CN102727536B - 一种水杉皮提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水杉皮提取物及其制备方法和用途，其制备包括：（1）将水杉树皮粉末在提取剂中于25℃至回流温度提取2小时～24小时，滤除残渣，得到提取液；（2）将提取液冷却后过滤，滤液浓缩得到一次浓缩液；（3）将一次浓缩液经乙酸乙酯萃取，石油醚或氯仿脱脂和干燥，得到水杉皮提取物；或者，将一次浓缩液经大孔吸附树脂柱层析，收集洗脱液经浓缩和干燥，得到水杉皮提取物；该方法操作简单、成本低，无需特殊的设备，适于工业化生产。该水杉皮提取物含有较丰富的原花色素以及多酚类成分，具有很强的自由基清除作用和抗氧化能力、酪氨酸酶抑制作用、α-葡萄糖苷酶抑制作用和心血管保护作用。

Description

一种水杉皮提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及中药领域，具体涉及一种水杉皮提取物及其制备方法和用途。

背景技术

水杉（Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng）为杉科水杉属植物，为单种属植物，是我国特有的孑遗物种，被称为“活化石”。水杉的化石发现其在中生代白垩纪和新生代广泛分布于北半球，但在第四世纪冰期以后，水杉属的其它种类全部灭绝。在20世纪40年代中期中国的植物学家在湖北、四川及湖南三省交界的局部地区发现水杉。水杉的栽培、繁殖技术成熟使得水杉成为国内主要的园林绿化树种，并在国外约50个国家和地区引种栽培。

据《中国中药资源志要》记载，水杉具有“祛风燥湿，括血止痛”之功效，叶、果实有清热解毒、消炎止痛的功效。水杉叶的化学成分比较复杂，含有黄酮类、萜类（倍半萜、半日花型二萜、松香烷型二萜和三萜等）、木脂素类和甾醇等成分。水杉叶黄酮有高良姜素（5,6,7-Trihydroxyflavone）、橙皮苷（Hesperidin）、芹菜素（Apigenin）、芦丁-7葡萄糖苷（Luteolin-7-glucoside）、五羟黄酮（Tricetin-7-glucoside）、山萘酚-3-鼠李糖苷（Kampferol-3-rhamnoside）、杨梅树皮素-3-鼠李糖苷（Myricetin-3-rhamnoside）、扁柏双黄酮（Hinokiflavon）、异柳杉双黄酮（Isocryptomerin）、阿曼托黄酮（Amentoflavon）、阿曼托黄酮-7",4"-二甲基醚（Amentoflavon-7",4"-dimethylather）、金松双黄酮（Sciadopitysin）、2,3-二羟基扁柏双黄酮（2,3-Dihydrohinokiflavon）、2,3-二羟基金松双黄酮（2,3-Dihydro sciadopitysin）等。水杉叶和种子中还有挥发油成分，以萜烯、倍半萜烯及其含氧衍生物为主要成分的油状液体，还存在二苯基甲烷等物质。

关于水杉药理作用研究主要是针对水杉叶中的总黄酮和挥发油的作用。水杉总黄酮具有较好的抗大鼠血小板聚集和改善血液流变性的作用、抗实验性心肌肥厚和心律失常的作用及对缺血再灌注损伤心肌具有保护作用，对胰岛素样生长因子1（IGF1）诱导的乳鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原的合成具有抑制作用，对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。水杉叶挥发油具有抗菌和抗氧化活性；如水杉叶甲醇提取物浓度为2mg/mL下对苹果腐烂病菌、葡萄白腐病菌和葡萄黑痘病菌的抑制率超过50%，对苹果腐烂病菌、棉花枯萎病菌、葡萄白腐病菌、葡萄黑痘病菌、瓜果腐霉菌、立枯丝核菌的EC50分别为:1.33mg/mL、4.809mg/mL、2.198mg/mL、1.765mg/mL、2.483mg/mL、5.456mg/mL（水杉叶甲醇提取物的农用抑菌活性研究，姜明凯等，《现代农业科技》，2007年10期）。而有关水杉树皮的研究未见报道。

