CN102753042B - 浓味赋予剂 - Google Patents

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Abstract

通过探索具有CaSR激动剂活性的多种多样的化合物，发现具有更优异的浓味赋予作用，特别是具有前味型的浓味赋予作用，且具有优异的稳定性，可以简便而低成本地生产的赋予浓味的物质，提供包含该物质的浓味赋予剂，以及包含该物质和其它具有CaSR激动剂活性的物质的复合浓味赋予剂。包含γ-Glu-Nva(L-γ-谷氨酰-L-正缬氨酸)的浓味赋予剂，以及将该物质与其它具有CaSR激动剂活性的物质组合而成的复合浓味赋予剂。

Description

浓味赋予剂
技术领域
本发明涉及包含显示CaSR激动剂活性的肽的浓味赋予剂及复合浓味赋予剂。本发明还涉及含有一定浓度以上的显示CaSR激动剂活性的肽的调味料。
背景技术
近年来，随着饮食生活的多样化等，消费者对味觉的要求日益提高，随之对能够赋予“浓味”——无法仅用甜味、咸味、酸味、苦味和鲜味等5种基本味觉来表达，而是连醇厚感、充盈感、绵延感和协调感等上述基本味觉的边缘味觉也得以增强的味觉——的优异的浓味赋予剂的需求也日益增加。
另外，钙感应受体(Calcium Sensing Receptor，CaSR)，亦称作钙受体，该受体信号调节各种活体内的功能，具有CaSR激动剂活性的物质可用作浓味赋予剂(专利文献1、2，非专利文献4)。
上述“浓味”中存在多种呈味模式，特别是对于呈味模式为前味型的能够赋予浓味的浓味赋予剂的需要较高。而且，赋予浓味的物质通常用于食品等，因此需要其具有优异的稳定性。进一步，产业上希望赋予浓味的物质可以更加简便而低成本地生产。
因此，需要探索具有CaSR激动剂活性的多种多样的化合物，发现具有更优异的浓味赋予作用，特别是具有前味型的浓味赋予作用，且具有优异的稳定性，可以简便而低成本地生产的赋予浓味的物质，提供包含该物质的浓味赋予剂、以及将该物质与其它具有CaSR激动剂活性的物质组合而成的复合浓味赋予剂。
另外，对于在N端具有γ-谷氨酰胺的一些γ-谷氨酰肽，虽然已知在酶活性研究等中将其作为底物合成的例子(专利文献3、非专利文献1~3)，但尚未知将γ-Glu-Nva用于食品用途的例子以及天然存在的例子。此外，将专利文献1和2的内容并入本说明书的记载。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2007/055393号小册子
专利文献2：国际公开第2008/139945号小册子
专利文献3：国际公开第2007/066430号小册子
非专利文献
非专利文献1：Molecular Pharmacology(1982),21(3),629-36
非专利文献2：Agricultural and Biological Chemistry(1981),45(12),2839-45
非专利文献3：Journal of Biological Chemistry(1979),254(12),5184-90
非专利文献4：The Journal of Biologial Chemistry,(2010),285(2),1016-22
发明内容
本发明的目的是通过探索具有CaSR激动剂活性的多种多样的化合物，发现具有更优异的浓味赋予作用，特别是具有前味型的浓味赋予作用，且具有优异的稳定性，可以简便而低成本地生产的赋予浓味的物质，提供包含该物质的浓味赋予剂以及将该物质与其它具有CaSR激动剂活性的物质组合而成的复合浓味赋予剂。进一步，以提供含有一定浓度的该物质的食品组合物作为目的。
本发明人探索了多种多样的化合物，结果令人惊讶地发现γ-Glu-Nva(L-γ-谷氨酰-L-正缬氨酸)具有高的CaSR激动剂活性和极为优异的浓味赋予效果，特别是其呈味模式可赋予前味型的浓味。进一步发现，所发现的γ-Glu-Nva与同样为二肽的γ-Glu-Cys相比，效价非常高，此外稳定性优异，并且显示前味更强的优选的呈味模式。进一步发现了所发现的γ-Glu-Nva可单独用作浓味赋予剂。还发现通过添加γ-Glu-Nva，可以得到增强了浓味的优选的食品组合物。还发现可用作将该物质与其它具有CaSR激动剂活性的物质组合而成的复合浓味赋予剂，从而完成了本发明。
即，本发明提供包含γ-Glu-Nva的浓味赋予剂。
此外，本发明还提供含有γ-Glu-Nva的食品组合物(以下，亦称为“本发明的食品组合物”)。此外，本发明提供了将(a)γ-Glu-Nva与(b)选自γ-Glu-X-Gly、γ-Glu-Val-Y、γ-Glu-Abu、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH2、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys(S-Me)(O)、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leu以及γ-Glu-Cys(S-Me)中的1种或2种以上的氨基酸或肽组合而成的复合浓味赋予剂，其中X、Y分别表示氨基酸或氨基酸衍生物。
根据本发明，能够提供具有极为优异的浓味赋予作用、特别是具有呈味模式具有如图1所示的概貌的独特的前味型的优异的浓味赋予作用，而且稳定性优异，可简便且低成本地生产的浓味赋予剂和复合浓味赋予剂。此外，通过本发明，能够提供包含一定浓度以上的具有浓味赋予作用的物质的优异的食品组合物。
使用本发明的浓味赋予剂，由于其呈味模式类似食盐的呈味模式，能够赋予低盐食品的呈味以咸味样的浓厚感及前味冲击，从而即使减少食品中的食盐含量，仍然能够保持与原先食品相同的咸味感，能够制成对健康非常有益的食品。作为此类食品，可举出各种汤和各种酱等为例。特别是具有如下优点：在进食含有本发明的浓味赋予剂的食品时，一旦入口，便能够感觉到咸味样的浓厚感及前味冲击。
附图简述
图1显示了前味型浓味赋予剂的味觉概貌。
具体实施方式
在本发明作为对象的γ-Glu-Nva中，包含2个氨基酸形成肽键形成的L-γ-谷氨酰-L-正缬氨酸和/或其盐，特别是可食用盐。
