CN102753147B - 长效红细胞生成素缀合物的液体制剂 - Google Patents

Abstract

公开了一种液体制剂，其使得具有改善的体内持续时间和稳定性的长效EPO缀合物能在长时间储存时稳定。所述液体制剂包含以缓冲剂和甘露醇为特征的稳定剂组合物。由于不含人血清白蛋白和其他对身体有害的潜在因子，所以所述液体制剂没有病毒感染的问题，并且确保长效EPO缀合物的优异的储存稳定性。

Description

长效红细胞生成素缀合物的液体制剂

技术领域

本发明涉及用于确保长效红细胞生成素缀合物的长期储存稳定性的液体制剂，所述液体制剂中红细胞生成素、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段共价连接并且其显示出与野生型相比延长的作用持续时间。

背景技术

红细胞生成素（EPO）是由165个氨基酸残基组成的糖蛋白，其在骨髓中充当红细胞前体的细胞因子，从而负责控制红细胞生成（红细胞产生）。EPO主要由肾细胞合成，少量由肝生成。在慢性肾衰竭中可看到，肾功能的丧失通常伴有例如EPO水平的降低，并同时伴有红细胞产生的减少。现在，EPO用于治疗由慢性肾病和其他严重病症引起的贫血并且被施用给准备进行外科手术的患者（Mijake等,J.Biol.Chem.25:5558-5564,1977;Eschbach等,New Engl.J.Med.316:73-78,1987;Sanford B.K,Blood,177:419-434,1991;PCT WO85-02610）。

人尿EPO首先由Miyake等从再生障碍性贫血患者中纯化（Miyake等,J.Biol.Chem.,252:5558,1977），但是该来源的EPO的量不足以用于治疗贫血。自从美国专利No.4,703,008的出版物中公开了人类EPO基因的鉴定和克隆以及重组EPO蛋白质的表达以来，已通过多种不同的遗传操作实现了EPO的大量生产。

由于多肽易于因其稳定性低而变性、被血液中的蛋白水解酶降解并且易于通过肾脏或肝脏，因此需要频繁地向患者施用蛋白质药物（包括作为药物有效成分的多肽）以维持期望的血液水平浓度和效价。但是，这种蛋白质药物的频繁施用引起患者疼痛，特别是在通过注射施用的情况下。

为了解决这些问题，进行了很多努力来改善蛋白质药物的血清稳定性并使血液中的药物在更长的时间内维持在高水平，从而使药物的药效最大化。为了在长效制剂中使用，必须将蛋白质药物配制成高稳定性的且其效价维持在足够高的水平而不引起患者免疫应答。

为了稳定蛋白质并防止被肾脏酶促降解和清除，通常使用具有高溶解度的聚合物（如聚乙二醇（PEG））来对蛋白质药物表面进行化学修饰。通过与靶蛋白的特定区域或多个区域结合，PEG使蛋白质稳定并防止水解，而不引起严重的副作用（Sada等，J.FermentationBioengineering71:137-139,1991）。然而，尽管聚乙二醇化能够增强蛋白质稳定性，但其也存在问题，例如大大降低生理活性蛋白质的效价。另外，产量随着PEG分子量的增加而降低，这是由于蛋白质反应性的降低所致。

用于改善生理活性蛋白质的体内稳定性的一种替代性方法是通过基因重组技术将生理活性蛋白质的基因与编码具有高血清稳定性之蛋白质的基因连接，并且培养用该重组基因转染的细胞以生产融合蛋白。例如，融合蛋白可以这样制备：通过基因重组将白蛋白（已知的在增强蛋白质稳定性方面最有效的蛋白质）或其片段与目的生理活性蛋白质缀合（PCT公开No.WO93/15199和WO93/15200，欧洲专利公开No.413,622）。

另一种方法是使用免疫球蛋白。如美国专利No.5,045,312中所描述的，通过使用交联剂将人生长激素与牛血清白蛋白或小鼠免疫球蛋白缀合。该缀合物与未修饰的生长激素相比具有增强的活性。采用碳化二亚胺或戊二醛作为交联剂。但是，与肽非特异性结合的这种低分子量交联剂不允许形成均一的缀合物，并且甚至在体内是有毒的。此外，该专利表明活性增加仅仅是由于与生长激素的化学偶联。该专利的方法不能保证不同种类的多肽药物的活性增强，因此该专利甚至没有认识到与蛋白质稳定性相关的因素，如持续时间、血液半衰期等。

最近提出的一种药物制剂是体内持续时间和稳定性均改善的长效蛋白质药物制剂。为了在长效药物制剂中使用，通过将生理活性多肽、非多肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段共价连接来制备蛋白质缀合物（韩国专利No.10-0567902和10-0725315）。

在该方法中，EPO可以用作生理活性多肽以提供长效EPO缀合物。为了将长效EPO缀合物应用到药物产品中，必须维持其在体内的药效，同时抑制在储存和运输期间的物理化学变化，如光、热或添加剂引起的变性、聚集、吸附或水解。与EPO多肽自身相比，长效EPO缀合物由于其体积和分子量增加因而更难以稳定化。

通常，蛋白质具有非常短的半衰期，并且当暴露于不合适的温度、水-空气界面、高压、物理/机械应力、有机溶剂、微生物污染等时，其发生变性，如单体聚集、聚集沉淀以及吸附到容器表面上。在变性后，蛋白质失去其物理化学特性和生理活性。一旦变性，蛋白质几乎不能恢复其原有特性，因为变性是不可逆的。特别在所施用的蛋白质（如EPO）是每次注射几百微克的微量的情况下，当它们丧失稳定性并因此吸附到容器表面上时，产生的损失相对较大。此外，在变性过程中吸附的蛋白质容易聚集，并且变性蛋白质的聚集体在施用到体内时，其充当抗原（不像体内合成蛋白质那样）。因此，蛋白质必须以稳定形式施用。已经进行了许多研究以防止蛋白质在溶液中变性（John Geigert,J.Parenteral Sci.Tech.,43(5):220-224,1989；David Wong,Pharm.Tech.,34-48,1997;Wei Wang.,Int.J.Pharm.,185:129-188,1999;Willem Norde,Adv.Colloid Interface Sci.,25:267-340,1986;Michelle等，Int.J.Pharm.120:179-188,1995）。