发明内容

本发明提供了一种具有很强的自由基清除作用和抗氧化能力的水杉皮提取物。

本发明还提供了一种水杉皮提取物的制备方法，该方法操作简单、成本低，适于工业化生产。

本发明研究发现水杉树皮与文献报道的水杉叶化学成分有很大的差异，其主要含有儿茶素、表儿茶素、棓儿茶素、表棓儿茶素等原花色素单体及其聚合物，以及绿原酸等多酚酸类成分。原花色素，尤其是原花色素的低聚体（OPC），是一种强效的抗氧化剂和自由基清除剂，抗氧化能力是维生素E的50倍，是维生素C的20倍。经过多年的临床试验，世界各国研制出不少以原花色素为主要活性成分的医药产品，如法国海岸松提取物碧萝芷（Pycnogenol）、葡萄籽提取物等，它们是强力的抗氧化剂，具有延缓衰老、抗皱、抗过敏、抗辐射、防治心脑血管疾病等作用。

一种水杉皮提取物的制备方法，包括步骤：

（1）将水杉树皮粉末在提取剂中于25℃至回流温度提取2小时～24小时，滤除残渣，得到提取液；

所述的提取剂为水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种或两种以上的混合溶液；

（2）将步骤（1）中的提取液冷却后过滤，滤液浓缩，得到一次浓缩液；

（3）将步骤（2）中的一次浓缩液经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液经石油醚或氯仿脱脂和干燥，得到水杉皮提取物；

或者，将步骤（2）中的一次浓缩液经大孔吸附树脂柱层析，收集洗脱液经浓缩和干燥，得到水杉皮提取物。

步骤（1）中，水杉树皮粉末与提取剂的用量关系对于提取效果并没有显著的影响，因而不需进行严格限定。

为了达到更好的提取效果，优选：

步骤（1）中，所述的提取剂选用水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种或水与甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种的混合溶液，进一步优选质量百分浓度为50%～95%的乙醇水溶液。

步骤（1）中，所述的水杉树皮粉末的目数为20目～100目。

步骤（3）中，将步骤（2）中的一次浓缩液经乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液后干燥并浓缩，得到二次浓缩液，二次浓缩液经石油醚或氯仿脱脂和干燥，得到水杉皮提取物。

步骤（3）中，所述的大孔吸附树脂柱层析的洗脱液为甲醇、乙醇、丙酮、体积百分浓度为10%～95%的乙醇水溶液、体积百分浓度为10%～95%的丙酮水溶液或体积百分浓度为10%～95%的甲醇水溶液。

所述的水杉皮提取物中原花色素和总多酚含量高，具有很强的自由基清除作用和抗氧化能力，可用于制备抗氧化剂或自由基清除剂，该水杉皮提取物还对酪氨酸酶和α-葡萄糖苷酶均具有抑制作用，对心血管具有保护作用，可用于制备具有抗衰老、美容护肤和/或预防和治疗心血管疾病作用的药物或者制备具有抗衰老、美容护肤和/或预防和治疗心血管疾病作用的保健食品，还可以用于制备具有预防和治疗糖尿病作用的药物或者制备具有预防和治疗糖尿病作用的保健食品。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明水杉皮提取物含有较丰富的原花色素以及多酚酸类成分，具有很强的自由基清除作用和抗氧化能力，还对酪氨酸酶和α-葡萄糖苷酶均具有抑制作用，对心血管具有保护作用。

