ１６（Ｆｃγ受容体ＩＩＩ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ２４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ８７、ＣＤ４８およびＣＤ５２からなる群より選択される、項目３８に記載の方法。
（項目４０） 前記試薬が抗体またはその抗原結合フラグメントである、項目３８または３９に記載の方法。
（項目４１） 前記複数の白血球を、ＧＰＩに結合する試薬およびＧＰＩ連結タンパク質に結合する試薬と接触させる、項目２４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾の場合は、定義を含む本書類が支配する。好ましい方法および材料を以下で述べるが、本明細書で述べるものに類似するまたは等価の方法および材料も、本明細書で開示される方法および組成物の実施または試験において使用できる。本明細書で言及されるすべての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の他の特徴および利点、例えば被験体において血小板減少症または血栓症の危険度を決定するための方法は、以下の説明、実施例から、および特許請求の範囲から明らかである。
図１は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８と複合した非溶解型アエロリシンおよびフィコエリトリン（ＰＥ）に複合したＣＤ２４に結合する抗体の両方を含む溶液と共にインキュベートしたヒト末梢血顆粒球の集団を示す２色のドットプロットである。非溶解性アエロリシンはＧＰＩアンカーに特異的に結合し、それゆえ任意のＧＰＩアンカー型タンパク質を発現する細胞はこの蛍光タンパク質で標識される。ＣＤ２４は顆粒球上で発現されるＧＰＩ連結タンパク質であり、そのためＣＤ２４を発現する細胞は、抗ＣＤ２４抗体および非溶解性アエロリシンの両方によって結合される。Ｘ軸は、細胞に結合したアエロリシンコンジュゲートから生成される検出可能なシグナルの対数強度を表し、Ｙ軸は、細胞に結合した抗ＣＤ２４抗体コンジュゲートから生成される検出可能なシグナルの対数強度を表す。顆粒球の３つの集団がこの分析によって明らかにされる：ＧＰＩ連結タンパク質を有さず、したがって抗ＣＤ２４抗体および非溶解性アエロリシンのどちらでも標識されないと思われる、ＩＩＩ型細胞；ＧＰＩアンカーを欠く細胞と比較して高レベルのＧＰＩ連結タンパク質を発現する、Ｉ型顆粒球；および中間的なレベルのＧＰＩ連結タンパク質を発現し、したがって正常（Ｉ型）顆粒球で見られるよりも低いレベルで抗ＣＤ２４および非溶解性アエロリシンの両方で標識される、ＩＩ型顆粒球。 図２は、ＰＮＨを有する患者の血液中の絶対血小板数対ＰＮＨ ＩＩ型顆粒球のパーセンテージを示す散布図である。Ｙ軸は、１μＬの患者血液（×１０−３）中の血小板数を表し、Ｘ軸は、全顆粒球集団内のＰＮＨ ＩＩ型顆粒球のパーセンテージを表す。散布図の左半分は、検出可能なＰＮＨ ＩＩ型顆粒球集団を有さないＰＮＨ患者（Ｎ＝１４１）において認められた血小板数の分布である。散布図の右半分は、検出可能なＰＮＨ ＩＩ型顆粒球集団を有するＰＮＨ患者（Ｎ＝１９）において認められた血小板数の分布である。
詳細な説明
本開示は、中でも特に、患者がＰＮＨ ＩＩ型細胞集団を有するかどうかならびに／または血小板減少症および／もしくは血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを決定するために有用な種々の診断および治療適用を特徴とする。本開示はまた、前記方法において使用できる試薬を特徴とする。決して限定を意図するものではないが、例示的な試薬、コンジュゲートおよび前記のいずれかを使用するための方法を以下で詳述し、実施例において例証する。
試薬
本開示は、本明細書で述べる診断および治療方法において有用な多くの試薬を特徴とする。一部の実施形態では、試薬は、多くの細胞表面タンパク質を細胞膜につなぎとめる、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）部分に結合する。ＧＰＩ部分は一般に、エタノールアミン−ＨＰＯ４−６Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−６Ｍａｎα１−４ＧｌｃＮＨ２ｌ−６ミオイノシトール−１ＨＰＯ４−ジアシルグリセロール（またはアルキルアシルグリセロールまたはセラミド）のコアを含む。例えば、ＰａｕｌｉｃｋとＢｅｒｔｏｚｚｉ（２００８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７（２７）：６９９１−７０００参照。しかし、このコア構造の多くの変形が報告されている。例えば、グリカンコアは、ホスホエタノールアミン、マンノース、ガラクトース、シアル酸または他の糖類などの、しかしこれらに限定されない側鎖で修飾され得る。同上。
一部の実施形態では、試薬はアエロリシンタンパク質、例えば、非溶解性アエロリシンタンパク質であり得る。アエロリシンは、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａおよびＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａなどの、しかしこれらに限定されない毒性Ａｅｒｏｍｏｎａｓ種によって発現されるチャネル形成細胞溶解タンパク質である。アエロリシンは、Ｃ末端ペプチドのタンパク質分解除去によって活性形態に変換される（活性化される）５２ｋＤａの前駆体として細菌細胞から分泌される。アエロリシン前駆体は、宿主プロテアーゼならびにアエロリシン発現細菌により分泌されるプロテアーゼによって活性化され得る。細胞に結合すると、アエロリシンはオリゴマー化し、細胞内でチャネルを生成して、最終的に細胞を溶解する（ＨｏｗａｒｄとＢｕｃｋｌｅｙ（１９８５）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １６３：３３６−３４０）。
Ａｅｒｏｍｏｎａｓファミリーの様々な成員の各々によって産生されるアエロリシンポリペプチドのアミノ酸配列は高度に保存されている。したがって、アエロリシンポリペプチドは、本明細書で使用される場合、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａ．ｃａｖｉａｅ、Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ（生物型ｓｏｂｒｉａ）、Ａ ｖｅｒｏｎｉｉ（生物型ｖｅｒｏｎｉｉ）、Ａ．ｊａｎｄａｅｉ、Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、およびＡ．ｓｃｈｕｂｅｒｔｉｉなどの、しかしこれらに限定されないＡｅｒｏｍｏｎａｓの任意の種に由来し得る。
一部の実施形態では、アエロリシンポリペプチドはＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａまたはＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａに由来する。一部の実施形態では、アエロリシンポリペプチドは２４アミノ酸のシグナルペプチドを含むプロフォームである。一部の実施形態では、プロフォームアエロリシンポリペプチドは、配列番号１または配列番号６に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを有し得るまたは前記ポリペプチドで構成され得る。
一部の実施形態では、アエロリシンポリペプチドは、シグナル配列が除去された形態のタンパク質である。例えば、アエロリシンポリペプチドは、配列番号２または配列番号７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを有し得るまたは前記ポリペプチドで構成され得る。
一部の実施形態では、アエロリシンポリペプチドは活性形態のタンパク質である。例えば、アエロリシンポリペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを有し得るまたは前記ポリペプチドで構成され得る。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は交換可能に使用され、長さまたは翻訳後修飾に関わらず、アミノ酸の任意のペプチド連結鎖を意味する。本明細書で述べるアエロリシンポリペプチドは、野生型タンパク質を含み得るもしくは野生型タンパク質であり得るか、または５０以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０以下）の保存的アミノ酸置換を有する野生型ポリペプチドの変異体であり得る。保存的置換は、典型的には以下の群内での置換を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリンおよびトレオニン；リシン、ヒスチジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。
本明細書で述べるアエロリシンポリペプチドはまた、完全長のプロフォームポリペプチドより短いが、ＧＰＩ部分に結合する活性ポリペプチドの能力の少なくとも１０％（例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または１００％以上）を保持する、ポリペプチドの「ＧＰＩ結合フラグメント」を含む。アエロリシンポリペプチドのＧＰＩ結合フラグメントは、タンパク質の末端ならびに内部欠失変異体を含む。欠失変異体は、（２以上のアミノ酸の）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアミノ酸セグメントまたは連続しない単一アミノ酸を欠如し得る。ＧＰＩ結合フラグメントは、少なくとも４０（例えば、少なくとも４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００または３２５以上）アミノ酸残基長（例えば、配列番号１〜３の少なくとも４０の連続するアミノ酸残基）であり得る。一部の実施形態では、アエロリシンポリペプチドのＧＰＩ結合フラグメントは、４００未満（例えば、３５０、３２５、３００、２７５、２５０、２２５、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９５、９０、８５、８０、７５、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１または４０未満）のアミノ酸残基長（例えば、配列番号１〜３の４００未満の連続するアミノ酸残基）である。一部の実施形態では、アエロリシンポリペプチドのＧＰＩ結合フラグメントは、少なくとも４０であるが４００未満のアミノ残基長である。
一部の実施形態では、アエロリシンポリペプチドのＧＰＩ結合フラグメントは、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み得るまたは前記ポリペプチドで構成され得る：
一部の実施形態では、アエロリシンポリペプチドのＧＰＩ結合フラグメントは、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み得るまたは前記ポリペプチドで構成され得る：
一部の実施形態では、アエロリシンポリペプチドは、配列番号１〜３、６または７のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有するアエロリシン配列に７０％以上（例えば、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％）同一であるアミノ酸配列を有し得る（下記参照）。
アミノ酸配列同一性パーセント（％）は、配列を整列し、必要に応じてギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成した後の、参照配列中のアミノ酸に同一である候補配列中のアミノ酸のパーセンテージと定義される。配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当分野の技術範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウエアを使用して達成され得る。比較する配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータは、公知の方法によって決定され得る。
意図される適用に依存して、一部の実施形態では、細胞を溶解する能力を欠くバリアント型アエロリシンポリペプチドを使用することが好ましいと考えられる。そのようなバリアント型のアエロリシンポリペプチドは当分野において公知であり、例えば、Ｂｒｏｄｓｋｙら（２０００）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １１４：４５９−４６６に記載されている。一部の実施形態では、非溶解性のバリアント型アエロリシンは、１３２位のヒスチジンがアスパラギンで置換されている（Ｈｉｓ１３２Ａｓｎ）；２０２位のグリシンがシステインである；２５３位のトレオニンがシステインであり、および３００位のアラニンがシステインである；ならびに２２５位のトレオニンがグリシンである、のうちの１つ以上である、配列番号２または配列番号７に示すアミノ酸配列を含むまたは前記アミノ酸配列からなる。１つの例示的な非溶解性バリアント型のアエロリシンは、２５３位のトレオニンがシステインであり、および３００位のアラニンがシステインである、配列番号２または７に示すアミノ酸配列を含む。上述したように、バリアント型は、ＧＰＩ部分に結合する能力を保持する。
一部の実施形態では、バリアント型アエロリシンポリペプチドは、標的細胞を溶解する非バリアント型の対応するアエロリシンポリペプチドの能力の１０％未満（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２または１％未満）を有する。一部の実施形態では、バリアント型アエロリシンポリペプチドは検出可能な細胞溶解活性を有さない。
