CN102725405A - 原生藻菌的转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供使原生藻菌的有用物质的产生能力提高的转化方法。解决方法：涉及向原生藻菌中导入外源基因的原生藻菌转化方法，原生藻菌为网粘菌类，更具体地为属于网粘菌属、交链孢霉属Altornia属、Aplanochytrium属、裂殖壶菌属、Aurantiochytrium属、破囊壶菌属、吾肯氏壶菌属等的微生物。外源基因是与抗生素耐药性、发色蛋白质、和/或脂肪酸不饱和化酶相关联的基因(Δ5去饱和酶基因、Δ12去饱和酶基因、和/或ω3去饱和酶基因)，通过电穿孔法或基因枪法导入外源基因。
Description
技术领域
本发明涉及原生藻菌(stramenopile)的转化方法。本发明还涉及通过导入脂肪酸不饱和化酶基因，不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌，从这些不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌生产不饱和脂肪酸的方法等。
背景技术
多不饱和脂肪酸(poly unsaturated fatty acid，PUFA)是动物和人类营养中重要的成分。由于如二十碳五烯酸(EPA)或二十二碳六烯酸(DHA)这样的ω3多不饱和脂肪酸(也称作n-3多不饱和脂肪酸)在儿童脑的发育、眼的机能、激素和其它信号物质的合成以及包括心血管障碍、癌症和糖尿病的预防的健康状况中实现各种作用(非专利文献1)，因此它们是人类营养中的重要成分。由于这样的原因，多不饱和脂肪酸的制造已成为必要。
一方面，已知分类于网粘菌(Labyrinthula)纲的微生物制造多不饱和脂肪酸。已经报道属于破囊壶菌(Thraustochytriales)科的微生物中，利用裂殖壶菌(Schizochytrium)属的微生物的含有多不饱和脂肪酸的磷脂的制备方法(专利文献1)，具有二十二碳六烯酸生产能力的破囊壶菌(Thraustochytrium)属的微生物(专利文献2)等。由于这些不饱和脂肪酸使得食物和/或饲料的强化成为可能，因此这些不饱和脂肪酸的，特别是在真核生物中的，简便经济的制造方法是非常必要的。
在网粘菌类中，作为外源基因的导入方法，已经报道了对于裂殖壶菌属的特定菌株(按照现在的分类体系(非专利文献2)属于Auranthiochytrium属(非专利文献3))的方法(专利文献3、4)。而且，作为通过转化使得脂肪酸组成变化的方法，虽然已知有破坏聚酮合成酶(PKS)系基因，其结果是脂肪酸组成变化的例子(非专利文献4)，但是，至今未知操作构成延长酶/去饱和酶通路的酶使得脂肪酸组成变化的报道。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007-143479号公报
专利文献2：日本特开2005-102680号公报
专利文献3：日本特开2006-304685号公报
专利文献4：日本特开2006-304686号公报
专利文献5：日本特开2005-287380号公报
专利文献6：PCT/DK96/00051
非专利文献
非专利文献1：Poulos，A Lipids 30：1-14，1995；Horrocks，LA和Yeo YK，Pharmacol Res 40：211-225，1999
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非专利文献3：第60届日本生物工程学会大会讲演要旨集，p136，2008
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非专利文献5：FEBS Lett.553，440-444(2003)
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非专利文献7：Prasher，D.C.等人，Gene，111(2)：229-233(1992)
非专利文献8：Chalfie M.等人，Science，263：802-805，(1994)
非专利文献9：Southern，P.J.，和Berg，P.，J.Molec.Appl.Gen.1，327-339.(1982)
非专利文献10：バイオ实验イラストレイテツド2遺伝子解析の基礎p63-68，秀润社
非专利文献11：Sanger，F.，等人Proc.Natl.Acad.Sci(1977)74，5463
非专利文献12：バイオ实验イラストレイテツド2遺伝子解析の基礎p117-128，秀润社
非专利文献13：Adachi，J.等人Comput.Sci.Monogr.(1996)28
发明内容
发明概述
发明所解决的课题
本发明目的是为了使原生藻菌的有用物质的产生能力提高而导入外源基因进行转化。通过导入与原生藻菌的有用物质的产生有关的外源基因，改变有用物质的产生能力本发明目的为改变原生藻菌产生的脂肪酸组成的方法，使原生藻菌蓄积大量的脂肪酸的方法，不饱和脂肪酸的制造方法，不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌，从这些不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌生产提供不饱和脂肪酸。通过本发明，提供了改变原生藻菌产生的脂肪酸组成和使原生藻菌蓄积大量脂肪酸的方法，使得更加有效地制造多不饱和脂肪酸成为可能。
解决课题的方法
本发明人，借鉴上述现有技术的状况专心研究的结果，为了使原生藻菌产生大量不饱和脂肪酸的能力提高，成功地导入外源基因进行转化，并且，发现了通过向原生藻菌导入脂肪酸不饱和化酶基因，并使其表达进行原生藻菌产生的脂肪酸组成的改变的方法，以及使得该转化的原生藻菌蓄积大量的不饱和脂肪酸的方法，并通过进一步促进其实用化目的的研究、开发，直至完成了本发明。
本发明将以下(1)～(22)记载的技术事项作为要点。
(1)一种原生藻菌的转化方法，其特征在于向原生藻菌中导入外源基因。
(2)根据(1)所述的原生藻菌的转化方法，其中所述原生藻菌为网粘菌类。
(3)根据(2)所述的原生藻菌的转化方法，其中所述网粘菌类为属于网粘菌属(Labyrinthula)、交链孢霉属(Altornia)、Aplanochytrium、Japonochytrium、Labyrinthuloides、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、海洋壶菌属(Aurantiochytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)、Oblongichytrium、Botryochytrium、Parietichytrium、或Sicyoidochytrium的微生物。
(4)根据(1)至(3)任一项所述的原生藻菌的转化方法，其中所述微生物是裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)M-8株(FERM P-19755)、金黄色破囊壶菌(Thraustochytriumaureum)ATCC34304、破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)ATCC26185、裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)AL1Ac、裂壶藻(Schizochytrium aggregatum)ATCC 28209、吾肯氏壶菌(Ulkenia sp.)ATCC28207、裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)SEK210(NBRC102615)、裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)SEK345(NBRC102616)、Botryochytrium radiatum SEK353(NBRC 104107)、或Parietichytrium sarkarianumSEK364(FERM ABP-11298)。
(5)根据(1)至(4)任一项所述的原生藻菌的转化方法，其中所述外源基因为与抗生素耐受能力、发色蛋白质、和/或脂肪酸不饱和化酶相关联的基因。
(6)根据(1)至(5)任一项所述的原生藻菌的转化方法，其中与脂肪酸不饱和化酶相关联的基因为Δ5去饱和酶基因、Δ5去饱和酶基因、和/或ω3去饱和酶基因。
(7)根据(1)至(6)任一项所述的原生藻菌的转化方法，其特征在于利用电穿孔或基因枪法导入外源基因。
(8)一种改变原生藻菌脂肪酸组成的方法，其特征在于导入脂肪酸不饱和化酶基因，并表达该脂肪酸不饱和化酶。
(9)根据(8)所述的方法，其中脂肪酸不饱和化酶是去饱和酶。
(10)根据(8)或(9)所述的方法，其中脂肪酸不饱和化酶是Δ5去饱和酶、Δ5去饱和酶、或ω3去饱和酶。
(11)根据(8)至(10)任一项所述的方法，其中所述原生藻菌为网粘菌类。
(12)根据(11)所述的方法，其中所述网粘菌类为属于网粘菌属(Labyrinthula)、交链孢霉属(Altornia)、Aplanochytrium、Japonochytrium、Labyrinthuloides、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、海洋壶菌属(Aurantiochytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)、Oblongichytrium、Botryochytrium、Parietichytrium、或Sicyoidochytrium的微生物。
(13)根据(12)所述的方法，其中所述微生物是裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)M-8株(FERM P-19755)、金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)ATCC34304、破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)ATCC26185、裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)AL1Ac、裂壶藻(Schizochytrium aggregatum)ATCC 28209、吾肯氏壶菌(Ulkenia sp.)ATCC28207、裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)SEK210(NBRC102615)、裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)SEK345(NBRC102616)、Botryochytrium radiatum SEK353(NBRC 104107)、或Parietichytrium sarkarianum SEK364(FERM ABP-11298)。
(14)通过(8)至(13)任一项所述的方法使原生藻菌大量蓄积脂肪酸的方法。
(15)根据(14)所述的方法，其中所述脂肪酸为不饱和脂肪酸。
(16)根据(15)所述的方法，其中所述不饱和脂肪酸为碳原子数在18-22的不饱和脂肪酸。
(17)通过(14)至(16)任一项所述的方法得到的脂肪酸。
(18)以脂肪酸组成的改变为目的被转化的原生藻菌。
(19)以使脂肪酸大量蓄积为目的被转化的原生藻菌。
(20)根据(18)或(19)所述的原生藻菌，其为网粘菌类。
(21)根据(20)所述的原生藻菌，其中所述网粘菌类为属于网粘菌属(Labyrinthula)、交链孢霉属(Altornia)、Aplanochytrium、Japonochytrium、Labyrinthuloides、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、海洋壶菌属(Aurantiochytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)、Oblongichytrium、Botryochytrium、Parietichytrium、或Sicyoidochytrium的微生物。
(22)根据(21)所述的原生藻菌，其中所述微生物是裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)M-8株(FERM P-19755)、金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)ATCC34304、破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)ATCC26185、裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)AL1Ac、裂壶藻(Schizochytrium aggregatum)ATCC 28209、吾肯氏壶菌(Ulkeniasp.)ATCC28207、裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)SEK210(NBRC102615)、裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)SEK345(NBRC102616)、Botryochytrium radiatum SEK353(NBRC 104107)、或Parietichytrium sarkarianum SEK364(FERM ABP-11298)。
发明效果
通过本发明，以下成为可能：导入与原生藻菌的有用物质(不饱和脂肪酸)的产生有关的外源基因而改变有用物质的产生能力，通过该改变，改变原生藻菌产生的脂肪酸组成的方法，使原生藻菌蓄积大量脂肪酸的方法，不饱和脂肪酸的制造方法，提供不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌，从这些不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌生产提供不饱和脂肪酸。通过改变原生藻菌产生的脂肪酸组成，以及提供使原生藻菌蓄积大量脂肪酸的方法，能够更加有效地制造多不饱和脂肪酸。
附图说明
图1表示显示敏感性的抗生素筛选结果。另外，X轴的项目名从左侧开始按照如下的顺序：对照G418(2mg/ml)、博来霉素(1mg/ml)、嘌呤霉素(100μg/ml)、杀稻瘟菌素(100μg/ml)、潮霉素(2mg/ml)、氯霉素(30μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)、青霉素(500μg/ml)、链霉素(500μg/ml)、四环素(100μg/ml)。
图2表示金黄色破囊壶菌(T.aureum)在液体培养时的最低抑菌浓度。
