CN102742508A - 一种利用组培袋模拟生态进行植物组织培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种利用组培袋模拟生态植物组织培养的方法。利用耐高温材料制成耐高温透明无毒的组培袋，装入一定量的植物组织培养基水溶液及适合于栽种试管苗的生态培养基支撑物，经过高温高压灭菌，在无菌条件下模拟植物生长外环境，从而进行植物组织培养的规模化生产。本发明减去了支付洗瓶人工费、水费、电费等及高利用率的高压灭菌的装锅数量，高效率的无菌接种生产速度和培养室空间的高利用率，组培苗的运输、炼苗等都降低了成本，使组培工厂化规模化的生产及实验室的研究更加方便、简单、快捷，易监督、易管理。

Description

一种利用组培袋模拟生态进行植物组织培养的方法

技术领域

本发明涉及模拟植物生长外环境进行植物组织培养，具体是一种利用自粘组培袋拟生态进行植物组织培养的方法。

背景技术

植物组织培养规模化生产中多采用在无菌条件下，将离体植物器官（根、茎、叶、花、果实等）、组织（形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞）以及原生体，培养在人工配置的培养基上，进行脱出病毒、快速繁殖和保存种质资源。由于植物细胞具有全能性，在植物组织培养中，离体的组织和细胞接种到培养容器内培养获得的小植株叫试管苗。采用植物组织培养方法可以使试管苗具有很高的繁殖速度。植物组织培养技术是当前生物工程中应用最广泛，最有效的技术和方法，在园林、农林、药用植物种植生产得到广泛的应用。试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照和温度近100%的相对湿度环境条件下生长的，因此，在生理、形态等方面都与自然条件生长的小苗有着很大的差异。所以必须通过炼苗，例如通过控水、减肥、增光、降温等措施，使它们逐渐地适应外界环境，从而使生理、形态、组织上发生相应的变化，使之更适合于自然环境，只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功。从叶片上看，试管苗的角质层不发达，叶片通常没有表皮毛，或仅有较少表皮毛，甚至叶片上出现了大量的气孔，而且，气孔的数量、大小也往往超过普通苗。由此可知，试管苗更适合于高湿的环境生长，当将它们移栽到试管外环境时，试管苗失水率会很高，非常容易死亡。因此，为了改善试管苗的上述不良生理、形态特点，则必须经过与外界相适应的驯化处理。植物组织培养的培养基（液体培养基、固体培养基），由细胞生长发育所必需的各种无机盐（大量元素、微量元素等）、有机营养物（氨基酸、糖类等）、生物活性物质（维生素类等）、植物生长调节物质（细胞生长素、细胞分裂素等）、天然提取物（椰子乳、酵母提取物等）和水等所组成。也可在培养基中加入琼脂等使之成为凝胶态的固体培养基。配制好的培养基需经过热压消毒方可使用。植物组织培养过程中可采用各种不同类型的容器来进行植物组织培养。一般的组培工厂及实验室中玻璃培养瓶是广泛应用的容器，各种大小的试管、广口瓶、牛奶瓶、罐头瓶等均可在生产中利用：但在组培中只应使用硼硅酸盐玻璃容器，钠玻璃对某些植物材料组织可能是有毒的，重复使用更加明显。目前在很多组培工厂及实验室内，玻璃培养容器和制备培养基所需的其它玻璃器皿都已被塑料器皿取代，有些塑料容器可以进行高温灭菌，有些塑料容器（特别是用于原生质体、细胞培养的容器）在出厂时即是有菌的，这种一次性消耗在国外已得到普遍应用，在国内也有生产应用。在培养、生产中，使用罐头瓶并用塑料薄膜或塑料盖封口以橡皮圈或棉线箍扎虽是一种经济有效可重复使用的方法，但这种封口方法费时费事，不利于提高效率规模化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一套方便、快捷、高效率、低成本、规模化的利用组培袋模拟生态植物组织培养的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案是利用组培袋培养容器【聚丙烯、BOPP光膜等耐高温材料生产而成，替代玻璃瓶、塑料瓶、试管等组培容器，装入一定量的植物组织培养的培养基水溶液及适合于栽种试管苗的拟生态培养基支撑物：（蛭石、珍珠岩、松毛、陶化营养土、腐殖土、枯枝落叶、木屑、山沙、琼脂等），经过高温高压灭菌，在无菌条件下模拟植物生长外环境以降低试管苗在自然环境中的死亡率为目的，从而高效低成本的进行植物组织培养的规模化生产。