バリアント型アエロリシンポリペプチドがＧＰＩ部分に結合するかどうかを決定するための方法は当分野において公知であり、実施例に例示されている。例えば、バリアント型アエロリシンポリペプチドと細胞表面のＧＰＩ部分との結合を検出するための細胞ベースの方法は、フローサイトメトリ技術および検出可能に標識された（例えばフルオロフォア標識された）バリアント型アエロリシンポリペプチドを使用して決定され得る。例えば、Ｈｏｎｇら（２００２）ＥＭＢＯ Ｊ ２１（１９）：５０４７−５０５６参照。
同様に、アエロリシンポリペプチドまたはそのバリアント型の細胞溶解活性を検出するおよび／または定量するための方法も当分野において公知である。例えば、バリアント型アエロリシンポリペプチドの溶血活性は、バリアント型ポリペプチドを正常ヒト赤血球に接触させ、赤血球から放出されるヘモグロビンの量を測定することによって決定され得る。例えば、ＨｏｗａｒｄとＢｕｃｋｌｅｙ（１９８２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１（７）：１６６２−１６６７；ＡｖｉｇａｄとＢｅｒｎｈｅｉｍｅｒ（１９７６）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３（５）：１３７８−１３８１；ＧａｒｌａｎｄとＢｕｃｋｌｅｙ（１９８８）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５６（５）：１２４９−１２５３；およびＢｅｒｎｈｅｉｍｅｒとＡｖｉｇａｒｄ（１９７４）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９：１０１６−１０２１参照。非バリアント型の対応するポリペプチドが有する細胞溶解活性の量と比較して、バリアント型による細胞溶解活性の低下した量または細胞溶解活性の不在は、バリアント型ポリペプチドが低下した細胞溶解活性を有するかまたは細胞溶解活性を有さないことの指標である。
アエロリシンポリペプチドを得るまたは本明細書で述べるポリペプチドの変異体を生産するための方法は、分子生物学の分野において公知であり、実施例に例示されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９２）“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ参照。アエロリシンポリペプチドをコードする鋳型ＤＮＡは、標準的な方法（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、前出参照）を用いて本明細書で述べるＡｅｒｏｍｏｎａｓ種のいずれかから入手し得る。例えば、Ｈｏｗａｒｄらは、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａからのアエロリシンポリペプチドをコードする核酸配列の単離および特性づけを述べている（Ｈｏｗａｒｄら（１９８７）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １６９（６）：２８６９−２８７１）。Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａから単離されたアエロリシンポリペプチドは、Ｂｕｃｋｌｅｙ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６８：２２１−２２４およびＷｏｎｇら（１９８９）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：２５２３−２５２７に述べられている。
一部の実施形態では、アエロリシンポリペプチドは、内部または末端（カルボキシまたはアミノ末端）の無関係なまたは異種アミノ酸配列（例えば他のタンパク質に由来する配列またはいかなる天然タンパク質にも対応しない合成配列）を含み得る。配列は、例えば抗原性標識（例えば、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン、赤血球凝集素（ＨＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））であり得る。異種配列はまた、診断または検出マーカーとして有用なタンパク質、例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を含み得る。
例示的なアエロリシンポリペプチドならびに前記ポリペプチドを作製し、精製するための方法は、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許仮出願第６１／２００，６５５号に述べられている。
一部の実施形態では、試薬は、ＧＰＩ部分に結合する抗体であり得る。非ヒトＧＰＩ部分に結合する抗体が同定され、単離されている。例えば、Ｎａｉｋら（２００６）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７４（２）：１４１２（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＧＰＩ部分に結合する天然抗体の単離）参照。本明細書で詳細に述べるように、ヒトＧＰＩ部分に結合する抗体を作製することは十分に当業者の能力の範囲内である。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、全長または無傷抗体分子（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥ）またはその任意の抗原結合フラグメントを指す。抗体という用語は、例えば、キメラ化またはキメラ抗体、ヒト化抗体、脱免疫抗体および完全ヒト抗体を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、一本鎖抗体、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む。ｓｃＦｖフラグメントは、ｓｃＦｖが由来する抗体の重鎖および軽鎖可変領域の両方を含むポリペプチド一本鎖である。加えて、細胞内抗体、ミニボディ、トリアボディおよびダイアボディ（例えば、その各々の開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８（１）：４７−６６；ＨｕｄｓｏｎとＫｏｒｔｔ（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１（１）：１７７−１８９；Ｐｏｌｊａｋ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２（１２）：１１２１−１１２３；ＲｏｎｄｏｎとＭａｒａｓｃｏ（１９９７）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５１：２５７−２８３参照）も抗体の定義に含まれ、本明細書で述べる方法における使用に適合性である。二重特異性抗体も、「抗体」の用語に包含される。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する、好ましくはヒトまたはヒト化の、モノクローナル抗体である。抗体またはそのフラグメントを作製するための方法を本明細書で論じる。
一部の実施形態では、試薬はＧＰＩアンカー型タンパク質に結合し得る。例えば、試薬は、ＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する抗体であり得る。一部の実施形態では、試薬はＧＰＩアンカー型タンパク質に対するリガンドであり得る。ＧＰＩアンカー型タンパク質は多種多様であり、限定されることなく、アルカリホスファターゼ、５’ヌクレオチダーゼ（５’ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｓｅ）、アセチルコリンエステラーゼ、ジペプチダーゼ、ＬＦＡ−３、ＮＣＡＭ、ＰＨ−２０、ＣＤ５５、ＣＤ５９、Ｔｈｙ−１、Ｑａ−２、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ１６（Ｆｃγ受容体ＩＩＩ型）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびＣＤ５２を含む。ＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する抗体は当分野において周知であり、例えば、ＨａｌｌとＲｏｓｓｅ（１９９６）前出、Ｒｉｃｈａｒｄｓら（２００８）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｂ Ｃｌｉｎ Ｃｙｔｏｍ ７６Ｂ（１）：４７−５５；ＲｉｃｈａｒｄｓとＢａｒｎｅｔｔ（２００７）Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｍｅｄ ２７（３）：５７７−５９０；Ｌｕｚｚａｔｔｏら（２００６）Ｉｎｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ８４（２）：１０４−１１２；およびＴｈｏｍａｓｏｎら（２００４）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １２２（１）：１２８−１３４に述べられている。そのような抗体はまた、例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）およびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から市販されている。
前述した診断および／または治療方法における使用のためにＧＰＩアンカー型タンパク質またはＧＰＩ部分に結合する抗体を作製するための適切な方法は当分野において周知であり、以下の章で述べる。
抗体を作製するための方法
本開示にしたがって抗体（例えば、ＧＰＩ部分またはＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する抗体）またはその抗原結合フラグメントを生産するための適切な方法は当分野において公知であり、本明細書で説明する。例えば、モノクローナル抗ＣＤ５５抗体は、ヒトＣＤ５５発現細胞、ＣＤ５５ポリペプチドまたはＣＤ５５ポリペプチドの抗原性フラグメントを免疫原として使用し、したがって抗体産生細胞および次にモノクローナル抗体が単離され得る動物において免疫応答を誘発して作製され得る。そのような抗体の配列を決定し、組換え技術によって抗体またはその変異体を生成し得る。組換え技術を使用して、モノクローナル抗体の配列ならびにＧＰＩアンカー型タンパク質またはＧＰＩ部分に結合することができるポリペプチドの配列に基づいてキメラ、ＣＤＲ移植、ヒト化および完全ヒト抗体を生産し得る。
さらに、組換えライブラリに由来する抗体（「ファージ抗体」）は、例えば、ＧＰＩ部分もしくはＧＰＩアンカー型タンパク質、組換えＧＰＩ連結タンパク質、または遊離ＧＰＩ部分を発現する細胞を、標的特異性に基づいて抗体またはポリペプチドを単離するためのバイトとして使用して選択し得る。非ヒトおよびキメラ抗体の生産および単離は十分に当業者の技術範囲内である。
組換えＤＮＡ技術を使用して、非ヒト細胞において産生される抗体の１以上の特性を修飾することができる。したがって、診断または治療適用においてその免疫原性を低減するためにキメラ抗体を構築することができる。さらに、ＣＤＲ移植および、場合によりフレームワーク修飾によって抗体をヒト化することにより、免疫原性を最小限に抑えることができる。その各々の内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２２５，５３９号および同第７，３９３，６４８号参照。
抗体は、動物血清から入手できるかまたは、モノクローナル抗体またはそのフラグメントの場合は、細胞培養物において生産できる。組換えＤＮＡ技術を使用して、細菌または、好ましくは哺乳動物細胞培養物における手順を含む、確立された手順にしたがって抗体を生産することができる。選択される細胞培養系は、好ましくは抗体産物を分泌する。
別の実施形態では、本明細書で開示される抗体の生産のための工程は、ハイブリッドベクターで形質転換された宿主、例えばＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）または哺乳動物細胞を培養することを含む。ベクターは、正しいリーディングフレーム内で抗体タンパク質をコードする第二ＤＮＡ配列に連結されたシグナルペプチドをコードする第一ＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモータを含有する１以上の発現カセットを含む。次に抗体タンパク質を収集し、単離する。場合により、発現カセットは、各々個別に正しいリーディングフレーム内でシグナルペプチドに作動可能に連結された抗体タンパク質をコードするポリシストロン性（例えば２シストロン性）ＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモータを含み得る。
ハイブリドーマ細胞または哺乳動物宿主細胞のインビトロでの増殖は、場合により哺乳動物血清（例えばウシ胎仔血清）または微量元素と増殖維持添加物（例えば、正常マウス腹腔浸出細胞、脾細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸等のようなフィーダー細胞）を添加した、通常の標準的な培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ １６４０培地など）を含む、適切な培地中で実施される。細菌細胞または酵母細胞である宿主細胞の増殖は、同様に当分野で公知の適切な培地中で実施される。例えば、細菌に関しては、適切な培地は、ＬＥ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、テリフィックブロス、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２ｘＹＴ培地またはＭ９最小培地を含む。酵母については、適切な培地は、ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最小培地または完全最小ドロップアウト培地を含む。
インビトロ生産は比較的純粋な抗体製剤を提供し、大量の所望抗体が得られるスケールアップ生産を可能にする。細菌細胞、酵母、植物または哺乳動物細胞培養のための技術は当分野で公知であり、均一懸濁培養（例えばエアリフト反応器または連続撹拌反応器中）および固定化または捕捉細胞培養（例えば、中空糸、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズまたはセラミックカートリッジ上）を含む。