图3表示破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)在液体培养时的最低抑菌浓度。
图4表示mh0186在液体培养时的最低抑菌浓度。
图5表示AL1Ac在液体培养时的最低抑菌浓度。
图6表示金黄色破囊壶菌(T.aureum)在平板培养时的最低抑菌浓度。
图7表示破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)在平板培养时的最低抑菌浓度。
图8表示mh0186在平板培养时的最低抑菌浓度。
图9表示AL1Ac在平板培养时的最低抑菌浓度。
图10表示耐药性基因盒的模式图(EF-1a启动子、终止子)。[符号的说明]1.18S2.1R 3.2F 4.neo-pro-3F 5.n-G-pro-3F 6.n-term-G-4R 7.n-term-G-4F 8.终止子5R。
图11表示耐药性基因盒的模式图(泛素启动子、终止子)。[符号的说明]1.Ndel18SF 2.18s-fug-ubq-R 3.Ubpro-HindIII-R 4.UbproG418fus1R 5.ubproG418fus2F 6.G418ubtersus3R 7.G418ubterfus4F 8.KpnlterR。
图12表示构建的网粘菌-大肠杆菌穿梭载体(shuttle-vector)。
图13表示将G418耐受能力作为指标的A.limacinum转化体的评价。
图14表示A.limacinum转化体和野生株的形态比较。
图15表示通过以基因组DNA作为模板的PCR的A.limacinum转化体的评价。[符号的说明]1：转化体1 2：转化体2 3：转化体3 4：转化体4 5：转化体5 6：野生型 7：阳性对照(以导入的DNA片段作为模板)
图16表示通过印记杂交(southern blotting)的A.limacinum转化体的评价。[符号的说明](A)1.阳性对照(476pg的导入DNA) 2.转化体1，Xbal处理 3.转化体1，Pstl处理 4.转化体1，HindIII处理 5.转化体1，EcoRl处理 6.转化体1，BamHl处理7～11。阴性对照(野生型)(B)1.阳性对照(30pg的导入DNA) 2.野生型，Pstl处理 3.转化体5，Pstl处理 4.转化体4，Pstl处理 5.转化体3，Pstl处理 6.转化体2，Pstl处理 7.转化体1，Pstl处理。
图17表示通过RT-PCR的A.limacinum转化体的评价。[符号的说明]1：转化体1 2：转化体2 3：转化体3 4：转化体4 5：转化体5 6：野生型 7：阳性对照(以导入的DNA片段为模板)8～13：以总RNA为模板。
图18表示金黄色破囊壶菌(T.aureum)转化体和野生株的形态比较。
图19表示通过以基因组DNA作为模板的PCR和印记杂交(southern blotting)的金黄色破囊壶菌(T.aureum)转化体的评价。[符号的说明](A)M：φX174/Hincll，λHindIII 1：无模板 2：阳性对照(导入DNA片段) 3：转化体1 4：转化体2 5：转化体3 6：野生型(B)P：阳性对照(导入DNA2.5ng)1：野生型，NotI处理 2：转化体1，NotI处理 3：转化体2，NotI处理 4：转化体3，NotI处理。
图20表示通过RT-PCR的金黄色破囊壶菌(T.aureum)转化体的评价。[符号的说明]M：φX174/HincII，λHindIII 1：转化体1 2：转化体2 3：转化体3 4：野生型 5：阳性对照(导入DNA片段)6～9：在1～4中以RNA为模板的PCR(阴性对照)。
图21表示通过以基因组DNA作为模板的PCR和印记杂交(southern blotting)的破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)ATCC26185转化体的评价。[符号的说明](A)1：λHindIII消化/φx-174HincII消化 2：野生型DNA(2F/5R) 3：野生型DNA(仅2F) 4：野生型DNA(仅5R) 5：转化体-1DNA(2F/5R) 6：转化体-1DNA(仅2F) 7：转化体-1DNA(仅5R) 8：转化体-2DNA(2F/5R) 9：转化体-2DNA(仅2F) 10：转化体-2DNA(仅5R) 11：转化体-3DNA(2F/5R) 12：转化体-3RNA(仅2F) 13：转化体-3RNA(仅5R) 14：阳性对照(2F/5R)15：阳性对照(仅2F)16：阳性对照(仅5R)(B)1：λHindIII消化/φx-174HincII消化 2：转化体-2DNA(2F/4R) 3：转化体-2DNA(仅2F) 4：转化体-2DNA(仅4R) 5：转化体-2DNA(3F/4R) 6：转化体-2DNA(仅3F) 7：转化体-2DNA(3F/5R) 8：转化体-2DNA(仅5R)(C) 1：野生型，Pst I处理 2：野生型HindIII处理 3：转化体-1Pst I处理 4：转化体-1，HindIII处理 5：转化体-2，Pst I处理 6：转化体-2，HindIII处理 71：转化体-3，Pst I处理 8：转化体-3，HindIII处理 10：阳性对照(100ng的导入DNA)。
图22表示通过RT-PCR的破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)ATCC26185转化体的评价。[符号的说明](A)1：λHindIII消化/φx-174HincII消化 2：野生型cDNA(3F/4R)3：野生型cDNA(仅3F) 4：野生型cDNA(仅4R) 5：野生型RNA(3F/4R)6：野生型RNA(仅3F) 7：野生型RNA(仅4R) 8：转化体-1cDNA(3F/4R) 9：转化体-1cDNA(仅3F) 10：转化体-1cDNA(仅4R) 11：转化体-1RNA(3F/4R) 12：转化体-1RNA(仅3F)13：转化体-1RNA(仅4R) 14：阳性对照(3F/4R) 15：阳性对照(仅3F) 16：阳性对照(仅4R)(B) 1：λHindIII消化/φx-174HincII消化 t2：转化体-2cDNA(3F/4R) 3：转化体-2cDNA(仅3F) 4：转化体-2cDNA(仅4R) 5：转化体-2RNA(3F/4R) 6：转化体-2RNA(仅3F) 7：转化体-2RNA(仅4R) 8：转化体-3cDNA(3F/4R) 9：转化体-3cDNA(仅3F) 10：转化体-3cDNA(仅4R) 11：转化体-3RNA(3F/4R) 12：转化体-3RNA(仅3F) 13：转化体-3RNA(仅4R) 14：阳性对照(3F/4R) 15：阳性对照(仅3F)16：阳性对照(仅4R)。
图23表示通过以基因组DNA为模板的PCR的裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)AL1Ac转化体的评价。[符号的说明]1～3道：转化体4～6道：野生株7道：无模板DNA(阴性对照)8道：以导入的DNA为模板(阳性对照)。
图24表示制得的GFP(绿色荧光蛋白)基因/耐新霉素基因表达盒的模式图。Ub-pro-F1和Ub-term-R2在序列中分别有Kpn I位点。
图25表示以对照株和GFP基因/耐新霉素基因表达盒导入株来源的基因组DNA作为模板的PCR分析。各自表示如下：(A，B)是Aurantiochytrium sp.mh0186、(C，D)是金黄色破囊壶菌(T.aureum)中PCR结果、以及(A，C)是耐新霉素基因、(B，D)是扩增GFP基因的结果。[符号的说明]M：λHindIII消化/φx-174HincII消化N：野生株(阴性对照)C：耐新霉素基因表达盒导入株(A，C中是阳性对照/B，D中是阴性对照)T：GFP基因/耐新霉素基因表达盒导入株P：将GFP基因/耐新霉素基因表达盒作为模板(阳性对照)。
图26表示以对照株和GFP基因/耐新霉素基因表达盒导入株来源的cDNA作为模板的PCR分析。各自表示如下：(A，B)是Aurantiochytrium sp.mh0186、(C，D)是金黄色破囊壶菌(T.aureum)中PCR结果、以及(A，C)是耐新霉素基因、(B，D)是扩增GFP基因的结果。[符号的说明]M：λHindIII消化/φx-174HincII消化N：野生株(阴性对照)C：耐新霉素基因表达盒导入株(A，C中是阳性对照/B，D中是阴性对照)T：GFP基因/耐新霉素基因表达盒导入株P：将GFP基因/耐新霉素基因表达盒作为模板(阳性对照)。
图27表示使用共焦激光显微镜的GFP的荧光观察结果。(A)金黄色破囊壶菌(T.aureum)野生型的相差干涉图像(B)金黄色破囊壶菌(T.aureum)野生型的荧光成像(C)表达GFP的金黄色破囊壶菌(T.aureum)的相差干涉图像(D)表达GFP的金黄色破囊壶菌(T.aureum)的荧光成像(E)Aurantiochytrium sp.mh0186野生型的相差干涉图像(F)Aurantiochytrium sp.mh0186野生型的荧光成像(G)表达GFP的Aurantiochytrium sp.mh0186的相差干涉图像(H)表达GFP的Aurantiochytriumsp.mh0186的荧光成像。
图28表示Pinguiochrysis pyriformis来源的Δ12去饱和酶的推导氨基酸序列和真菌和原虫来源的Δ12去饱和酶的推导氨基酸序列的多重序列比对分析。以P.pyriformis、真菌和原虫来源的Δ12去饱和酶的推导氨基酸序列为对象，通过ClustalW 1.81和ESPript2.2来进行多重序列比对分析。同样的氨基酸残基用涂成黑色背景中的白色字，类似的氨基酸残基用黑框框起来的粗体字各自记录。下划线的部分表示共同的保守组氨酸盒。
图29表示Δ12去饱和酶和双功能性Δ12/Δ15去饱和酶的系统分析。
图30表示导入对照载体pYES2/CT或重组质粒pYpD12Des的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的脂肪酸甲酯(FAME)的GC分析。箭头指示出新的峰，其保留时间与标准品的亚油酸甲酯的一致。
图31表示导入pYpD12Des的酿酒酵母来源的FAMEs中新的峰的GC-MS分析。[符号的说明](A)亚油酸标准物质(B)新的峰。
图32表示制得的Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒的模式图。Ub-pro-F1和Ub-term-R2在序列中分别有KpnI位点。
图33表示以对照株和Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株来源的基因组DNA为模板的PCR分析。各自表示如下：(A)是耐新霉素基因、(B)扩增Δ12去饱和酶基因的结果。[符号的说明]M：λHindIII消化/φx-174HincII消化N：野生株(阴性对照)C1：耐新霉素基因表达盒导入株1(A中是阳性对照/B中是阴性对照)C2：耐新霉素基因表达盒导入株2(A中是阳性对照/B中是阴性对照)C3：耐新霉素基因表达盒导入株3(A中是阳性对照/B中是阴性对照)T1：Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株1T1：Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株2T1：Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株3P：将GFP基因/耐新霉素基因表达盒作为模板(阳性对照)。
图34表示以对照株和Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株来源的cDNA为模板的PCR分析。各自表示如下：(A)是耐新霉素基因、(B)扩增Δ12去饱和酶基因的结果。[符号的说明]M：λHindIII消化/φx-174HincII消化N：野生株(阴性对照)C1：耐新霉素基因表达盒导入株1(A中是阳性对照/B中是阴性对照)C2：耐新霉素基因表达盒导入株2(A中是阳性对照/B中是阴性对照)C3：耐新霉素基因表达盒导入株3(A中是阳性对照/B中是阴性对照)T1：Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株1T1：Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株2T1：Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株3P：将GFP基因/耐新霉素基因表达盒作为模板(阳性对照)。
图35表示金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的Δ5去饱和酶的多重序列分析。
图36表示去饱和酶的系统分析。
图37a表示以酵母作为宿主的Δ5去饱和酶的过量表达实验1的结果。(向培养基中添加ETA的GC分析结果)。
图37b表示以酵母作为宿主的Δ5去饱和酶的过量表达实验2的结果。(向培养基中添加DGLA的GC分析结果)。
图37c表示EPA和AA的经GC-MS结构分析的结果。(a)TauΔ5des产物的EPA(b)EPA的标准物质(c)TauΔ5des产物的AA(d)AA的标准物质。
图38(a)表示含有制得的Δ5去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒的载体构建(b)表示经PCR扩增的Δ5去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒。
图39表示以对照株和Δ5去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株来源的基因组DNA为模板的PCR分析。1-6道扩增耐新霉素基因、7-12道扩增Δ5去饱和酶基因。[符号的说明]1：Δ5去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株12：Δ5去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株23：Δ5去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株34：野生株(阴性对照)5：以Δ5去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒为模板(阳性对照)6：无模板(阴性对照)7：Δ5去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株18：Δ5去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株29：Δ5去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株310：野生株(阴性对照)11：以Δ5去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒为模板(阳性对照)12：无模板(阴性对照)。