由于γ-Glu-Nva具有优异的浓味赋予效果，因此可以作为浓味赋予剂使用。可以添加γ-Glu-Nva，使得相对于赋予浓味的食品组合物的重量含有(浓度范围)0.1ppb~99.9质量%，优选为1ppb~10质量%，更优选为0.01ppm~1质量%的γ-Glu-Nva。即，本发明的其它实施方式为含有γ-Glu-Nva的食品组合物，优选涉及含有0.1ppb~99.9质量%、更优选含有1ppb~10质量%、更优选含有0.01ppm~1质量%的γ-Glu-Nva的食品组合物。更详细来说，例如，本发明涉及含有以质量换算的0.1ppb、0.005ppm、0.02ppm或0.01%以上~99.9%、90.0%、50%、600,000ppm、100,000ppm、80ppm、30ppm或10ppm以下的γ-Glu-Nva的食品组合物。
此外，通过将本发明的浓味赋予剂，即γ-Glu-Nva与选自谷氨酸钠(MSG)等氨基酸类、肌苷酸(IMP)等核酸类、氯化钠等无机盐类、柠檬酸等有机酸类、以及各种酵母提取物等中的至少一种其它调味原料组合使用，与其它调味原料单独使用的情况相比，可以提供浓味进一步增加、优选的调味料。就γ-Glu-Nva与上述其它调味原料组合使用时的浓度而言，只是要是本领域技术人员就可以通过感官评价等研究进行适当地设定。
对于本发明，“浓味”(kokumi)是指是不能由五种基本味道，即甜味(sweettaste)、咸味(salty taste)、酸味(sour taste)、苦味(bitter taste)和鲜味(umami)表示的味道，更具体地说是不仅使所述基本味道增强，还使基本味道的醇厚感(thickness)、充盈感(growth)(满口感(mounthfulness))、绵延感(continuity)和协调感(harmony)等边缘味道(marginal tastes)增强的味道。在此，“赋予浓味”是指增强以甜味、咸味、酸味、苦味和鲜味表示的五种基本味道，以及赋予醇厚感、充盈感、绵延感和协调感等伴随所述基本味道的边缘味道。此外，这也可以表述为呈味增强作用。由此，本发明的浓味赋予剂γ-Glu-Nva亦可表述为呈味增强剂(flavor enhancer)。本发明的浓味赋予剂γ-Glu-Nva还能够用作甜味增强剂、咸味增强剂、酸味增强剂、苦味增强剂或鲜味增强剂。
此外，味觉随着进食后的时间经过而变化，从刚进食之后开始顺次称为前味(initial taste)、中味(middle taste)和后味(after taste)。这些是相对的概念，大致而言，前味、中味和后味分别为进食后0至2秒，2至5秒和5秒之后所感觉的呈味。此外，0至5秒称作“前中味”，2秒之后至约30秒左右为“中后味”(参见图1)。由于对于分为三类的评价，进食者难以专心于评价，因此一般常用分为两类的评价。
此外，前味和中味合称为“前中味”，中味和后味合称为“中后味”。
具有CaSR活性的物质对于浓味和呈味模式的效果可通过人体味觉测试等方法来确认。此种人体味觉官能测试可以本发明说明书的实施例所示的测试为例，但并不限于此。
在本说明书中，所谓“CaSR”，意指钙感应受体(Calcium SensingReceptor)，它属于七次跨膜受体的C类，也称作钙受体。在本说明书中，所谓“CaSR激动剂”意指与上述CaSR结合，激活CaSR的物质。此外，在本说明书中，所谓“激活CaSR”，意指配体与CaSR结合，激活鸟苷酸结合蛋白质而进行信号传导。此外，与CaSR结合而激活CaSR的性质称为“CaSR激动剂”活性。
下面具体地展示筛选具有CaSR激动剂活性的化合物的方法，但并不限于这些步骤。
1)将受检物质添加至用于测定CaSR活性的CaSR活性测定系统，测定CaSR活性。
2)将添加受检物质时的CaSR活性与未添加受检物质时的CaSR活性相比较。
3)选择在添加受检物质时显示CaSR激动剂活性的受检物质。
CaSR活性的测定可例如，利用使用表达CaSR的细胞的测定系统来进行。上述细胞可以为内源表达CaSR的细胞，亦可为外源地导入了CaSR基因的重组细胞。对于上述CaSR活性测定系统而言，只要能够在向上述表达CaSR的细胞添加对CaSR具有特异性的细胞外配体(激活物质)时能检测出激活物质与CaSR的结合(反应)，抑或响应激活物质与CaSR的结合(反应)而传导在细胞内可检测出的信号即可使用，无特别限制。当与受检物质反应而检测出CaSR活性时，判定该受检物质具有CaSR刺激活性。
上述CaSR可优选例如以GenBank登录号NM_000388登录的人CaSR基因所编码的人CaSR。而且，CaSR并不限于由上述序列的基因编码的蛋白质，可以是由与上述序列具有60%以上、优选80%以上，更优选90%以上的同一性的基因所编码的蛋白质，只要所述基因编码具有CaSR机能的蛋白质即可。此外，CaSR的机能可通过将这些基因在细胞中表达，并测定添加钙时电流的变化和细胞内钙离子浓度的变化来加以调查。
上述CaSR的来源并无特别限制，不仅是上述的人CaSR，也可举出包括小鼠、大鼠和犬等所有动物来源的CaSR。
如上所述，CaSR活性可以利用表达CaSR或其片段的活细胞，表达CaSR或其片段的细胞膜，包含CaSR或其片段的的蛋白质的体外系统等来确认。
以下显示使用活细胞的一个实例，但并不限于此。
将CaSR在非洲爪蟾卵母细胞，仓鼠卵巢细胞和人胎儿肾细胞等培养细胞中表达。这可以通过将CaSR基因克隆至保持外源基因的质粒中，再将其以质粒的形式导入，或导入以其为模板的cRNA而实现。反应的检测可使用电生理学手段和细胞内钙升高的荧光指示剂。
首先通过由钙或特异性激活剂所致的响应来确认CaSR的表达。使用对于5mM左右浓度的钙能够检测到细胞内电流的卵母细胞或能够检测到荧光指示剂的荧光的培养细胞。改变钙浓度来测定浓度依赖性。之后，将受检物质调整为1μM~1mM左右，添加卵母细胞或培养细胞，在上述受检物质存在下测定CaSR活性，由此测定上述受检物质的CaSR激动剂活性。
此外，更具体而言，CaSR激动剂活性测试可举出本申请说明书的试验例为例，但不限于此。