将冻干法应用于一些蛋白质药物以实现稳定性目标。但是，冻干产品的不便之处在于它们必须重新溶解于注射用水中使用。此外，因为其生产过程包括冻干过程，所以需要在大容量冻干机上进行巨大投资。有人提出通过使用喷雾干燥器使蛋白质破碎。但是，该方法由于产量低而不经济。此外，喷雾干燥过程将蛋白质暴露于高温，因此对蛋白质稳定性有负面影响。

作为克服该限制的替代方案，出现了稳定剂，当将其添加到蛋白质的溶液中时，可以抑制蛋白质药物的物理化学变化并维持体内药效，甚至在长时间储存之后也是如此。稳定剂有糖类、氨基酸、蛋白质、表面活性剂、聚合物和盐。尤其是人血清白蛋白已被广泛用作多种蛋白质药物的稳定剂并且其性能已得到证明（Edward Tarelli等，Biologicals,26:331-346,1998）。

人血清白蛋白的典型纯化过程包括使生物污染物（如支原体、朊病毒、细菌和病毒）失活，或者筛选或检查一种或更多种生物污染物或病原体。但是，总存在因生物污染物未完全去除或失活而使患者处在与其接触风险。例如，筛选来自供体的人血以检查其是否包含某些病毒。但是，该过程不总是可靠的。特别地，以非常小的数目存在的某些病毒不能被检测到。

最近提出了人血清白蛋白的替代物，包括重组白蛋白（韩国专利公开No.10-2004-0111351）和不含白蛋白的红细胞生成素（韩国专利No.10-0560697和10-0596610）。

即便采用不含白蛋白的稳定剂，不同蛋白质由于其化学差异可逐渐失活，因为它们在储存期间有不同的比率和条件。稳定剂对蛋白质储存期的影响因蛋白质而异。即，根据目的蛋白质的物理化学特性，不同稳定剂可以以不同的比率使用。

此外，同时使用不同稳定剂时，由于其竞争和误操作可引起相反作用。不同稳定剂的组合也引起不同的作用，因为它们使得蛋白质的特性或浓度在储存期间发生改变。因为每种稳定剂在特定浓度范围中才适宜地发挥其稳定作用，所以必须做许多努力来谨慎地将不同稳定剂的种类和浓度进行组合。

特别地，对于体内持续时间和稳定性改进的长效EPO缀合物来说，因为它们由生理活性肽EPO、非肽聚合物和免疫球蛋白片段Fc构成，所以其分子量和体积与普通红细胞生成素复合物的相当不同。因此，需要不同于EPO稳定剂之组成的特定稳定剂来用于长效EPO缀合物。

开发长效EPO缀合物的稳定液体制剂（其能够长期保持药效而没有病毒感染）的大量而充分的研究得到了本发明，导致这一发现，即包含特定pH范围的缓冲剂和高浓度甘露醇的稳定剂赋予长效EPO缀合物增强的稳定性并且允许形成经济而稳定的长效EPO缀合物液体制剂。

发明内容

技术问题

因此本发明的一个目的是提供一种包含长效红细胞生成素缀合物和不含白蛋白的稳定剂的液体制剂，其中所述长效红细胞生成素缀合物中EPO、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段共价连接，并且所述稳定剂由缓冲剂和甘露醇组成。

问题的解决方案

根据其中的一个实施方案，本发明提供了一种包含长效红细胞生成素缀合物和不含白蛋白的稳定剂的液体制剂，其中所述长效红细胞生成素缀合物中EPO、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段共价连接，并且所述稳定剂包含缓冲剂和甘露醇。

本文所用术语“长效红细胞生成素缀合物”或“长效EPO缀合物”意指蛋白质构建体，其中生理活性的EPO、一种或更多种非肽聚合物和一种或更多种免疫球蛋白Fc片段共价连接，并且所述蛋白质构建体与其天然形式的EPO相比具有延长的作用持续时间。

本文所用术语“长效”意指相比于天然形式延长的作用持续时间。术语“缀合物”意指其中EPO、非肽聚合物和免疫球蛋白Fc片段共价连接的构建体。

为了在本发明中使用，EPO具有人红细胞生成素或密切相关类似物的氨基酸序列。可用于本发明的EPO可以是天然蛋白质或重组蛋白质。而且，EPO可以是经插入、缺失或插入氨基酸的突变体，前提是所述突变对其原有生物活性没有显著影响。

可用于本发明的人EPO或其类似物可以分离自脊椎动物或可以化学合成。或者，EPO或其类似物可以得自使用基因重组技术用编码EPO或其类似物的基因转化的原核生物或真核生物。对此，可以将肠细菌（如大肠杆菌（E.coli））、酵母细胞（如啤酒酵母（S.cerevisiae））或哺乳动物细胞（如中国仓鼠卵巢细胞、猴细胞）用作宿主细胞。根据宿主细胞，重组EPO或其类似物可以用哺乳动物或真核生物的糖进行糖基化，或者是非糖基化的。在表达时，重组EPO或其类似物可包含初始的甲硫氨酸残基（1位）。优选地，使用CHO细胞作为宿主制备重组人EPO（HuEPO）。

为了在本发明中使用，免疫球蛋白Fc片段具有人免疫球蛋白Fc片段或其密切相关的类似物的氨基酸序列。Fc片段可以从分离自动物（包括牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠）的天然形式中得到。此外，免疫球蛋白Fc片段可以是来自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc片段，或者由其组合或杂合体制得。优选地，它来自在人血中最丰富的蛋白质IgG或IgM，并且最优选地来自已知增强配体结合蛋白的半衰期的IgG。本文中，免疫球蛋白Fc可以通过分离人或动物有机体的完整免疫球蛋白并用蛋白水解酶处理它们而得自天然免疫球蛋白，或者，它可以是得自经转化的动物细胞或微生物的其重组体或衍生物。优选的是由大肠杆菌转化体生产的重组人免疫球蛋白Fc。