图40表示对照株和Δ5去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株来源的cDNA为模板的PCR分析。上段表示扩增耐新霉素基因的结果，下段表示扩增Δ5去饱和酶基因的结果。[符号的说明]mhneor1：耐新霉素基因表达盒导入株1mhneor2：耐新霉素基因表达盒导入株2mhneor3：耐新霉素基因表达盒导入株3mh？5neor1：Δ5去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株1mh？5neor2：Δ5去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株2mh？5neor3：Δ5去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株3。
图41表示导入对照株或Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒的Aurantiochytrium sp.mh0186来源的FAMEs的GC分析。箭头指示出新的峰，其保留时间与标准品的亚油酸甲酯的一致。
图42表示在Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株来源的FAMEs中的新的峰的GC-MS分析。
图43表示对照株和Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株的脂肪酸组成的比较。白柱和黑柱各自表示对照株和Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株的脂肪酸组成。箭头指示出作为外源脂肪酸的油酸，星号表示生物合成的亚油酸。其值是平均值±标准偏差的值。
图44表示mh0186转化体的GC分析结果。
图45表示经PCR检测出Neor(约2300bp)的结果，向网粘菌导入基因的转化体中观察到野生株看不到的Neor的特异性扩增。
图46表示含有亚克隆的pcDNA3.1Myc-His载体来源的SV40终止子序列的质粒。
图47表示在融合PCR中使用的引物和产物的模式图。终产物成为破囊壶菌ATCC34304来源的泛素启动子和pTracer-CMV/Bsd/lacZ来源的耐杀稻瘟菌素基因融合的序列。
图48表示制得的pTracer-CMV/Bsd/lacZ来源的耐杀稻瘟菌素基因BgIII盒。
图49表示融合PCR中使用的引物和产物的模式图。终产物成为破囊壶菌ATCC34304来源的泛素启动子和水霉菌(Saprolegnia diclina)来源的ω3去饱和酶基因序列以及破囊壶菌ATCC34304来源的泛素终止子融合的序列。
图50表示将图48记载的耐杀稻瘟菌素基因BgIII盒中的一边的BgIII位点替换为Kpnl位点的质粒。
图51表示制得的水霉菌来源的ω3去饱和酶表达质粒。作为耐药性的标志，具有耐杀稻瘟菌素基因。
图52表示显示水霉菌来源的ω3去饱和酶基因的基因组插入确认PCR中使用的引物位置的模式图。
图53表示经基因组DNA作为模板的PCR的破囊壶菌ATCC34304转化体的评价。[符号的说明]1～2道：转化体。
图54表示破囊壶菌ATCC34304的对照株和ω3去饱和酶基因导入株的脂肪酸组成的比较。白柱和黑柱分别表示对照株和ω3去饱和酶基因导入株的脂肪酸组成。其值是平均值±标准偏差的值。
图55表示将破囊壶菌ATCC34304野生株设为100％时的对照株和ω3去饱和酶基因导入株的脂肪酸比率。
具体实施方式
近年，对于脂质的生理活性和药理作用的研究在进展，出现了对于不饱和脂肪酸的代谢中变化为各种化学物质及其作用的阐述。特别是饱和脂肪酸、单烯酸、不饱和脂肪酸的营养学上适合的比率，二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等鱼油来源的ω3系(也称为n-3系)脂肪酸和以亚油酸为中心的植物来源的ω6系(也称为n-6系)脂肪酸的比率在与疾病的联系中被重视起来。然而，由于动物中脂肪酸不饱和化酶(去饱和酶，desaturase)的缺损和低下其必须将一部分不饱和脂肪酸作为食物来摄取。这些脂肪酸被称作必须脂肪酸(也是维生素F)，亚油酸(LA)、γ-亚麻酸(GLA)、花生四烯酸(AA或ARA)等属于此类。
在不饱和脂肪酸的生成中，称作脂肪酸不饱和化酶(去饱和酶)的酶参与。在脂肪酸不饱和化酶(去饱和酶)中有以下两种类型：(1)从脂肪酸的羰基起在确定的位置形成双键(也称不饱和键)的类型(例如：Δ9去饱和酶，将其羰基碳原子作为第一个碳原子的情况下，在第9个碳原子的位置形成双键)以及(2)从脂肪酸的甲基末端起在特定的位置形成双键的类型(例如：ω3去饱和酶，将甲基末端作为第一个位置的情况下，在第三个位置形成双键)，已知经这些去饱和酶的双键的生成(不饱和化)，以及经数个不同的延长酶反复进行链的延长，生物合成不饱和脂肪酸。例如，Δ9去饱和酶通过将在体内从棕榈酸合成或从外部直接摄取的硬脂酸不饱和化合成油酸(OA)。再有，Δ6、Δ5、Δ4去饱和酶是花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)、以及二十二碳六烯酸(DHA)这样的多不饱和脂肪酸合成中必要的脂肪酸不饱和化酶(去饱和酶)。
一方面，在属于原生藻菌的网粘菌类中存在破囊壶菌科(也称为破囊壶菌科)(Thraustochytriaceae)和网粘菌科(Labyrinthulaceae)这两个科。这些作为蓄积花生四烯酸、EPA、DTA、DPA、DHA等多不饱和脂肪酸的微生物而被知晓。
本发明涉及原生藻菌的转化方法，其特征在于向原生藻菌中导入外源基因。通过以本发明的转化方法为基础，使新构建改变原生藻菌产生的脂肪酸组成的方法、使原生藻菌蓄积大量的脂肪酸的方法、以及不饱和脂肪酸的制造方法成为可能，而且，通过向原生藻菌中导入脂肪酸不饱和化酶基因，开发提供不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌、从这些不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌生产不饱和脂肪酸的方法成为可能。
下面，对本发明进行更详细的说明。
[微生物]
虽然作为在本发明的脂肪酸改变方法中使用的微生物，只要是想到可能是通过导入脂肪酸不饱和化酶基因进行脂肪酸合成的原生藻菌，就没有特别地限定，但是优选是以网粘菌类为对象。作为网粘菌类，可以举例如下，属于网粘菌属(Labyrinthula)、交链孢霉属(Altornia)、Aplanochytrium、Japonochytrium、Labyrinthuloides、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、或吾肯氏壶菌属(Ulkenia)、Aurantiochytrium、Oblongichytrium、Botryochytrium、Parietichytrium、或Sicyoidochytrium的微生物。
作为本发明使用的原生藻菌，优选属于裂殖壶菌属(Schizochytorium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、Aurantiochytrium、Parietichytrium的微生物，其中特别优选的可举例如下，裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)M-8株(FERM P-19755)、金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)ATCC34304、破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)ATCC26185、裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)AL1Ac、裂壶藻(Schizochytriumaggregatum)ATCC 28209、吾肯氏壶菌(Ulkenia sp.)ATCC28207、裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)SEK210(NBRC 102615)、裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)SEK345(NBRC 102616)、Botryochytrium radiatum SEK353(NBRC 104107)、或Parietichytrium sarkarianum SEK364(FERM ABP-11298)。裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)M-8株在专利文献5中已经进行了报道，在本发明公开记载的方法(破囊壶菌科M-8株)中按照以下的方法得到。首先，将在石垣岛的红树林中收集的海水·落叶300ml放入锥形瓶中，加入约0.05g松花粉(此处使用宫崎市周边海岸收集的物质)。室温放置1周，收集含有水面松花粉的海水，取0.1ml涂布于培养皿中制得的土豆右旋糖琼脂培养基上。于28℃培养5天，收集奶油色无光泽的菌落，将其涂布于新的琼脂培养基上。3天后，于显微镜下观察增殖的微生物，从细胞的大小、形态判断为网粘菌类的微生物，并保存于倾斜培养基中。另外，该菌株在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1-1-1筑波中心中央第6)以保藏号(FERM P-19755)于平成16年3月29日国内保藏，可以从那里得到该菌株。再者，Parietichytrium sarkarianum SEK364是按照以下方法得到的：将在石垣岛·吹通川的河口区域收集的表层水10mL放入试管中，加入松花粉，室温放置。7天后，将松花粉涂布于无菌琼脂培养基(2g葡萄糖、1g蛋白胨、0.5g酵母提取物、0.2g氯霉素、15g琼脂、蒸馏水100mL、海水900mL)中。5天后，分离培养出现的菌落，反复数次，分离菌体。另外，该菌株在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1-1-1中央第6)以保藏号(FERMABP-11298)于平成22年9月24日国际保藏，可以从那里得到该菌株。
再者，本发明原生藻菌在其之后的文献中也被称作裂殖壶菌(Schizochytoriumsp.)mh0186、Aurantiochytirum sp.mh0186、或者Aurantiochytrium limacinum mh0186.在本发明中也有使用这些名称。以通常使用的固体培养基或液体培养基等通过常规方法培养这些原生藻菌。这时，作为使用的培养基，只要是为了培养网粘菌类通常使用的物质，例如作为碳源的葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、甘油等，再者作为氮源的酵母提取物、玉米浆、多聚蛋白胨、谷氨酸钠、尿素、醋酸铵、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、硝酸钠等，还有作为无机盐的磷酸钾等，适当组合其它必要成分的培养基，并没有特别地限定。培养基制备后，将pH调节至3.0～8.0的范围，然后通过高压灭菌器等杀菌使用。并且，破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)ATCC34304、破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)ATCC26185、裂壶藻(Schizochytriumaggregatum)ATCC 28209、以及吾肯氏壶菌(Ulkenia sp.)ATCC 28207在ATCC，以及裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)SEK210(NBRC 102615)、裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)SEK345(NBRC 102616)、以及Botryochytrium radiatum SEK353(NBRC 104107)在独立行政法人制品评价技术基础机构，各自保藏，一般可以得到这些菌。
[脂肪酸不饱和化酶]
本发明的脂肪酸不饱和化酶(去饱和酶，desaturase)只要是具有作为脂肪酸不饱和化酶的功能的物质，并没有特别地限定。作为脂肪酸不饱和化酶基因虽然并不特别地限制于动物来源、植物来源等的来源，但是可以优选地列举Δ4脂肪酸不饱和化酶基因、Δ5脂肪酸不饱和化酶基因、Δ6脂肪酸不饱和化酶基因、Δ12脂肪酸不饱和化酶基因等的脂肪酸不饱和化酶基因，可以单独或联合使用这些。相关的Δ4脂肪酸不饱和化酶基因、Δ5脂肪酸不饱和化酶基因、Δ6脂肪酸不饱和化酶基因、Δ12脂肪酸不饱和化酶基因是从脂肪酸的末端羧基的碳原子(δ末端)数起，各自在第4、第5、第6、第12个碳原子处形成不饱和键的物质，作为这些脂肪酸不饱和化酶基因具体地可以列举，例如微细藻类来源的Δ4脂肪酸不饱和化酶基因(Tonon，T.，Harvey，D.，Larson，T.R.，和Graham，I.A.Identification of a very long chainpolyunsaturated fatty acid Δ4-desaturase from the microalga Pavlova lutheri.非专利文献5)。并且，具体地，作为Δ5去饱和酶，举例为金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的Δ5去饱和酶，破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)ATCC 26185，盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)、大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)、土壤线虫(Caenorhabditis elegans)、利什曼原虫(Leishmaniamajor)来源的Δ5去饱和酶。再者，作为Δ12去饱和酶，举例为粉核油球藻(Pinguiophyceae)Pinguiochrysis pyriformis来源的Δ12去饱和酶、真菌以及原虫来源的Δ12去饱和酶。
去饱和酶是对于具有许多重要功能的多不饱和脂肪酸的生产不可欠缺的。例如，多不饱和脂肪酸是细胞膜的主要成分，以磷脂形态存在。其也具有作为哺乳动物环前列腺素、类二十烷酸、白三烯、以及前列腺素的前体物质的功能。进一步地，多不饱和脂肪酸在发育中婴儿脑的正常发育和组织形成以及修复中是必要的。借鉴多不饱和脂肪酸的生物学意义，尝试有效的生产多不饱和脂肪酸和其中间体。
