CN102743421A

CN102743421A - 神秘果果树枝叶提取物及其提取方法和应用

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Publication number: CN102743421A
Application number: CN2012102412134A
Authority: CN
Inventors: 赵谋明; 万福群
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-07-12
Filing date: 2012-07-12
Publication date: 2012-10-24

Abstract

本发明涉及一种神秘果果树枝叶提取物的提取方法，包括将神秘果枝叶粉碎，得提取原料；加入乙醇水溶液，回流提取2～5小时，过滤，上清夜减压蒸馏，冷冻干燥，得枝叶粗提取物干粉溶于水中，经大孔吸附树脂处理，然后用乙醇水溶液洗脱，得到收集液分别进行真空浓缩，冷冻干燥得精制枝叶提取物；得到的提取物含总酚66.5％，枝提取物含总酚84.1％。对于DPPH·清除能力是谷胱甘肽的7.9和7.8倍；对于氧自由基吸收能力是谷胱甘肽的7.0和6.2倍；具有良好的黄嘌呤氧化酶抑制活性；可用于制备抗氧化剂、抗痛风药物和保健品。

Description

神秘果果树枝叶提取物及其提取方法和应用

技术领域

本发明涉及提取技术，具体是神秘果果树枝叶提取物及其提取方法；本发明还涉及所述提取物在制备抗氧化剂和抗痛风药物中的应用。

背景技术

神秘果(Synsepalum dulcificum Denill)原产西非加纳刚果一带，属热带常绿灌木，原产于西非热带地区。20世纪60年代引入我国海南、云南、广西等热带亚热带地区种植。神秘果之英文名为Mysterious Fruit(神秘水果)或Miracle Fruit(不可思议的水果)，神秘果之神奇在于要将食之奇酸无比的水果转化成甘甜如饴的果实，神秘果应可能提供制成酸性食品的助食剂，或制成可满足糖尿病患者需要甜味的变味剂。此外，从神秘果枝、叶中分离出具有良好抗氧化活性的酚酸类化合物。

痛风是由于嘌呤代谢紊乱，导致血尿酸增高，和/或肾脏排泄尿酸减少，从而引起尿酸盐在组织沉积的疾病，其自然病程分为无症状高尿酸血症、急性痛风性关节炎、间歇期痛风、慢性痛风石性痛风四个阶段，偶尔也会出现痛风性肾病。尿酸盐沉积是痛风的特征性病理改变，也是急性痛风性关节炎的诊断依据。高尿酸血症可能是癌症发生的早期征兆。严重的痛风会引起与健康相关的生活质量的下降甚至残疾，痛风发作次数越多，受累关节越多，这种情况越严重。目前采用的降尿酸药物包括别嘌呤醇、丙磺舒、苯溴马隆、苯磺唑酮等。其中别嘌呤醇是通过抑制黄嘌呤氧化酶活性来减少尿酸产生，其副作用包括皮疹、胃肠副作用、头痛、风疹和间歇性肾炎，其最大副作用是与发烧、骨髓抑制、肝脏毒性、肾衰竭和系统性超敏血管炎等有关的超敏症状。其他药物也有类似的对健康不利的副作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种神秘果果树枝叶提取物。