大量の所望抗体はまた、哺乳動物細胞をインビボで増殖させることによっても得られる。このために、所望抗体を産生するハイブリドーマ細胞を組織適合性哺乳動物に注射し、抗体産生腫瘍の増殖を生じさせる。場合により、注射の前に動物を炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）などの鉱油でプライムする。１〜３週間後、それらの哺乳動物の体液から抗体を単離する。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスからの抗体産生脾細胞と適切な骨髄腫細胞の融合によって得られるハイブリドーマ細胞、または所望抗体を産生するハイブリドーマ細胞株Ｓｐ２／０に由来するトランスフェクト細胞を、場合によりプリスタンで前処置したＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射する。１〜２週間後、動物から腹水を採取する。
前記や他の技術は、例えば、その開示がすべて参照により本明細書に組み込まれる、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；米国特許第４，３７６，１１０号；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒにおいて論じられている。組換え抗体分子の作製のための技術は、上記参考文献およびまた、例えば、その各々の内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開公報第ＷＯ９７／０８３２０号；米国特許第５，４２７，９０８号；米国特許第５，５０８，７１７号；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：１３１５−１３１７；ＰａｒｍｌｅｙとＳｍｉｔｈ（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８；Ｄｅ Ｌａ Ｃｒｕｚら（１９８８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６３：４３１８−４３２２；米国特許第５，４０３，４８４号；米国特許第５，２２３，４０９号；国際公開公報第ＷＯ８８／０６６３０号；国際公開公報第ＷＯ９２／１５６７９号；米国特許第５，７８０，２７９号；米国特許第５，５７１，６９８号；米国特許第６，０４０，１３６号；Ｄａｖｉｓら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１８（４）：４２１−５；およびＴａｙｌｏｒら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７−６２９５；Ｔｏｍｉｚｕｋａら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７（２）：７２２−７２７の中で述べられている。
細胞培養上清を、優先的にＧＰＩもしくはＧＰＩアンカー型タンパク質発現細胞の免疫蛍光染色によって、免疫ブロット法によって、酵素免疫検定法、例えばサンドイッチアッセイもしくはドットアッセイによって、または放射免疫検定法によって、所望抗体に関してスクリーニングする。
抗体の単離のために、培養上清中または腹水中の免疫グロブリンを、例えば、硫酸アンモニウムでの沈殿、ポリエチレングリコールなどの吸湿性材料に対する透析、選択性膜でのろ過等によって濃縮し得る。必要に応じておよび／または所望する場合は、抗体を通常のクロマトグラフィ法によって、例えば、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィおよび／または（免疫）アフィニティクロマトグラフィ、例えばＧＰＩ部分、その表面にＧＰＩアンカーを発現する細胞、ＧＰＩアンカー型ポリペプチド、その表面にＧＰＩアンカー型タンパク質を発現する細胞またはプロテインＡもしくはＧによるアフィニティクロマトグラフィによって精製する。
別の実施形態は、適切な哺乳動物においてＧＰＩ部分またはＧＰＩアンカー型タンパク質に対する抗体を分泌する細菌細胞株の調製のための工程を提供する。例えば、ウサギをＧＰＩ部分、その表面にＧＰＩアンカーを発現する細胞、ＧＰＩアンカー型ポリペプチド、その表面にＧＰＩアンカー型タンパク質を発現する細胞、またはそのフラグメントで免疫する。免疫したウサギから作製されるファージディスプレイライブラリを構築し、当分野で周知の方法（例えば、参照により本明細書に組み込まれる様々な参考文献に開示されている方法など）にしたがって所望抗体に関してパニングする。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞も開示される。好ましいハイブリドーマ細胞は、遺伝的に安定であり、所望特異性を有する本明細書で述べるモノクローナル抗体を分泌し、深冷凍培養物からインビトロでの解凍と増殖によってまたはインビボで腹水として増殖させることができる。
別の実施形態では、ＧＰＩ部分またはＧＰＩアンカー型タンパク質に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株の調製のための工程が提供される。その工程では、適切な哺乳動物、例えばＢａｌｂ／ｃマウスを、例えばＣＤ５５もしくはＣＤ１４の１以上のポリペプチドもしくは抗原性フラグメント、またはＣＤ５５発現細胞に由来する１以上のポリペプチドもしくは抗原性フラグメント、ＣＤ５５発現細胞自体または精製ポリペプチドを含む抗原性担体で前述したように免疫する。同様に、哺乳動物をヒトＧＰＩ部分、そのフラグメント、またはヒトＧＰＩ部分を、おそらく高い量で、発現する細胞で免疫することができる。免疫した哺乳動物の抗体産生細胞を培養中で短期間増殖させるかまたは適切な骨髄腫細胞株の細胞と融合する。融合で得られたハイブリッド細胞をクローニングし、所望抗体を分泌する細胞クローンを選択する。例えば、例えばＧＰＩアンカー型タンパク質またはＧＰＩ部分で免疫したＢａｌｂ／ｃマウスの脾細胞を、骨髄腫細胞株ＰＡＩまたは骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ１４の細胞と融合する。得られたハイブリッド細胞を、次に、所望抗体の分泌に関してスクリーニングし、陽性ハイブリドーマ細胞をクローニングする。
ハイブリドーマ細胞株を調製するための方法は、対象とする抗原を数か月間にわたって、例えば２〜４か月間、数回、例えば４〜６回、皮下および／または腹腔内注射することによってＢａｌｂ／ｃマウスを免疫することを含む。免疫マウスからの脾細胞を、最後の注射の２〜４日後に採取し、融合プロモータ、好ましくはポリエチレングリコールの存在下で骨髄腫細胞株ＰＡＩの細胞と融合する。好ましくは、骨髄腫細胞を、約３０％〜約５０％の分子量約４０００のポリエチレングリコールを含む溶液中で３〜２０倍過剰の免疫マウスからの脾細胞と融合する。融合後、通常の骨髄腫細胞が所望のハイブリドーマ細胞を圧倒するのを防ぐために、一定の間隔で選択培地、例えばＨＡＴ培地を添加した、前述したような適切な培地中で細胞を増殖させる。
抗体およびそのフラグメントは「キメラ」であり得る。キメラ抗体およびその抗原結合フラグメントは、２以上の異なる種（例えばマウスとヒト）に由来する部分を含む。キメラ抗体は、ヒト定常ドメイン遺伝子セグメントにスプライシングされた所望特異性のマウス可変領域を用いて生産できる（例えば米国特許第４，８１６，５６７号参照）。このようにして、非ヒト抗体を、ヒトでの臨床適用（例えばＰＮＨ ＩＩ型細胞を検出するための方法）により適したものにするように修飾することができる。
本開示のモノクローナル抗体は、「ヒト化」形態の非ヒト（例えばマウス）抗体を含む。ヒト化またはＣＤＲ移植ｍＡｂは、マウス抗体ほど迅速に循環中から清掃されず、典型的には有害な免疫反応を引き起こさないので、ヒトのための治療薬として特に有用である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源からその中に導入された１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「インポート」残基と称され、典型的には「インポート」可変ドメインから取られる。ヒト化抗体を調製する方法は、一般に当分野において周知である。例えば、ヒト化は、基本的に、ヒト抗体の対応する配列をげっ歯動物ＣＤＲまたはＣＤＲ配列に置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒと共同研究者達の方法（例えば、Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６参照）にしたがって実施できる。また、例えばＳｔａｅｌｅｎｓら（２００６）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４３：１２４３−１２５７も参照のこと。一部の実施形態では、ヒト化形態の非ヒト（例えばマウス）抗体は、レシピエント抗体の超可変（ＣＤＲ）領域残基が、マウス、ラット、ウサギまたは所望の特異性、親和性および結合能力を有する非ヒト霊長動物などの非ヒト種（ドナー抗体）からの超可変領域残基によって置換されているヒト抗体（レシピエント抗体）である。一部の場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域残基も、対応する非ヒト残基によって置換されている（いわゆる「復帰突然変異」）。加えて、ファージディスプレイライブラリは、抗体配列内の選択位置でアミノ酸を変化させるために使用できる。ヒト化抗体の特性はまた、ヒトフレームワークの選択によっても影響される。さらに、ヒト化およびキメラ化抗体は、例えば親和性またはエフェクター機能などの抗体特性をさらに改善するために、レシピエント抗体またはドナー抗体では認められない残基を含むように修飾できる。
完全ヒト抗体も本開示で提供される。「ヒト抗体」という用語は、（存在する場合は）ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含む。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異によってまたはインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含み得る。しかし、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体（すなわちヒト化抗体）を含まない。完全ヒト抗体またはヒト抗体は、ヒト抗体遺伝子を担持する（可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、連結（Ｊ）および定常（Ｃ）エクソンを担持する）トランスジェニックマウスまたはヒト細胞に由来し得る。例えば、現在、免疫の際、内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全なレパートリーを生産することができるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製することが可能である。（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら（１９９３）Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３；およびＤｕｃｈｏｓａｌら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５５：２５８参照）。トランスジェニックマウス系統を、再構成されていないヒト免疫グロブリン遺伝子からの遺伝子配列を含むように遺伝子操作することができる。ヒト配列は、ヒト抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードすることができ、マウスにおいて正しく機能して、再構成を受け、ヒトにおけるものに類似する広い抗体レパートリーを提供する。トランスジェニックマウスを標的タンパク質（例えば、ＧＰＩ部分またはＣＤ５５もしくはＣＤ１４などのＧＰＩアンカー型タンパク質）で免疫して、特異的抗体およびそれらがコードするＲＮＡの多様なアレイを創造することができる。そのような抗体の抗体鎖成分をコードする核酸を、その後、動物からディスプレイベクターにクローニングし得る。典型的には、重鎖および軽鎖配列をコードする核酸の別々の集団をクローニングし、次に、ベクターの所与のコピーが重鎖と軽鎖のランダムな組合せを受け取るように、別々の集団をベクターへの挿入時に組み換える。ベクターは、ベクターを含むディスプレイパッケージの外表面で構築され、提示され得るように抗体鎖を発現するように設計される。例えば、抗体鎖は、ファージの外表面からファージコートタンパク質との融合タンパク質として発現され得る。その後、ディスプレイパッケージを、標的に結合する抗体の提示に関してスクリーニングし得る。
加えて、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリに由来し得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７；およびＶａｕｇｈａｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４：３０９（１９９６））。合成ヒト抗体Ｖ領域のランダムに選ばれた組合せを使用する合成ファージライブラリを創造することができる。抗原の選択により、Ｖ領域が本質的に非常にヒト様である完全ヒト抗体を作製することができる。例えば、その各々の内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７９４，１３２号、同第６，６８０，２０９号、同第４，６３４，６６６号およびＯｓｔｂｅｒｇら（１９８３）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：３６１−３６７参照。