Δ5去饱和酶催化，例如，从二高-γ-亚麻酸(DGLA)向花生四烯酸(AA)的转化，和从二十碳四烯酸(ETA)向二十碳五烯酸(EPA)的转化。Δ6去饱和酶催化，例如，从亚油酸(LA)向γ-亚麻酸(GLA)的转化，和从α-亚麻酸(ALA)向硬脂四烯酸(STA)的转化。在多不饱和脂肪酸的合成中Δ5去饱和酶和Δ6去饱和酶以外的许多酶参与其中。例如，延长酶(elongase)催化从γ-亚麻酸(GLA)向二高-γ-亚麻酸(DGLA)的转化，和从硬脂四烯酸(STA)向二十碳四烯酸(ETA)的转化。再者，通过Δ12去饱和酶从油酸(OA)生产亚油酸(LA)。
[产生的不饱和脂肪酸]
通过在原生藻菌体内表达的脂肪酸不饱和化酶生成的不饱和脂肪酸是例如，碳原子数在18～22的不饱和脂肪酸。虽然使用的脂肪酸不饱和化酶的种类、脂肪酸底物的种类的不同，但是可以优选举例二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)，除此以外可以列举，α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(OTA、18:4n-3)、二十碳四烯酸(ETA、20:4n-3)、n-3二十二碳五烯酸(DPA、22:5n-3)、二十四碳五烯酸(TPA、24:5n-3)、二十四碳六烯酸(THA、24:6n-3)、亚油酸(LA)、γ-亚麻酸(GLA)、二十碳三烯酸(20:3n-6)、花生四烯酸(AA)、n-6二十二碳五烯酸(DPA，22:5n-6)等。
[脂肪酸不饱和化酶基因源]
在本发明中作为脂肪酸不饱和酶基因源可以利用的生物是段落[脂肪酸不饱和化酶]中记载的那样，并不限定特别的属、种或菌株等，只要是具有多不饱和脂肪酸生产能力的生物，任何的物质都可以使用。这些生物只要是微生物，例如，可以从公共微生物保藏机构容易地得到。作为这样的微生物，可以举例，属于南极菌属(Moritella)的细菌Moritella marina的MP-1株(ATCC15381)等，作为去饱和酶和延长酶基因源的例子，以下将说明对于使用该菌株的情况的方法。但是，本文所示的方法能够适用于从具有去饱和酶/延长酶通路的全部生物物种进行作为其构成基因的去饱和酶和延长酶基因的分离。
为了从MP-1株分离去饱和酶和/或延长酶基因，需要推测在其各自的目标酶基因的氨基酸序列中的保守区域。例如，已知在去饱和酶中有一个细胞色素b5区域和3个组氨酸盒，在延长酶中有2个组氨酸盒，通过生物物种保守下来。更具体地说，通过使用clustal w程序(Thompson，J.D.，等人非专利文献6)的多重序列比对比较各种生物物种来源的已知去饱和酶或延长酶基因的氨基酸序列，能够推测出目标酶的保守区域。进一步地，通过多重序列比对比较在已知的其它生物来源的去饱和酶和/或延长酶中具有相同底物特异性的去饱和酶或延长酶基因的氨基酸序列，能够推测具有相同底物特异性的去饱和酶和/或延长酶中的特异性保守区域。然后，基于推测的保守区域制备各种简并寡核苷酸引物，通过进行以MP-1株来源的cDNA库为模板的PCR、RACE法等，扩增MP-1株来源的目标基因的部分序列。接着，将得到的扩增产物克隆于质粒载体中后，通过常规方法决定碱基序列，通过与已知的酶基因的比较确认基于MP-1株的目标酶基因的一部分分离成功。为了得到目标酶基因的全长，通过以得到的部分序列作为探针的杂交法进行筛选，或者进行使用从目标基因的部分序列制得的寡核苷酸引物的RACE法。
[其它的基因源]
GFP(绿色荧光蛋白)参考非专利文献7或非专利文献8，EGFP(增强型GFP)参考专利文献6，耐新霉素基因参考非专利文献9。
[向原生藻菌的脂肪酸不饱和化酶的导入和表达]
作为脂肪酸不饱和化酶基因的导入方法，通过向现有的微生物中导入基因的转化方法可以适用，也可以列举将重组表达载体导入细胞的转化方法。对于本发明中向原生藻菌中的导入去饱和酶基因的详细说明具体记载于实施例中。再者，作为转化对象的原生藻菌没有特别地限定，如前所述，可以作为优选的例子列举出网粘菌类。
作为表达的载体没有特别地限定，可以列举出插入基因的重组表达载体。在重组表达载体的制备中，可以使用质粒、噬菌体、或者粘粒等，但是没有特别地限定。再者，制备方法也可以使用公知的方法。载体的具体种类没有特别地限定，可以适当选择在宿主细胞中能够表达的载体。也就是说，根据宿主细胞的种类，为了确定地使基因被表达而选择适当的启动子序列，作为表达载体可以使用将该启动子序列与本发明的基因组合入各种质粒等的物质。表达载体中优选至少含有一个选择标记。作为这样的标记，对于真核生物细胞的培养，可以列举出二氢叶酸还原酶或者耐新霉素基因、GFP等。借鉴抗生素感受性的结果和真核生物转化体系中使用的选择标记基因，表明在网粘菌类的转化体系中能够使用的选择标记基因为以下表1中所示的物质有效。
如果使用上述的选择标记，能够确认本发明相关的聚核苷酸是否导入进宿主细胞，进一步地其在宿主细胞中是否确实地表达了。或者，可以将本发明相关的脂肪酸不饱和化酶作为融合多肽表达，例如，可以将维多利亚多管发光水母(Aequorea Victoria)来源的绿色荧光多肽GFP作为标记使用，使本发明相关的脂肪酸不饱和化酶作为GFP融合多肽表达。
优选通过电穿孔或基因枪法导入外源基因，关于具体的导入条件如表2所示。在本发明中，通过导入脂肪酸不饱和化酶基因，与导入脂肪酸不饱和化酶基因前相比较，细胞的脂肪酸组成发生变化。即，通过表达脂肪酸不饱和酶化基因，能够得到脂肪酸组成的改变的效果。
通过原生藻菌的转化，能够得到改变产生的脂肪酸组成的原生藻菌(微生物)。编码该脂肪酸不饱和化酶的基因被能够表达地导入原生藻菌，例如，能够在不饱和脂肪酸的制造中利用。在不饱和脂肪酸的制造中，可以使用上述产生的脂肪酸组成被改变的原生藻菌，对于其它的工序、制造设备、器具等的各种条件没有特别地限定。在不饱和脂肪酸的制造中，包含培养通过上述的改变方法产生的脂肪酸组成被改变的微生物的工序，利用微生物和其它的培养基，制造不饱和脂肪酸。
上述细胞的培养条件(培养基、培养温度、通气状态等)能够根据细胞的种类、目标不饱和脂肪酸的种类、它们的量等适当的设定。
此外，本发明所述不饱和脂肪酸也指含有不饱和脂肪酸的物质，其含量、纯度、形状、组成等没有特别地限定。即，在本发明中，脂肪酸组成被改变的细胞或其培养基本身也可视为不饱和脂肪酸。再者，可以进一步包含从该细胞或培养基纯化不饱和脂肪酸的工序。作为纯化不饱和脂肪酸的方法，可以适用作为以不饱和脂肪酸起始的脂质(含有复合脂质)的纯化方法的公知方法。
[使原生藻菌大量蓄积不饱和脂肪酸的方法]
通过培养转化的本发明的原生藻菌达到使原生藻菌蓄积不饱和脂肪酸。例如，用通常可以使用的固体培养基或液体培养基等培养。这时，作为可以使用的培养基，例如，作为碳源的葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、甘油等，以及作为氮源的酵母提取物、玉米浆、多聚蛋白胨、谷氨酸钠、尿素、醋酸铵、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、硝酸钠等，以及作为无机盐的磷酸钾等，适当组合其它必要成分的培养基，只要是为了培养网粘菌类通常可以使用的物质，并没有特别地限定，但是特别优选的是使用酵母提取物·葡萄糖琼脂培养基(GY培养基)。制备培养基后，将pH调节至3.0～8.0的范围内后，通过高压灭菌锅杀菌使用。培养可以在以下条件中进行：10～40℃，优选15～35℃，1～14天，通气搅拌培养、振荡培养、或静置培养。
回收产生的不饱和脂肪酸是，在培养基中生长原生藻菌，处理从该培养基得到的微生物细胞，使其释放细胞内脂质(含有多不饱和脂肪酸的油脂含有物或多不饱和脂肪酸)，从含有该被释放的细胞内脂质的培养基回收脂质。即，将这样培养的原生藻菌通过离心分离等回收，破坏细胞，按照规定使用适当的有机溶剂提取出细胞内的脂肪酸，通过以上方法能够得到多不饱和脂肪酸含有比例增加的油脂。
本发明通过培养导入脂肪酸不饱和化酶的转化的原生藻菌，改变原生藻菌产生的脂肪酸的组成，但是这是经将原生藻菌通常产生的脂肪酸通过被导入的脂肪酸不饱和化酶基因不饱和化实现的。改变前后的脂肪酸组成的变化在表8至表10中对比表示。例如，通过粉核油球藻(Pinguiophyceae)来源的Δ12去饱和酶的表达生成的脂肪酸的种类没有变化，但是导入的酶对生成比例产生了影响。特别地，发生从油酸向亚油酸的转化，其转化效率达到30±6.6％。
其次，在有的种类的网粘菌中，根据异种网粘菌来源的Δ5去饱和酶的表达试验，EPA的含有比例上升了1.4倍左右。用含有ETA或DGLA的培养基培养时，ETA和DGLA各自被转化为EPA和AA，增加了不饱和脂肪酸。网粘菌内的转化效率是，网粘菌内的前体物质的转化效率较酵母的情况高，ETA是75％，DGLA是63％。这些结果是从CG-MS的试验数据得到的。
再者，本发明的不饱和脂肪酸被包含在各种医药品、食品、或者工业制品中，其使用领域没有特别地限定。而且，在含有具有本发明不饱和脂肪酸的油脂的食品中，包括补充剂等的健康食品、食品添加剂等。另外，作为工业制品，可以举例以人以外的生物为对象的饲料、薄膜、生物分解性塑料、功能性纤维、润滑油、洗剂等。
下面，基于本发明的实施例具体说明本发明，但是本发明并非根据以下的实施例有任何的限定。
实施例1
[网粘菌类及其培养方法·保存方法]
(1)本发明使用的菌株
金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)ATCC 34304、和破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)ATCC 26185获自ATCC。Aurantiochytrium limacinummh0186、和裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)AL1Ac获自宫崎大学农学部。
再者，裂壶藻(Schizochytrium aggregatum)ATCC28209、和吾肯氏壶菌(Ulkeniasp.)ATCC28207获自ATCC。裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)SEK210(NBRC 102615)、裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)SEK345(NBRC 102616)、Botryochytrium radiatumSEK353(NBRC 104107)、和Parietichytium sarkarianum SEK364获自甲南大学理工学部。
(2)培养基的组成
i.琼脂培养基的组成
PDA琼脂平板培养基
将0.78％(w/v)土豆右旋糖琼脂培养基(日水制药公司制)、1.75％(w/v)海洋生物(sea life)(Marine Tech公司制)、1.21％(w/v)琼脂粉末(Nacalai Tesque公司制)混合，于121℃进行高压灭菌锅灭菌20分钟。充分冷却后，为了防止细菌污染，加入氨苄青霉素酸钠(Nacalai Tesque公司制)，使其最终浓度为100μg/ml，分配于培养皿中，在平的处所静置使其固化。
ii.液体培养基的组成
GY液体培养基
将3.18％(w/v)葡萄糖(Nacalai Tesque公司制)、1.06％(w/v)干燥酵母提取物(Nacalai Tesque公司制)、1.75％(w/v)海洋生物(Marine Tech公司制)、混合，于121℃高压灭菌锅灭菌20分钟后，添加100μg/ml氨苄青霉素酸纳(Nacalai Tesque公司制)。
PD液体培养基
将0.48％(w/v)土豆右旋糖(Difco公司制)、1.75％(w/v)海洋生物(Marine Tech公司制)混合，于121℃高压灭菌锅灭菌20分钟后，添加100μg/ml氨苄青霉素酸纳(Nacalai Tesque公司制)。
H液体培养基
将0.2％(w/v)葡萄糖(Nacalai Tesque公司制)、0.02％(w/v)干燥酵母提取物(Nacalai Tesque公司制)、0.05％谷氨酸钠(Nacalai Tesque公司制)、1.75％(w/v)海洋生物(Marine Tech公司制)混合，于121℃高压灭菌锅灭菌20分钟后，添加100μg/ml氨苄青霉素酸纳(Nacalai Tesque公司制)。
(3)培养方法
i.琼脂平板培养
使用接种环或涂布器接种网粘菌菌体，经25℃静置培养使其出现菌落。关于其次代培养，用接种环取出菌落悬浮于灭菌生理盐水后，使用接种环或涂布器将所得悬浮液涂布进行次代培养。并且，根据需要通过将平板上的菌体接种于液体培养基进行向液体培养基的转换。
ii.液体培养
接种网粘菌菌体，使用锥形瓶或试管于25℃以150rpm的转速边搅拌边进行悬浮培养。关于其次代培养，以相对于新的GY或PD液体培养基的1/200～1/10的容积加入确认增殖的对数增殖期至稳定期的培养液进行次代培养。并且，根据需要通过将细胞培养液涂布于PDA琼脂平板培养基中进行向琼脂平板培养的转换。
(4)网粘菌类的保持·保存方法
通过加入至次代培养中，制备甘油储藏液进行冰冻贮藏。即，向使用GY液体培养基的对数增殖期至稳定期的细胞悬浮液，添加最终浓度为15％(v/v)的甘油(Nacalai Tesque公司制)，在-80℃的深冷冰箱中保存。
实施例2
[在网粘菌类的抗生素感受性试验和转化体系中使用的选择标记的选择]
(1)经液体培养显示感受性的抗生素的筛选
网粘菌类4株的预培养液添加含有各种抗生素的GY液体培养基，以150rpm、25℃培养5天后于600nm处测定其浊度(OD600)。使用的抗生素和浓度、以及其结果如图1所示。
(2)在液体培养中的最小抑菌浓度(MIC)的确定
关于显示感受性的抗生素，在液体培养中进行MIC的确定。向含有各种浓度的各种抗生素的GY液体培养基中加入网粘菌类4株的预培养液，于150rpm、25℃培养5天后，于600nm处测定浊度(OD600)。金黄色破囊壶菌(T.aureum)的结果如图2所示，破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)ATCC 26185的结果如图3所示，A.limacinum mh0186的结果如图4所示，裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)AL1Ac的结果如图5所示。
(3)在琼脂平板培养中的MIC的确定
将网粘菌类4株的预培养液5μl滴入至含有各种浓度的各种抗生素的PDA琼脂平板培养基中，于25℃培养7天后，观察菌落的形成。金黄色破囊壶菌(T.aureum)的结果如图6所示，破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)ATCC 26185的结果如图7所示，A.limacinum mh0186的结果如图8所示，裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)AL1Ac的结果如图9所示。