本发明水杉皮提取物的制备方法操作简单、成本低，无需特殊的设备，适于工业化生产。

附图说明

图1为水杉皮提取物清除DPPH自由基活性的清除率-浓度曲线；

图2为水杉皮提取物清除羟自由基活性的清除率-浓度曲线；

图3为水杉皮提取物清除超氧阴离子自由基活性的清除率-浓度曲线；

图4为水杉皮提取物对酪氨酸酶的抑制率-浓度曲线；

图5为水杉皮提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率-浓度曲线。

具体实施方式

实施例1

水杉皮提取物的制备

1kg水杉树皮粗粉（40目）以25kg水50℃提取5小时，滤除残渣，得到20L提取液，冷却到20℃，过滤。滤液于40℃减压浓缩至滤液总体积的1/5，得到一次浓缩液，以乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为一次浓缩液体积的1/2，合并乙酸乙酯萃取液用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩到乙酸乙酯萃取液总体积的1/5，得到二次浓缩液，在机械搅拌下倾入二次浓缩液三倍体积的石油醚（沸程60℃-90℃）中。静置沉淀，过滤，沉淀再以乙酸乙酯溶解，石油醚（沸程60℃-90℃）沉淀纯化，石油醚（沸程60℃-90℃）洗涤，于40℃以下减压干燥，得到水杉皮提取物，该水杉皮提取物样品名记作SSW。SSW的原花色素重量百分含量为35.6%，总多酚重量百分含量为48.3%。

实施例2

水杉皮提取物的制备

1kg水杉树皮粗粉（60目）以20kg质量百分浓度为70%的乙醇水溶液回流提取3小时，滤除残渣，得到20L提取液，冷却到30℃，过滤。滤液于40℃减压浓缩至无醇味，得到一次浓缩液，加水至4L使混悬，混悬液以乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为混悬液体积的1/2，合并乙酸乙酯萃取液用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩到乙酸乙酯萃取液总体积的1/5，得到二次浓缩液，在机械搅拌下倾入二次浓缩液三倍体积的石油醚（沸程60℃-90℃）中。静置沉淀，过滤，沉淀再以乙酸乙酯溶解，石油醚（沸程60℃-90℃）沉淀纯化，石油醚（沸程60℃-90℃）洗涤，于40℃以下减压干燥，得到水杉皮提取物，该水杉皮提取物样品名记作SSE1。SSE1的原花色素重量百分含量为44.9%，总多酚重量百分含量为59.2%。

实施例3

水杉皮提取物的制备

1kg水杉树皮粗粉（20目）以20kg质量百分浓度为95%的乙醇水溶液回流提取2小时，滤除残渣，得到20L提取液，冷却到25℃，过滤。滤液于40℃减压浓缩至无醇味，得到一次浓缩液，加水至4L使混悬，混悬液以乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为混悬液体积的1/2，合并乙酸乙酯萃取液用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩到乙酸乙酯萃取液总体积的1/5，得到二次浓缩液，在机械搅拌下倾入二次浓缩液三倍体积的石油醚（沸程60℃-90℃）中。静置沉淀，过滤，沉淀再以乙酸乙酯溶解，石油醚（沸程60℃-90℃）沉淀纯化，石油醚（沸程60℃-90℃）洗涤，于40℃以下减压干燥，得到水杉皮提取物，该水杉皮提取物样品名记作SSE2。SSE2的原花色素重量百分含量为46.1%，总多酚重量百分含量为41.7%。

实施例4

水杉皮提取物的制备

1kg水杉树皮粗粉（80目）以20kg质量百分浓度为70%的乙醇水溶液于25℃提取6小时，滤除残渣，得到20L提取液，冷却到28℃，过滤，滤液于40℃以下减压浓缩至无醇味，得到一次浓缩液。一次浓缩液上D101型大孔吸附树脂柱层析，先以3倍柱体积的水洗去杂质，再用体积百分浓度为60%的乙醇水溶液进行洗脱，直至薄层层析鉴别无明显斑点。收集洗脱液，于40℃减压浓缩至无醇味，冷冻干燥，得到水杉皮提取物，该水杉皮提取物样品名记作SSE3。SSE3的原花色素重量百分含量为62.8%，总多酚重量百分含量为65.7%。