另一方面，IgG分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型，并且本发明包括其组合和杂交体。优选的是IgG2和IgG4亚型，最优选的是很少具有效应功能（如CDC（补体依赖性细胞毒性））的IgG4的Fc片段。也就是说，作为本发明的药物载体，最优选的免疫球蛋白Fc片段是人IgG4的非糖基化Fc片段。人源Fc片段比非人源Fc片段更优选，后者可在人体中充当抗原并引起不期望的免疫应答，如产生针对抗原的新抗体。

通过将EPO与免疫球蛋白Fc片段连接在一起来制备可用于本发明的长效EPO缀合物。对此，EPO和免疫球蛋白Fc片段可通过非肽聚合物交联，或者可以使用重组技术形成融合蛋白。

用于交联的非肽聚合物可选自可生物降解聚合物、脂质聚合物、甲壳素、透明质酸及其组合。可生物降解聚合物可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖（dextran）、聚乙烯基乙醚（polyvinyl ethylether）、PLA（聚乳酸）、PLGA（聚乳酸-乙醇酸）及其组合。最优选聚(乙二醇)（PEG），优选聚乙二醇。本领域熟知的并且能够易于由本技术领域技术人员制备的其衍生物也包含于本发明的范围中。

可以使用基因工程技术制备用于本发明的长效EPO缀合物，如韩国专利No.10-0725315中所公开的。

根据本发明的液体制剂包含治疗有效量的长效EPO缀合物。通常，EPO的治疗有效量为每个一次性瓶2,000至10,000国际单位（IU）。在本发明中使用的长效EPO缀合物的浓度为约1至5000μg/ml，优选约50至3000μg/ml。

本文所用术语“稳定剂”意指允许长效EPO缀合物安全储存的物质。术语“稳定”意指在储存条件下某时间段内活性成分的损失不多于预定的比例（通常最高10%）。当在10℃下储存2年、在25℃下6个月或在40℃下一至两周之后，EPO保留其原有活性的90%或更多（优选其原有活性的95%或更高）时，应理解为是稳定的。对于诸如EPO的蛋白质而言，其储存稳定性对于抑制EPO样抗原性物质的可能生成以及保证准确施用量是重要的。在储存期间，除非制剂中的EPO聚集或破裂形成抗原性物质，否则可将约10%的EPO活性损失理解为是施用所允许的。

用于本发明的稳定剂包含配制成赋予长效EPO缀合物以稳定性的缓冲溶液和甘露醇。

此外，本发明的稳定剂优选不含白蛋白。因为从人血中制备，所以可作为蛋白质稳定剂的人血清白蛋白有被人源致病性病毒污染的可能性。明胶或牛血清白蛋白可在一些患者中引起疾病或引起过敏反应。由于不含来自人或动物的血清白蛋白或异源蛋白质（如纯化明胶），因此本发明的稳定剂没有病毒感染的问题。

甘露醇（一种糖醇）因其起到增强长效EPO缀合物稳定性的作用而用在本发明的稳定剂中。甘露醇以优选浓度为基于液体制剂总体积的1至20%（w/v）、更优选浓度为3至12%（w/v）并且最优选浓度为5至10%（w/v）的浓度使用。

根据本发明的一个实施方案，当在磷酸盐缓冲溶液的存在下将甘露醇用作稳定剂时，长效EPO缀合物的储存稳定性表现出比使用包含山梨醇、麦芽糖、PEG400和氨基酸的常规稳定剂时大大增加（见表1）。当应用于本发明时，发现日本专利公开出版物No.2009-249292中用作稳定剂的麦芽糖降低了长效EPO缀合物在储存期延长时的稳定性（见表8）。

这些数据揭示出甘露醇作为长效EPO缀合物之稳定剂相比于其他稳定剂的专一性，表明根据需要稳定的目标需要不同的稳定剂。

稳定剂中的缓冲溶液在维持液体制剂pH恒定以防止pH波动中起作用，从而使长效EPO缀合物稳定。可用于本发明的缓冲溶液可包含可药用的pH缓冲剂，其包括碱性盐（磷酸钠或磷酸钾、其氢盐或二氢盐）、柠檬酸钠/柠檬酸、乙酸钠/乙酸及其组合。适用于本发明的是柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、碳酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂和乙酸盐缓冲剂，优选磷酸盐缓冲剂和柠檬酸盐缓冲剂，更优选磷酸盐缓冲剂。在磷酸盐缓冲剂中，磷酸盐的浓度范围优选为5至100mM，更优选10至50mM。缓冲剂的pH优选为4.0至8.0，更优选pH为5.0至7.0。

在本发明的另一个实施方案中，可用于本发明的稳定剂除所述缓冲溶液和甘露醇外，可还包含至少一种选自等张剂（isotonic agent）、多元醇、糖、非离子型表面活性剂和中性氨基酸的成分。

所述等张剂不仅起到使液体制剂中的长效EPO缀合物进入体内时能维持合适渗透压的作用，还起到进一步稳定液体制剂中长效EPO缀合物的作用。等张剂的实例包括水溶性无机盐。其包括氯化钠、硫酸钠、柠檬酸钠、氯化钙及其组合。最优选氯化钠。

优选地，等张剂的浓度为约5至200mM。在该范围内，可根据所包含组分的种类和量来调整等张剂的浓度，使得液体制剂是等张的。

根据本发明的一个实施方案，在存在缓冲溶液的情况下评估了不同种类的盐对长效EPO缀合物稳定性的影响。结果是，发现包含硫酸钠、氯化钠、柠檬酸钠或硫酸钠与氯化钠的组合连同磷酸盐缓冲溶液的液体制剂与不含盐的液体制剂相比，使长效EPO缀合物的稳定性增加（见表2）。从这些数据可理解，本发明的长效EPO缀合物根据所用盐的种类被不同程度地稳定，并且某些盐表现出峰值稳定性。