ヒト抗体の作製については、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｎｄｅｚら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６、ＧｒｅｅｎとＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５も参照のこと。ヒト抗体は、米国特許第５，９３９，５９８号；同第６，６７３，９８６号；同第６，１１４，５９８号；同第６，０７５，１８１号；同第６，１６２，９６３号；同第６，１５０，５８４号；同第６，７１３，６１０号；および同第６，６５７，１０３号ならびに米国特許公開第２００３０２２９９０５ Ａ１号、同第２００４００１０８１０ Ａ１号、同第２００４００９３６２２ Ａ１号、同第２００６００４０３６３ Ａ１号、同第２００５００５４０５５ Ａ１号、同第２００５００７６３９５ Ａ１号、同第２００５０２８７６３０ Ａ１号においてさらに論じられ、説明されている。また、国際公開公報第ＷＯ９４／０２６０２号、同第ＷＯ９６／３４０９６号および同第ＷＯ９８／２４８９３号ならびに欧州特許第ＥＰ ０ ４６３ １５１ Ｂ１号も参照のこと。上記に引用した特許、特許出願および参考文献の各々の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
選択的なアプローチでは、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．を含む他者が「ミニ遺伝子座」法を用いている。ミニ遺伝子座法では、Ｉｇ遺伝子座からの複数の断片（個々の遺伝子）を含めることを介して外因性Ｉｇ遺伝子座を模倣する。したがって、１以上のＶＨ遺伝子、１以上のＤＨ遺伝子、１以上のＪＨ遺伝子、μ定常領域、および２番目の定常領域（好ましくはγ定常領域）が、動物に挿入するための構築物へと形成される。このアプローチは、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，６２５，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，７７０，４２９号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８１４，３１８号；同第５，５９１，６６９号；同第５，６１２，２０５号；同第５，７２１，３６７号；同第５，７８９，２１５号；同第５，６４３，７６３号；同第５，５６９，８２５号；同第５，８７７，３９７号；同第６，３００，１２９号；同第５，８７４，２９９号；同第６，２５５，４５８号；および同第７，０４１，８７１号に述べられている。また、その各々の開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、欧州特許第０ ５４６ ０７３ Ｂ１号、国際公開公報第ＷＯ９２／０３９１８号、同第ＷＯ９２／２２６４５号、同第ＷＯ９２／２２６４７号、同第ＷＯ９２／２２６７０号、同第ＷＯ９３／１２２２７号、同第ＷＯ９４／００５６９号、同第ＷＯ９４／２５５８５号、同第ＷＯ９６／１４４３６号、同第ＷＯ９７／１３８５２号および同第ＷＯ９８／２４８８４号も参照のこと。さらに、その各々の開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｙｌｏｒら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７；Ｃｈｅｎら（１９９３）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：６４７；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３７２０−４；Ｃｈｏｉら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７；Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９；Ｔａｙｌｏｒら（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９−５９１；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６４５３−６５；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５；およびＴｕａｉｌｌｏｎら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２９９８−３００５も参照のこと。
ある実施形態では、脱免疫抗体（例えば、ヒトＧＰＩ部分もしくはＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する抗体）またはその抗原結合フラグメントが提供される。脱免疫抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体またはその抗原結合フラグメントを所与の種に対して非免疫原性にするまたはより低免疫原性にするように修飾され得る。脱免疫は、当業者に公知の様々な技術のいずれかを利用して抗体またはその抗原結合フラグメントを修飾することによって達成できる（例えば、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ０４／１０８１５８号および同第ＷＯ００／３４３１７号参照）。例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体またはその抗原結合フラグメントのアミノ酸配列内の潜在的Ｔ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープを同定し、例えば組換え技術を使用して、抗体またはその抗原結合フラグメントから潜在的Ｔ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープの１以上を除去することによって脱免疫され得る。次に、修飾された抗体またはその抗原結合フラグメントを、場合により生産し、例えば結合親和性などの１以上の所望の生物学的活性を保持するが、低い免疫原性を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを同定するために試験し得る。潜在的Ｔ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープを同定するための方法は、例えばコンピュータによる方法（例えばＰＣＴ公開公報第ＷＯ０２／０６９２３２号参照）、インビトロまたはインシリコ技術、および生物学的アッセイまたは物理的方法（例えば、ＭＨＣ分子へのペプチドの結合の測定、抗体もしくはその抗原結合フラグメントを受容する種に由来するＴ細胞受容体へのペプチド：ＭＨＣ複合体の結合の測定、抗体もしくはその抗原結合フラグメントを受容する種のＭＨＣ分子に関するトランスジェニック動物を使用したタンパク質もしくはそのペプチド部分の試験、または抗体もしくはその抗原結合フラグメントを受容する種に由来する免疫系細胞で再構成されたトランスジェニック動物に関する試験等）などの、当分野で公知の技術を使用して実施し得る。様々な実施形態において、本明細書で述べる脱免疫抗体は、脱免疫された抗原結合フラグメント、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、モノクローナル抗体、マウス抗体、遺伝子操作された抗体（例えば、キメラ、一本鎖、ＣＤＲ移植、ヒト化、完全ヒト抗体および人為的に選択された抗体など）、合成抗体ならびに半合成抗体を含む。
一部の実施形態では、抗体発現細胞株の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする挿入物を含む組換えＤＮＡを生産する。ＤＮＡという用語は、コード一本鎖ＤＮＡ、前記コードＤＮＡとそれに相補的なＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ、またはこれらの相補的（一本鎖）ＤＮＡ自体を含む。
さらに、抗体（例えば、抗ＧＰＩ抗体または抗ＧＰＩアンカー型タンパク質抗体）の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡを、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする真正ＤＮＡ配列、またはその突然変異体を含むように酵素的または化学的に合成することができる。真正ＤＮＡの突然変異体は、１以上のアミノ酸が欠失している、挿入されているまたは１以上の他のアミノ酸と交換されている上記抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡである。好ましくは、前記修飾は、ヒト化および発現最適化適用では抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲの外側である。突然変異体ＤＮＡという用語はまた、１以上のヌクレオチドが、同じアミノ酸をコードする新しいコドンを有する他のヌクレオチドによって置換されているサイレント突然変異体を包含する。突然変異体配列という用語はまた、縮重配列を含む。縮重配列は、無制限の数のヌクレオチドが、もともとコードされているアミノ酸配列の変化を生じさせずに他のヌクレオチドによって置換されているという点で遺伝暗号の意味の範囲内で縮重している。そのような縮重配列は、それらの異なる制限部位ならびに／または重鎖マウス可変ドメインおよび／もしくは軽鎖マウス可変ドメインの最適発現を得るために特定の宿主、特に大腸菌によって好まれる特定のコドン使用頻度のゆえに有用であり得る。
突然変異体という用語は、当分野で公知の方法に従って真正ＤＮＡのインビトロ突然変異誘発によって得られるＤＮＡ突然変異体を含むことが意図されている。
完全な四量体免疫グロブリン分子の構築およびキメラ抗体の発現のために、重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする組換えＤＮＡ挿入物を、重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする対応するＤＮＡと融合し、次に、例えばハイブリッドベクターへの組込み後、適切な宿主細胞に移入する。
ヒト定常ドメインＩｇＧ、例えば、γ１、γ２、γ３またはγ４、特定の実施形態ではγ１またはγ４に融合した対象とする抗体の重鎖マウス可変ドメインをコードする挿入物を含む組換えＤＮＡを使用し得る。ヒト定常ドメインκまたはλ、好ましくはκに融合した抗体の軽鎖マウス可変ドメインをコードする挿入物を含む組換えＤＮＡも提供される。
別の実施形態は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインがスペーサー基によって連結されており、場合により、宿主細胞における抗体のプロセシングを促進するシグナル配列ならびに／または抗体の精製を促進するペプチドおよび／もしくは切断部位および／もしくはペプチドスペーサーおよび／もしくは作用物質をコードするＤＮＡ配列を含む、組換えポリペプチドをコードする組換えＤＮＡに関する。作用物質をコードするＤＮＡとは、診断または治療適用において有用な作用物質をコードするＤＮＡであることが意図されている。したがって、毒素または酵素、特にプロドラッグの活性化を触媒することができる酵素である作用物質分子が特に指示される。そのような作用物質をコードするＤＮＡは、天然の酵素または毒素をコードするＤＮＡの配列またはその変異体を有し、当分野で周知の方法によって調製できる。
したがって、本開示のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、他の作用物質、例えば、治療薬または検出可能標識に複合されていない裸の抗体または抗原結合フラグメントであり得る。あるいは、モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、細胞傷害性薬剤、低分子、ホルモン、酵素、増殖因子、サイトカイン、リボザイム、ペプチドミメティック、化学物質、プロドラッグ、コード配列を含む核酸分子（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、遺伝子標的構築物等）または検出可能標識（例えば、ＮＭＲもしくはＸ線造影剤、蛍光分子等）のような作用物質に複合し得る。ある実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、一本鎖ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２）は、抗体または抗原結合フラグメントの半減期を上昇させる分子に連結される（「コンジュゲート」と題する章参照）。
いくつかの考えられるベクター系が、哺乳動物細胞におけるクローニングされた重鎖および軽鎖遺伝子の発現のために使用可能である。１つのクラスのベクターは、宿主細胞ゲノムへの所望遺伝子配列の組込みに基づく。安定に組み込まれたＤＮＡを有する細胞を、大腸菌ｇｐｔ（ＭｕｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２）またはＴｎ５ ｎｅｏ（ＳｏｕｔｈｅｒｎとＢｅｒｇ（１９８２）Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７）などの薬剤耐性遺伝子を同時に導入することによって選択できる。選択マーカー遺伝子を、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に連結するか、または同時トランスフェクションによって同じ細胞に導入することができる（Ｗｉｇｌｅｒら（１９７９）Ｃｅｌｌ １６：７７）。２番目のクラスのベクターは、染色体外プラスミドに自律複製する能力を与えるＤＮＡエレメントを利用する。これらのベクターは、ウシパピローマウイルス（Ｓａｒｖｅｒら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：７１４７）、ポリオーマウイルス（Ｄｅａｎｓら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１２９２）またはＳＶ４０ウイルス（ＬｕｓｋｙとＢｏｔｃｈａｎ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９３：７９）などの動物ウイルスに由来し得る。