在本发明的复合浓味赋予剂中与γ-Glu-Nva组合的氨基酸或肽为选自由γ-Glu-X-Gly(X表示氨基酸或氨基酸衍生物)、γ-Glu-Val-Y(Y表示氨基酸或氨基酸衍生物)、γ-Glu-Abu、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH2、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys(S-Me)(O)、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leu和γ-Glu-Cys(S-Me)组成的群组中的1种或2种以上的氨基酸或肽，在此，所谓氨基酸包括Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Thr，Cys，Met，Asn，Gln，Pro，Hyp，t-Leu等中性氨基酸，Asp，Glu等酸性氨基酸，Lys，Arg，His等碱性氨基酸，Phe，Tyr，Trp等芳族氨基酸，还包括高丝氨酸，瓜氨酸，鸟氨酸，α-氨基丁酸，正缬氨酸，正亮氨酸和牛磺酸等。此外，亦可为叔亮氨酸(tert-leucine)，环亮氨酸(cycloleucine)，α-氨基异丁酸，L-青霉胺，别苏氨酸(allo-threonine)和别异亮氨酸(allo-isoleucine)等非天然(非蛋白质构成性)氨基酸。而且，在肽γ-Glu-X-Gly中，X可为任意如上所述的氨基酸或其衍生物，但优选为Cys以外的氨基酸或其衍生物。其中，作为组合使用的肽，优选γ-Glu-Val-Gly、γ-Glu-Abu-Gly、γ-Glu-tLeu-Gly、γ-Glu-Nva-Gly和γ-Glu-Abu等。
具体而言，本发明的浓味赋予剂由γ-Glu-Nva组成，具有如图1所示的概貌的独特的前味型的优异的浓味赋予作用，因此优选将其与具有不同于这种概貌的概貌的肽，例如γ-Glu-Val-Gly组合使用。
在本说明书中，氨基酸残基的缩写意指下述氨基酸：
(1)Gly：甘氨酸
(2)Ala：丙氨酸
(3)Val：缬氨酸
(4)Leu：亮氨酸
(5)Ile：异亮氨酸
(6)Met：甲硫氨酸
(7)Phe：苯丙氨酸
(8)Tyr：酪氨酸
(9)Trp：色氨酸
(10)His：组氨酸
(11)Lys：赖氨酸
(12)Arg：精氨酸
(13)Ser：丝氨酸
(14)Thr：苏氨酸
(15)Asp：天冬氨酸
(16)Glu：谷氨酸
(17)Asn：天冬酰胺
(18)Gln：谷氨酰胺
(19)Cys：半胱氨酸
(20)Pro：脯氨酸
(21)Orn：鸟氨酸
(22)Sar：肌氨酸
(23)Cit：瓜氨酸
(24)N-Val(或者Nva)：正缬氨酸(2-氨基戊酸)
(25)N-Leu(或者Nle)：正亮氨酸
(26)Abu：α-氨基丁酸
(27)Tau：牛磺酸
(28)Hyp：羟脯氨酸
(29)t-Leu：叔亮氨酸
(30)Cle：环亮氨酸
(31)Aib：α-氨基异丁酸(α-aminoisobutyric acid，2-甲基丙氨酸)
(32)Pen：L-青霉胺(penicillamine)
(33)allo-Thr：别苏氨酸
(34)allo-Ile：别异亮氨酸
此外，所谓“氨基酸衍生物”是上述氨基酸的各种衍生物，例如特殊氨基酸和非天然氨基酸、氨基醇、或末端羰基或氨基、半胱氨酸的巯基等氨基酸侧链由各种取代基取代者。所谓取代基可举出烷基、酰基、羟基、氨基、烷基氨基(alkylamino)、硝基、磺酰基和各种保护基等，例如，包括Arg(NO2):N-γ-硝基精氨酸，Cys(SNO):S-硝基半胱氨酸，Cys(S-Me):S-甲基半胱氨酸，Cys(S-烯丙基):S-烯丙基半胱氨酸，Val-NH2:缬氨酰胺(valinamide)，Val-ol:缬氨醇(valinol)(2-氨基-3-甲基-1-丁醇)等。而且，在本说明书中，γ-Glu-Cys(SNO)-Gly具有下述结构式，而上述γ-Glu-Met(O)以及γ-Glu-Cys(S-Me)(O)式中的(O)意指亚砜结构。所谓γ-Glu的(γ)意指谷氨酸通过γ位的羧基与其他氨基酸结合。
S-ニトロソグルタチオン(S-Nitrosoglutathione(GNSO))
S-亚硝基谷胱甘肽(GNSO)
本发明的γ-Glu-Nva以及与其组合的氨基酸或肽，在有市售的情况下可使用市售品，此外，可适当地使用经由(1)化学合成方法或(2)通过酶反应合成方法等公知手段而获得，化学合成更加简便。由于在本发明中使用的γ-Glu-Nva所含的氨基酸残基数为2个残基，长度较短，化学合成方法是简便的，与所含的氨基酸残基数为3个残基的三肽相比可更加简便且低成本地加以生产，在产业上非常有利。此外，在本发明的γ-Glu-Nva以及与其组合的氨基酸或肽是化学合成的情况下，可通过使用肽合成仪合成或半合成该寡肽来进行。化学合成方法可举出肽固相合成法等为例。如此合成出的肽可通过通常的手段，例如离子交换层析，反相高效液相色谱，亲和层析等进行纯化。这样的肽固相合成法，以及之后的肽纯化在本领域是公知的。
此外，在本发明中使用的γ-Glu-Nva以及与其组合的氨基酸或肽是通过酶反应产生的情况下，亦可使用例如国际公开小册子WO2004/011653号记载的方法。即，可以通过将一方的羧基端被酯化或酰胺化的氨基酸或二肽与氨基酸为游离状态的氨基酸(例如，羧基受保护的氨基酸)在肽生成酶的存在下进行反应，并将生成的二肽或三肽纯化，来加以生产。所谓肽生成酶，可举出具有生成肽的能力的微生物的培养物，由该培养物分离的微生物菌体，或该微生物的菌体处理物，或来自该微生物的肽生成酶。而且，将WO2004/011653号记载的事项并入本说明书的记载。
进一步，除了如上所述的酶学方法和化学合成方法以外，本发明中使用的肽亦可存在于蔬菜和水果等植物，酵母等微生物，以及其他天然物质中。在天然存在的情况下，亦可从它们中提取出来后使用。
本发明的浓味赋予剂以及复合浓味赋予剂可单独地，或与饮食品上可接受的担载体和其他调味原料混合来作为调味料。对于其他的调味原料，可举出香料、糖类、甜味剂、膳食纤维、维生素、谷氨酸钠(MSG)等氨基酸类、肌苷酸(IMP)等核酸类、氯化钠等无机盐类、柠檬酸等有机酸类为例，还可以列举各种酵母提取物为例。
而且，就作为包含本发明的浓味赋予剂或复合浓味赋予剂的食品组合物的优选的低盐食品而言，是原来含有食盐的食品，特别是该食盐含量减少的食品。
此类低盐食品可举出黄油、奶酪等乳制品，人造黄油、酱(sauce)、油脂面糊(roux)等含有动物油脂和/或植物油脂的食品，沙拉调料(dressing)或蛋黄酱(mayonnaise)等乳化食品等，各种咖喱和炖汤(stew)，含有肉提取物-奶油的各种汤等。此外，可举出在味噌、酱油等酿造食品、腌菜、泡菜(pickles)等蔬菜加工食品，火腿、香肠等畜肉加工食品，鱼糕、干鱼、佃煮等水产加工食品，已烹制的肉丸、汉堡肉、油炸食品、烤鸡肉串等。其中，所谓低盐食品，优选食用时食盐含量为0.01~0.5质量%。
通过使上述低盐食品含有本发明的浓味赋予剂，在食用这些食品时，可在一开始就感觉到咸味样的浓厚感及前味冲击。