还可以包含的增加长效EPO缀合物的储存稳定性的糖的优选实例包括单糖（如甘露糖、葡萄糖、果糖和木糖）和多糖（如乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖和葡聚糖）。在液体制剂中，糖的使用量优选为1至20%（w/v）且更优选的使用量为5至20%（w/v）。可用于本发明的多元醇的实例包括丙二醇、低分子量的聚乙二醇、甘油和低分子量聚丙二醇。它们可以单独或组合使用。并且它们在液体制剂中的浓度优选为约1至15%（w/v），更优选约5至15%（w/v）。

对于非离子型表面活性剂而言，其降低蛋白质溶液的表面张力以防止蛋白质被吸附到或聚集于疏水表面上。基于聚山梨酯(polysorbate)的非离子型表面活性剂和基于泊洛沙姆（poloxamer）的非离子型表面活性剂适合用在本发明中。它们可以单独或组合使用。优选基于聚山梨酯的非离子型表面活性剂。其中有聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60和聚山梨酯80，更优选聚山梨酯80。

不建议使用高浓度的非离子型表面活性剂，因为如果非离子型表面活性剂以高浓度存在，则会干扰UV光谱法或等电聚焦法，使得难以准确评估蛋白质的浓度或稳定性。因此，本发明的液体制剂可包含优选浓度为0.1%（w/v）或更少且更优选0.01至0.05%（w/v）的非离子型表面活性剂。

在本发明的一个实施方案中，分析了非离子型表面活性剂在磷酸盐缓冲剂存在下对蛋白质稳定性的影响。在短到一周的储存期中，发现非离子型表面活性剂对长效EPO缀合物稳定性的影响很小（见表3）。而且，当使用非离子型表面活性剂聚山梨酯80时，发现包含0.01%（w/v）聚山梨酯80的稳定剂比包含0.1%聚山梨酯80的稳定剂使长效EPO缀合物在储存期间更稳定（见表4）。

氨基酸也可作为液体制剂的稳定剂，其在溶液中起到将更多水分子吸引到EPO周围的作用，使得EPO最外面的亲水性氨基酸分子被进一步稳定（Wang，Int.J.Pharm.185:129-188,1999）。在这点上，带电氨基酸可引起与EPO的静电吸引而促进EPO聚集。因此，添加中性氨基酸（例如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）作为稳定成分。在液体制剂中，中性氨基酸的使用浓度优选为0.1至10%（w/v）。

在本发明的一个实施方案中，麦芽糖在与甘氨酸组合使用时比单独使用时确保长效EPO缀合物的更高的储存稳定性。但是，观察到用浓度高达3至12%（w/v）的甘露醇处理，甚至在缺乏中性氨基酸的情况下也比用麦芽糖与甘氨酸组合处理的情况下提供更高的稳定性（见表10）。

因此，即使在不添加中性氨基酸时也可以使用高浓度的甘露醇制备用于提供高稳定性长效EPO缀合物的液体制剂。但是，超过20%（w/v）的甘露醇浓度超出了等张上限。因此，甘露醇在液体制剂中的使用浓度为1至20%，优选浓度为3至12%（w/v），更优选浓度为5至10%（w/v）。

除了包括缓冲剂、等张剂、糖醇、中性氨基酸和非离子型表面活性剂在内的上述组分外，本发明的液体制剂还可选择性地包含本领域已知的其他组分，只要它们不降低本发明的作用。

根据本发明的一个优选实施方案，所述液体制剂不包含白蛋白并且可包含缓冲溶液、甘露醇、等张剂和非离子型表面活性剂。

更具体地，本发明提供了包含长效EPO缀合物和稳定剂的液体制剂，所述稳定剂包含磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂、甘露醇、等张剂和聚山梨酯80，所述等张剂选自氯化钠、硫酸钠、柠檬酸钠及其组合。优选地，所述液体制剂包含浓度为5至100mM的磷酸盐或柠檬酸盐缓冲溶液、浓度为1至20%（w/v）的甘露醇、浓度为5至200mM的等张剂以及浓度为0.001至0.05%（w/v）的聚山梨酯80，其中所述等张剂选自氯化钠、硫酸钠和柠檬酸钠。更优选地，所述液体制剂包含浓度为5至100mM的磷酸盐缓冲溶液、浓度为3至12%（w/v）的甘露醇、浓度为100至200mM的氯化钠以及浓度为0.001至0.05%（w/v）的聚山梨酯80。最优选地，所述液体制剂包含浓度为10mM的柠檬酸钠缓冲剂（pH6.5）、浓度为5至10%（w/v）的甘露醇、浓度为100至200mM的钠以及浓度为0.001至0.05%（w/v）的聚山梨酯80，并且不包含中性氨基酸。

在本发明的一个实施方案中，将长效EPO缀合物液体制剂与已知的EPO制剂Recormon（Roche）的EPO储存稳定性进行了比较，所述长效EPO缀合物液体制剂包含浓度为10mM的磷酸钠缓冲溶液（pH6.5）、浓度为5至10%（w/v）甘露醇、浓度为100至200mM的氯化钠和浓度为0.001%至0.05%（w/v）聚山梨酯80。发现EPO在本发明的液体制剂中比在市售制剂中更稳定（见表6和14）。

还比较了本发明的EPO液体制剂与其他制剂（如Aranesp（Amgen生产的贫血治疗剂）；依那西普（Enbrel）（TNFR-Fc）（Amgen生产的类风湿性关节炎治疗剂）；以及单独的PBS）的EPO储存稳定性。结果是本发明的长效EPO缀合物液体制剂表现出比任何其他液体制剂都高的稳定性（见表17）。

在另一个实施方案中，测定了本发明的长效EPO缀合物液体制剂的长期稳定性，并发现其使长效EPO缀合物稳定12个月并且即使在加速条件下储存6个月之后仍确保至少92.5%的活性（见表19至21）。