具体通过以下步骤实现：利用耐高温材料制成耐高温透明无毒的组培袋，装入一定量的植物组织培养基水溶液及适合于栽种试管苗的生态培养基支撑物，经过高温高压灭菌，在无菌条件下模拟植物生长外环境，从而进行植物组织培养的规模化生产，具体步骤如下：

1）组培袋为类似信封的矩形，长：10～70cm、宽5～50cm、长口贴有自粘胶条，长口与短口的距离为1～5cm，具体大小可按不同植物组织培养的需要进行可大可小、可长可短的调整；

2）在组培袋内装入培养基水溶液与生态培养基支撑物，所述的生态培养基支撑物为蛭石、珍珠岩、松毛、陶化营养土、腐殖土、枯枝落叶、木屑、山沙、琼脂中的一种，控制温度在119~125℃的条件下灭菌30~50分钟，然后无菌接种，进行无菌条件下的植物组织培养至得到试管苗；

3）在试管苗移栽到大棚等外环境条件下时，破开组培袋一部分进行带袋移栽，保留组培袋内的全部或部分培养基水溶液及拟生态培养基支撑物，或取袋移栽或直接种植试管苗。

在植物组织培养时，可根据需要在组培袋中加入适合植物生长的伴生植物苔藓等。

在进行培养基MS装入时，应掌握好培养基水溶液与拟生态培养基支撑物（固体基质）的比例，一般以拟生态培养基支撑物潮湿不漂浮为佳（不同植物组织可进行适当调整）。

装好培养基MS组培袋进行装锅时使组培袋尽量直立，袋子与袋子之间尽量不要叠落在一起，每锅装袋数量应控制在同等条件下玻璃瓶的4~8倍之间，不宜过份装多以免出现培养基溢出。

利用组培袋拟生态植物组织培养进行无菌接种操作与传统的玻璃瓶操作类似，接种植物组织时可根据须要确定是丢投或是扦插植物组织，也可分为留母袋或是与不留母袋：留母袋时，剪刀、镊子等一些操作工具应尽量选择长度相对适合袋子规格的，并在操作中避免出现碰到袋子长口（贴有自粘胶条），在无菌接种完毕后将母袋袋口顶部下折1~3圈，再用经过高温灭菌可重复使用的金属夹子夹住折口（子袋也是一样）。不留母袋时，应备用一把不经消毒的剪刀进行剪袋（沿袋子左侧或右侧边缘约0.2~0.5cm处由下往上全部剪开，并沿自粘组培袋底部边线一分为二用手撕开），剪袋时需避免碰到袋内植物组织，袋子外部两个面（外侧面）平放在无菌工作台桌面上，将袋子内部两个面（内侧面）当作无菌纸在其上进行无菌接种操作。组培袋拟生态植物组织培养每人每天（8小时/天）人均无菌接种速度远高于玻璃瓶。在同等条件下每人每天人均接种自粘组培袋拟生态植物组织方法是玻璃瓶（传统方式）的2~4倍。

无菌接种完毕后，采取挂袋的方式进行上架培养更节约培养室空间及成本。在培养架各层支架间拉上金属线或其他材料（塑料线等），以每夹2袋为例：以2袋间的空隙挂到金属线或其他材料（塑料线等）线上，这种挂袋上架方式远快于传统方式并在很大程度上的节约了培养室空间及培养架成本。在同等条件下自粘组培袋拟生态植物组织培养节约的培养室空间是玻璃瓶培养的4~6倍，培养架放置植物组织节约的成本是玻璃瓶的3~5倍。

若需要还可在组培袋中加入（灭菌前）适合植物生长的伴生植物（苔藓等），模拟出一个符合植物特性、适合植物生长的环境，进行无需驯化、炼苗、移栽的无菌操作及培养过程，直接在组培实验室或规模化组培工厂车间中形成商品产生经济效益。