此外，从其它的观点来看，作为含有本发明的浓味赋予剂或复合浓味赋予剂的食品组合物，还优选唇形科的草本植物和/或香料类、或添加了唇形科的草本植物和/或香料类的食品。作为唇形科的草本植物，可以列举紫苏、罗勒(basil)、以及大茴香、牛至、鼠尾草、百里香、日本薄荷、洋薄荷、香柠檬、墨角兰、薄荷、薰衣草、迷迭香等，但没有特别地限定。对于含有唇形科的草本植物和/或香料类和本发明的浓味赋予或复合浓味赋予剂的食品的场合，作为上述食品，食用时的唇形科的草本植物和/或香料类以固体成分计优选为0.01~10质量%。
如上所述，作为含有γ-Glu-Nva和唇形科草本植物和/或香料的食品，优选例如酱、沙拉调料、汤、小食或畜肉加工食品(火腿、香肠等)。
此外，从其它观点来看，作为含有本发明的浓味赋予剂或复合浓味赋予剂的食品组合物，还优选为含有味噌的食品。作为味噌，可以列举大米味噌、小麦味噌、大豆味噌、将这些中的2种以上混和而得到的调配味噌等，没有特别的限制。作为这样的含有味噌的食品，只要是含有味噌即可，没有特别的限制，可以列举例如：味噌汤、含有味噌作为调味料的各种加工食品、调味味噌、味噌拉面汤、味噌使用酱等。在含有味噌和本发明的浓味赋予或复合浓味赋予剂的食品的情况下，作为上述食品，食用时的味噌类以固体成分计优选为0.01~99.9重量%。
进一步，从其它观点来看，作为含有本发明的浓味赋予剂或复合浓味赋予剂的食品组合物，还优选为含有番茄的食品。作为这样的含有番茄的食品，只要是含有番茄即可，没有特别的限制，可以列举例如：番茄酱汁(tomatosauce)、调味番茄酱(ketchup)、番茄酱(tomato paste)、含有番茄的各种汤类等。在含有番茄类和本发明的浓味赋予或复合浓味赋予剂的食品的情况下，作为上述食品，食用时的番茄类以固体成分计优选为0.01~99.9重量%。
在本发明中使用的γ-Glu-Nva以及组合使用的氨基酸或肽亦包括盐形式。在本发明的γ-Glu-Nva以及组合使用的氨基酸或肽能够形成盐形式的情况下，该盐只要是药学上可接受的、可食用的盐即可，例如，对于羧基等酸性基团，可举出铵盐，与钠、钾等碱金属的盐，与钙、镁等碱土金属的盐，铝盐，锌盐，与三乙胺、乙醇胺、吗啉、吡咯烷、哌啶、哌嗪和二环己胺等有机胺的盐，与精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸的盐。此外，对于碱性基团，可举出与盐酸，硫酸，磷酸，硝酸，氢溴酸等无机酸的盐，与醋酸，柠檬酸，苯甲酸，马来酸，富马酸，酒石酸，琥珀酸，单宁酸，丁酸，2-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸(hibenzic acid)，扑酸(pamoic acid)，庚酸(enanthic acid)，癸酸(decanoic acid)，8-氯茶碱(テオクル酸)，水杨酸，乳酸，草酸，扁桃酸和苹果酸等有机羧酸的盐，和与甲磺酸，苯磺酸，对甲苯磺酸等有机磺酸的盐。
本发明的浓味赋予剂、食品组合物或复合浓味赋予剂可以以干燥粉末，糊剂，溶液等任何形态加以使用，对其物理性质没有限制。
本发明的浓味赋予剂、食品组合物或复合浓味赋予剂可配合到食品、饮料、调味料等各种饮食品中使用。
将本发明的浓味赋予剂、食品组合物或复合浓味赋予剂配合到食品、饮料、调味料等各种饮食品中使用的情况下，对于最终的γ-Glu-Nva量以及组合使用的氨基酸或肽的量而言，只要是可获得所期望的效果的量即可，无特别的限制，作为γ-Glu-Nva的量和/或氨基酸或肽的量，以食品、饮料或调味料等的总质量为基准，各自为0.1ppb~99.9质量%、优选1ppb~10质量%、更优选0.01ppm~1质量%左右。
在配合有本发明的浓味赋予剂、食品组合物或复合浓味赋予剂的食品、饮料、调味料等各种饮食品中，亦可进一步配合与对于饮食品而言可接受的任何固体或液体担载体、适当的调味原料等。
作为上述的担载体，可举出例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、明胶、白蛋白、氨基酸、水和生理盐水等。
上述的调味原料可以是任何本领域使用的调味原料，并无特别的限制，更具体而言可以列举上文所述者。
上述的担载体、其它的调味原料等，其含量均无特别的限制。
在上述调味原料中，酵母提取物可使用任何酵母提取物，对其来源的菌体、其培养条件，提取处理方法等均无特别限制，亦可是进一步经过热处理、酶处理、浓缩、粉末化处理等的酵母提取物。
本发明的浓味赋予剂、食品组合物或复合浓味赋予剂可以以干燥粉末，糊剂，溶液等任何形态加以使用，对其物理性质没有限制。
本发明的浓味赋予剂、食品组合物或复合浓味赋予剂可配合到食品、饮料、调味料等各种饮食品中使用。
本发明还提供各种饮食品的制造方法，其特征在于，向各种饮食品中间产品中添加γ-Glu-Nva使其含有1质量ppb~99.9质量%。在此作为各种饮食品，优选低盐食品。
本发明还提供各种饮食品的制造方法，其特征在于，向各种饮食品中间产品中添加本发明的食品组合物。在此作为各种饮食品，优选低盐食品。
就使用本发明的浓味赋予剂的中间产品的制造方法而言，优选如下饮食品或饮食品的中间产品的制造方法，该方法包含：将包含γ-Glu-Nva的呈味增强剂添加混合至饮食品原料(例如，鲜味原料、蛋白质水解产物、或草本植物和/或香料类)的步骤，以及根据需要，进一步烹调得到的饮食品原料混合物的步骤。
在此，将包含γ-Glu-Nva的呈味增强剂添加至饮食品原料的步骤优选包括使饮食品的中间产品的γ-Glu-Nva浓度为0.005~600,000重量ppm，优选为0.1~100,000重量ppm的步骤。
此外，还进一步优选包括：将饮食品的中间产品添加至其它饮食品原料(例如，农产品、水产品、畜肉、乳制品、或其加工品等)，使所得的饮食品的γ-Glu-Nva浓度为0.005~30重量ppm，优选为0.05~10重量ppm的步骤。
此外，将包含γ-Glu-Nva的呈味增强剂添加混合至饮食品原料的步骤还进一步优选包括：使饮食品的γ-Glu-Nva浓度为0.005~30重量ppm，优选为0.05~10ppm的步骤。
在上述的制造方法中，优选饮食品为含有唇形科草本植物和/或香料的食品(例如，酱、沙拉调料、汤、小食或畜肉加工食品)。此时，优选含有0.005~30重量ppm的γ-Glu-Nva、0.01~10重量%的唇形科的草本植物和/或香料类、以及其它食品原料。