从该数据应理解，包含缓冲剂和浓度为1至20%（w/v）的甘露醇的液体制剂即使在没有中性氨基酸的情况下也可以在其中稳定储存长效EPO缀合物12个月或更久。

发明的有利效果

由于不含人血清白蛋白和其他对身体有害的潜在因子，因此本发明的长效EPO缀合物液体制剂没有病毒感染的问题并且确保长效EPO缀合物的优异的储存稳定性，所述液体制剂中EPO和免疫球蛋白Fc片段连接并且比天然形式的EPO有更大的分子量和更长的作用持续时间。即使在不包含中性氨基酸时，本发明的液体制剂也可以提供优异的EPO储存稳定性，从而在经济上比其他稳定剂和冻干剂更有利。

附图说明

图1是表明当在40℃下储存四周的时间中每周用反相色谱法进行分析时不同的长效EPO缀合物液体制剂中和市售EPO制剂Recormon中的EPO稳定性的图。

图2是表明当在4℃下储存12个月的时间中每两个月用反相色谱法和尺寸排阻色谱法进行分析时，包含pH6.5的磷酸盐缓冲剂、氯化钠、甘露醇和聚山梨酯80的液体制剂中长效EPO缀合物稳定性的图。

图3是表明当在4℃下储存12个月的时间中每两个月用体外测定法进行分析时，包含pH6.5的磷酸盐缓冲剂、氯化钠、甘露醇和聚山梨酯80的液体制剂中长效EPO缀合物稳定性的图。

发明实施方式

通过以下实施例可更好地理解本发明，列出所述实施例以举例说明本发明，但不应理解为限制本发明。

实施例1：构建长效EPO缀合物

<1-1>使用免疫球蛋白制备免疫球蛋白Fc片段

可用于本发明的免疫球蛋白Fc片段是人的非糖基化IgG4Fc片段，其可如韩国专利No.725314中描述的由大肠杆菌转化体表达。

<1-2>制备重组人红细胞生成素

如韩国专利No.880509中所公开的得到本实施例中使用的人EPO。为此，培养用载体转染的动物细胞系以表达人EPO蛋白质，所述载体能够通过人工削弱二氢叶酸还原酶基因启动子（其为该基因的转录控制序列）来大大增强基因扩增效率。仅纯化了高度糖基化的蛋白质供使用。

<1-3>使用免疫球蛋白Fc片段制备长效EPO缀合物

本实施例中的长效EPO缀合物是人红细胞生成素与免疫球蛋白Fc片段通过非肽聚合物共价连接的构建物。其通过如韩国专利No.725315和775343所述而得到。

实施例2：测定取决于不同稳定剂的长效EPO缀合物稳定性

在磷酸盐缓冲剂存在下，测定包括糖、糖醇、多元醇和氨基酸在内的不同稳定剂稳定长效EPO缀合物的能力。

对于该测定，使用磷酸钠缓冲剂作为磷酸盐缓冲剂，使用甘露醇或山梨醇作为糖醇，使用组氨酸或甲硫氨酸作为糖醇，使用麦芽糖作为糖，使用PEG400作为多元醇。

将表1所列组合物在40℃下储存一周后，用反相色谱法进行分析。结果归纳在下表1中。长效EPO缀合物相比于其初始值的保留率表示为RPC（%）（面积%/初始面积%）。

表1

[表1]

[表格]

编号	EPO	缓冲剂	稳定剂	RPC（%）
					1	200μg/ml	10mM磷酸钠，pH6.5	1%甘露醇	95.2
2	200μg/ml	10mM磷酸钠，pH6.5	1mM组氨酸	86.2
					3	200μg/ml	10mM磷酸钠，pH6.5	1mM甲硫氨酸	76.1
4	200μg/ml	10mM磷酸钠，pH6.5	10%麦芽糖	93.5
					5	200μg/ml	10mM磷酸钠，pH6.5	1%PEG400	92.8
6	200μg/ml	10mM磷酸钠，pH6.5	1%山梨醇	92.7

从表1的数据可明显看出，使用甘露醇作为稳定剂使长效EPO缀合物保持最稳定。

实施例3：测定取决于盐的长效EPO缀合物稳定性

在磷酸盐缓冲剂的存在下，如下测定了不同盐稳定长效EPO缀合物的能力。诸如碱性盐和无机盐的盐不仅充当pH缓冲剂以赋予长效缀合物额外的pH稳定性，而且还充当等张剂以维持合适的渗透压。

将表2中所列的组合物在40℃下储存一周后，用反相色谱法进行分析。对于该测定，使用磷酸钠缓冲剂（pH6.5）作为缓冲剂而使用氯化铜(II)、硫酸钠、柠檬酸钠和碳酸钠作为盐。结果归纳在下表2中。长效EPO缀合物相比于其初始值的保留率表示为RP-HPLC（%）。

表2

[表2]

[表格]

从表2中的数据可明显地看出，在磷酸盐缓冲剂的存在下，当使用硫酸钠、氯化钠、柠檬酸钠或者硫酸钠与氯化钠的组合时，相比于这些全都不添加的对照，长效EPO缀合物的稳定性增加。相反，在氯化铜(II)存在下，与对照相比，长效EPO缀合物的稳定性降低。

从数据应理解，本发明的长效EPO缀合物根据所用盐的种类被不同程度地稳定并且某些盐表现出更高的稳定性。

实施例4：测定取决于非离子型表面活性剂的长效EPO缀合物稳定性

在磷酸盐缓冲剂存在下，如下测定了不同非离子型表面活性剂稳定长效EPO缀合物的能力。

对于该测定，将聚山梨酯80用作非离子型磷酸缓冲剂，并且以适当组合使用表现出提供长效EPO缀合物稳定性的其他试剂，包括盐、糖醇和糖。

为简单起见，从包括以下的经验证的盐中选择氯化钠：氯化钠、硫酸钠和柠檬酸钠。还使用了在实施例1中证明的确保最大稳定性的甘露醇。在将EPO设定为在10mM磷酸钠缓冲剂（pH6.5）中200μg/ml的相同条件下，将本发明的长效EPO缀合物在表3所列组合物中于40℃下储存一周，然后以反相色谱法分析。结果归纳在下表3中。长效EPO缀合物相比于其初始值的保留率表示为RP-HPLC（%）。