借鉴在这些结果、抗生素耐受性的结果和真核生物转化体系中可以使用的选择标记基因，显示在网粘菌类的转化体系中可以使用的选择标记基因是以下表1中所示的物质有效。
[表1]
| 测试菌株 | 能够使用的选择标记基因 |
| 金黄色破囊壶菌(T.aureum) | Neor、Hygr、Blar |
| 破囊壶菌(Thraustochytrium sp.) | Neor、Hygr、Blar、Bler |
| A.limacinum mh0186 | Neor、Hygr、Blar、Bler |
| 裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)AL1Ac | Neor、Hygr、 |
Neor…耐新霉素基因 Hygr…耐潮霉素基因
Blar…耐杀稻瘟菌素基因 Bler…耐博来霉素基因
实施例3
[金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的EF-1α和泛素基因的分离，以及它们的基因表达调控区域的分离]
(1)金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的EF-1α基因和基因表达调控区域的分离
i.金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的EF-1α基因cDNA序列的分离
通过将GY液体培养基培养的金黄色破囊壶菌(T.aureum)的对数增殖期至稳定期的菌体于4℃、3500xg离心10分钟收集细菌。将得到的菌体悬浮于灭菌生理盐水中后通过再次进行离心操作洗涤菌体，经液氮迅速冷冻后于乳钵中将其捣碎直至成粉末状。然后，使用
RNA I Super(Nacalai Tesque公司制)从细胞破碎液提取总RNA。然后，使用OligotexTM-dT30<Super>mRNA纯化试剂盒(Takara Bio公司制)进行从总RNA至mRNA的纯化。
接着，使用SMARTTMRACE cDNA扩增试剂盒(clontech公司制)制备在5’和3’末端添加合成接头的cDNA库。并且，基于已知的EF-1α的保守序列，使用DNA合成器(Applied Biosystems公司制)制备一个正向的简并寡核苷酸引物EF-F1(序列表序列号1)。使用这些进行3’RACE时，特异性扩增产物被确认。于是，用干净的刀等将经1％琼脂糖凝胶电泳分离的该DNA片段切割出，按照非专利文献10中记载的方法从琼脂糖凝胶中提取出DNA。然后，使用pGEMR-T easy Vector SystemI(Promega公司制)进行该DNA片段的TA克隆，根据Sanger等的方法(非专利文献11)确定它们的碱基序列。具体地说，通过使用BigDyeR Terminator v3.1CyeleSequencing Kit和3130基因分析器(Applied Biosystems公司制)，通过染料标记的终止法进行碱基序列的确定。其结果，由于得到的980bp的3’RACE产物(序列表序列号2)显示与其它生物来源的EF-1α基因的高度同源性，因此强烈提示其为金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的EF-1α基因的部分序列。
因此，基于得到的序列制备2个反向的寡核苷酸引物EF-1r(序列表序列号3)和EF-2r(序列表序列号4)，使用它们进行5’RACE。其结果，两者中各自特异性的5’RACE产物被确认。碱基序列分析的结果，由前者是由496bp(序列表序列号5)、后者是由436bp(序列表序列号6)形成的金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的推测EF-1α基因的部分序列。关于任何一方的重复部分，可知与3’RACE产物完全一致。
从以上的结果显示，本次得到的金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的推测EF-1α基因的cDNA序列是1396bp(序列表序列号7)，其中关于ORF区域是编码341个氨基酸残基(序列表序列号8)的1023bp(序列表序列号9)。
ii.金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的EF-1α基因的基因调控区域的分离
通过将GY培养基培养的金黄色破囊壶菌(T.aureum)菌体离心收集菌体。通过将得到的菌体悬浮于灭菌生理盐水后进行再次离心操作洗涤菌体，用液氮急速冷冻后于乳钵中捣碎直至成粉末状。然后，按照非专利文献12中记载的方法提取出基因组DNA，通过测定A260/280进行提取出的基因组DNA的纯度和浓度的测定。
然后，使用体外LA PCR克隆试剂盒，通过PCR基因组步移法尝试EF-1α基因ORF上游序列(启动子)、或ORF下游序列(终止子)的分离。并且，在ORF上游序列的扩增中使用的反向寡核苷酸引物是r3(序列表序列号10)，在ORF下游序列的扩增中使用的正向寡核苷酸引物是EF-t-F1(序列表序列号11)和EF-t-F2(序列表序列号12)。在分析可以得到的特异性扩增产物的碱基序列时，可知在615bp的金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的EF-1α基因ORF上游序列(序列表序列号13)，和1414bp的ORF下游序列(序列表序列号14)的分离中取得成功。以下，前者记为EF-1α启动子，后者记为EF-1α终止子。
(2)金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的泛素基因和基因表达区域的分离
i.金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的泛素基因cDNA序列的分离
以使用SMARTTMRACE cDNAAmplification Kit(clontech公司制)制备的cDNA库作为模板，进行使用基于已知的泛素基因的保守序列制备的正向简并寡核苷酸引物2F(序列表序列号15)的3’RACE。在分析得到的扩增产物的碱基序列时，可知其为278bp(序列表序列号16)的金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的推测泛素基因的部分序列。关于5’RACE，尽管尝试各种寡核苷酸引物的使用和PCR条件，也不能得到特异性扩增产物。由此，怀疑高GC含量来源的目标RNA的高级结构阻碍cDNA库制备时的逆转录反应的可能性。
因此，使用具有热稳定性高的逆转录酶的5’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends，第2版，(Invitrogen公司制)进行5’RACE。并且，在逆转录反应中使用的反向寡核苷酸引物，和cDNA合成后的PCR反应中使用的反向寡核苷酸引物分别是1R(序列表序列号17)和2R(序列表序列号18)。在分析得到的扩增产物的碱基序列时，其为260bp(序列表序列号19)的金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的推测泛素基因的部分序列，与3’RACE产物的重复部分完全一致。从以上的结果可知在金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的推测泛素基因的cDNA序列的分离中取得成功。
但是，已知泛素基因一般具有同一序列的折返结构。即，推测本次的结果并没有显示该基因的全长结构，而是明确了构成5’、3’末端的非编码区域和ORF区域中的折返结构的单一序列。并且，表明本次阐明的金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的泛素基因ORF区域中的单一序列是编码76个氨基酸残基(序列表序列号20)的228bp(序列表序列号21)。
ii.金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的泛素基因的基因调控区域的分离
使用体外LAPCR克隆试剂盒，通过PCR基因组步移法尝试泛素基因ORF上游序列(启动子)，或ORF下游序列(终止子)的分离。并且，在ORF上游序列的扩增中使用的反向寡核苷酸引物是REVERS-UPR-1(序列表序列号22)和REVERS-UPR-2(序列表序列号23)，在ORF下游序列的扩增中使用的正向寡核苷酸引物是ubqterminal f1(序列表序列号24)和ter2F(序列表序列号25)。在分析得到的特异性扩增产物的碱基序列时，可知在801bp的金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的泛素基因ORF上游序列(序列表序列号26)和584bp的ORF下游序列(序列表序列号27)的分离中取得成功。以下，前者记为泛素启动子，后者记为泛素终止子。
该结果，在作为在网粘菌类中恒定功能的基因表达调控区域的，金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的管家基因的，EF-1α和泛素基因的启动子·终止子的分离中取得成功。
实施例4
[耐药基因表达盒的制备]
(1)耐新霉素基因(Neor)的人工合成
委托Medibikku公司，根据密码子使用数据库(codon usage database)(www.Kazusa.or.jp/codon/)中记载的金黄色破囊壶菌(T.aureum)的密码子使用频率的合成人工合成的Neor。其碱基序列如序列表序列号28所示，编码的氨基酸序列如序列表序列号29所示。
(2)Neor表达盒的构建
i.使用EF-1α启动子·终止子的Neor表达盒的构建
按照[日本农芸化学会志第77卷第2号(2003年2月)p150-153]记载的方法，通过融合PCR使用序列表序列号30～38记载的寡核苷酸引物制备将金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的18S rDNA连接于由EF-1α启动子/人工合成Neor/EF-1α终止子形成的耐药基因(Neor)表达盒的上游的DNA片段。并且，PCR反应条件是设定变性温度为98℃，时间10秒，退火及延长反应是根据引物的Tm和扩增产物的长度适当调节进行的。
其结果，在4454bp的金黄色破囊壶菌(T.aureum)18S rDNA/EF-1α启动子/人工合成Neor/EF-1α终止子的连接中取得成功(序列表序列号39，图10)。
然后，进行使用pGEM-T easy(Invitrogen公司制)的TA克隆，构建具有使用作为网粘菌用的选择标记的EF-1α启动子·终止子的Neor表达盒，和作为相同重组部位的金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的18S rDNA序列的网粘菌-大肠杆菌穿梭载体。以下，将其记为pEFNeomycinr(图12)。
ii.使用泛素启动子·终止子的Neor表达盒的构建
根据与使用EF-1α启动子·终止子的Neor表达盒的情况相同的方法，使用序列表序列号40～47记载的寡核苷酸引物，连接金黄色破囊壶菌(T.aureum)18SrDNA/泛素启动子/人工合成Neor/泛素终止子(图11)。利用pUC18载体的NdeI/KpnI位点插入构建的Neor表达盒，构建具有使用作为网粘菌用的选择标记的泛素启动子·终止子的Neor表达盒，和作为同源重组部位的金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的18S rDNA序列的网粘菌-大肠杆菌穿梭载体。以下，将其记为pUBNeomycinr(图12)。
这些的结果，构建了具有利用作为网粘菌用选择标记的EF-1α启动子/终止子的Neor表达盒的网粘菌-大肠杆菌穿梭载体pEFNeomycinr，和具有利用泛素基因的启动子/终止子的Neor表达盒的pUBNeomycinr。两种载体中，为了使得Neor的网粘菌中的表达容易，人工合成并使用在参考破囊壶菌(T.aureum)的密码子使用频率中最优化密码子的Neor。并且，考虑向利用相同重组的染色体DNA中的插入，具有金黄色破囊壶菌(T.aureum)来源的18S rDNA序列(图10和11)。
实施例5
[向网粘菌中的基因导入实验]
(1)基因导入实验中使用的DNA
进行使用以下所示的4种DNA的基因导入实验
(1)环状载体pUBNeomycinr
(2)同pUBNeomycinr
(3)基于泛素启动子·终止子的直链Neor表达盒(ub-Neor)
(4)基于EF-1α启动子·终止子的直链Neor表达盒(EF-Neor)
关于(3)是以下物质，以pUBNeomycinr为模板，使用LA taq Hot StartVersion(Takara Bio公司制)、和1对寡核苷酸引物-Ubpro-fug-18s-F(序列表序列号42)/KpnterR(序列表序列号47)进行PCR，凝胶纯化得到的扩增产物而得到的物质；对于(4)是以下物质，以pEFNeomycinr为模板，使用LA taq Hot Start Version(TakaraBio公司制)、和1对寡核苷酸引物2F(序列表序列号32)/终止子5R(序列表序列号33)进行PCR，凝胶纯化得到的扩增产物得到的物质。
(2)在基因导入实验中使用的基因导入法
i.电穿孔法
使用GY液体培养基，将网粘菌类于25℃、150rpm培养至对数增殖期中期至后期后，3500xg、4℃离心10分钟除去上清液。将得到的菌体悬浮于灭菌1.75％海洋生物(marine tech公司制)后，通过进行再次离心操作洗涤菌体。然后，将5×106个细胞悬浮于50mM蔗糖或附属于使用设备的基因导入试剂中，施加各种条件的电脉冲。施加电脉冲后立刻加入1mlGY液体培养基，于25℃进行12小时的培养。然后，将培养液涂布于含有2mg/ml(金黄色破囊壶菌(T.aureum)、破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)ATCC 26185、裂殖壶菌(Schozochytrium sp.)AL1Ac)或0.5mg/ml(A.limacinum mh0186)的G418的PDA琼脂平板培养基中，于25℃进行静置培养，观察给予G418耐药性的转化的菌落的形成。
ii.基因枪法
使用GY液体培养基，将网粘菌于25℃、150rpm培养至对数增殖期中期至后期后，3500xg、4℃离心10分钟除去上清液。然后，为了形成原培养液的浓缩100倍将得到的菌体再次悬浮于GY液体培养基中，将其中20μl分的细胞液以直径3cm左右薄薄地均匀地涂布于含有或不含有G418的直径5cm的PDA琼脂平板培养基上使其干燥。然后，通过使用PDS-1000/He系统(Bio·Rat Laboratories公司制)的基因枪法进行DNA的射入操作。在射入条件中，考察使如下所示的射入压变化的条件。
·靶距离(target distance)-6cm(固定)
·真空(vacuum)-26英寸Hg(固定)
·微载体大小(micro carrier size)-0.6μm(固定)