实施例5

水杉皮提取物的制备

1kg水杉树皮粗粉（100目）以20kg质量百分浓度为70%的乙醇水溶液于25℃提取8小时，滤除残渣，得到20L提取液，冷却到22℃，过滤，滤液于40℃以下减压浓缩至无醇味，得到一次浓缩液。一次浓缩液上AB-8型大孔吸附树脂柱层析，先以3倍柱体积的水洗去杂质，再用体积百分浓度为60%的乙醇水溶液进行洗脱，直至薄层层析鉴别无明显斑点。收集洗脱液，于40℃减压浓缩至无醇味，冷冻干燥，得到水杉皮提取物，该水杉皮提取物样品名记作SSE4。SSE4的原花色素重量百分含量为63.7%，总多酚重量百分含量为67.2%。

实施例6

水杉皮提取物的自由基清除作用

与机体老化相关的疾病及基因的突变，都与自由基的损伤有关，因此保持机体足够的抗氧化物质，及时清除自由基，是抗衰老的重要手段。

1.1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除活性测定：

于96孔培养板中，加入0.5mM（mmol/L）的DPPH无水乙醇溶液100μL和供试样品溶液（溶剂为质量百分浓度为2%的二甲基亚砜(DMSO)的水溶液）100μL，振摇后避光40℃反应30min，反应后以酶标仪于492nm测定吸光度A，作为供试样品组；同时设空白溶剂组（100μL无水乙醇和100μL质量百分浓度为2%的DMSO的水溶液的混合液，其余同供试样品组）、对照组（100μL DPPH无水乙醇溶液和100μL质量百分浓度为2%的DMSO的水溶液的混合液，其余同供试样品组）。DPPH自由基清除活性以清除率表示，清除率%=（A_c-A_s）/(A_c-A_b)×100%，A_c、A_s、A_b分别表示对照组、供试样品组和空白溶剂组的吸光度，结果见图1。

2.羟自由基（OH·）清除活性测定：

根据南京建成羟自由基试剂盒说明操作，于5ml离心管中，加入底物工作液和供试样品溶液（溶剂为质量百分浓度为2%的DMSO的水溶液）各0.2mL，混合后37℃预热，加经37℃预热的羟自由基试剂盒的试剂三0.4mL后，于37℃反应1min，立即加羟自由基试剂盒的显色剂（Griess试剂）2mL终止反应，混匀后室温放置20min，于550nm测吸光度值A，作为供试样品组；同时设空白溶剂组（底物工作液以水代替，供试品溶液以质量百分浓度为2%的DMSO的水溶液代替，其余同供试样品组）、对照组（不加供试样品溶液，其余同供试样品组）。羟基自由基清除活性以清除率表示，清除率%=（A_c-A_s）/(A_c-A_b)×100%，A_c、A_s、A_b分别表示对照组、供试样品组和空白溶剂组的吸光度，结果见图2。

3.超氧阴离子自由基（O₂·^-）清除活性测定：

根据南京建成抑制与产生超氧阴离子自由基试剂盒说明操作，于5mL离心管中，加入抑制与产生超氧阴离子自由基试剂盒的试剂一1mL，供试样品溶液（溶剂为质量百分浓度为2%的DMSO的水溶液）50μL，抑制与产生超氧阴离子自由基试剂盒的试剂二、抑制与产生超氧阴离子自由基试剂盒的试剂三、抑制与产生超氧阴离子自由基试剂盒的试剂四各0.1mL，混匀后，于37℃反应40min，加抑制与产生超氧阴离子自由基试剂盒的显色剂（Griess试剂）2mL，混匀，避光放置10min后，550nm测定吸光度A，作为供试样品组；同时设空白溶剂组（不加供试样品溶液，显色剂以质量百分浓度为25%的冰醋酸水溶液代替，其余同供试样品组）、对照组（不加供试样品溶液，其余同供试样品组）。超氧阴离子自由基清除活性以清除率表示，清除率%=（A_c-A_s）/(A_c-A_b)×100%，A_c、A_s、A_b分别表示对照组、供试样品组和空白溶剂组的吸光度，结果见图3。