表3

[表3]

[表格]

在磷酸盐缓冲剂的条件下，如表3所示，不论是否存在非离子型表面活性剂，EPO确实仅在小幅波动，表明非离子型表面活性剂在短到一周期间对EPO稳定性确实具有显著影响。

还进行了非离子型表面活性剂浓度对长效EPO缀合物稳定性影响的实验。在将EPO设定为在10mM磷酸钠缓冲剂（pH6.5）中200μg/ml的相同条件下，将本发明的长效EPO缀合物在表4中所列组合物中于40℃储存两周，然后以反相色谱法分析。结果归纳在下表4中。长效EPO缀合物相比于其初始值的保留率表示为RP-HPLC（%）。

表4

[表4]

[表格]

编号	表面活性剂	盐	稳定剂	1W(%)	2W(%)
						1	0.1%聚山梨酯80	150mM NaCl	5%甘露醇	95.9	91.8
2	0.01%聚山梨酯80	150mM NaCl	5%甘露醇	98.4	93.7

对于2周的储存时间，如表4所示，发现在10mM磷酸钠缓冲剂（pH6.5）中包含5%甘露醇和150mM氯化钠的液体制剂中，长效EPO缀合物在补充0.01%聚山梨酯80时比补充0.1%聚山梨酯80时更稳定。

实施例5：比较长效EPO缀合物液体制剂（I）

在储存稳定性方面，比较了市售EPO液体制剂Recormon（Roche）与本发明的长效EPO缀合物液体制剂。Recormon的组成(虽然仍需证明)包括作为缓冲剂的磷酸钠、作为表面活性剂的聚山梨酯20、作为盐的氯化钠以及作为稳定剂的尿素、CaCl、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸。

对于本发明的长效EPO缀合物液体制剂而言，将浓度为0.1至0.005%不等的聚山梨酯80用作表面活性剂，浓度为150至200mM的氯化钠用作盐，浓度为1至10%（w/v）不等的甘露醇或尿素用作稳定剂。将本发明的长效EPO缀合物在表5中所列的组合物中于40℃储存2周，随后通过反相色谱法和尺寸排阻色谱法（SE-HPLC）分析。结果归纳在下表6中。长效EPO缀合物相比于其初始值的保留率表示为RP-HPLC（%）和SE-HPLC（%）。

表5

[表5]

[表格]

表6

[表6]

[表格]

对于两周的储存时间而言，如表6中所示，除含有0.1%聚山梨酯80作为表面活性剂的5号制剂和含有尿素作为稳定剂的7号制剂之外，本发明的所有液体制剂都确保了比Recormon更高的稳定性。

实施例6：研究能够赋予长效EPO缀合物以储存稳定性的稳定剂

为了研究能够在长期储存时间中稳定长效EPO缀合物的稳定剂，用下表7的组分制备了长效EPO缀合物液体制剂。对此而言，将甘氨酸和甲硫氨酸单独添加到表面活性剂-氯化钠-麦芽糖组合物中以检测氨基酸对长期储存稳定性的影响。在液体制剂中，将EPO浓度设定为在10mM磷酸钠缓冲剂（pH6.5）中的200μg/ml。

在40℃下储存4周，每周用反相色谱法分析长效EPO缀合物液体制剂。结果归纳在下表8中。长效EPO缀合物相比于其初始值的保留率表示为RP-HPLC（%）。

表7

[表7]

[表格]

编号	表面活性剂	盐	稳定剂
				1	0.005%聚山梨酯80	200mM NaCl	10%麦芽糖

2	0.005%聚山梨酯80	200mM NaCl	10%麦芽糖+1%甘氨酸
				3	0.005%聚山梨酯80	200mM NaCl	10%麦芽糖+1mM甲硫氨酸

表8

[表8]

[表格]

对于4周的储存时间，如表8所示，发现长效EPO缀合物在包含氯化钠与麦芽糖和甘氨酸的组合（作为稳定剂）的液体制剂中更稳定。在储存2周之后，分别检测到其中仅使用10%麦芽糖和与1%甘氨酸组合使用的液体制剂之间有相似的储存稳定性。但是，仅使用10%麦芽糖在储存4周之后稳定性显著降低。相反，发现10%麦芽糖与1%甘氨酸组合使用在储存4周后保持高稳定性。

参考2号和3号液体制剂之间的比较，甲硫氨酸显著降低长效EPO缀合物的稳定性，表明中性氨基酸（尤其是甘氨酸）对长效EPO缀合物的长期储存稳定性有很大贡献。

实施例7：针对长效EPO缀合物的长期储存稳定性测定甘露醇和麦芽糖

制备了如下表9中给出的三种液体制剂：实施例6中表现出长效EPO缀合物最高稳定性的包含麦芽糖-甘氨酸的液体制剂；除了用甘露醇替代麦芽糖以外相同的液体制剂；以及只包含甘露醇的液体制剂。测定它们的长期储存稳定性。在液体制剂中，将EPO的浓度设定为在10mM磷酸钠缓冲剂（pH6.5）中200μg/ml。

在40℃下储存4周，每周用反相色谱法分析长效EPO缀合物液体制剂。结果归纳在下表10中。长效EPO缀合物相比于其初始值的保留率表示为RP-HPLC（%）。表10中的数据还用曲线图表示在图1中，其中市售EPO制剂Rocormon的值是外推的。

表9

[表9]

[表格]

编号	表面活性剂	盐	稳定剂
				1	0.005%聚山梨酯80	200mM NaCl	10%麦芽糖、1%甘氨酸
2	0.005%聚山梨酯80	200mM NaCl	10%甘露醇、1%甘氨酸
				3	0.005%聚山梨酯80	200mM NaCl	10%甘露醇