本发明的目的还在于提供所述提取物的提取方法。

本发明的目的还在于提供所述提取物在制备抗氧化剂中的应用。

本发明的目的还在于提供所述提取物在制备抗痛风药物中的应用。

本发明的神秘果果树枝叶提取物的提取方法，包括如下步骤：

(1)神秘果枝叶粉碎，得提取原料；

(2)在提取原料中加入乙醇水溶液，回流提取2～5小时，过滤，上清夜减压蒸馏，冷冻干燥，得枝叶粗提取物干粉；该提取物干粉脱除了蛋白质、糖类、有机酸类等杂质；

其中采用乙醇水溶液进行回流处理，可选择性地提取具有抗氧化性且具有抑制黄嘌呤氧化酶活性的酚酸类化合物；

(3)取步骤(2)所得的干粉溶于水中，经大孔吸附树脂柱处理，然后乙醇水溶液洗脱，分离富集得到总酚含量较高的收集液；

(4)将收集液分别进行真空浓缩，至原来体积的1/7～1/3，得浓缩液，冷冻干燥得精制枝叶提取物。

优选方案如下：步骤(1)中，神秘果枝叶粉碎后过20～80目筛，得到提取原料。

步骤(2)所述乙醇水溶液的浓度为50％～90％体积。

步骤(3)中，采用浓度为10％～90％体积的乙醇水溶液洗脱，所述洗脱液用量为柱床体积的3～6倍；所述大孔吸附树脂为HP-20大孔吸附树脂。

步骤(4)中，冷冻干燥时间为20小时，得到的神秘果果树枝叶提取物呈浅红色。采取冷冻干燥，可避免提取物因高温发生氧化而损失活性。

经检测，得到的得到的神秘果果树枝叶提取物主要成分为酚酸类化合物。

得到的神秘果果树枝叶提取物，对于DPPH·清除能力较强(IC₅₀分别为7.92和8.0μg/mL)，是谷胱甘肽的7.9和7.8倍；对于氧自由基吸收能力也很强(ORAC值分别为9425.9和8383.5Troloxμmol/g)，是谷胱甘肽的7.0和6.2倍；具有显著的黄嘌呤氧化酶抑制活性。可用常规的方法将神秘果果树枝叶提取物用于制备抗氧化剂和抗痛风药物以及预防痛风的药物和保健品等，可以是片剂、冲剂、针剂、胶囊等。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1、本发明方法采用不同浓度的乙醇回流选择性提取出酚酸类化合物，先脱除蛋白质、糖类、有机酸类等杂质，然后采用大孔吸附树脂富集酚酸类化合物，得到的叶提取物总酚含量达到66.5％，枝提取物总酚含量达到84.1％。

2、本发明方法得到的枝叶提取物对于DPPH·清除能力较强(IC₅₀分别为7.92和8.0μg/mL)，是谷胱甘肽的7.9和7.8倍；对于氧自由基吸收能力也很强(ORAC值分别为9425.9和8383.5Troloxμmol/g)，是谷胱甘肽的7.0和6.2倍；具有显著的黄嘌呤氧化酶抑制活性。

3、本发明的植物资源丰富，提取得率高，安全无毒，可加工成天然抗氧化剂，或抗痛风药物或保健食品。

附图说明

图1是本发明方法步骤(1)(2)得到的粉末制成5mg/mL水溶液(实施例1)抑制黄嘌呤氧化酶活性的柱状图。

图2是本发明方法得到的神秘果枝叶提取物制成5mg/mL水溶液(实施例2)抑制黄嘌呤氧化酶活性的柱状图。

图3是本发明方法得到的神秘果枝叶提取物抑制黄嘌呤氧化酶活性曲线图。

具体实施方式

实施例1

步骤(1)神秘果枝、叶分别粉碎，得提取原料，各分4等份；

步骤(2)取神秘果枝、叶提取原料分别加入50％、70％、0％、90％乙醇，回流时间分别为5小时，减压蒸馏，冻干分别得八种粉末。

常规方法测定上述粉末成分及其提取率和含量，测定方法如F：

标准曲线的绘制：称取120℃干燥恒重没食子酸9.4mg，蒸馏水定容至100ml。分别精密量取没食子酸溶液0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.4ml，0.5ml，0.6ml，0.7ml，0.8ml置10ml容量瓶中，加水至约6ml，摇匀，各加Folin-Ciocalteu试剂0.5ml，摇匀，在1～8min内加20％碳酸钠溶液1.5ml，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，40℃水浴保温2小时，迅速冷却，立即在760nm(总酚)测定吸光度，绘制标准曲线。

提取物总酚含量测定：按照标准曲线绘制方法，对上述粉末分别测定，结果如表1所示。

表1

表1可见，采用上述四种浓度乙醇提取均有较高的提取率。对叶的提取率高于对枝的提取率。提取物中以50％、70％、90％乙醇回流得到的组分中总酚含量最高。

抗氧化性、黄嘌呤氧化酶抑制活性测定

采用电子转移法(DPPH·清除能力)和H质子转移法(氧自由基吸收能力(ORAC))两种通用方法评价上述粉末的抗氧化能力，结果见表2。

表2

如表2所示，神秘果枝叶粉末DPPH·清除能力与氧自由基吸收能力(ORAC)具有较强的正相关性。神秘果枝叶粉末具有较强的抗氧化活性。以乙醇水溶液回流提取物抗氧化性最强，其抗氧化性超过谷胱甘肽。神秘果枝叶乙醇回流得到的粉末具有一定的黄嘌呤氧化酶抑制活性。

高尿酸血症和痛风患者体内氧化应激水平增加，氧化损伤严重。因此，对高尿酸血症和痛风患者来说，抑制黄嘌呤氧化酶活性、防止自由基形成、避免尿酸过量产生是非常重要的。图1是本实施例得到的粉末的抑制黄嘌呤氧化酶活性柱状图。图1显示，各粉末配制成5mg/mL水溶液时，具有一定的黄嘌呤氧化酶抑制活性，其中以70％乙醇提取物粉末的活性最好，其黄嘌呤氧化酶抑制活性超过20％，而0％乙醇提取物粉末的5mg/mL水溶液未显示出黄嘌呤氧化酶抑制活性。

实施例2

步骤(3)取实施例1步骤(2)所得的70％乙醇提取物粉末溶于水中，经HP-20大孔吸附树脂处理，然后分别采用浓度为0％、10％、30％、50％、70％、90％体积的乙醇水溶液洗脱，所述洗脱液用量分别为柱床体积的4、3、4、5、4、6倍，得到收集液；