此外，在上述的制造方法中，优选饮食品为含有味噌的食品。此时，优选含有0.02~80重量ppm的γ-Glu-Nva、0.01~99.9重量%的味噌(进一步优选0.1~90.0重量%)、以及其它食品原料。
此外，在上述的制造方法中，优选饮食品为含有番茄的食品。此时，优选含有0.02~80重量ppm的γ-Glu-Nva、0.01~99.9重量%的番茄(进一步优选0.1~90.0重量%)、以及其它食品原料。
另外，还列举增强饮食品呈味的方法，其包括将含有γ-Glu-Nva的组合物添加至饮食品，优选以0.01重量~50重量%添加至饮食品的步骤，在此，增强呈味优选为赋予浓味。
以下举出实施例对本发明更加详细的加以说明，但这些并不限定本发明。
实施例
(合成例1)γ-Glu-Nva(γ-L-谷氨酰-L-正缬氨酸)的合成
将Boc-Nva·DCHA (叔丁氧基羰基-L-正缬氨酸二环己铵盐(t-Butoxycarbonyl-L-norvaline dicyclohexylammonium salt)、3.39g、8.49mmol)和苯甲醇(1.01g、9.34mmol)溶解在二氯甲烷(CH2Cl2、60ml)中。将反应液保持在0℃，添加了DMAP(4-二甲基氨基吡啶、0.21g、0.2当量、1.70mmol)和WSC·HCl(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐、1.81g、1.1当量、9.34mmol)。使反应液的温度缓慢升高，在室温下搅拌过夜(16小时)。将反应液减压浓缩，向残渣中添加乙酸乙酯(500ml)，使有机层为50℃，然后利用水(100ml)、5%柠檬酸水溶液(100ml)清洗2次、利用饱和食盐水(100ml)、5%碳酸氢钠水溶液(100ml)清洗2次、以及利用饱和食盐水(100ml)清洗，利用无水硫酸镁干燥。过滤除去硫酸镁，将滤液减压浓缩。由于在减压浓缩的过程中析出晶体，过滤收集晶体，并减压干燥得到晶体Boc-Nva-OBzl(2.41g、7.83mmol)。
向与另行合成的Boc-Nva-OBzl合并后得到的Boc-Nva-Obzl(2.68g、8.72mmol)中添加4N HCl/二烷溶液(43.6ml)，在室温下搅拌1小时。减压浓缩除去二烷，向残渣中添加正己烷(30ml)进行减压浓缩，重复操作3次，以定量的收率得到H-Nva-OBzl·HCl。
将H-Nva-OBzl·HCl溶解在二氯甲烷(60ml)中，将反应液保持在0℃。向反应液中添加Z-Glu-Obzl(N-α-苄氧羰基-L谷氨酸α-苄酯(N-α-Carbobenzoxy-L-glutamic acid α-benzyl ester)、3.24g、8.72mmol)、三乙胺(1.34ml、1.1当量、9.59mmol)、HOBt·H2O(1-羟基苯并三唑水合物、1.47g、1.1当量、9.59mmol)及WSC·HCl(1.84g、1.1当量、9.59mmol)。使反应液的温度缓慢升高，在室温下搅拌过夜(16小时)。减压浓缩反应混合物，向残渣中添加乙酸乙酯(200ml)，将有机层利用水(80ml)、5%柠檬酸水溶液(80ml)清洗2次，利用饱和食盐水(80ml)、5%碳酸氢钠水溶液(80ml)清洗2次，并利用饱和食盐水(80ml)清洗，再利用无水硫酸镁干燥。过滤除去硫酸镁，将滤液减压浓缩。将残渣从乙酸乙酯和正己烷中重结晶，过滤收集晶体、减压干燥得到Z-Glu(Nva-OBzl)-OBzl(4.05g)结晶。
向乙醇(150ml)和水(30ml)的混合液中添加Z-Glu(Nva-OBzl)-OBzl(4.05g)和5%钯碳(5%钯/碳、0.70g)，在50℃过夜(14小时)，在氢气氛下进行接触还原。在反应中，一点点添加水(50ml)。过滤除去钯炭，将滤液减压浓缩。将残渣从少量的水和乙醇中重结晶得到白色结晶γ-Glu-Nva(1.50g)。进一步，将该结晶溶解在水(100ml)中并冷冻干燥得到γ-Glu-Nva(1.27g、5.16mmol)的白色粉末。其特性值如下所示。
ESI-MS:(M+H)+=247.1、(M-H)‐=245.2。
1H-NMR(400MHz,D2O)δ(ppm):0.77(3H,t,J=7.3Hz),1.18-1.33(2H,m),1.50-1.73(2H,m),1.97-2.08(2H,m),2.36(2H,dd,J=6.6和8.4Hz),3.68(1H,t,J=8.4Hz),4.15(1H,dd,J=5.2和8.8Hz)。
(合成例2)γ-Glu-Nle(γ-L-谷氨酰-L-正亮氨酸)的合成(比较例)
Boc-Nle·0.2AcOEt(叔丁氧基羰基-L-正亮氨酸(t-Butoxycarbonyl-L-norvleucine)·0.2mol乙酸乙酯、0.51g，2.00mmol)和苯甲醇(0.24g、mmol)溶解在二氯甲烷(CH2Cl2、30ml)中。将反应液保持在0℃，添加了DMAP(4-二甲基氨基吡啶、0.05g、0.2当量、0.40mmol)和WSC·HCl(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐、0.43g、1.1当量、2.20mmol)。使反应液的温度缓慢升高，在室温下搅拌过夜(16小时)。将反应液减压浓缩，向残渣中添加乙酸乙酯(100ml)，利用水(30ml)、5%柠檬酸水溶液(30ml)清洗2次，利用饱和食盐水(30ml)、5%碳酸氢钠水溶液(30ml)清洗2次，并利用饱和食盐水(30ml)清洗，利用无水硫酸镁干燥。过滤除去硫酸镁，将滤液减压浓缩，得到Boc-Nle-OBzl(0.61g、1.90mmol)的油状物。
向Boc-Nle-OBzl(0.61g、1.90mmol)中添加4N HCl/二烷溶液(9.40ml)，在室温下搅拌1小时。减压浓缩除去二烷，向残渣中添加正己烷(5.0ml)进行减压浓缩，重复操作3次，以定量的收率得到H-Nle-OBzl·HCl。