表10

[表10]

[表格]

对于5周的储存时间来说，如表10所示，发现长效EPO缀合物在包含甘露醇-甘氨酸作为稳定剂的液体制剂中比在麦芽糖-甘氨酸作为稳定剂的液体制剂中更稳定。在只包含甘露醇的液体制剂中检测到相当的储存稳定性。

这些结果与下述事实完全相反：仅包含麦芽糖的液体制剂相比于包含麦芽糖和甘露醇的液体制剂在储存稳定性上显著降低，这表明甘露醇即使在不借助中性氨基酸的情况下也可以确保长效EPO缀合物的长期储存稳定性。还发现使用浓度高达5至15%（w/v）的甘露醇使得EPO缀合物即使在不含中性氨基酸的情况下也能储存并保持高稳定性。

实施例8：针对长效EPO缀合物的长期储存稳定性测定缓冲剂

测定了缓冲剂稳定长效EPO缀合物的能力。还如下对长效EPO缀合物的稳定性与盐和糖醇剂量之间的关系进行了研究。

首先，使用如表11所示的用0.01%聚山梨酯、150mM氯化钠和磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂配制的液体制剂（1号和2号）研究了缓冲剂对长效EPO缀合物稳定性的影响。液体制剂包含高浓度（5%）的甘露醇作为稳定剂，但是不含任何氨基酸，并且以浓度200μg/ml添加长效EPO缀合物。将制剂在40℃下储存4周，其间在第1周和第4周用反相色谱法分析长效EPO缀合物液体制剂。结果归纳在下表12中（1号和2号）。长效EPO缀合物相比于其初始值的保留率表示为RP-HPLC（%）。

检测了下述液体制剂对长效EPO缀合物稳定性的影响：与实施例7相同的包含甘露醇的液体制剂、包含柠檬酸盐缓冲剂替代磷酸盐缓冲剂的相同液体制剂，以及只包含一半量的盐和糖醇的相同液体制剂。

在液体制剂中，将长效EPO缀合物的浓度设定为200μg/ml并且使用如下表11中所示的稳定剂。将长效EPO缀合物液体制剂在40℃下储存并在第1周和第4周用反相色谱法分析。结果归纳在下表12中。长效EPO缀合物相比于其初始值的保留率表示为RP-HPLC（%）。

表11

[表11]

[表格]

表10

[表10]

[表格]

从表12中的数据可明显地看出，如果液体制剂在其中包含甘露醇，则无论其中使用何种缓冲剂都确保长效缀合物的储存稳定性在期望的水平上。这些结果表明，可使用除磷酸盐缓冲剂之外的典型缓冲剂来制备其中长效EPO缀合物可以长时间稳定储存的液体制剂。

实施例9：比较液体制剂之间的长效EPO缀合物的储存稳定性（II）

就储存稳定性而言，用均已在实施例2至8中证明了稳定能力的磷酸盐缓冲剂（pH6.5）、氯化钠、甘露醇和聚山梨酯80制备的液体制剂与市售EPO液体制剂Recormon（Roche）进行了比较。本发明液体制剂和Recormon的组成在下表13中示出。在40℃下储存4周，在第2周和第4周用反相色谱法和尺寸排阻色谱法分析长效EPO缀合物液体制剂。结果归纳在下表14中。长效EPO缀合物相比于其初始值的保留率表示为RP-HPLC（%）和SE-HPLC（%）。

表13

[表13]

[表格]

表14

[表14]

[表格]

从表14中的数据可明显地看出，包含高浓度甘露醇作为稳定剂的液体制剂比包含多种中性氨基酸的Recormon确保了更高的EPO储存稳定性。从这些结果，应理解本发明的液体制剂能够专门确保长效EPO缀合物的优异的储存稳定性。

实施例10：比较多种液体制剂之间的储存稳定性

关于储存稳定性而言，用均已在实施例2至8中证明了稳定能力的磷酸盐缓冲剂（pH6.5）、氯化钠、甘露醇和聚山梨酯80制备的液体制剂与通过采用长效EPO缀合物的不同市售制剂的组合物制备的液体制剂进行了比较。

本实施例中使用的液体制剂归纳在下表15中。在表15中，1号是Aranesp（Amgen公司生产），目前用作贫血治疗剂；2号是用包含磷酸盐缓冲剂（pH6.5）、氯化钠、甘露醇和聚山梨酯80的稳定组合物制备的液体制剂；3号是除了用长效EPO缀合物替代药物之外与Aranesp相同的液体制剂；4号是除用长效EPO缀合物替代药物之外与依那西普（TNFR-Fc）（Amgen公司生产的类风湿性关节炎治疗剂）相同的液体制剂；5号则是只包含PBS的液体制剂。

在40℃下储存三周，每周用反相色谱法和尺寸排阻色谱法分析长效EPO缀合物液体制剂。结果归纳在下表17中。长效EPO缀合物相比于其初始值的保留率表示为RP-HPLC（%）和SE-HPLC（%）。

表15

[表15]

[表格]

表16

[表16]

[表格]

批号	HM10760A B10098LGL211（研究中心批次）
		温度	40℃
储存条件	玻璃注射器，500μl
		分析方法	SEC、RPC
取样频率	初始，第1周、第2周、都3周

表17

[表17]

[表格]

从表17中的数据可明显地看出，除本发明的包含10mM磷酸钠缓冲剂（pH6.5）、0.005%聚山梨酯80、10%甘露醇和200nM氯化钠的液体制剂外，所有的液体制剂在3周的储存过程中都观察到了聚集。因此，本发明的包含10mM磷酸钠缓冲剂（pH6.5）、0.005%聚山梨酯80、10%甘露醇和200nM氯化钠的液体制剂是长时间稳定储存长效EPO缀合物的最有希望的试剂。