·爆破膜(Rupture disk)(射入压)-450，900，1100，1350，和1550
在含有G418的PDA琼脂平板培养基上进行射入操作的情况是，导入后，12小时左右静置培养后，向PDA琼脂平板上滴加100μlPDA液体培养基，再次扩展菌体后继续静置培养。一方面，在不含有G418的PDA琼脂平板培养基上进行射入操作的情况是，导入后，12小时左右静置培养后，回收菌体，将其再次涂布于含有2mg/ml或0.5mg/ml的G418的PDA琼脂平板培养基中，于25℃进行静置培养，观察给予G418耐药性的转化的菌落的形成。
(3)转化体的得到及其评价
i.A.1imacinum转化体
首先，在电穿孔法中尝试按照以下所示的条件的基因导入。
·导入DNA…pUBNeomycinr和ub-Neor
·基因导入法…电穿孔法
·悬浮细胞缓冲液…50mM蔗糖
·基因导入设备…Gene Pulser(Bio·Rat Laboratories公司制)。使用1mm间隙皿(gap cuvette)
·脉冲条件…50μF/50Ω/0.75kV、加压次数1次。
该结果，在使用直链DNA的ub-Neor的情况中，发现以～2.4×100cfu/μg DNA的效率显示G418耐药性的菌落的出现。一方面，使用环状DNA的pUBNeomycinr情况是，可知尽管多次进行导入操作，也完全没有发现菌落的形成。
然后，通过基因导入设备进行导入效率的比较研究。使用MicroporatorMP-100(Air Brown公司制)或者NucleofectorTM(amaxa公司制)，使用随附的条件检索试剂盒进行导入试验。其结果，用Microporator MP-100没有形成1个菌落。一方面，将Nucleofector与随附的细胞悬浮缓冲液NucleofectorR溶液L共同使用的情况中，可知能够得到以～9.5×100cfu/μg DNA的效率的再现性好的转化体。
因此接下来，使用Gene Pulser(Bio·Rat Laboratories公司制)进行使用NucleofectorR溶液L的脉冲条件的研究。其结果，在捕获场(キヤパシスタンス)50μF/电阻50Ω/电场强度0.75kV、加压次数2次的情况中，可知能够得到以～1.2×101cfu/μg DNA的效率的重现性好的转化体。总结以上的结果，在表2中表示。
[表2]
ii.以G418耐药性为指标的A.limacinum转化体的评价
将得到的转化体用含有0.5mg/ml G418的GY液体培养基培养，野生株用不含有G418的GY液体培养基培养。将两菌株的培养液每个10μl点于含有G418(0，0.2，0.5，1，2，4mg/ml)的PDA琼脂平板培养基上，于25℃进行2天的培养，观察琼脂平板培养基上的生长。其结果，可知与野生株在0.2mg/ml的G418中增殖被阻碍相对，转化体在4mg/ml的G418存在下还有增殖(图13A)。并且可知，在不含有G418的GY液体培养基中5次次代培养转化体，使用含有G418(0，2，4，8，16，32mg/ml)的PDA琼脂平板培养基进行同样的实验的情况中，也没有观察到G418耐药性的变化，在G418浓度为32mg/ml的情况中也能观察到增殖(图13B)。由此确认，将G418耐药性作为指标的情况中，被赋予的性质是稳定的。
iii.A.limacinum转化体和野生株形态的比较
通过显微镜观察(图14A)、和细胞内油球的尼罗红(nile red)染色后的共焦激光显微镜观察(图14B)确认，在野生株和本次得到的转化体之间没有发现形态的变化。并且，通过18S rDNA分析也确认转化体是A.limacinum。
iv.经以基因组DNA为模板的PCR的A.limacinum转化体的评价
将得到的转化体用含有0.5mg/ml G418的GY液体培养基培养，野生株用不含有G418的GY液体培养基培养。使用ISOPLANT(Nacalai Teque公司制)进行从两菌株的菌体的基因组DNA的提取。然后，以得到的基因组DNA为模板，通过使用LAtaq Hot Start Version(Takara Bio公司制)的PCR进行Neor的扩增。使用的寡核苷酸引物是ubproG418fus2F(序列表序列号45)/G418ubtersus3R(序列表序列号46)(PCR循环：94℃2分钟/98℃10秒，68℃1分钟，72℃，30次循环/4℃)。
其结果，在转化体中观察到野生株中没有观察到的Neor特异性扩增(图15)。由此，提示导入的ub-Neor是被插入到染色体DNA上的。
v.经southern blotting的A.limacinum转化体的评价
将按照常规方法提取出的A.limacinum转化体和野生株的2μg基因组DNA用各种限制酶于37℃消化16小时后，按照[DIG说明书集第8、Roche]将DIG标记的Neor作为探针进行southern blotting。
其结果如图16A所示，检测出Neor带。由此显示基于导入的泛素启动子·终止子的ub-Neor被插入至染色体DNA中。并且，从由同样的酶(PstI)消化的5个转化体的带的分子量不同显示导入的DNA片段是被随机地插入进染色体DNA的(图16B)。
vi.经RT-PCR的A.limacinum转化体的评价
使用Sepasol RNA I Super(Nacalai Tesque公司制)，从A.limacinum转化体和野生株的菌体进行总RNA的提取。然后，使用RNeasy plus mini kit(QIAGEN公司制)进行总RNA的净化后，使用Cloned DNase I(Takara Bio公司制)，根据随附的手册于37℃使其反应1小时。接下来，进行使用PrimeScript Reverse Transcriptase(TakaraBio公司制)的逆转录反应，进行经逆转录反应的cDNA的合成。然后，以得到的cDNA为模板，进行经使用LA taq Hot Start Version(Takara Bio公司制)的PCR的Neor的扩增。使用的寡核苷酸引物是ubproG418fus2F(序列表序列号45)/G418ubtersus3R(序列表序列号46)(PCR循环：94℃2分钟/98℃10秒，68℃1分钟，72℃，30次循环/4℃)。
其结果，在转化体中确认了Neor扩增产物(图17，1～5道)。在以总RNA为模板进行PCR的情况中(图17，8～13道)没有发现扩增产物，其提示在1～5道观察到的产物不是基因组DNA的污染，而是来源于NeormRNA的逆转录产物(NeorcDNA)。由此可知，插入至染色体DNA上的ub-Neor是接受了向mRNA的转录。
vii.金黄色破囊壶菌转化体的获得
作为导入DNA，使用pUBNeomycinr或ub-Neor这两种DNA。研究各种条件的结果，证明使用电穿孔法一点也不能得到转化体。因此，在研究基因枪法的时候，在被赋予G418耐药性的转化体的获得中取得成功。其基因导入效率为1100psi的射入压的情况是最高的，对于导入ub-Neor的情况，可知为～1.9×102cfu/μg DNA。而且，pUBNeomycinr的导入效率是～1.4×101cfu/μgDNA，可知导入直链DNA的随机插入这一方，其导入效率与导入以18S rDNA序列作为相同重组部位的环状DNA相比高约14倍左右。而且，可知在不含有G418的GY液体培养基中5次次代培养后，转化体保持了其G418耐药性。
viii.金黄色破囊壶菌转化体和野生株的形态比较
通过用尼罗红染色细胞内的油球后的共焦激光显微镜的观察(图18)，确认野生株和本次得到的转化体之间没有发现形态的变化。而且，通过18S rDNA分析确认转化体是金黄色破囊壶菌。
ix.经以基因组DNA为模板的PCR和southern blotting的金黄色破囊壶菌转化体的评价
与A.limacinum转化体的情况相同，通过以基因组DNA为模板的PCR(图19A)和southern blotting的Neor的检出(图19B)，确认ub-Neor被随机地插入染色体DNA。
x.经RT-PCR的金黄色破囊壶菌转化体的评价
与A.limacinum转化体的情况相同，可知被插入到染色体DNA上的ub-Neor被转录为mRNA(图20)。
xi.破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)ATCC 26185转化体的获得
作为导入DNA，使用基于EF-1α启动子·终止子的直链Neor表达盒(EF-Neor)。条件研究的结果为，在电穿孔法中，以极低的基因导入效率(10-1cfu/μgDNA以下)得到转化体。而且，可知在不含有G418的GY液体培养基中5次次代培养后，转化体保持其G418耐药性。
xii.经以基因组DNA为模板的PCR和southern blotting的破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)ATCC 26185转化体的评价
与A.limacinum转化体的情况相同，通过以基因组DNA为模板的PCR(图21A、B)和southern blotting的Neor的检出(图21C)，确认EF-Neor被随机地插入染色体DNA。但是，关于分析的3个转化体中的1个(转化体2)，提示终止子区域的一部分的缺失(图21B，7道)。
xiii.经RT-PCR的破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)ATCC 26185转化体的评价
可知包括提示终止子区域的一部分缺失的转化体2(图22，14道)，被插入染色体DNA上的EF-Neor被转录为mRNA(图22A，B)。
xiv.裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)AL1Ac转化体的获得
作为导入DNA，使用ub-Neor。尽管各种条件研究，也没能得到使用电穿孔法的转化体。因此，在研究基因枪法时，在1100psi的射入压中，以极低的基因导入效率(10-1cfu/μgDNA以下)得到转化体。而且可知，在不含有G418的GY液体培养基中5次次代培养后，转化体保持了其G418耐药性。
xv.经以基因组DNA为模板的PCR的裂殖壶菌AL1Ac转化体的评价
与A.limacinum转化体的情况相同，通过以基因组DNA为模板的PCR(图23)，强烈提示将导入DNA片段插入了染色体DNA。
这些基因导入实验的结果表明，利用使用直链DNA的随机插入，分别使用电穿孔法或基因枪法，能够得到网粘菌4株的全部转化体(表3)。
[表3]
| 测试菌株 | 基因导入法 | 基因导入效率 |
| A.limacinum mh0186 | 电穿孔法 | ～1.2×101cfu/μg DNA |
| 金黄色破囊壶菌 | 基因枪法 | ～1.9×102cfu/μg DNA |
| Thraustochytrium sp. | 电穿孔法 | ～100cfu/μg DNA |
| 裂殖壶菌AL1Ac | 基因枪法 | ～100cfu/μg DNA |
再者，得到的转化体的G418耐药性是稳定的，在以基因组DNA为模板的PCR和southern blotting分析中，显示导入DNA被随机地插入染色体DNA。
实施例6
经转化的Aurantiochytrium limacinum mh0186和金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)ATCC 34304中的异种蛋白质的表达
(1)维多利亚多管发光水母绿色荧光蛋白质(Green Fluorescent Protein：GFP)的表达
i.GFP基因的向mh0186基因组DNA的插入
通过使用PrimeSTAR GC聚合酶试剂盒(Takara Bio公司制)的PCR扩增金黄色破囊壶菌ATCC 34304(获自美国菌种保藏中心(American type culture collection))来源的泛素基因来源的启动子区域和终止子区域以及强化GFP(enhanced GFP)基因(Clontech公司制)(PCR循环：94℃2分钟/94℃1分钟，62℃30秒，72℃1分钟，30次循环/4℃)。然后，通过使用PrimeSTAR GC聚合酶试剂盒(Takara Bio公司制)的融合PCR连接启动子区域和GFP基因(PCR循环：94℃2分钟/94℃1分钟，62℃30秒，72℃2分钟，30次循环/4℃)。然后，将其作为模板使用PrimeSTARGC聚合酶试剂盒(Takara Bio公司制)进行融合PCR，连接启动子区域·GFP基因·终止子区域((PCR循环：94℃2分钟/94℃1分钟，62℃30秒，72℃3分钟，30次循环/4℃)。将连接的DNA片段插入pGEM-T Easy载体(Promega公司制)。以该质粒作为模板，通过进行使用引物Ub-pro-F1(序列表序列号48)和Ub-term-R2(序列表序列号49)、PrimeSTAR GC聚合酶试剂盒(Takara Bio公司制)的PCR，向制备的GFP基因盒的两端附加Kpn I位点。然后，通过插入至含有人工合成耐新霉素基因盒(泛素基因来源的启动子区域和终止子区域)的pUC18载体的Kpn I位点(紧接着终止子区域后)中，制备GFP基因/耐新霉素基因表达盒。含有GFP基因/耐新霉素基因表达盒的载体被命名为pNeoGFP。
使用引物-Ub18Spro-F2(序列表序列号50)和pUC18-R(序列表序列号51)、PrimeSTAR GC聚合酶试剂盒(Takara Bio公司制)扩增制备的GFP基因/耐新霉素基因表达盒，并纯化。将纯化的DNA片段5μg导入mh0186菌株。导入使用在200ml的GY液体培养基中培养3天的细胞，将其悬浮于作为最终细胞悬浮液的0.3M山梨醇(和光纯药工业公司制)或Nucleofector溶液L(lonza公司制)中，以0.75kV、50Ω、50μF的条件通过使用GENE PULSER(注册商标)II(Bio·Rad Laboratories公司制)的电穿孔法进行基因导入操作。并且，同样地，使用Standard Pressure Kit(Bio·Rad Laboratories公司制)和PDS-1000/He系统(Bio·Rad Laboratories公司制)通过基因枪法将纯化的DNA片段0.625μg导入于200mlGY液体培养基中培养5天的金黄色破囊壶菌中。作为导入条件，在0.6微米的金粒子、靶距离6cm、真空26mmHg、爆破片1、100PSI中进行，射入涂布于PDA琼脂平板培养基(含有2mg/mlG418)的菌体中。
关于mh0186是在100ml的GY液体培养基(含有0.5mg/mlG418)中培养3天的菌体，关于金黄色破囊壶菌是在100ml起的GY液体培养基(含有2mg/mlG418)中培养7天的菌体，从所述菌体提取基因组DNA，通过使用Ultrospec3000(AmershamPharmacia Biotech公司制)测定A260/280，进行提取的基因组DNA的纯度和浓度的测定。以提取的基因组DNA作为模板，使用引物3F(序列表序列号52)、4R(序列表序列号53)、Ub-GFP-F(序列表序列号54)、UB-GFP-R(序列表序列号55)、和LA Taq HS聚合酶试剂盒(Takara Bio公司制)进行PCR(PCR循环：98℃2分钟/98℃20秒，60℃30秒，72℃1分钟，30次循环/4℃)。