步骤(4)将收集液分别进行真空浓缩至原来体积的1/7、1/6、1/5、1/4、1/3、1/3，得浓缩液，冷冻干燥20小时得精制枝叶提取物干粉。

测定枝叶提取物干粉回收率、总酚回收率，方法同实施例1，结果如表3所示。

表3

表3显示，经大孔树脂分离，神秘果枝叶提取物干粉与总酚的回收率较高，特别是酚酸类化合物，发明人经过创造性劳动探索出大孔树脂能高效地分离纯化神秘果枝叶中的酚类物质。

抗氧化性、黄嘌呤氧化酶抑制活性评价

神秘果枝叶提取物干粉的抑制黄嘌呤氧化酶活性如图2所示。黄嘌呤氧化酶抑制活性试验结果表明，10％，30％和50％乙醇水溶液处理得到的提取物干粉具有较高的黄嘌呤氧化酶抑制活性。30％乙醇水溶液处理得到的提取物干粉活性最高，其对黄嘌呤氧化酶抑制活性达80％以上。

采用电子转移法(DPPH·清除能力)和H质子转移法(氧自由基吸收能力(ORAC))两种通用方法评价神秘果枝叶提取物干粉的抗氧化性，结果见表4。

表4

如表4所示，神秘果枝叶提取物干粉都具有抗氧化性，以30％乙醇水溶液处理得到的干粉总酚含量、黄嘌呤氧化酶抑制活性、抗氧化活性最高。

实施例3

将实施例2得到的30％乙醇水溶液处理得到的神秘果枝叶提取物干粉用于测定其不同水溶液浓度下的黄嘌呤氧化酶抑制活性，结果如图3所示，在较低浓度下(0.5mg/mL水溶液)，提取物干粉溶液的活性较低(不超过40％)。随着浓度的增加，从0.5到5mg/mL，干粉溶液对黄嘌呤氧化酶抑制活性不断增加。在较高浓度下(5mg/mL)，提取物干粉溶液的黄嘌呤氧化酶抑制活性可以超过80％。

实施例4采用实施例2得到的神秘果枝叶提取物制成颗粒物冲剂进行小白鼠临床试验，毒性试验

(1)对次黄嘌呤致高尿酸血症小鼠血清尿酸的影响

选取体重约20g昆明种小鼠90只，雌雄各半，随机分为九组，每组10只，即对照组、模型组、阳性药别嘌呤醇(50mg/kg)组、神秘果枝叶提取物冲剂高、中和低剂量(6g/kg、3g/kg、1g/kg)组。灌胃给药，1次/天，对照组和模型组灌胃给予等容量蒸馏水连续10天。末次给药1h后腹腔注射次黄嘌呤10mg/kg，1h后眼球取血，3000r/min离心10min，取上清液测血清尿酸含量。

与对照组比较，模型组小鼠血清尿酸含量明显升高，说明造模成功。与模型组比较，神秘果枝叶提取物冲剂高剂量组能显著降低小鼠血清尿酸含量，表明神秘果枝叶提取物对次黄嘌呤致高尿酸血症小鼠血清尿酸有降低作用，见表5。

表5

(2)急性毒性实验

选取健康成年小鼠60只，观察6天，然后随机分为两组：对照组(给予等体积的蒸馏水)和神秘果枝叶提取物冲剂组，每组20只，雌雄各半。灌胃给予最大浓度、最大体积(20mL/kg)实施例2得到的神秘果枝叶提取物冲剂，相当于60g神秘果枝叶提取物冲剂/kg，然后观察14天。观察小鼠的饮食情况、体重、毒性症状(包括外观行为、分泌物、排泌物等)和死亡情况，14天后处死小鼠，解剖小鼠观察主要器官的状态。

14天内所有小鼠无死亡发生，饮食、外观、行为、分泌物、排泌物均无异常，对小鼠体重的正常增长无显著影响。14天后处死小鼠，与对照组比较，神秘果枝叶提取物冲剂组小鼠心、肝、肺等主要脏器大小颜色质地均无异常，可见神秘果枝叶提取物冲剂的使用是安全可靠的。

Claims

1.一种神秘果果树枝叶提取物的提取方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)神秘果枝叶粉碎，得提取原料；

(2)在提取原料中加入乙醇水溶液，回流提取2～5小时，过滤，上清夜减压蒸馏，冷冻干燥，得枝叶粗提取物干粉；

(3)取步骤(2)所得的干粉溶于水中，经大孔吸附树脂处理，然后用乙醇水溶液洗脱，得到收集液；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，神秘果枝叶粉碎后过20～80目筛，得到提取原料。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(2)所述乙醇水溶液的浓度为50％～90％体积。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(3)中，采用浓度为10～90％体积的乙醇水溶液洗脱，所述洗脱液用量为柱床体积的3～6倍；所述大孔吸附树脂为HP-20大孔吸附树脂。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(4)中，冷冻干燥时间为20小时。

6.权利要求1～5之一所述方法得到的神秘果果树枝叶提取物。

7.权利要求6所述神秘果果树枝叶提取物在制备抗氧化剂中的应用。

8.权利要求6所述神秘果果树枝叶提取物在制备抗痛风药物中的应用。