实施例11：测定长效EPO缀合物液体制剂的长期储存稳定性和加速稳定性

为检测其长期储存稳定性和加速稳定性，将证明了确保最大储存稳定性的由包含磷酸盐缓冲剂（pH6.5）、氯化钠、甘露醇和聚山梨酯80的稳定剂制备的长效EPO缀合物液体制剂在4℃下储存12个月，其间分析长效EPO缀合物的稳定性。详细储存条件归纳在下表18中。在表19和图2中给出了分析结果。在表19中，长效EPO缀合物相比于其初始值的保留率表示为RP-HPLC（%）和SE-HPLC（%）。

此外，在4℃下储存12个月的时间中，对长效EPO缀合物液体制剂的储存稳定性进行了体外测定（图3）。

在TF-1细胞系（红白血病细胞（erythroleukemia cell）、ATCC CRL2003）中体外测量了本实施例中使用的长效EPO缀合物的效价。从储氮罐中解冻后，将TF-1细胞培养至预定程度并计数。将预定比率的BRP-EPO和长效EPO缀合物的混合物以50μL/孔的量置于96孔板中。在测定培养基中将细胞稀释至浓度为40000个细胞/mL，然后以50μ/孔的量接种到96孔板上。在37℃的CO₂培养箱中孵育72小时后，将15μLCellTiter96Aqueous One SolutionReagent（PROMEGA、G358B）添加到96孔板的每个孔中。将其在37℃的CO₂培养箱中再次孵育4小时。用移液管轻轻地除去染色剂，然后测量490nm的吸光度以计算EC50。从计算的EC50值得到比活性。

表18

[表18]

[表格]

批号	HM10760A B10098LGL071
		浓度	0.352mg/ml蛋白质
温度	4℃
		储存条件	玻璃注射器500ml
分析方法	SEC、RPC
		配方	10mM磷酸钠（pH6.5）/0.005%聚山梨酯80/10%甘露醇/200mM NaCl
取样频率	初始，第1、3、6、9、12个月

表19

[表19]

[表格]

如表19所示，发现12个月中，长效EPO缀合物在本发明的包含稳定剂组合物的液体制剂中非常稳定。

此外，如上所述，将包含相同稳定剂组合物的长效EPO缀合物液体制剂在4℃下储存12个月并随后在25℃下储存6个月，其间分析样品的储存稳定性。结果归纳在下表20和21中。在表20和21中，长效EPO缀合物相比于其初始值的保留率表示为RP-HPLC（%）、SE-HPLC（%）、蛋白质含量（%）和生物惰性活性（biological inert activity）（%）。

表20

[表20]

[表格]

表21

[表21]

[表格]

从表20和21中的数据可明显地看出，12个月中，长效EPO缀合物在本发明的包含稳定剂组合物的液体制剂中保持高度稳定并且发现甚至在加速条件下储存6个月后在所述液体制剂中仍具有92.5%的初始活性。因此，本发明的长效EPO缀合物液体制剂表现出有效的储存稳定性。

尽管出于举例说明的目的公开了本发明的优选实施方案，但本领域的技术人员应理解，在不脱离所附权利要求书描述的本发明的范围和精神的情况下，可进行多种修改、添加和替换。

工业实用性

由于不含人血清白蛋白，因此本发明的用于专门确保长效EPO缀合物储存稳定性的液体制剂没有病毒感染的问题。它组成简单，因此比其他稳定剂或冻干制剂更具优势。此外，因为其包含具有比其他天然形式更长的作用持续时间并且长时间保持高蛋白质活性的长效EPO缀合物，所以所述液体制剂可以用作有效的药物系统。

Claims (16)

1.一种长效红细胞生成素(EPO)缀合物的液体制剂，其由治疗有效量的长效EPO缀合物、甘露醇、缓冲剂、盐和基于聚山梨酯的非离子型表面活性剂组成，其中所述缀合物中EPO通过非肽聚合物与免疫球蛋白Fc片段共价连接，其中甘露醇以5至20％(w/v)的浓度存在，并且其中所述液体制剂不包含中性氨基酸和白蛋白，并且所述缓冲剂是磷酸钠缓冲剂或柠檬酸钠缓冲剂。

2.根据权利要求1的液体制剂，其中所述缓冲剂的浓度范围为5至100mM。

3.根据权利要求1的液体制剂，其中所述缓冲剂的pH范围为4至8。

4.根据权利要求1的液体制剂，其中所述盐选自氯化钠、硫酸钠、柠檬酸钠及其组合。

5.根据权利要求1的液体制剂，其中所述盐的浓度范围为5至200mM。

6.根据权利要求1的液体制剂，其中所述基于聚山梨酯的非离子型表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60和聚山梨酯80。

7.根据权利要求1的液体制剂，其中所述基于聚山梨酯的非离子型表面活性剂的浓度范围为基于所述液体制剂总体积的0.01至0.05％(w/v)。

8.根据权利要求1的液体制剂，其中所述缓冲剂是浓度为5至100mM的磷酸钠缓冲剂，所述盐是浓度为5至200mM的氯化钠，以及所述基于聚山梨酯的非离子型表面活性剂是浓度为0.001至0.05％(w/v)的聚山梨酯80。

9.根据权利要求1的液体制剂，其中所述长效EPO缀合物的浓度为1至500μg/ml。

10.根据权利要求1的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc片段选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其组合。

11.根据权利要求10的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc片段是由来自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的不同来源的结构域组成的杂合片段。

12.根据权利要求10的液体制剂，所述免疫球蛋白Fc片段是单链免疫球蛋白的二聚体或多聚体形式，所述单链免疫球蛋白由相同来源的结构域组成。

13.根据权利要求10的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc片段是IgG4Fc片段。

14.根据权利要求13的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc片段是人的非糖基化IgG4Fc片段。

15.根据权利要求1的液体制剂，其中所述非肽聚合物选自可生物降解聚合物、脂质聚合物、甲壳素、透明质酸及其组合。

16.根据权利要求15的液体制剂，其中所述可生物降解聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、PLA(聚乳酸)和PLGA(聚乳酸-乙醇酸)。