使用表4所示的嵌合体引物的融合PCR的结果，完成了GFP基因·泛素基因启动子区域·泛素基因终止子区域的全部的连接。进一步地，通过将该连接片段插入含有人工合成的耐新霉素基因盒(泛素基因来源的启动子区域和终止子区域)的pUC18载体(Takara Bio公司制)的Kpn I位点(紧接着终止子区域后)，制备GFP基因/耐新霉素基因表达盒(图24)。将制备的GFP基因/耐新霉素基因表达盒导入A.limacinum mh0186菌株和破囊壶菌的结果，能够获得转化体。以对于得到的转化体的基因组DNA作为模板进行PCR时，确认确实将GFP基因和耐新霉素基因插入了GFP基因/耐新霉素基因表达盒转化体的基因组DNA中(图25)。
[表4]
Ub-pro-F1和Ub-term-R2在序列中均有Kpn I位点(下划线部分)
ii.GFP mRNA的表达
使用Sepasol RNA I Super(Nacalai Tesque公司制)，对于mh0186菌株从100mlGY液体培养基(含有0.5mg/ml G418)中培养3天的菌体提取总RNA，对于金黄色破囊壶菌是从100ml起的GY液体培养基(含有2mg/ml G418)中培养7天的菌体提取总RNA。然后，使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司制)进行总RNA的净化。进一步地，通过进行使用Cloned DNase I(Takara Bio公司制)的DNase处理，纯化高纯度的总RNA，通过使用Ultrospec 3000(Amersham Pharmacia Biotech公司制)测定A260/280，进行纯化的总RNA的纯度和浓度的测定。然后，使用PrimeScriptTM逆转录酶(Takara Bio公司制)从纯化的总RNA制备cDNA。以制备的cDNA为模板，进行使用引物3F(序列表序列号52)、4R(序列表序列号53)、Ub-GFP-F(序列表序列号54)、UB-GFP-R(序列表序列号55)、LA Taq HS聚合酶试剂盒(Takara Bio公司制)的PCR(PCR循环：98℃2分钟/98℃20秒，60℃30秒，72℃1分钟，30次循环/4℃)。
其结果，显示将被插入的GFP基因和耐新霉素基因转录为mRNA(图26)。
iii.GFP的表达
将对于mh0186菌株是在3mlGY液体培养基(含有0.5mg/ml G418)中培养3天的菌体，对于金黄色破囊壶菌是在100ml起的GY液体培养基(含有2mg/ml G418)中培养7天的菌体1ml，在室温、3500xg、离心10分钟收集菌体。用500μl灭菌SEA LIFE洗涤收集的菌体2次，于共焦激光显微镜(ECLIPSE TE2000-U；尼康公司制)下(40×60倍，油浸物镜、激发光Ar激光488nm)观察，使用EZ-C1软件(尼康公司制)得到成像。
共焦激光显微镜观察的结果，得到的GFP基因/耐新霉素基因表达盒转化体中，观察到野生型中没有看到的GFP荧光(图27)。
(2)粉核油球藻(Pinguiophyceae)的Δ12去饱和酶的表达
i.Δ12去饱和酶的克隆
用ESM培养基(用NIES保藏的培养基列表中记载的方法制备)培养Pinguiochrysis pyriformis MBIC 10872(获自海洋生物工程研究所菌种保藏中心(Marine Biotechnology Institute Culture collection))后，通过将体数增殖期后期的菌体于4℃、6000xg离心15分钟收集菌体。通过液氮冷冻收集的菌体，用苯酚/SDS/LiCl法(1)提取总RNA。使用mRNAPurification Kit(GE医疗生物科学公司制)从得到的总RNA纯化poly(A)+RNA。使用Ready-To-Go T-PrimedFirst-StrandKit(GE医疗生物科学公司制)从纯化的poly(A)+RNA制备单链cDNA。以制备的cDNA为模板，使用基于已知的Δ12去饱和酶的保守序列制备的引物F1(序列表序列号56)、R1(序列表序列号57)、和AdvantageTM2PCR试剂盒(Clontech公司制)进行PCR(PCR循环：95℃30秒，50℃30秒，68℃2分钟，40次循环/4℃)。将扩增的PCR产物插入pGEM-T easy载体(Promega公司制)后，通过电穿孔法导入感受态细胞DH5α(东洋纺织公司制)。以提取的转化体质粒为模板，使用染料终止子循环测序试剂盒(Dye Terminator Cycle Sequencing Kit)(BECKMANCOULTER公司制)，通过序列分析碱基序列。使用Lambda cDNA LibraryConstruction Kits(Stratagene公司制)构建P.pyriformis的cDNA库。通过使用ECL直接核酸标记和检测系统(Direct Nucleic Acid Labeling and Dection System)(GE医疗生物科学公司，Bio-science公司制)的菌斑杂交进行阳性克隆品的筛选。与探针一起的孵育条件设定为与8ng/ml的浓度添加的标记探针于42℃3小时，洗涤条件是，初次洗涤(无尿素)是于55℃10分钟2次，二次洗涤(无尿素)是于室温5分钟2次。探针使用的是通过以含有获得的部分序列的质粒为模板，使用引物SP1/F(序列表序列号58)、SP1/R(序列表序列号59)、和AdvantageTM2PCR试剂盒(Clontech公司制)进行PCR，扩增得到的314bp的cDNA片段(PCR循环：94℃3分钟/94℃30秒，56℃30秒，68℃1分钟，35次循环/4℃)。数次筛选后，将得到的阳性克隆品使用ExAssist辅助噬菌体(Stratagene公司制)从λ噬菌体移植入pBluescript(Stratagene公司制)。
其结果，在515bp的推测Δ12去饱和酶基因部分序列的扩增中取得成功。通过以获得的DNA片段作为探针的菌斑杂交进行含有目标基因全长的阳性克隆的筛选。结果，成功地从5.5×106个克隆中分离了7个阳性克隆。分析这些序列的结果，提示获得的基因是含有编码437氨基酸的1314bp ORF的基因。
ii.与其它生物来源的Δ12去饱和酶的比对
以P.pyriformis、真菌和原虫来源的Δ12去饱和酶的氨基酸序列为对象，通过Clustal W 1.81和ESpript 2.2(http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)进行多重序列比对分析。
其结果，可知获得的基因的氨基酸序列与其它生物来源的Δ12去饱和酶基因的氨基酸序列显示高度的同一性(图28)。而且，获得的基因的推测氨基酸序列中去饱和酶全部被保存下来，3个组氨酸盒被保存下来(图28)。
iii.系统分析
通过使用MOLPHY 2.3版计算机程序包(非专利文献13)的最大似然法作成含有P.pyriformis来源的Δ12去饱和酶，Δ12去饱和酶和Δ12/Δ15去饱和酶的分子系谱树。首先，使用全部的氨基酸序列，通过ClustalW 1.81进行多重序列比对。然后，去除不确定部分后，通过邻近结合法(2)进行以系统树作为初期系统树的最大似然系统树的探索。
其结果，获得的推测Δ12去饱和酶、其它生物来源的Δ12去饱和酶和Δ12/Δ15去饱和酶被分类为真菌和线虫类Δ12去饱和酶群、植物Δ12去饱和酶群、蓝藻菌的(cyanobacterial)和位于叶绿体的植物(chloroplast-localized plant)Δ12去饱和酶群和3个系统群。并且，获得的推测Δ12去饱和酶被归类于真菌和线虫类Δ12去饱和酶群，其与异枝水霉(Saprolegnia diclina)来源的Δ12去饱和酶为最接近(图29)。
iv.Δ12去饱和酶在酵母中的表达
以含有P.pyriformis来源的Δ12去饱和酶基因全长的质粒作为模板，使用引物Pry-F(序列表序列号60)、Pyr-R(序列表序列号61)、和PrimeSTAR GC聚合酶试剂盒(Takara Bio公司制)进行PCR，在两端添加HindIII限制酶位点和Xba I限制酶位点。通过将扩增片段插入pGEM-T-Easy载体(Promega公司制)进行序列分析，通过HindIII/Xba I处理从无扩增错误的质粒切割出Δ12去饱和酶基因，同样地插入限制酶处理的酵母用载体pYES2/CT(Invitrogen公司制)中，构建Δ12去饱和酶基因表达载体pYpΔ12Des。按照[Current Protocols in Molecular Biology，Unit 13(Ausubel等人，1994)]和[Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Gutherie和Fink，1991)]记载的方法，使用醋酸锂法，将构建的Δ12去饱和酶基因表达载体pYpΔ12Des和pYES2/CT导入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行转化体的挑选。然后，根据Qiu等的方法(Qiu，X.，等人J.Biol.Chem.(2001)276，31561-6)培养得到的转化体(pYpΔ12Des导入株和mock导入株)，进行菌体来源的脂肪酸的提取和甲酯化。在GC分析中使用气相色谱仪GC-2014(岛津制作所制)，在以下条件下进行，柱：HR-SS-10(30m×0.25mm；信和化工公司制)、柱温：150℃→(5℃/分钟)→220℃(10分钟)、载气：He(1.3mL/分钟)。并且，在GC-MS分析中，使用GC-17A和GCMS-QP-5000(岛津制作所制)，用DB-1毛细管柱(0.25mmi.d.×30m，膜厚0.25μm；安捷伦公司制)在以下条件下进行：柱温160℃→(4℃/分钟)→260℃、进样口温度250℃。并且，进一步关于分析有困难的峰，使用与上述相同的装置和柱，以240℃→(2.5℃/分钟)→260℃(15分钟→(2.5℃/分钟)→280℃的温度条件，进行分析甲代吡啶酯化(picolinyl ester)的脂肪酸。
为了验证得到的基因是否确实是编码Δ12去饱和酶，构建表达载体，以酿酒酵母(S.cerevisiae)(Invitrogen公司制)作为宿主进行表达实验。首先，进行pYpΔ12Des导入株和pYES2/CT导入株的脂肪酸组成的GC分析的结果，确认在相当于亚油酸的保留时间的位置，在pYpΔ12Des导入株中，出现了在mock对照品中没有看见的新的峰(图30)。然后，进行该新的峰的GC-MS分析的结果，可知其分子量和片段模式与标准品的亚油酸甲酯的一致(图31)。根据转化率(％)＝产物(％)/(产物(％)+底物(％))×100，计算式计算的情况，油酸向亚油酸的转化率是23.5±1.23％，没有发现对应于其它脂肪酸的活性(表5)。
[表5]
外源底物全部按照最终浓度为40μM添加。底物(％)和产物(％)均表示对于总脂肪酸的比例(GC的峰面积)。
转化率％Conversion＝100×([产物]/[产物+底物])的值是全部平均值±标准偏差，n＝3。
a内源性脂肪酸
b外源性脂肪酸
cND，检测限以下
v.Δ12去饱和酶基因向mh0186基因组DNA的插入
首先，经使用PrimeSTAR GC聚合酶试剂盒(Takara Bio公司制)的PCR扩增泛素基因来源的启动子区域和终止子区域、和Δ12去饱和酶基因(PCR循环：94℃2分钟/94℃1分钟，62℃30秒，72℃1.5分钟，30次循环/4℃)。然后，使用PrimeSTAR GC聚合酶试剂盒(Takara Bio公司制)，通过融合PCR连接启动子区域和Δ12去饱和酶基因(PCR循环：94℃2分钟/94℃1分钟，62℃30秒，72℃2.5分钟，30次循环/4℃)。然后，以此为模板，使用PrimeSTAR GC聚合酶试剂盒(TakaraBio公司制)进行融合PCR，连接启动子区域·GFP基因·终止子区域(PCR循环：94℃2分钟/94℃1分钟，62℃30秒，72℃3分钟，30次循环/4℃)。将连接的DNA片段插入pGEM-T Easy载体(Promega公司制)。以该质粒为模板，使用PrimeSTAR MAX DNA聚合酶(Takara Bio公司制)，向存在于Δ12去饱和酶基因序列中的Kpn I位点导入碱基突变。然后，切割出经Kpn I处理的连接片段，将其插入含有人工合成耐新霉素基因盒(两端连接EF1-α基因来源的启动子区域和终止子区域)的pUC18载体(Takara Bio公司制)的Kpn I位点。含有Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒的载体命名为pNeoDes12。在制备中需要的PCR引物的序列如表6所示。使用引物2F(序列表序列号62)和pUC18-R(序列表序列号51)、PrimeSTAR GC聚合酶试剂盒扩增制备的Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒，并纯化。与(1)-1相同，将纯化的DNA片段5μg导入mh0186株。作为最终细胞悬浮液使用Nucleofector溶液L(lonza公司制)。从100mlGY液体培养基(含有0.5或2mg/mlG418)中主要培养(本培養)3天的菌体提取出基因组DNA，通过使用Ultrospec 3000(Amersham Pharmacia Biotech公司制)测定A260/280而测定提取出的基因组DNA的纯度和浓度的测定。以提取出的基因组DNA为模板，使用引物3F(序列表序列号52)、4R(序列表序列号53)、ub pro-D12d-F(序列表序列号63)、ub term-Δ12d-R(序列表序列号64)、和LA Taq HS聚合酶试剂盒(Takara Bio公司制)进行PCR(PCR循环：98℃2分钟/98℃20秒，60℃30秒，72℃1.5分钟，30次循环/4℃)。
使用表6所示的嵌合体引物的融合PCR的结果，在Δ12去饱和酶基因·泛素基因启动子区域·泛素基因终止子区域全部的连接中获得成功。进一步地，通过向含有人工合成耐新霉素基因盒(EF1-α基因来源的启动子区域和终止子区域)的pUC18载体的Kpn I位点中插入此连接片段，制备Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒(图32)。将制备的Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入m0186株的结果为在获得转化体中取得了成功。对于得到的转化体在进行以基因组DNA为模板的PCR时，确认了在Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒转化体的基因组DNA中确实插入了Δ12去饱和酶基因和耐新霉素基因(图33)。
[表6]
18S和5R各自在序列中具有Ssp I位点或Pst I位点(下划线部分)。
Ub-pro-F1和Ub-term-R2在序列中均有KpnI位点(下划线部分)。
D12d-F2和D12d-R2的序列中的用粗体字斜体的文字显示导入突变的碱基。