由图1～3可见，水杉皮提取物SSW、SSE1、SSE2和SSE3均具有清除DPPH自由基、羟自由基（OH·）和超氧阴离子自由基（O₂·^-）的能力。清除DPPH自由基活性，SSE1、SSE2和SSE3强于法国海岸松标准提取物（PCG，Maritime Pine Extract，符合美国药典标准）；清除OH·活性，SSE1、SSE3强于PCG；清除O₂·^-活性、高浓度时SSE2、SSE3、SSW强于PCG。

实施例7

水杉皮提取物对酪氨酸酶的抑制作用

酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶，酪氨酸酶抑制剂就是通过抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色素的生成，因而可用于预防和治疗色素沉着和黑色素瘤等，也可作为化妆品添加剂用于美白、保护皮肤等。

在96孔板中，200μl反应体系中加酪氨酸酶(终浓度400U/ml)和供试品或阳性对照药各50μL(以pH=7.4PBS（磷酸盐缓冲液）溶解)，37℃反应10min，加底物L-酪氨酸100μL(终浓度1mM)后，37℃反应30min，酶标仪490nm处测定吸光度，计算供试品或曲酸（kojic）对酪氨酸酶的抑制率，抑制率%=（A_c-A_s）/(A_c-A_b)×100%，A_c、A_s、A_b分别表示对照组、供试品组和空白溶剂组的吸光度，结果见图4。

由图4结果可知，水杉皮提取物SSE1，SSE3能够浓度依赖性地抑制酪氨酸酶的活性，抑制活性强于法国海岸松标准提取物（PCG，MaritimePine Extract，符合美国药典标准），低浓度0.8-20μg/ml时与酪氨酸酶抑制剂曲酸的抑制活性相当，高浓度100μg/ml时抑制活性弱于酪氨酸酶抑制剂曲酸。

实施例8

水杉皮提取物的心血管保护作用

1.对大鼠凝血功能的影响

雄性SD大鼠90只，体重180-220g，随机分为9组，即正常对照组、模型对照组、SSE1 18、6、2mg/kg剂量组、SSE3 18、6、2mg/kg剂量组，每组10只，各药物组大鼠ig给药，正常对照组和模型对照组大鼠ig给予等体积水，每天1次，共10天。于第9天给药后，除正常对照组外，其余各组大鼠皮下注射给予肾上腺素0.8mg·kg^-1共2次，间隔时间为4h。第1次皮下给予肾上腺素后2h，将大鼠至于0℃冰水中游泳5min，2h后再第二次给予肾上腺素，造成大鼠急性血瘀症。于末次给药后1h，腹主动脉取血，3.8%柠檬酸钠抗凝血（枸橼酸钠：全血为1：9，V/V），按试剂盒的要求进行凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、血浆纤维蛋白原(FIB)的测定。

表1SSE1、SSE3对肾上腺素致血瘀大鼠凝血功能的影响

注：n=10，#p<0.05（与正常对照组比较），*p<0.05（与模型对照组比较）；

表1结果可见，SSE1（6、2mg/kg）及SSE3（2mg/kg）能够改善肾上腺素致大鼠血淤情况，延长APTT，而SSE3（18、2mg/kg）能通过延长PT发挥作用。此外，SSE1各剂量能使TT略有延长，但与模型对照组无统计学差异（P>0.05）；SSE1及SSE3两者对于FIB均无明显影响。