免疫グロブリンｃＤＮＡは、抗体タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡを示す配列だけからなるので、免疫グロブリンｍＲＮＡの合成のためには遺伝子の転写およびＲＮＡのプロセシングを調節する付加的な遺伝子発現エレメントが必要である。これらのエレメントは、スプライシングシグナル、誘導的プロモータを含む転写プロモータ、エンハンサーおよび終結シグナルを含み得る。そのようなエレメントを組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターは、ＯｋａｙａｍａとＢｅｒｇ（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２８０；Ｃｅｐｋｏら（１９８４）Ｃｅｌｌ ３７：１０５３；およびＫａｕｆｍａｎ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６８９によって述べられているものを含む。
本開示から明らかなように、抗ＧＰＩ部分抗体または抗ＧＰＩアンカー型タンパク質抗体は、疾患を診断する（例えば、ＰＮＨまたは血小板減少症を発症する増大している危険度を診断する）ための方法、疾患の進行のモニタリング、および被験体においてＰＮＨ、血小板減少症または血栓症を処置するための、併用療法を含む適切な療法の選択において使用できる。
本開示の診断実施形態では、二重特異性抗体が企図される。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する、好ましくはヒトまたはヒト化の、モノクローナル抗体である。本開示の場合、結合特異性の１つはＧＰＩ部分または細胞（例えば、白血球また赤血球など）上のＧＰＩアンカー型タンパク質に対してであり、他の１つは任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質または受容体もしくは受容体サブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作製するための方法は当業者の技術範囲内である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づき、前記の２本の重鎖は異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎとＣｕｅｌｌｏ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−５３９）。所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの間で行われる。免疫グロブリン重鎖融合物および、所望する場合は、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に同時トランスフェクトする。二重特異性抗体を作製するための例示的な現在公知の方法のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０；ＰＣＴ公開公報第ＷＯ９６／２７０１１号；Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１；Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）１７５：２１７−２２５；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；Ｇｒｕｂｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８；およびＴｕｔｔら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０参照。二重特異性抗体はまた、架橋またはヘテロコンジュゲート抗体を含む。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋法を用いて作製し得る。適切な架橋剤は当分野で周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号の中で多くの架橋技術と共に開示されている。
組換え細胞培養から直接二重特異性抗体フラグメントを作製し、単離するための様々な技術も記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されてきた（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３参照）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結し得る。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、次に再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成し得る。この方法はまた、抗体ホモ二量体の生産のためにも利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８によって記述された「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための選択的機構を提供している。フラグメントは、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは別のフラグメントの相補的ＶＬおよびＶＨドメインと対合することを強いられ、それにより２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体フラグメントを作製するための他の方法も報告されている（例えば、Ｇｒｕｂｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８参照）。あるいは、抗体は、例えばＺａｐａｔａら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２に述べられているような「線状抗体」であり得る。簡単に述べると、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対の縦列Ｆｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は二重特異性または単一特異性であり得る。
コンジュゲート
一部の実施形態では、本明細書で述べる試薬（例えば、非溶解性アエロリシンポリペプチドまたはＧＰＩ部分もしくはＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する抗体）は異種部分に複合することができる。異種部分は、例えば、異種タンパク質（上記参照）、治療薬（例えば、毒素もしくは薬剤）、または放射性標識、酵素標識、蛍光標識もしくは発光標識などの、しかしこれらに限定されない検出可能標識であり得る。適切な放射性標識は、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓおよび３Ｈを含む。適切な蛍光標識は、限定されることなく、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＧＦＰ、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ｃｙ５、アロフィコシアニン、Ｃｙ７およびＰＥ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０を含む。発光標識は、例えば、様々な発光ランタニド（例えば、ユウロピウムまたはテルビウム）キレートの任意のものを含む。例えば、適切なユウロピウムキレートは、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）のユウロピウムキレートを含む。酵素標識は、例えば、アルカリホスファターゼ、ＣＡＴ、ルシフェラーゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼを含む。
異種部分を試薬に複合するための適切な方法はタンパク質化学の分野において周知である。例えば、２つのタンパク質を、多くの公知の化学的架橋剤のいずれかを使用して架橋することができる。そのような架橋剤の例は、「障害された」ジスルフィド結合を含む連結によって２個のアミノ酸残基を連結するものである。これらの連結において、架橋ユニット内のジスルフィド結合は、例えば、還元型グルタチオンまたはジスルフィドレダクターゼ酵素の作用による還元から保護されている（ジスルフィド結合の両側の障害基によって）。１つの適切な試薬、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）は、一方のタンパク質上の末端リシンおよび他方のタンパク質上の末端システインを利用して２つのタンパク質の間にそのような連結を形成する。各々のタンパク質上の異なるカップリング部分によって架橋するヘテロ二官能性試薬も使用できる。他の有用な架橋剤は、限定されることなく、２つのアミノ基（例えばＮ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド）、２つのスルフヒドリル基（例えば１，４−ビス−マレイミドブタン）、アミノ基とスルフヒドリル基（例えばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、アミノ基とカルボキシル基（例えば４−［ｐ−アジドサリチルアミド］ブチルアミン）、およびアミノ基とアルギニンの側鎖に存在するグアニジニウム基（例えばｐ−アジドフェニルグリオキサール一水和物）を連結する試薬を含む。
放射性標識は、共有または非共有（例えば、イオンまたは疎水）結合によって試薬に複合することができる。それらは、複合が、ＧＰＩ部分またはＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する試薬の能力を妨げないことを条件としてタンパク質の任意の部分に結合し得る。一部の実施形態では、試薬がタンパク質である場合、放射性標識を試薬のアミノ酸骨格に直接複合することができる。あるいは、放射性標識を、遊離アミノ基に結合して関連タンパク質のメタヨードフェニル（ｍＩＰ）誘導体を形成する（例えば、Ｒｏｇｅｒｓら（１９９７）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３８：１２２１−１２２９参照）より大きな分子（例えばメタ−［１２５Ｉ］ヨードフェニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（［１２５Ｉ］ｍＩＰＮＨＳ）中の１２５Ｉ）またはキレート（例えばＤＯＴＡもしくはＤＴＰＡ）の一部として含めることができ、次にそれをタンパク質骨格に結合する。本明細書で述べる試薬に放射性標識またはそれらを含むより大きな分子／キレートを複合する方法も当分野において公知である。そのような方法は、放射性標識またはキレートの試薬への結合を促進する条件（例えば、ｐＨ、塩濃度および／または温度）下で試薬を放射性標識と共にインキュベートすることを含む（例えば、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，００１，３２９号参照）。
蛍光標識（時として「フルオロフォア」と称される）を試薬（例えば非溶解性アエロリシンタンパク質または抗体）に複合するための方法はタンパク質化学の分野において公知である。例えば、フルオロフォアを、フルオロフォアに結合したスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルまたはＴＦＰエステル部分を使用してタンパク質の遊離アミノ基（例えばリシンの）またはスルフヒドリル基（例えばシステイン）に複合することができる。一部の実施形態では、フルオロフォアをスルホ−ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能性架橋剤部分に複合することができる。適切な複合方法は、フルオロフォアの試薬への結合を促進する条件下で試薬をフルオロフォアと共にインキュベートすることを含む。例えば、ＷｅｌｃｈとＲｅｄｖａｎｌｙ（２００３）“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（ＩＳＢＮ：０４７１４９５６０３）参照。フルオロフォアをタンパク質に複合する際に使用するための様々なキット、例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＫｉｔおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））が市販されている。一部の実施形態では、フルオロフォアを、タンパク質１モルにつき１〜２モルの染料で試薬に複合することができる。
一部の実施形態では、試薬（例えば、アエロリシンタンパク質またはＧＰＩ部分もしくはＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する抗体）を、例えば、循環中、例えば血液、血清または他の組織中の抗体自体の安定化および／または保持を改善する部分で修飾することができる。例えば、本明細書で述べる試薬は、例えば、Ｌｅｅら（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ １０（６）：９７３−８；Ｋｉｎｓｔｌｅｒら（２００２）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｉｅｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４７７−４８５；およびＲｏｂｅｒｔｓら（２００２）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４５９−４７６に述べられているようにＰＥＧ化することができる。安定化部分は、被験体の身体（例えば血液または組織）中での試薬の安定性または保持を少なくとも１．５倍（例えば少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０または５０倍以上）改善し得る。
生物学的試料および試料の収集