本发明是利用组培袋达到模拟植物生长外环境进行植物组织培养，以组培袋替代传统容器（玻璃瓶等），以适合于栽种试管苗的各类基质模拟植物生长外环境替代（或不替代）高成本胶状培养基（琼脂等），加上同固体培养基一起栽种组织苗，均衡植物所需要的营养既环保又不浪费基质，还在传统无菌接种操作的基础上采取投苗方式接种等进行植物组织培养的创新。相对于传统玻璃瓶等容器的重复使用的高污染率、移栽成活率低等而言，本发明采取模拟植物生长外环境进行植物组织培养，所产生的组培苗无需驯化、假植（炼苗）等，在组培苗移栽时还能将拟生态植物组织的培养基水溶液及支撑物全部与组培苗同时移栽下地，无需清洗组培苗基部及丢失任何营养物质（培养基水溶液及支撑物），达到植物组织培养与组培苗移栽过程一体化。其在利用自粘组培袋进行植物组织培养接种污染率平均数为1%以下，在携代营养物质移栽组培苗成活率平均数为98%以上。虽然自粘组培袋相对于玻璃瓶等是一次性使用显得成本高，但实际上减去了支付洗瓶人工费、水费、电费等及高利用率的高压灭菌的装锅数量，高效率的无菌接种生产速度和培养室空间的高利用率，以及在组培苗的运输、炼苗等成本都得到了降低，在规模化生产条件下成本远低于传统技术的5—10倍，使组培工厂化规模化的生产及实验室的研究更加方便、简单、快捷，易监督、易管理、低成本、高效益。

具体实施方式

组培袋的制备：利用耐高温材料聚丙烯、或BOPP光膜制成耐高温透明无毒的组培袋，组培袋的规格为：类似信封的矩形组培袋长：10~70cm、宽5~50cm、长口贴有自粘胶条，与短口的距离为1~5cm。装入一定量的植物组织培养基MS培养基水溶液（每升MS水溶液含有：40倍母液的25ml大量元素、200倍母液的5 ml铁盐、1000倍母液的1ml微量元素、200倍母液的5ml有机物）和生态培养基支撑物、食用白糖10-50g/L；培养基水溶液与生态培养基支撑物固体基质的比例以生态培养基支撑物潮湿不漂浮为佳；将贴有自粘胶条的袋子顶部向下折1~2厘米，待冷却后方可进行无菌接种；

实施例1：

马铃薯的组培袋模拟生态进行植物组织培养方法按以下方法进行：

先将已经过高低、温处理的马铃薯外植体自来水冲洗3—5分钟，并按规格取健康顶芽部分，在无菌条件下用0.1%升汞浸泡10—25分钟，随即用无菌水冲洗2—3次，每次时间大约3—5分钟，冲洗后的马铃薯外植体芽放入以上所述的装有MS培养基 [每升MS水溶液含有：25ml大量元素（40倍母液）、5ml铁盐（200倍母液）、1ml微量元素（1000倍母液）、5ml有机物（200倍母液）]的组培袋中，在PH5.8、温度20℃以上、25℃以下、光照充足的环境中采取挂袋的方式培养10~15天（在培养架各层支架间拉上金属线或其他线材，以2袋间的空隙挂到金属线或其他线材上进行植物组织培养）即可通过解剖镜进行茎尖剥离、组织培养、病毒检测、组织培养继代扩繁健康组培苗，可选用珍珠岩粉作培养基支撑物，当健康组培苗生长到可1袋（苗高5~7cm）转接3袋或更多的时候，即可进行组培苗继代扩繁，每隔18~25天继代一次，增值系数为1:3~1:6。继代培养过程中的温度为20℃以上、25℃以下、光照充足并配备一定数量的日光灯以保证夜间光照。在继代操作中组培苗污染率为1%以下，人均每天工作8小时接苗（袋：每袋15~20苗）数为400~600袋。