2.对异丙肾上腺素致心肌缺血大鼠的影响

SD大鼠60只，雌雄各半，体重180-220g，随机分为6组，即正常对照组、模型组、阳性对照维拉帕米10mg/kg组、SSE1 18、6、2mg/kg三剂量组，每组10只，每天1次灌胃给予相应药物，连续7-10d，给药体积均为1mL/100g体重，对照组、模型组分别给予等体积生理盐水。末次给药后30min戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定，连接生物信号采集处理系统心电图电极，记录一段正常心电图。除对照组外，各组分别腹腔注射异丙肾上腺素5mg/kg复制大鼠心肌缺血模型，记录大鼠给予异丙肾上腺素后1、5、10、20min时的心电图，观察T波、ST段的变化。然后眼球取血，分离血清，按试剂盒说明检测其中乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的含量。处死大鼠，取心脏，切片，HE染色，常规病理组织学处理，光镜下观察心肌细胞坏死程度及炎性细胞浸润情况，按文献（心复力冲剂对大鼠实验性心肌损伤的影响，马丽红等，《中国中西医结合杂志》，2004年第S1期）分级评价心肌损伤程度。0级:正常心肌；1级：心内膜下局灶性病变；2级：心肌多处局灶损害，有色泽斑驳的染色和心肌纤维断裂组成;3级:心肌广泛融合性病变;4级:心肌大面积梗死，偶有急性动脉瘤形成与腔内血栓形成。

表2SSE1对异丙肾上腺素致心肌缺血大鼠血清酶学的影响

n=10）

注：#p<0.05（与正常对照组比较），*p<0.05（与模型对照组比较）；

表3SSE1对异丙肾上腺素致心肌缺血大鼠ST段变化的影响

n=10）

注：#p<0.05（与正常对照组比较），*p<0.05（与模型对照组比较）；

表4SSE1对异丙肾上腺素致心肌缺血大鼠T波变化的影响

n=10）

注：#p<0.05（与正常对照组比较），*p<0.05（与模型对照组比较）；

从表2结果可见，注射异丙肾上腺素造模后大鼠LDH、MDA、CK升高，SOD明显降低，其中CK、SOD与正常对照组有统计学差异（P<0.05），提示异丙肾上腺素造模可使大鼠出现心肌损伤；SSE1各剂量预防用药后对上述各指标有一定的改善作用。

从表3、4结果可见，注射异丙肾上腺素造模后大鼠10min以内各时段ST、T波均有明显下降，提示异丙肾上腺素造模可使大鼠出现心肌缺血心电波形，SSE1各剂量预防用药后对上述各指标也有一定的保护作用。

3．对离体家兔主动脉血管环张力的影响

健康新西兰家兔，体重2-3kg，雌雄兼用，击头处死，迅速打开胸腔，小心分离并剪下胸主动脉于4℃经饱和的Kreb’s营养液中。冲洗血管内血迹，小心剥离血管外侧的结缔组织和脂肪，剪成长为3~4mm的血管环。标本一侧挂于不锈钢钩置于麦氏水浴槽中，另一端垂挂于不封口的三角铁环上，连接张力换能器。浴槽保持37℃，持续通以O₂。给予血管环1g负重，平衡15min，换以2g平衡30min，3g平衡30min，每隔15min更换一次培养液。以终浓度0.06mol/LKCl作用血管环15min诱导其产生收缩能力，后以营养液冲洗3次，平衡30min，使其张力恢复至基线。对于上述血管环，给予0.15μmmol/L去甲肾上腺素（NE）预收缩，待稳定后加入乙酰胆碱10μmmol/L，舒张程度超过10%即判断内皮完整，可进行进一步试验。

3.1SSE1与SSE3对于主动脉血管环的直接作用

内皮完整主动脉血管，待平衡后加入不同剂量的SSE1和SSE3，以Kreb’s液为对照，以加入药物5min后的血管张力幅度与初始张力变化相对的百分数反应血管张力的变化。结果不同浓度的SSE1和SSE3对主动脉血管无明显的舒张或是收缩作用(见表5和表6)。

3.2SSE1与SSE3对NE所致的主动脉血管环收缩作用的影响

内皮完整主动脉血管，加入NE（终浓度0.15μmmo/L），待血管收缩稳定后，加入不同剂量的SSE1和SSE3，以Kreb’s液为对照，以加入药物5min后的血管张力幅度与NE诱发的血管环的最大收缩幅度之间的比率反应血管张力的变化。结果显示SSE1累积浓度达15～20mg/L时对NE诱发的血管收缩有一定舒张作用，累积浓度到25mg/L以上时则出现显著缓解作用，且随浓度提高舒张程度不断加大；而不同浓度的SSE3则无明显舒张作用。