本明細書で述べる方法における使用のための適切な生物学的試料は、１以上の白血球および／または１以上の赤血球を含む、任意の生物学的液体、細胞の集団、または組織もしくはその画分を含む。生物学的試料は、例えば、被験体（例えばヒトなどの哺乳動物）から得られる標本であり得るかまたはそのような被験体に由来し得る。例えば、試料は、生検によって得られる組織切片、または組織培養下にあるもしくは組織培養に適した細胞であり得る。生物学的試料はまた、尿、全血もしくはその画分（例えば血漿）、唾液、精液、痰、脳脊髄液、涙または粘液などの生物学的液体であり得る。生物学的試料は、所望する場合は、特定の細胞型を含む画分にさらに分画することができる。例えば、全血試料を血清にまたは赤血球もしくは白血球などの特定の型の血球を含む画分に分画できる。所望する場合は、生物学的試料は、組織と液体試料の組合せなどの、被験体からの異なる生物学的試料の組合せであり得る。
生物学的試料は、被験体、例えば発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）を有する、有することが疑われる、または発症する危険性がある被験体から入手できる。生物学的試料を得るための任意の適切な方法が使用できるが、例示的な方法は、例えば瀉血、スワブ（例えば口腔スワブ）、洗浄または微細針吸引生検手順を含む。微細針吸引を実施しやすい組織の非限定的な例は、リンパ節、肺、甲状腺、乳房および肝臓を含む。生物学的試料はまた、骨髄からも入手できる。試料はまた、例えば顕微解剖（例えばレーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）もしくはレーザー顕微解剖（ＬＭＤ））、膀胱洗浄、スミア（ＰＡＰスミア）または乳管洗浄細胞診によっても収集できる。
生物学的試料中の細胞の活性または完全性を保持する試料を得るおよび／または保存するための方法は当業者に周知である。例えば、生物学的試料を、適切な緩衝液および／またはプロテアーゼ阻害剤を含む阻害剤、細胞を保存するまたは細胞における変化（例えば浸透圧もしくはｐＨの変化）もしくは細胞表面タンパク質（例えばＧＰＩ連結タンパク質）もしくは細胞表面のＧＰＩ部分の変性を最小限に抑えることが意図された作用物質などの１以上の付加的な作用物質とさらに接触させ得る。そのような阻害剤は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）などのキレート剤、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、アプロチニンおよびロイペプチンなどのプロテアーゼ阻害剤を含む。細胞全体を保存するまたは操作するための適切な緩衝液および条件は、例えば、ＰｏｌｌａｒｄとＷａｌｋｅｒ（１９９７），“Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”ｖｏｌｕｍｅ ７５ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｍａｓｔｅｒｓ（２０００）“Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，”ｖｏｌｕｍｅ ２３２ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｓｅｒｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；およびＪｏｎｅｓ（１９９６）“Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”ｖｏｌｕｍｅ ２ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓに述べられている。
試料はまた、干渉物質を排除するまたはその存在を最小限に抑えるように処理することができる。例えば、生物学的試料を、対象でない１以上の物質（例えば細胞）を除去するように分画または精製することができる。生物学的試料を分画または精製する方法は、フローサイトメトリ、蛍光活性化細胞選別および沈降を含むが、これらに限定されない。
診断および治療方法
上記で指摘し、実施例で詳述するように、本発明者らは、患者におけるＰＮＨ ＩＩ型造血細胞（例えばＩＩ型白血球および／またはＩＩ型赤血球）の存在または量と血小板減少症との間の臨床的関係を発見した。例えば、本発明者らは、試験した生物学的試料中の同じ組織型（同じ系統）の全白血球と比較して少なくとも１．２％（例えば、少なくとも１．２、１．５、２、３、５、７、９、１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７、３０、３２、３５、３７、４０、４２、４５、４７、５０、５２、５５、５７、６０、６２、６５または６５．３％以上）のＰＮＨ ＩＩ型白血球集団を有する患者は、検出可能なＰＮＨ ＩＩ型白血球集団を有さない患者または１．２％未満のＰＮＨ ＩＩ型白血球集団を有する患者よりも血小板減少症である可能性がはるかに高いと決定した。ＰＮＨ ＩＩ型顆粒球集団を有する患者試料は、検出可能なＩＩ型顆粒球集団を有さない患者試料と比較して、類似の末梢白血球数、末梢赤血球数、絶対好中球数およびヘモグロビン（Ｈｇｂ）レベルを有しており、血小板数の差は、基礎にある骨髄産生の差によるものではない可能性が高いことを示した。言い換えると、検出可能なＰＮＨ ＩＩ型顆粒球クローンを有する患者における低下した血小板数は、ＰＮＨ患者における死亡の主要原因である血栓症に結びつき得る、末端補体介在性血小板消費または破壊の上昇によるものであると考えられる。例えば、Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ（２００６）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １１（３）：１３９−１４６参照。したがって、本開示は、患者が血小板減少症および／または血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを決定するために患者試料中のＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージに関する情報を使用するための方法を特徴とする。同様に、本発明者らは、少なくとも０．０２％（例えば、少なくとも０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７１、７１．３または７５％以上）のＰＮＨ ＩＩ型ＲＢＣ集団を有する患者は、検出可能なＰＮＨ ＩＩ型ＲＢＣ集団を有さない患者または０．０２％未満のＰＮＨ ＩＩ型ＲＢＣ集団を有する患者よりも血小板減少症である可能性がはるかに高いと決定した。したがって、本開示はまた、患者が血小板減少症および／または血栓症を発症する危険性があるかどうかを決定するために患者におけるＰＮＨ ＩＩ型ＲＢＣクローンサイズに関する情報を使用するための方法を特徴とする。
以下の方法は、患者からの生物学的試料中の同じ組織型（同じ系統）の細胞の総数と比較してＰＮＨ ＩＩ型造血細胞（例えばＰＮＨ ＩＩ型白血球）の存在を検出するまたはそのパーセンテージを決定するために使用できる。複数の白血球を調べる実施形態では、前記方法は、複数の中の同じ組織型の白血球の総数と比較して全異常ＰＮＨ集団（すなわちＩＩ型プラスＩＩＩ型細胞）のサイズを正確に決定する（および／または医師が複数の中のＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージを決定することを可能にする）ために、医師が、同じ組織型（同じ系統）のＰＮＨ Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型白血球の集団を区別することを可能にするうえで有用である。第一に、細胞（例えば、白血球、赤血球、または白血球と赤血球の組合せ）の集団を、（ｉ）ＧＰＩ部分または（ｉｉ）ＧＰＩ連結タンパク質に結合する試薬と、試料中に存在する細胞の表面上の、存在する場合は、ＧＰＩ部分またはＧＰＩ連結タンパク質への試薬の結合を可能にする期間および条件下で接触させる。細胞の集団は、生物学的試料（例えば、全血試料；「生物学的試料および試料の収集」と題する章参照）、例えば患者から得た生物学的試料中に存在し得る。例えば、患者からの全血試料中に存在する細胞を、アエロリシンタンパク質（例えば非溶解性形態のアエロリシン）またはＧＰＩ部分もしくはＣＤ５９などのＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する抗体と接触させ得る。例えば、ＨａｌｌとＲｏｓｓｅ（１９９６）Ｂｌｏｏｄ ８７（１２）：５３３２−５３４０および米国特許第６，５９３，０９５号参照。試薬と接触させた細胞（例えば白血球またはＲＢＣ）の少なくとも一部を、細胞の表面に結合した試薬の量に基づいて区別することができる。例えば、検出可能に標識された試薬を使用した場合は、表面に結合した試薬の量を、細胞の表面に結合した検出可能標識試薬から生成されるシグナルの総量の関数として決定できる。上述したように、細胞への試薬の結合の量は、細胞がＰＮＨ ＩＩＩ型細胞（ＧＰＩおよびＧＰＩアンカー型タンパク質をほとんどまたは全く発現しない）、正常細胞（Ｉ型細胞；ＩＩＩ型細胞と比較して相対的に高いレベルのＧＰＩおよびＧＰＩアンカー型タンパク質の発現を有する）ならびにＰＮＨ ＩＩ型細胞（Ｉ型細胞およびＩＩＩ型細胞と比較して中間的なレベルのＧＰＩおよびＧＰＩアンカー型タンパク質の発現を有する）であることを示す、ＧＰＩ部分および／またはＧＰＩアンカー型タンパク質の発現の量を反映する。区別するかまたは調べる工程は、例えばフローサイトメトリを含み得る。
一部の実施形態では、前記方法は、患者試料からのＲＢＣへの試薬の結合の量を検出するために使用できる。一部の実施形態では、前記方法は、患者試料からの白血球への試薬の結合の量を検出するために使用できる。本明細書で述べる診断方法における評価に特に適する白血球は、例えば、顆粒球および単球（例えばマクロファージ）を含む。
試料は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）を有する、有することが疑われる、または発症する危険性がある被験体に由来し得る。一部の実施形態では、患者は、例えばクームス陰性血管内溶血、ＬＤＨレベル上昇、再発性鉄欠乏性貧血、異常な部位における血栓症、エピソード性嚥下障害または腹痛を含む１以上の症状を有する。
一部の実施形態では、正常細胞またはＰＮＨ細胞の同定を助けるために、対照細胞集団のセットも検出方法に供することができる。対照集団は、対象とする細胞集団の評価の前に、評価と同時にまたは評価後に評価することができる。以下でより詳細に論じるように、医師は、ＰＮＨ ＩＩ型細胞であることが公知の細胞の対照集団、ＰＮＨ ＩＩＩ型細胞であることが公知の細胞の対照集団、および／または正常もしくはＩ型細胞であることが公知の細胞の対照集団を、使用される試薬の特定細胞型への結合の典型的な量または平均量を決定する方法に供することを選択できる。この対照情報を使用して、対象とする細胞（例えば、白血球または赤血球）を正常細胞、ＰＮＨ ＩＩ型細胞および／またはＰＮＨ ＩＩＩ型細胞として分類するまたは同定することができる。
生物学的試料中の細胞集団の特定の組成に依存して、集団の少なくとも一部の細胞を、結合試薬の高い量、結合試薬の低い量または結合試薬の中間的な量に基づいて他の細胞から区別することができる。一部の場合には、結合試薬の高い量を有する細胞だけが存在する（例えば、健常患者またはＰＮＨを有さない患者からの細胞）。一部の場合には、より大きなパーセンテージの細胞が、ほとんどまたは全くそれらの表面に試薬を結合しない（例えば、高いパーセンテージのＰＮＨ ＩＩＩ型細胞を有するＰＮＨ患者からの白血球またはＲＢＣ）。一部の実施形態では、試薬と接触させた細胞の集団を、細胞に結合した試薬の量に基づいて高、低および中間カテゴリーに分類できる。
一部の実施形態では、１以上の細胞（例えば、１以上の区別されたかまたは調べられた細胞）を、それらの細胞表面に結合した試薬の量に基づいて分類できる。実施例で例示し、図１に示すように、フローサイトメトリ法を用いて、集団中の個々の細胞を、試薬が多量に結合しているか、試薬が少量結合しているかまたは試薬がわずかに結合しているか、および試薬が中間的に結合していると容易に分類できる。例えば、ＰＮＨを有する患者から得た白血球を２つの異なる試薬：ＧＰＩ部分に結合する第一試薬（例えば検出可能に標識された非溶解性アエロリシンタンパク質）およびＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する第二試薬（例えばヒトＣＤ２４に結合する検出可能に標識された抗体）と接触させる。第一試薬および第二試薬は異なる検出可能標識で標識する。接触させた細胞を、次に、フローサイトメトリに供する。フローサイトメトリの当業者は、各々の試薬の細胞への結合の量に基づいて細胞間を区別する方法を容易に使用し得る。例えば、Ｍａｃｅｙ（２００７）“Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（ＩＳＢＮ：１５８８２９６９１１）およびＢｒｏｄｓｋｙら（２０００）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １１４：４５９−４６６参照。図１に示すように、フローサイトメトリ法は、ＰＮＨ患者から得た顆粒球を、各々の試薬の多量の結合（右上の細胞集団；正常またはＩ型細胞）、各々の試薬の少量の結合（左下の細胞集団；ＩＩＩ型細胞）、および各々の試薬の中間的な量の結合（下部中央の細胞集団；ＩＩ型細胞）を有すると分類するために容易に使用できる。
細胞の分類は、細胞に結合した試薬の量を対照量（例えば、ＰＮＨ Ｉ型細胞、ＰＮＨ ＩＩ型細胞および／またはＰＮＨ ＩＩＩ型細胞への試薬の結合の対照量）と比較することによって実施できる。ＰＮＨ Ｉ型細胞への試薬の結合の対照量は、例えば、１名以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０名以上）の健常個人から得た同じ組織型の細胞への試薬の観察された結合の平均量に基づき得る。ＰＮＨ ＩＩＩ型細胞への試薬の結合の対照量は、ＰＮＨを有する１名以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０名以上）の患者から得た同じ型の細胞への観察された結合の平均量に基づき得る。ＰＮＨ ＩＩ型細胞への試薬の結合の対照量は、例えば、ＰＮＨを有し、同じ組織型（同じ系統）のＰＮＨ ＩＩ型細胞の検出可能な集団を有する１名以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０名以上）の患者から得た同じ型の細胞への観察された結合の平均量に基づき得る。例えば、細胞の表面に結合した試薬の量に基づいて対象とする白血球を分類するために、医師は、細胞に結合した試薬の量を、ＰＮＨ Ｉ型白血球であることが公知の白血球、ＰＮＨ ＩＩ型白血球であることが公知の白血球、および／またはＰＮＨ ＩＩＩ型白血球であることが公知の白血球に結合した試薬の典型的な量または平均量と比較することができる。