将H-Nle-OBzl·HCl溶解在二氯甲烷(30ml)中，将反应液保持在0℃。向反应液中添加Z-Glu-Obzl(N-α-苄氧羰基-L谷氨酸α-苄酯、0.70g、1.90mmol)、三乙胺(0.29ml、1.1当量、2.10mmol)、HOBt·H2O(1-羟基苯并三唑水合物、0.32g、1.1当量、2.10mmol)及WSC·HCl(0.41g、1.1当量、2.10mmol)。使反应液的温度缓慢升高，在室温下搅拌过夜(16小时)。减压浓缩反应混合物，向残渣中添加乙酸乙酯(100ml)，将有机层利用水(30ml)、5%柠檬酸水溶液(30ml)清洗2次，利用饱和食盐水(30ml)、5%碳酸氢钠水溶液(30ml)清洗2次，并利用饱和食盐水(30ml)清洗，利用无水硫酸镁干燥。过滤除去硫酸镁，将滤液减压浓缩。将残渣从乙酸乙酯和正己烷中重结晶，过滤收集结晶，减压干燥得到Z-Glu(Nle-OBzl)-Obzl结晶(0.91g)。
向乙醇(50ml)和水(10ml)的混合液中添加Z-Glu(Nle-OBzl)-OBzl(4.05g)和5%钯碳(5%钯/碳、0.40g)，在50℃过夜(14小时)，在氢气氛下进行接触还原。反应中，一点点添加水(10ml)。过滤除去钯碳，将滤液减压浓缩。将残渣从少量的水和乙醇中重结晶得到作为吸湿性晶体的γ-Glu-Nle(0.29g)。进一步，将该晶体溶解在水(30ml)中并冷冻干燥得到γ-Glu-Nle(0.13g、0.50mmol)的白色粉末。其特性值如下所示。
ESI-MS:(M+H)+=261.1、(M-H)-=259.0。
1H-NMR(400MHz,D2O)δ(ppm):0.79(3H,t,J=7.1Hz),1.18-1.30(4H,m),1.60-1.70(1H,m),1.70-1.80(1H,m),2.04-2.10(2H,m),2.38-2.44(2H,m),3.73(1H,t,J=6.3Hz),4.19(1H,dd,J=5.0和8.8Hz)。
(试验例1)CaSR表达质粒的制备
CaSR表达质粒的制备如下进行。
以在NCBI中登录的DNA序列(CaSR(钙受体)：NM_000388，SEQ ID NO:1，2)为基础，使用PCR合成了合成寡DNA(正向引物(SEQ ID NO:3:ACTAATACGACTCACTATAGGGACCATGGCATTTTATAGCTGCTGCTGG)，以及反向引物(SEQ ID NO:4:TTATGAATTCACTACGTTTTCTGTAACAG)。
以人肾脏来源的cDNA(Clontech公司制)为材料，使用前述引物，以及Pfu Ultra DNA聚合酶(Stratagene公司制)，以下述条件实施PCR。94℃3分钟之后，94℃30秒、55℃30秒、72℃2分钟循环35次，然后72℃7分钟进行反应。进行琼脂糖电泳，用DNA染色剂染色之后，通过紫外线照射检测是否通过PCR而发生了扩增。此外，通过与同时进行电泳的大小已知的DNA分子量标记相比较，确认PCR产物的链长。
将质粒载体pBR322用限制性酶EcoRV(Takara公司制)切断，在该切断位点用连接反应试剂盒(Promega公司制)连接通过PCR扩增所得的基因片段。用该反应溶液转化大肠杆菌DH5α株，筛选保留有克隆的PCR扩增产物的质粒的转化体，进一步通过DNA碱基序列分析确认PCR扩增产物。
使用此种重组质粒制备了人CaSR表达质粒hCaSR/pcDNA3.1。
(试验例2)CaSR激动剂活性的评价
将293E细胞(表达EBNA1的HEK293细胞，ATCC No.CRL-10852)在200μg/ml的G418(遗传霉素)存在下，在包含10%的胎牛血清的DMEM/Ham′s-F 12(含3.15/ml葡萄糖的Dulbecco′s modified Eagle medium，Nakaraitesk)中培养。以3×106细胞/10ml接种于F25烧瓶中，在CO2培养箱(5%CO2，37℃)中静置24小时之后，用转染剂Fugene6(Roche)转染人CaSR表达质粒hCaSR/pcDNA3.1。在CO2培养箱中放置6~7小时之后，用包含10%胎牛血清的DMEM/Ham′s-F12回收细胞，以70000细胞/孔接种于聚-D-赖氨酸包被的96孔板(BD-Biocoat)。
在CO2培养箱中静置24小时之后，从接种该细胞的96孔板去除培养基，以200μl/孔添加溶解于测定缓冲液(146mM NaCl，5mM KCl，1mM MgSO4，1mg/ml葡萄糖，20mM HEPES(pH 7.2)，0.75~1.25mM CaCl2)的Ca2+荧光指示剂Calcium 4 Assay Kit(Molecular Devices)，在37℃下静置1小时，接着在室温下静置10分钟，使其摄入指示剂。
向该96孔板以50μl/孔添加溶解于含0.1%BSA的测定缓冲液的受验化合物(γ-Glu-Nva或γ-Glu-Nle)，用FLEX Station(Molecular Devices)在测定3分钟时间内荧光强度的变化。
(EC50计算方法)
通过FLEX Station的自动计算确定化合物添加前后的荧光强度的最大值和最小值的差(RFU(Max-Min))。将以最大浓度添加化合物时的RFU(Max-Min)定义为100%，将使用不含受验化合物的含0.1%BSA的测定缓冲液时的RFU(Max-Min)定义为0%来计算活性率。通过表计算软件Xfit或Graph-Pad-Prism进行曲线拟合，确定活性率50%时的化合物浓度EC50值。结果示于表1。
此外，作为比较例，针对其它二肽进行同样地测定得到的值如表2所示。
表1
  化合物   EC50，μM
  γ-Glu-Nva   0.12
  γ-G1u-Nle   4.41
表2
  γ-Glu-Abu   0.21
  γ-Glu-Ala   1.24
  γ-Glu-Val   1.03
  γ-Glu-tLeu   3.06
  γ-Glu-Cys   0.16
  γ-Glu-Ser   11
  γ-Glu-Thr   6.97
  γ-Glu-Aib   15.4
与其他二肽相比，γ-Glu-Nva显示与γ-Glu-Cys相当的强CaSR作用活性。已知具有CaSR作用活性的小分子二肽可用作浓味赋予剂(专利文献1)，这表明γ-Glu-Nva是特别优异的浓味赋予剂。
实施例1浓味赋予活性的评价
对于γ-Glu-Nva，通过定量的官能评价实验检查了浓味赋予活性的强度。