表5不同浓度的SSE1对血管环的影响程度

*P<0.05（与对照比较），**P<0.01（与对照比较）；

表6不同浓度的SSE3对血管环的影响程度

上述结果显示，水杉皮提取物SSE1、SSE3具有心血管保护作用。

实施例9

水杉皮提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

α-葡萄糖苷酶对糖的分解代谢具有重要作用，α-葡萄糖苷酶抑制剂是比较成熟的治疗糖尿病药物，已广泛应用于临床，现已上市的药物有阿卡波糖（Acarbose）、伏格列波糖和米格列醇。

在96孔板中，200μl反应体系中加入α-葡萄糖苷酶(终浓度0.05U/ml，以PBS溶液溶解)和供试品或阳性对照各50μL（以pH=7.4PBS缓冲液溶液溶解），37℃反应10min，然后加底物对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（pNPG）(终浓度200μM，以pH=7.4PBS缓冲液溶液溶解)100μL，37℃反应30min，加0.2M Na₂CO₃水溶液50μl中止反应，于400nm波长处测定吸光度A，计算供试品或阳性对照对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，抑制率%=（A_c-A_s）/(A_c-A_b)×100%，A_c、A_s、A_b分别表示对照组、供试品组和空白溶剂组的吸光度，见图5。

图5中，SSE1、SSE3和PCG的三个浓度从左往右分别为2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml，而Acarbose的三个浓度从左往右分别为0.2mg/ml、1mg/ml和5mg/ml。

由图5可见，水杉皮提取物SSE1和SSE3能浓度依赖性地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，抑制作用与法国海岸松标准提取物（PCG，Maritime PineExtract，符合美国药典标准）相似，但远强于α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖的活性。

Claims (9)

1.一种水杉皮提取物的制备方法，包括步骤：

（1）将水杉树皮粉末在提取剂中于25℃至回流温度提取2小时～24小时，滤除残渣，得到提取液；

所述的提取剂为水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种或两种以上的混合溶液；

（2）将步骤（1）中的提取液冷却后过滤，滤液浓缩，得到一次浓缩液；

（3）将步骤（2）中的一次浓缩液经乙酸乙酯萃取，石油醚或氯仿脱脂和干燥，得到水杉皮提取物；

或者，将步骤（2）中的一次浓缩液经大孔吸附树脂柱层析，收集洗脱液经浓缩和干燥，得到水杉皮提取物；

所述的水杉皮提取物包括原花色素和总多酚。

2.根据权利要求1所述的水杉皮提取物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的提取剂为水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种或水与甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种的混合溶液。

3.根据权利要求1所述的水杉皮提取物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的水杉树皮粉末的目数为20目～100目。

4.根据权利要求1所述的水杉皮提取物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，将步骤（2）中的一次浓缩液经乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液后干燥并浓缩，得到二次浓缩液，二次浓缩液经石油醚或氯仿脱脂和干燥，得到水杉皮提取物。

5.根据权利要求1所述的水杉皮提取物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的大孔吸附树脂柱层析的洗脱液为甲醇、乙醇、丙酮、体积百分浓度为10%～95%的乙醇水溶液、体积百分浓度为10%～95%的丙酮水溶液或体积百分浓度为10%～95%的甲醇水溶液。

6.根据权利要求1～5任一项所述的水杉皮提取物的制备方法制备的水杉皮提取物。

7.权利要求6所述的水杉皮提取物在制备抗氧化剂或自由基清除剂中的应用。

8.权利要求6所述的水杉皮提取物在制备具有抗衰老、美容护肤和/或预防和治疗心血管疾病作用的药物或者保健食品中的应用。

9.权利要求6所述的水杉皮提取物在制备具有预防和治疗糖尿病作用的药物或者保健食品中的应用。

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