此方法与传统组培相比较，因选用珍珠岩代替了琼脂作为培养基支撑物，并且自粘组培袋拥有良好透光性等物理特性，从而模拟出一个适合马铃薯试管苗生长的外环境，既降低了成本又无须进行传统的试管苗驯化炼苗过程。用自粘组培袋进行拟生态（珍珠岩粉）组培马铃薯试管苗，代替了玻璃瓶等传统组培容器及传统的培养基支撑物（琼脂粉），提高了高压锅等设备利用率及人工效率，避免了洗瓶等重复利用所带来的成本及二次污染，在无菌接种过程中因所有操作均简化，也提高了组培苗在外环境中的成活率及人工效率，更适合进行低成本规模化生产。

实施例2：

花卉的组培袋模拟生态进行植物组织培养方法按以下方法进行：

与实施例1不同的是，例如在进行非洲菊组织培养，需在MS中每升添加植物生长调节物质0.1--1.0ml[BA（1g/L）]与0.01--0.5ml[NAA（1g/L）]和白糖（20--30g/L）并根据选择种植方式的不同在自粘组培袋中加入不同的培养基支撑物如：蛭石、陶化营养土、腐殖土、琼脂粉等中的一种。其无菌接种方式与传统方式类似，但由于自粘组培袋的特性，在组培苗移栽到大棚等条件时,可选择破袋带袋移栽，也可选择取袋无需驯化炼苗直接带袋种植单株或多株移栽。

实施例3：

块根、块茎和球茎的组培袋模拟生态进行植物组织培养方法按以下方法进行：

与实施例1不同的是，在进行魔芋块茎操作时需进行温度在20℃的适当遮阴处理，在实施例1培养基的基础上，并根据选择种植方式的不同在自粘组培袋中加入培养基支撑物如: 陶化营养土、腐殖土、珍珠岩粉、琼脂粉等中的一种，在MS培养基中加入植物生长调节物质0.3~2.5ml[BA（1g/L）]与0.01~0.5ml[NAA（1g/L）]。其无菌接种方式与传统方式类似。因组培袋的使用一次性及大小规格的多样性，在进行块根、块茎和球茎的组培操作时，可按比例适当增加植物组织的体形，尽量保证为长条形，这样在植物组织产生愈伤组织后在不用打开自粘组培袋的情况下，根据情况用手将长条状的植物组织掰断进行隔袋操作，无须继代转接，防止污染、减少程序、达到一次成苗之效果。

实施例4：

药材的组培袋模拟生态进行植物组织培养方法按以下方法进行：

与实施例1、2、3不同的是，在进行石斛组织培养时，在实施例1培养基的基础上，根据选择种植方式的不同在自粘组培袋中加入不同的培养基支撑物如: 蛭石、珍珠岩、松毛、陶化营养土、腐殖土、枯枝落叶、木屑、山沙、琼脂等中的一种，并每升添加植物生长调节物质1.0－3.0ml[BA（1g/L）]与0.01－1.0ml[NAA（1g/L）]，腐殖土在与培养基高压灭菌前，需先高温灭菌4~6小时。其无菌接种方式与传统方式类似。

Claims (2)

1.一种利用组培袋拟生态植物组织培养的方法，其特征是：利用耐高温材料制成耐高温透明无毒的组培袋，装入一定量的植物组织培养基水溶液及适合于栽种试管苗的生态培养基支撑物，经过高温高压灭菌，在无菌条件下模拟植物生长外环境，从而进行植物组织培养的规模化生产，具体步骤如下：

1）组培袋为类似信封的矩形，长：10～70cm、宽5～50cm、长口贴有自粘胶条，长口与短口的距离为1～5cm； 

2）在组培袋内装入培养基水溶液与生态培养基支撑物，所述的生态培养基支撑物为蛭石、珍珠岩、松毛、陶化营养土、腐殖土、枯枝落叶、木屑、山沙、琼脂中的一种，然后无菌接种，进行无菌条件下的植物组织培养至得到试管苗；

3）在试管苗移栽到大棚等外环境条件下时，破开组培袋一部分进行带袋移栽，保留组培袋内的全部或部分培养基水溶液及拟生态培养基支撑物，或取袋移栽或直接种植试管苗。

2.根据权利要求1所述的利用组培袋拟生态植物组织培养的方法，其特征是：在植物组织培养时，在组培袋中加入适合植物生长的伴生植物苔藓。