一部の実施形態では、対象とする細胞（例えば、白血球またはＲＢＣ）の区別または分類は、細胞に結合した試薬の量が、同じ組織型のＰＮＨ Ｉ型細胞、ＰＮＨ ＩＩ型細胞またはＰＮＨ ＩＩＩ型細胞を示すあらかじめ定められた範囲内であるかどうかを決定することによって実施できる。一部の実施形態では、対象とする造血細胞の区別または分類は、細胞の表面に結合した試薬の量が、あらかじめ定められたカットオフ値より上または下であるかどうかを決定することを含み得る。カットオフ値は、典型的にはそれより上
または下であることが特定のクラスの細胞、すなわちＰＮＨ Ｉ型細胞、ＰＮＨ ＩＩ型細胞またはＰＮＨ ＩＩＩ型細胞を示すとみなされる、細胞の表面に結合した試薬の量（または細胞から検出されたシグナルの量）である。
一部のカットオフ値は、診断上の相関関係（例えば、細胞の表面に結合する試薬の量と細胞がＰＮＨ ＩＩ型細胞である可能性）がカットオフ値のいずれかの側の数値範囲にわたってまだ有意のままであり得るという意味で、絶対ではない。最適カットオフ値の精密化は、使用される試薬の品質、使用される統計方法および検出装置（例えばフローサイトメトリ）の洗練、ならびに調べられた試料の数および供給源に依存して決定され得ると理解される。それゆえ、カットオフ値は、方法論または試料分布の定期的な再評価または変更に基づいて、上下に調整され得る。
本明細書で使用される場合、「血小板減少症」は、患者が、血液μＬ当たり２００，０００未満（例えば、１５０，０００未満；１４０，０００未満；１３０，０００未満；１２０，０００未満；１１０，０００未満；１００，０００未満または９０，０００未満）の血小板の血小板数を有する状態を指す。一部の実施形態では、血小板減少症を有する患者は血液μＬ当たり１００，０００未満の血小板の血小板数を有する。
上述したように、ＰＮＨ ＩＩ型細胞のパーセンテージに関する情報は、患者が血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを決定するための方法において使用できる。患者からの生物学的試料中のＰＮＨ ＩＩ型細胞（例えば、ＩＩ型白血球および／またはＩＩ型赤血球）のパーセンテージに関する情報は、医師が患者のために適切な治療レジメンを選択するのに使用されるべく、医師に伝達される（例えば電子または印刷形態）。試験した生物学的試料中の同じ組織型の白血球の総数と比較して、少なくとも１．２％（例えば、少なくとも１．２、１．５、２、３、５、７、９、１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７、３０、３２、３５、３７、４０、４２、４５、４７、５０、５２、５５、５７、６０、６２、６５または６５．３％以上）のＰＮＨ ＩＩ型白血球集団に基づき、医師は、患者が血小板減少症を発症する危険性がある、または血小板減少症である可能性があり得ると決定し得る。同様に、試験した生物学的試料中の全ＲＢＣに対して少なくとも０．０２％（例えば、少なくとも０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７１、７１．３または７５％以上）のＰＮＨ ＩＩ型ＲＢＣ集団を有する患者は、検出可能なＰＮＨ ＩＩ型ＲＢＣ集団を有さない患者または０．０２％未満のＰＮＨ ＩＩ型ＲＢＣ集団を有する患者よりも血小板減少症である可能性がはるかに高い。少なくとも１．２％のＰＮＨ ＩＩ型白血球集団または少なくとも０．０２％のＰＮＨ ＩＩ型赤血球集団を有する患者は、正常個人またはそのパーセンテージのＰＮＨ ＩＩ型細胞を有さない患者よりも血栓症を発症する可能性が、例えば、少なくとも１．５倍（例えば、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１５、２０、３０またはさらに４０倍以上）高いかもしれない。
医師は、患者における血小板数を決定する付加的な試験を要求し得る。被験体からの血液由来試料中の血小板数を決定するための方法は医学の分野において周知であり、例えば、Ｓａｌｌａｈら（１９９８）Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０３：２０９−２１０；Ｋｏｔｔｋｅ−Ｍａｒｃｈａｎｔ（１９９４）Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．８：８０９−８５３；Ｒｅｄｅｉら（１９９５）Ｊ Ｃｒｉｔ Ｉｌｌｎ １０：１３３−１３７；Ｂｕｔｋｉｅｗｉｃｚら（２００６）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１８（２）：１９９−２０４；Ｔｏｍｉｔａら（２０００）Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ６３（３）：１３１−１３５；およびＳｃｈｒｅｚｅｎｍｅｉｅｒら（１９９８）Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １００（３）：５７１−５７６に述べられている。
患者が医師によって血小板減少症であるまたは血小板減少症である可能性が高いと決定された場合、医師は患者に抗血小板減少症療法を選択、処方または投与し得る。抗血小板減少症療法は、例えば、コルチコステロイド、血小板輸血、脾摘出術または血小板産生促進剤であり得る。血小板産生促進剤は、例えば、トロンボポエチン（ＴＰＯ）またはトロンボポエチンミメティックであり得る。例えば、ＫｕｔｅｒとＢｅｇｌｅｙ（２００２）Ｂｌｏｏｄ １００：３４５７−３４６９；Ｌｉら（２００１）Ｂｌｏｏｄ ９８：３２４１−３２４８；およびＶａｄｈａｎ−Ｒａｊら（２０００）Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １３２：３６４−３６８参照。ＴＰＯミメティックペプチドは、その開示（特に図５）の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３００４９６８３号の図５に示されているアミノ酸配列を有し得る。
患者からの生物学的試料中のＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージが約１．２％である場合、医師はまた、患者が血栓症を発症する危険度が増大していると決定し得る。医師は、次に、患者のために適切な抗血栓症療法を選択し得る。例えば、医師は患者に抗凝固薬または血栓溶解剤を選択、処方または投与し得る。抗凝固薬は、例えば、クマジン、ヘパリンまたはそれらの誘導体であり得る。血栓溶解剤は、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（例えば、Ｒｅｔａｖａｓｅ（商標）、Ｒａｐｉｌｙｓｉｎ（商標））、ストレプトキナーゼまたはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子であり得る。
一部の実施形態では、１．２％以上のＰＮＨ ＩＩ型白血球集団または０．０２％以上のＰＮＨ ＩＩ型赤血球集団を有すると決定された患者は、ＰＮＨを有すると診断され得る。一部の実施形態では、ＰＮＨを有すると診断された患者または１．２％以上のＰＮＨ ＩＩ型白血球集団または０．０２％以上のＰＮＨ ＩＩ型赤血球集団を有すると決定される、以前に診断されたＰＮＨ患者は、補体阻害剤を処方され得るおよび／または補体阻害剤で処置され得る。
ヒト補体成分のいずれかに結合するまたはさもなければその生成および／もしくは活性をブロックする任意の化合物を本開示にしたがって利用し得る。例えば、補体の阻害剤は、例えば、低分子、核酸もしくは核酸類似体、ペプチドミメティック、または核酸もしくはタンパク質ではない高分子であり得る。これらの作用物質は、有機低分子、ＲＮＡアプタマー、Ｌ−ＲＮＡアプタマー、スピーゲルマー、アンチセンス化合物、二本鎖ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、ロックト核酸阻害剤、およびペプチド核酸阻害剤を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、補体阻害剤はタンパク質またはタンパク質フラグメントであり得る。
一部の実施形態では、ヒト補体成分に特異的な抗体は本明細書において有用である。一部の化合物は、補体成分Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５（またはそのフラグメント；下記参照）、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｄ因子、Ｂ因子、Ｐ因子、ＭＢＬ、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２に対する抗体を含み、したがってＣ５ａに関連するアナフィラトキシン活性の生成を防ぐおよび／またはＣ５ｂに関連する膜攻撃複合体の構築を防ぐ。
また、ＣＲ１、ＬＥＸ−ＣＲ１、ＭＣＰ、ＤＡＦ、ＣＤ５９、Ｈ因子、コブラ毒因子、ＦＵＴ−１７５、コンプレスタチンおよびＫ７６ ＣＯＯＨなどの天然または可溶性形態の補体阻害性化合物も本発明の方法において有用である。ヒト補体成分のいずれかに結合するまたはさもなければその生成および／または活性をブロックするために利用し得る他の化合物は、タンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチド、低分子、ＡＲＣ１８７（Ａｒｃｈｅｍｉｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡから市販されている）、Ｌ−ＲＮＡアプタマー、スピーゲルマーを含むＲＮＡアプタマー、アンチセンス化合物、セリンプロテアーゼ阻害剤、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）阻害剤、ペプチド核酸（ＰＮＡ）阻害剤等を含む二本鎖ＲＮＡなどのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に利用し得る分子を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、補体阻害剤は補体の活性化を阻害する。例えば、補体阻害剤はＣ１（例えば、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒもしくはＣ１ｓ）に結合してその補体活性化活性を阻害し得るか、または補体阻害剤はＣ２、Ｃ３またはＣ４に結合してそれらを阻害し得る（例えばその切断を阻害し得る）。一部の実施形態では、阻害剤は、補体の選択的および／または古典的経路のＣ３コンベルターゼおよび／またはＣ５コンベルターゼの形成または構築を阻害する。一部の実施形態では、補体阻害剤は、末端補体形成、例えばＣ５ｂ−９膜攻撃複合体の形成を阻害する。例えば、抗体補体阻害剤は抗Ｃ５抗体を含み得る。そのような抗Ｃ５抗体は、Ｃ５ｂの形成および／または生理的機能を阻害するように、Ｃ５および／またはＣ５ｂと直接相互作用し得る。例示的な抗Ｃ５抗体は、例えば、エクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）；Ａｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，ＣＴ；例えば、Ｋａｐｌａｎ（２００２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ ３（７）：１０１７−２３；Ｈｉｌｌ（２００５）Ｃｌｉｎ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ３（１１）：８４９−５０；およびＲｏｔｈｅｒら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５（１１）：１２５６−１４８８参照）およびペキセリズマブ（Ａｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，ＣＴ；例えばＷｈｉｓｓ（２００２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ ３（６）：８７０−７；Ｐａｔｅｌら（２００５）Ｄｒｕｇｓ Ｔｏｄａｙ（Ｂａｒｃ）４１（３）：１６５−７０；およびＴｈｏｍａｓら（１９９６）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３（１７−１８）：１３８９−４０１参照）を含む。
適切な抗血栓症療法および／または抗血小板減少症療法を、それを必要とする患者に投与するための方法は、医学の分野において周知である。
一部の実施形態では、患者が血小板減少症または血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを決定するための方法は、コンピュータを援用することができる。例えば、前記方法は、ＰＮＨ患者の医学的プロフィール、すなわち患者からの生物学的試料中の同じ組織型（同じ系統）の全白血球に対するＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージに関する情報を含むプロフィールを含むデータを受け取ること；および患者が血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを決定するための情報を含むデータの少なくとも一部を処理することを含み得る。別の例では、前記方法は、患者からの生物学的試料中の同じ組織型の全白血球に対するＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージに関する情報を提供すること；前記情報をコンピュータに入力すること；およびコンピュータと入力情報を使用して、患者が血栓症についての危険度が増大しているかどうかを示すパラメータを計算することを含み得る。血小板減少症または血栓症を発症することについての患者の相対的危険度を、コンピュータによって印刷物として出力し得るおよび／またはコンピュータ読取り可能媒体において保存し得る。