定量的官能评价实验以如下方式实施。在含有谷氨酸钠(0.05g/dl)，肌苷酸单磷酸(イノシン酸一リン酸)(0.05g/dl)，氯化钠(0.5g/dl)的蒸馏水中，将受验化合物以0.00001～0.5g/dl混合的情况下，测定浓味赋予活性的强度。对于在试料溶解之后相对于无添加的对照呈酸性的样品，通过NaOH将其调整为相对于无添加的对照pH±0.2的范围来使用。官能评分为对照：0分，强：3分，非常强：5分，同时为了使尺度更加明确，将γ-Glu-Val-Gly的前味、中后味分别作为3.0分。评分使用线性比例法，更具体地说，用对于标明-5～0～5分的位置的直线，将相应的评分作为位置记入的方法。此外，让累计具有一年以上食品调味开发的经验，能够判断出向鲜味咸味溶液添加的γ-Glu-Cys-Gly和γ-Glu-Val-Gly的效价之差为10倍左右的人(定期确认)作为评委。评价利用n＝4来实施。此外，“前味”是指含在口中后0～2秒的呈味，中后味是这之后的呈味。受检化合物在上述的添加浓度内显示了宽范围的浓味赋予活性，但仅将代表性的浓度的结果示于表3。
此外，对于γ-Glu-Val-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Val、γ-Glu-Ala和γ-Glu-Ser进行同样地评价得到的结果也示于表3。
表3
γ-Glu-Nva具有非常优异的浓味赋予活性，进一步，就其呈味模式而言，发现前味的升起是优异的。该前味的升起为与γ-Glu-Cys相比极其优异的一点。此外，γ-Glu-Nva的稳定性优异，该一点也是与γ-Glu-Cys相比优异点所在。关于浓味赋予活性，γ-Glu-Nva也具有优于到现有二肽的高效价。此外，γ-Glu-Nva所含的氨基酸残基数为二个残基，长度较短，因此与所含氨基酸残基数为三个残基的三肽相比可以更加简便且低成本地生产，在产业上也是非常有利的。
实施例2γ-Glu-Nva赋予罗勒的效果
γ-Glu-Nva为前味型二肽，但就食用时的浓味赋予效果活性而言，发现与γ-Glu-Abu、γ-Glu-Val等现有的高效价前味型二肽相比，其浓味赋予效果活性体现得稍晚。另一方面还发现，与γ-Glu-Cys-Gly(谷胱甘肽)、γ-Glu-Val-Gly等高效价的中后味型三肽比较，其非常早地体现出浓味赋予效果。发明人着眼于这一点，发现了这样的草本植物和/或香料类并对它们进行了详细地研究：它们与γ-Glu-Nva体现浓味赋予效果活性的时间同步，从而风味得到增强。这种性质在其他具有高浓味赋予效果活性的γGlu肽中并未发现。
官能评价试验如下实施。将市售的代表性的草本植物和/或香料粉末分散在水中使得其为0.5重量%，制备草本植物和/或香料溶液。针对该溶液，混合作为试样的γ-Glu-Nva、γ-Glu-Cys-Gly、或γ-Glu-Abu。根据成对比较检验法，对下述进行了比较评价：(1)0.00015重量%的γ-Glu-Nva与具有同等浓味赋予活性的0.02重量%的γ-Glu-Cys-Gly；(2)0.00015重量%的γ-Glu-Nva与同等量的0.00015重量%的γ-Glu-Abu；(3)0.00015重量%的γ-Glu-Nva与具有同等浓味赋予活性的0.003重量%的γ-Glu-Abu，并由评委评判何者“在不改变草本植物和/或香料溶液的呈味和风味的平衡的条件下增强其呈味和风味，是优选的”。让累计具有一年以上食品调味开发的经验，能够判断出在鲜味咸味溶液中添加的γ-Glu-Cys-Gly和γ-Glu-Val-Gly的效价之差为10倍左右的人(定期确认)作为评委。评价以n=9来实施。
将0.00015重量%的γ-Glu-Nva评价为“在不改变草本植物和/或香料溶液的呈味和风味的平衡的条件下增强其呈味和风味，是优选的”的评委数如表4所示。确认了对唇形科的草本植物和/或香料的效果，但仅示出了罗勒的结果作为代表。
根据该结果可以确认，即使在如(1)和(3)所示的同等的浓味效价的条件下，γ-Glu-Nva也具有极为显著地增强唇形科草本植物和/或香料的呈味和风味的突出效果。
表4
N=9
*)在1%的显著水平，可以认为γ-Glu-Nva在不改变唇形科的罗勒的溶液的呈味和风味的平衡的条件下增强其呈味和风味，是优选的
**)在5%的显著水平，可以认为γ-Glu-Nva不改变唇形科放入罗勒溶液的呈味和风味的平衡的条件下增强其增强呈味和风味，是优选的
根据上述的结果可知，与同等浓味赋予活性的浓度下的γ-Glu-Cys-Gly、γ-Glu-Abu等具有高浓味赋予活性的γGlu肽相比，γ-Glu-Nva具有“在不改变唇形科草本植物和/或香料的呈味和风味的平衡的条件下增强其呈味和风味，是优选的”这样极为突出的效果。唇形科的草本植物和/或香料除了紫苏、罗勒(basil)、以及大茴香、牛至、鼠尾草、百里香、日本薄荷、洋薄荷、香柠檬、墨角兰、薄荷、薰衣草、迷迭香等之外包括多种植物，在世界范围内(包括意大利料理在内)被广泛地用于调味料、汤、酱、畜肉加工品、烹调加工品、点心等。因此，γ-Glu-Nva能够以更低成本、微小的用量改善使用唇形科的草本植物和/或香料的食品的呈味和风味，在产业上也是非常有利的。
实施例3γ-Glu-Nva赋予味噌的效果
γ-Glu-Nva为前味型二肽，发现与γ-Glu-Abu、γ-Glu-Val等其它高效价的前味型二肽相比，当使用时，其浓味赋予效果活性体现稍晚。另一方面，与γ-Glu-Cys-Gly(谷胱甘肽)、γ-Glu-Val-Gly等高效价的中后味型三肽比较，其非常早地体现出浓味赋予效果。发明人着眼于这一点，发现了这样的调味料类并对它们进行了详细地研究：它们与γ-Glu-Nva体现浓味赋予效果活性的时间同步，从而风味得到增强。这种性质在其他具有高浓味赋予效果活性的γGlu肽中并未发现。
官能评价试验如下实施。将市售的一般的味噌(大豆和小麦原料)溶解在热水中使得其为10.0重量%，配制成味噌溶液。针对该溶液，混合作为试样的γ-Glu-Nva、γ-Glu-Cys-Gly、或γ-Glu-Abu。根据成对比较检验法，对下述进行了比较评价：(1)0.0004重量%的γ-Glu-Nva与具有同等浓味赋予活性的0.02重量%的γ-Glu-Cys-Gly、(2)0.0004重量%的γ-Glu-Nva与同等量的0.0004重量%的γ-Glu-Abu、(3)0.0004重量%的γ-Glu-Nva与具有同等浓味赋予活性的0.003重量%的γ-Glu-Abu，并由评委判断何者“在不改变味噌溶液的呈味和风味的平衡的条件下增强其呈味和风味，是优选的”。让累计具有一年以上食品调味开发的经验，能够判断出在鲜味咸味溶液中添加的γ-Glu-Cys-Gly和γ-Glu-Val-Gly的效价之差为10倍左右的人(定期确认)作为评委。评价以n=9来实施。
将0.0004重量%的γ-Glu-Nva评价为“在不改变味噌溶液的呈味和风味的平衡的条件下增强其呈味和风味、是优选的”的评委数如表5所示。
根据该结果可确认，即使在如(1)和(3)所示的同等的浓味效价的条件下，γ-Glu-Nva也具有极为显著地增强味噌的呈味和风味的突出效果。
表5
N=9
*)在5%的显著水平，可以认为γ-Glu-Nva在不改变味噌溶液的呈味和风味的平衡的条件下增强其呈味和风味，是优选的
**)在1%的显著水平，可以认为γ-Glu-Nva在不改变味噌溶液的呈味和风味的平衡的条件下增强其呈味和风味，是优选的
从上述的结果可见，与具有同等的浓味赋予活性的浓度的γ-Glu-Cys-Gly、γ-Glu-Abu等具有高浓味赋予活性的γGlu肽相比，γ-Glu-Nva具有“在不改变味噌的呈味和风味的平衡的条件下增强其呈味和风味、是优选的”这样极为突出的效果。味噌广泛地用于调味料、味噌汤、汤汁、佐料汁、烹调加工品等。因此，γ-Glu-Nva能够以更低成本、微小的用量改善使用味噌的食品的呈味和风味，在产业上也是非常有利的。
实施例4γ-Glu-Nva赋予调味番茄酱的效果
γ-Glu-Nva为前味型二肽，发现与γ-Glu-Abu、γ-Glu-Val等其它高效价的前味型二肽相比，其在食用时浓味赋予效果活性体现稍晚。另一方面，还发现与γ-Glu-Cys-Gly(谷胱甘肽)、γ-Glu-Val-Gly等高效价的中后味型三肽比较，其非常早地体现出浓味赋予效果。发明人着眼于这一点，发现了这样的调味料类并对它们进行了详细地研究：它们与γ-Glu-Nva体现浓味赋予效果活性的时间同步，从而风味得到增强。这种性质在其他具有高浓味赋予效果活性的γGlu肽中并未发现。
官能评价试验如下实施。将市售的一般的调味番茄酱溶解在热水中使得其为33.3重量％，配制成调味番茄酱溶液。针对该溶液，混合作为试样的γ-Glu-Nva、γ-Glu-Cys-Gly、或γ-Glu-Abu。根据成对比较检验法，对下述进行了比较评价：(1)0.0004重量%的γ-Glu-Nva与具有同等浓味赋予活性的0.02重量%的γ-Glu-Cys-Gly、(2)0.0004重量%的γ-Glu-Nva与同等量的0.0004重量%的γ-Glu-Abu、(3)0.0004重量%的γ-Glu-Nva与具有同等浓味赋予活性的0.003重量%的γ-Glu-Abu，并由评委判断何者为“在不改变调味番茄酱溶液的呈味和风味的平衡的条件下增强其呈味和风味，是优选的”。让累计具有一年以上食品调味开发的经验，能够判断出鲜味咸味溶液中添加的γ-Glu-Cys-Gly和γ-Glu-Val-Gly的效价之差为10倍左右的人(定期确认)作为评委。评价以n=9来实施。
将0.0004重量%的γ-Glu-Nva评价为“在不改变调味番茄酱溶液的呈味和风味的平衡的条件下增强其呈味和风味，是优选的”的评委数如表6所示。还确认对其它使用番茄的酱类等也具有效果，但仅示出了调味番茄酱的例子作为代表。
根据该结果可见，即使在如(1)和(3)所示的同等的浓味效价的条件下，γ-Glu-Nva也具有极为显著地增强调味番茄的呈味和风味的突出效果。
表6
N=9
*)在1%的显著水平，可以认为γ-Glu-Nva在不改变调味番茄酱溶液的呈味和风味的平衡的条件下增强其呈味和风味，是优选的
根据上述的结果可知，与具有同等的浓味赋予活性的浓度的γ-Glu-Cys-Gly、γ-Glu-Abu等具有高浓味赋予活性的γGlu肽相比，γ-Glu-Nva具有“在不改变使用番茄的调味料和酱等的番茄的呈味和风味的平衡的条件下增强其呈味和风味、是优选的”这样极为突出的效果。番茄广泛地用于调味料、汤、酱、烹调加工品等。因此，γ-Glu-Nva能够以更低的成本、微小的用量改善使用番茄的食品的呈味和风味，在产业上也是非常有利的。

Claims (19)

1.γ-Glu-Nva在浓味赋予剂中的用途。
2.一种食品组合物，其含有0.01ppm～1质量％的γ-Glu-Nva。
3.权利要求2所述的食品组合物，其中该食品组合物是低盐食品。
4.权利要求3所述的食品组合物，其中所述低盐食品食用时的食盐含量为0.01～0.5质量％。
5.权利要求2所述的食品组合物，其含有0.01～30重量ppm的γ-Glu-Nva、0.01～10重量％的唇形科的草本植物和/或香料类、以及其它食品原料。
6.权利要求2所述的食品组合物，其含有0.02～80重量ppm的γ-Glu-Nva、0.01～99.9重量％的味噌、以及其它食品原料。
7.权利要求2所述的食品组合物，其含有0.02～80重量ppm的γ-Glu-Nva、0.01～99.9重量％的番茄、以及其它食品原料。
8.一种饮食品或饮食品的中间产品的制造方法，其包括将包含γ-Glu-Nva的呈味增强剂添加混合至饮食品原料中的步骤，以及根据需要进一步烹调所得到的饮食品原料混合物的步骤。
9.权利要求8所述的饮食品或饮食品的中间产品的制造方法，其中，将包含γ-Glu-Nva的呈味增强剂添加混合至饮食品原料中的步骤包括使饮食品的中间产品的γ-Glu-Nva浓度为0.005～600000重量ppm的步骤。
10.权利要求9所述的饮食品或饮食品的中间产品的制造方法，其包含使饮食品的中间产品的γ-Glu-Nva浓度为0.1～100000重量ppm的步骤。
11.权利要求9所述的饮食品的制造方法，其进一步包括将饮食品的中间产品添加至其它饮食品原料中而使所获得的饮食品的γ-Glu-Nva浓度为0.005～30重量ppm的步骤。
12.权利要求11所述的饮食品的制造方法，其中，所获得的饮食品的γ-Glu-Nva浓度为0.05～10重量ppm。
13.权利要求9所述的饮食品的制造方法，其中，将包含γ-Glu-Nva的呈味增强剂添加混合至饮食品原料中的步骤包括使饮食品的γ-Glu-Nva浓度为0.005～30重量ppm的步骤。
14.权利要求8～13中任一项所述的饮食品的制造方法，其中，饮食品为含有唇形科草本植物和/或香料的食品。
15.权利要求8～13中任一项所述的饮食品的制造方法，其中，饮食品为含有味噌的食品。
16.权利要求8～13中任一项所述的饮食品的制造方法，其中，饮食品为含有番茄的食品。
17.通过权利要求8～16中任一项所述的方法获得的饮食品或饮食品的中间产品。
18.一种增强饮食品呈味的方法，其包括将含有γ-Glu-Nva的组合物添加至饮食品中的步骤。
19.权利要求18所述的方法，其中增强呈味是赋予浓味。
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