キット
また、患者からの生物学的試料がＰＮＨ ＩＩ型白血球集団を含むかどうかを決定するおよび／または患者が血小板減少症または血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかを決定する際に使用するためのキットも本明細書で取り上げる。キットは、例えば、アエロリシンコンジュゲート（例えば非溶解性変異体アエロリシンタンパク質コンジュゲート）またはＧＰＩアンカー型タンパク質に結合する抗体のコンジュゲートから選択される検出可能に標識されたコンジュゲートの１以上を含み得る。キットはまた、ＧＰＩ発現細胞またはＧＰＩ結合粒子を含む対照試料；および場合により、ＧＰＩ発現細胞の存在を検出するための指示書を含み得る。キットはまた、ヒトから生物学的試料（例えば血液試料）を得るための１以上の手段および／または上述したキット成分のいずれかを含み得る。
以下の実施例は本発明を例示することを意図するものであり、本発明を限定することを意図しない。
実施例１
試験材料および方法
ＰＮＨ ＩＩ型細胞およびＰＮＨ ＩＩＩ型細胞の存在を試験するために合計２，９２１名の患者の末梢血試料を得た。血液試料を、ＥＤＴＡを含む滅菌バイアルに導き入れた。
各々の患者試料中に存在する正常白血球（Ｉ型細胞）、ＰＮＨ ＩＩ型およびＰＮＨ ＩＩＩ型白血球のパーセンテージを決定するために、末梢血を以下のコンジュゲートの１以上と混合し、染色した：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８に複合した非溶解型アエロリシン変異体タンパク質（Ｐｒｏｔｏｘ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＦＬ２−Ｓ）、フィコエリトリン（ＰＥ）に複合した抗ＣＤ２４抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒクローンＡＬＢ９）、ＰＣ５に複合した抗ＣＤ１５抗体（クローン８０Ｈ５）、およびＰＣ７に複合した抗ＣＤ４５抗体（クローンＪ．３３）。血液を上記試薬の１以上と共に室温で１５〜３０分間インキュベートした後、血液をＩｍｍｕｎｏｐｒｅｐ（商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で溶解し、ＰＢＡ緩衝液（リン酸緩衝食塩水、１％ウシ血清アルブミンおよび１０ｍＭ ＮａＮ３）で２回洗浄した。次に細胞をＰＢＡ緩衝液に再懸濁し、ＦＣ ５００フローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて分析した。ＰＮＨ ＩＩ型またはＩＩＩ型顆粒球集団が同定された場合は、単球も、単球への系統特異的ゲーティングを可能にする、以下のコンジュゲートの１以上と接触させた患者血液を使用してＩＩ型またはＩＩＩ型集団に関して調べた：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８に複合した非溶解型アエロリシン変異体タンパク質（Ｐｒｏｔｏｘ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＦＬ２−Ｓ）、フィコエリトリン（ＰＥ）に複合したＣＤ３３に結合する抗体（クローンＤ３ＨＬ６０．２５１）、ＥＣＤに複合したＣＤ１４に結合する抗体（クローンＲＭ０５２）、ＰＣ５に複合したＣＤ６４に結合する抗体（クローン２２）、およびＰＣ７に複合したＣＤ４５に結合する抗体（クローンＪ．３３）。
正常赤血球（Ｉ型細胞）、ＰＮＨ ＩＩ型およびＰＮＨ ＩＩＩ型赤血球のパーセンテージを決定するために、ＥＤＴＡ中２０μｌの末梢血を３ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に入れ、十分に混合した。５０μｌの希釈患者血液を以下のコンジュゲートの１以上と接触させた：ＦＩＴＣに複合した抗ＣＤ２３５ａ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒクローン１１Ｅ４Ｂ−７−６／ＫＣ １６）およびＰＥに複合した抗ＣＤ５９抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｌｏｎｅ ＭＥＭ−４３）。血液とコンジュゲートを暗所にて室温で１時間、１５分ごとにボルテックスしながらインキュベートした。１時間のインキュベーション後、血液をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁して、ＦＣ ５００フローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。
実施例２
ＰＮＨに関する診断試験に供した２，９２１名の患者からの全血試料を、白血球（特に顆粒球）上のＧＰＩおよびＧＰＩアンカー型タンパク質の発現レベルを検出し、それによって各々の試料中のＩ型、ＰＮＨ ＩＩ型およびＰＮＨ ＩＩＩ型白血球（顆粒球）集団を決定するために、高感度フローサイトメトリに基づくアッセイを使用して分析した。前記アッセイを、各々の患者試料中のＩ型、ＰＮＨ ＩＩ型およびＰＮＨ ＩＩＩ型赤血球集団を検出するためにも使用した。前記方法は、蛍光標識した非溶解性アエロリシンタンパク質変異体を、特定のＧＰＩアンカー型系統特異的タンパク質抗原に対する抗体と共に用いた。１つの患者試料の例示的なフローサイトメトリ分析を図１に示す。全血試料からの細胞を蛍光標識アエロリシン試薬（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）およびＧＰＩアンカー型タンパク質ＣＤ２４に結合するフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗体と接触させた。全血試料の細胞をフローサイトメトリ分析に供し、その中の顆粒球を、顆粒球の表面に結合した各試薬から検出されたシグナルの量に基づいて提示した。図１に示すように、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒおよびＰＥ標識物から検出された最も増大している量のシグナルを有する顆粒球（右上；Ｉ型細胞）が、非常に低いシグナルを有するかまたはシグナルが存在しない顆粒球の集団（左下；ＩＩＩ型顆粒球）および中間的な量のシグナルを生じる顆粒球（中央の集団；ＩＩ型顆粒球）から分離された。
ＰＮＨ赤血球集団を２つの試薬：ＣＤ２３５に結合する検出可能標識抗体およびＣＤ５９に結合する検出可能標識試薬を使用して調べた。ＰＮＨ白血球集団を、検出可能標識アエロリシンタンパク質およびＣＤ２４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６６ｂおよびＣＤ５５を含むＧＰＩアンカー型系統特異的細胞表面タンパク質に対するいくつかの抗体を使用して調べた。
患者試料のうち２１６は、検出可能なＰＮＨ ＩＩＩ型顆粒球集団を有しており、これは試料中の顆粒球の総数の＞０．０１％であり、少なくとも５０のＰＮＨ ＩＩＩ型顆粒球の絶対数であった。いくつかのパラメータ（例えば、ヘモグロビンレベル、ＬＤＨレベルおよび血小板数）に関する臨床情報が、これらの患者のうち１６２名について得られた（表１参照）。
臨床情報が得られた患者からの試料のうちで、１９（８．８％）の患者試料は、全顆粒球集団の１．２〜６５．３％の範囲の明確なＩＩ型顆粒球集団を含み、クローンサイズのメジアンは約７％であった。１９の患者試料のうち４では、ＩＩ型顆粒球集団は全異常集団（例えば、ＰＮＨ ＩＩ型およびＩＩＩ型細胞）の＞５０％を占めた。１９の患者試料のうち１０では、ＰＮＨ ＩＩ型単球集団も検出された。顆粒球上で認められる個々のＧＰＩ連結タンパク質に特異的な様々な抗体の、ＰＮＨ ＩＩ型顆粒球を検出する能力の評価は、ＩＩ型顆粒球集団が、検出可能標識アエロリシン試薬を使用したすべての症例において検出可能であったが、ＣＤ６６ｂ（８８％）、ＣＤ５５（５０％）、ＣＤ２４（４７％）およびＣＤ１６（０％）に特異的な抗体を使用すると検出可能な症例の割合は低下した（表２参照）。これらの結果は、アエロリシンに基づくコンジュゲートは患者試料においてＰＮＨ ＩＩ型顆粒球集団を正確に検出するために特に有用であることを示す。
ＰＮＨ ＩＩ型顆粒球集団を含む患者試料は、ＩＩ型顆粒球を有さない患者試料よりも有意に大きな、ＰＮＨ ＩＩ型とＰＮＨ ＩＩＩ型を合わせた全顆粒球集団のメジアン（８７％対１１％；ｐ＝０．０００３）、ならびにより大きなＩＩ型およびＩＩＩ型ＲＢＣ集団メジアンを有しており、これは、全体としてより大きなＰＮＨ細胞集団を有する患者試料においてＰＮＨ ＩＩ型白血球集団を検出する、前記方法の増大している能力を反映する。
臨床データと比較した後、ＰＮＨ ＩＩ型顆粒球集団を有する患者試料はまた、より低い血小板（ｐｌｔ）数のメジアン（５４×１０９／Ｌ；ｐ＜０．０１）を有することが発見された。図２参照。ＰＮＨ ＩＩ型顆粒球集団を有する患者試料は、検出可能なＩＩ型顆粒球集団を有さない患者試料と比較して、類似の末梢白血球数、末梢赤血球数、絶対好中球数およびヘモグロビン（Ｈｇｂ）レベルを有しており（表１）、血小板数の差は、基礎にある骨髄産生の差によるものではない可能性が高いことを示した。言い換えると、本開示は決していかなる特定の理論または作用機構にも限定されるものではないが、ＰＮＨ患者はＧＰＩ連結補体調節タンパク質ＣＤ５５およびＣＤ５９の欠如による補体調節機能不全を有するので、検出可能なＰＮＨ ＩＩ型顆粒球クローンを有する患者において認められた低い血小板数は、ＰＮＨ患者における死亡の主要原因である血栓症に結びつき得る、末端補体介在性血小板消費または破壊の上昇によるものであると考えられる。
本開示は、その特定の実施形態を参照して説明されているが、本開示の真の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を行い得ることおよび等価物で置換され得ることが当業者に理解されるはずである。加えて、特定の状況、材料、物質の組成、工程、１以上の工程段階を本開示の目的、精神および範囲に適合させるために多くの修正を行い得る。すべてのそのような修正は本開示の範囲内であることが意図されている。

Claims (15)

  1. 発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）ＩＩ型顆粒球のパーセンテージを、ＰＮＨの患者が血栓症を発症する危険度が増大しているかどうかの指標とするための方法であって、
    患者からの生物学的試料中の全顆粒球に対するＰＮＨ ＩＩ型顆粒球のパーセンテージを決定することを含み、
    １．２％以上であるＰＮＨ ＩＩ型白血球のパーセンテージは、該患者は血栓症を発症する危険度が増大していることを示す、方法。
  2. 前記生物学的試料が全血試料である、請求項１に記載の方法。
  3. １．２％〜６５．３％（１．２％および６５．３％を含む）であるＰＮＨ ＩＩ型顆粒球集団は、前記患者は血栓症の危険度が増大していることを示す、請求項１または２に記載の方法。
  4. ａ）５％以上、ｂ）１０％以上、ｃ）２０％以上、またはｄ）５０％以上であるＰＮＨ ＩＩ型顆粒球集団は、前記患者は血栓症の危険度が増大していることを示す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記患者が血栓症を発症する危険度が増大していることは、該患者が血栓症の少なくとも１つの症状の発症に関してモニタリングすること必要とすることを示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記患者が血栓症を発症する危険度が増大していることは、該患者が抗血栓症療法を必要とすることを示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記抗血栓症療法が抗凝固薬または血栓溶解剤である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記抗凝固薬がクマジン、ヘパリンまたはそれらの誘導体である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記血栓溶解剤が組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼまたはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子である、請求項７に記載の方法。
  10. 前記患者が血栓症を発症する危険度が増大している場合、該患者に抗血栓症療法が投与されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）ＩＩ型顆粒球のパーセンテージを、ＰＮＨの患者が治療を必要とすることの指標とするための方法であって、患者が１．２％以上のＰＮＨ ＩＩ型顆粒球集団を有すると決定されることは、該患者が抗血栓症療法および抗血小板減少症療法の一方または両方を必要とすることを示す、方法。
  12. 発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）ＩＩ型顆粒球のパーセンテージを、ＰＮＨの患者が治療を必要とすることの指標とするための方法であって、該患者が１．２％より高いＰＮＨ ＩＩ型顆粒球集団を有することは、抗血栓症療法および抗血小板減少症療法の一方または両方が該患者に投与されることを示す、方法。
  13. 前記抗血栓症療法が抗凝固薬または血栓溶解剤である、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記抗血小板減少症療法が血小板輸血である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. ＰＮＨ ＩＩ型顆粒球のパーセンテージを決定するために非溶解バリアント型のアエロリシンタンパク質を使用する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
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