vi.Δ12去饱和酶基因向金黄色破囊壶菌基因组DNA中的插入
使用引物2F(序列表序列号62)和pUC18-R(序列表序列号51)、PrimeSTAR GC聚合酶试剂盒扩增制备的Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒，并纯化。通过使用标准压力试剂盒(Standard Pressure Kit)(Bio·Rad Laboratories公司制)和PDS-1000/He系统(Bio·Rad Laboratories公司制)的基因枪法，向200mlGY液体培养基培养5天的菌体中导入纯化的DNA片段0.625μg。作为导入条件在0.6微米的金粒子、靶距离6cm、真空26mmHg、爆破片1100PSI条件下进行，射入至涂布于PDA琼脂平板培养基(含有2mg/mlG418)的菌体中。从100mlGY液体培养基(含有2mg/mlG418)中培养7天的菌体提取基因组DNA，通过使用UItrospec3000(Amersham Pharmacia Biotech公司制)测定A260/280进行提取出的基因组DNA的纯度和浓度的测定。以提取出的基因组DNA为模板，进行使用引物3F(序列表序列号52)、4R(序列表序列号53)、ub pro-D12d-F(序列表序列号63)、ubterm-Δ12d-R(序列表序列号64)、和LATaq HS聚合酶试剂盒(Takara Bio公司制)的PCR(PCR循环：98℃2分钟/98℃20秒，60℃30秒，72℃1.5分钟，30次循环/4℃)。
将制备的Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入金黄色破囊壶菌的结果为在获得转化体方面取得成功。对于得到的转化体在进行以基因组DNA为模板的PCR时，确认在Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒转化体的基因组DNA中确实插入了Δ12去饱和酶基因和耐新霉素基因表达盒(图34)。
vii.在Δ12去饱和酶mRNA的mh0186株中的表达
使用Sepazol RNA I Super(Nacalai Tesque公司制)从100mlGY液体培养基(含有0.5mg/mlG418)中主要培养3天的菌体提取出总RNA。与实施例1(1)-2.相同，纯化纯度高的总RNA，制备cDNA。以制备的cDNA为模板，使用引物3F(序列表序列号52)、4R(序列表序列号53)、ub pro-D12d-F(序列表序列号63)、ubterm-D12d-R(序列表序列号64)、和LA Taq HS聚合酶试剂盒(Takara Bio公司制)进行PCR(PCR循环：98℃2分钟/98℃20秒，60℃30秒，72℃1.5分钟，30次循环/4℃)。
其结果，从以cDNA为模板的PCR的结果显示被插入的Δ12去饱和酶基因和耐新霉素基因被转录为mRNA(图35)。
viii.在Δ12去饱和酶mRNA的金黄色破囊壶菌中的表达
使用Sepazol RNA I Super(Nacalai Tesque公司制)从100mlGY液体培养基(含有2mg/mlG418)中主要培养7天的菌体提取出总RNA。与实施例1(1)-2.相同，纯化纯度高的总RNA，制备cDNA。以制备的cDNA为模板，使用引物3F(序列表序列号52)、4R(序列表序列号53)、ub pro-D12d-F(序列表序列号63)、ubterm-D12d-R(序列表序列号64)、和LA Taq HS聚合酶试剂盒(Takara Bio公司制)进行PCR(PCR循环：98℃2分钟/98℃20秒，60℃30秒，72℃1.5分钟，30次循环/4℃)。
其结果，从以cDNA为模板的PCR的结果显示被插入的Δ12去饱和酶基因和耐新霉素基因被转录为mRNA(图34)。
(3)金黄色破囊壶菌来源的Δ5去饱和酶的表达
i.Δ5去饱和酶的克隆
在与金黄色破囊壶菌ATCC 34304菌种邻近的菌种破囊壶菌(Thraustochytriumsp.)ATCC 26185具有的Δ5去饱和酶序列中存在的保守区域中，制备引物3F(序列表序列号65)和1R(序列表序列号66)。然后使用Advantage 2PCR试剂盒(Clontech公司制)，进行以金黄色破囊壶菌来源的RACE cDNA库为模板的巢式PCR(PCR循环：94℃30秒，50℃30秒，72℃2分钟，30次循环)的结果为，通过插入的引物组(1RNES：序列表序列号67)能够得到目标大小的扩增片段。
在分析通过该插入的引物得到的预计大小的DNA片段(550bp)时，由于金黄色破囊壶菌具有Δ5去饱和酶，从该扩增片段制备100％匹配的引物(RACEd5F：序列表序列号68，和RACEd5FNES：序列表序列号69)，使用Advantage 2PCR试剂盒，进行RACE PCR时(PCR循环：94℃30秒，50℃30秒，72℃2分钟，30次循环)，得到700bp的Δ5去饱和酶的3’末端。
然后，虽然从该已知序列制备反向引物GSP1(序列表序列号70)进行5’RACEPCR，但是得到的5’RACE产物比预计大小短(PCR循环：94℃30秒/70℃3分钟，5次循环；94℃30秒/70℃30秒/72℃3分钟，5次循环；94℃30秒/68℃30秒/72℃3分钟，20次循环)。因此，停止了以cDNA为模板的PCR，与前述同样地进行了以基因组盒库(TaKaRa LA PCR体外克隆试剂盒)为模板的PCR(引物-GSP2(序列表序列号71))。其结果，在进行以BgIII盒库为模板的PCR时，能够获得离引物制备部位约2.5kbp的上游基因组序列。
使用基因组步移法得到的上游序列含有Δ5去饱和酶的起始密码子，在分析的基因组中途没有看到内含子的存在。并且，从3’-RACE和5’-RACE得到的序列能够获得Δ5去饱和酶的全长序列信息。其结果，得到的全长序列是由具有1320bp的ORF的439个氨基酸形成的，其具有在Δ5去饱和酶中高度保守的一个细胞色素b5区域(HPGGSI)和3个组氨酸盒(HECGH，HSKHH和QIEHH)。基于该信息，在ORF末端制得以下引物，进行以cDNA为模板的PCR(引物d5fulllengthF(序列表序列号72)和d5fulllengthR(序列表序列号73)，PCR循环：94℃30秒，60℃30秒，72℃2分钟，30次循环)，通过以上操作，分离完整长度的金黄色破囊壶菌来源的Δ5去饱和酶。
ii.与其它生物来源的Δ5去饱和酶的比对
使用金黄色破囊壶菌来源的Δ5去饱和酶和破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)ATCC 26185、盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)、大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)、土壤线虫(Caenorhabditis elegans)、利什曼虫(Leishmania major)来源的Δ5去饱和酶氨基酸序列，进行经ClustalX-1.83的多重序列比对(图35)。
其结果，显示金黄色破囊壶菌来源的Δ5去饱和酶与其它生物来源的Δ5去饱和酶基因在氨基酸水平上有显著的相同性(D.discoideum：34％，大鼠：28％，小鼠：28％，人：26％)。特别地，其显示与同属的破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)的57％这样高的同一性。
iii.系统分析
通过使用molphy的最大似然法作成包括金黄色破囊壶菌来源的Δ5去饱和酶的全部去饱和酶基因的分析系统树。首先，将全部的序列制成Fasta形式，进行使用clustalW的多重比对。然后，除去不确定的部分后，通过邻近结合法进行系统树为初期系统树的最大似然系统树的探索。
其结果表明得到的基因与原生动物来源的去饱和酶群是近缘的，其被归类为与破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)ATCC 26185和L.major来源的Δ5去饱和酶相同的系统群(图36)。
iv.Δ5去饱和酶在酵母中的表达
为了验证得到的基因是否确实是Δ5去饱和酶，进行以酿酒酵母(S.cerevisiae)为宿主的过量表达实验。首先，在最初，将得到的基因插入作为酵母用载体的pYES2/CT(Invitrogen公司制)的EcoRl/Xhol位点，构建表达载体pYΔ5des。然后，将构建的表达载体pY5Δdes导入酿酒酵母，提取出经醋酸铵法将得到的转化体的脂肪酸后将其甲基化并进行GC分析。在GC分析中使用气相色谱仪GC-2014(岛津制作所制)，用以下条件进行：柱：HR-SS-10(30m×0.25mm；信和化工公司制)、柱温：150℃→(5℃/分钟)→220℃(10分钟)、载气：He(1.3mL/分钟)。并且，在GC-MS分析中，使用GC-17A和GCMS-QP-5000(岛津制作所制)，用DB-1毛细管柱(0.25mmi.d.×30m，膜厚0.25μm；安捷伦公司制)，以柱温160℃→(4℃/分钟)→260℃、进样口温度250℃的条件进行。并且，进一步，关于分析困难的峰，使用与上述相同的装置和柱，于240℃→(2.5℃/分钟)→260℃(15分钟→(2.5℃/分钟)→280℃的温度条件进行分析甲代吡啶酯化的脂肪酸。
其结果，作为Δ5去饱和酶的前体物质被公知的二十碳四烯酸(Eicosatetraenoicacid(ETA)，C20:4Δ8，11，14，17)和二高-γ-亚麻酸(dihomo-γ-linoleic acid(DGLA)，C20:3Δ8，11，14)分别被转化为EPA和花生四烯酸(Arachidonic acid(AA)；C20:4n-6)。转化率分别为32％和27％。并且，没有发现相对于其它底物的特异性。关于经变换产生的EPA和AA通过GC-MS进行结构的确认，确实结构是一致的(图37a～c，表7)。
[表7]
转化率＝(产物×100)/(底物+产物)
v.Δ5去饱和酶基因向mh0186基因组DNA的插入
为了表达载体的构建进行金黄色破囊壶菌ATCC 34304来源的泛素基因启动子/终止子的分离。首先，使用如下的RACE法进行泛素基因的分离。最初，使用简并引物2F(序列表序列号74)，经以cDNA为模板的PCR扩增泛素基因的3’端的片段。
然后，为了得到5’-RACE产物，使用cDNA末端快速扩增用5’RACE系统2.0版(5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，version 2.0)(invitrogen公司制)，制得逆转录用引物1R(序列表序列号17)和5’RACE用引物(序列表序列号75)，进行试剂盒操作。
基于得到的泛素基因ORF序列，制得引物REVERS-U PR-1(序列表序列号22)和REVERS-U PR-2(序列表序列号23)，进行经基因组步移法的PCR(PCR循环：98℃30秒/60℃30秒/72℃2分钟，30次循环)。其结果，通过以Sall盒库为模板的PCR分离812bp的启动子区域。
然后用同样的方法进行终止子的分离，其结果得到612bp的DNA片段。
并且，作为引物，在第一个PCR中使用ubqterminal f1(序列表序列号24)，在第二个PCR中使用ter2F(序列表序列号25)，PCR循环以94℃30秒/60℃30秒/72℃3分钟，30次循环进行。将得到的扩增片段经融合PCR连接，插入至pUC18中，制得如图38a所示那样的环状载体后，通过PCR调整如图38b所示的导入基因片段。
接着，进行对于Aurantiochytrium sp.mh0186的基因导入实验。首先，将Aurantiochytrium sp.mh0186株的单菌落克隆在GY培养基中于25℃培养至接近对数增殖期后，3500xg、4℃、离心15分钟，除去上清液。将5×106个细胞悬浮于Nucleofector试剂盒L(amaxa公司制)中，使用Bio Rad基因脉冲仪II(Gene PluserII)(Bio·Rad Laboratories公司制)，以0.75kV、50Ω、50μF的条件进行与导入DNA一起的两次脉冲。迅速加入1ml的PD液体培养基于25℃进行一晚的振荡培养。然后，接种于含有0.5mg/ml的G418的PDA琼脂平板培养基中经3～4天的培养得到转化体。
接下来，为了确认得到的转化体被插入到基因组DNA中，使用作为Δ5去饱和酶扩增引物的d5fulllengthF(序列表序列号72)和d5fulllengthR(序列表序列号73)、作为耐新霉素基因扩增引物的FU2FA(序列表序列号76)和FU2RA(序列表序列号77)，以98℃10秒/98℃10秒/60℃30秒/72℃1.5分钟，30次循环的PCR程序，进行以基因组DNA为模板的PCR。
其结果，确认了导入基因的扩增，确认其确实被插入至基因组中(图39)。
vi.Δ5去饱和酶mRNA的表达
培养Aurantiochytrium sp.mh0186转化体后，按照试剂盒的操作方法，进行RNA的提取(Sepazol RNA I super；Nacalai Tesque公司制)。首先，使用PrimeScript逆转录酶(Takara Bio公司制)将从各个克隆得到的总RNA逆转录进行cDNA的合成。以得到的cDNA为模板按照如下所示的条件进行PCR。(PCR循环：98℃10秒/55℃30秒/72℃1.5分钟，30次循环)。
其结果，可以确认各目标基因的扩增(图40)。由此确认，得到的转化体将导入基因转录为mRNA进行表达。
实施例7
经转化的Aurantiochytrium limacinum mh0186的脂肪酸组成的改变
(1)通过粉核油球藻(Pinguiophyceae)来源的Δ12去饱和酶的表达的脂肪酸组成的改变
将用实施例6(2)v.能够得到的转化体克隆于10mlGY液体培养基(含有0.5mg/mlG418)中培养2天后，按照形成最终浓度为50μM添加油酸，进一步培养1天。培养后，使用实施例6(2)iv.同样的GC和GC-MS分析脂肪酸组成。在GC分析中使用气相色谱仪GC-2014(岛津制作制)，用以下的条件进行：柱：HR-SS-10(30m×0.25mm；信和化工公司制)、柱温：150℃→(5℃/分钟)→220℃(10分钟)、载气：He(1.3mL/分钟)。并且，在GC-MS分析中，使用GC-17A和GCMS-QP-5000(岛津制作所制)，用DB-1毛细管柱(0.25mmi.d.×30m，膜厚0.25μm；安捷伦公司制)，于柱温160℃→(4℃/分钟)→260℃、进样口温度250℃的条件进行。并且，进一步，关于分析困难的峰，使用与前述相同的装置和柱，于240℃→(2.5℃/分钟)→260℃(15分钟→(2.5℃/分钟)→280℃的温度条件进行分析甲代吡啶酯化的脂肪酸。作为对照，使用仅导入耐新霉素基因盒的转化体。
进行得到的转化体的脂肪酸组成的GC分析的结果，在Δ12去饱和酶基因/耐新霉素基因表达盒导入株中，在相当于亚油酸的保留时间的位置中，确认了在对照株中没有看见的新的峰(图41)。进行该新的峰的GC-MS分析的结果，可知其分子量和片段模式与标准品的亚油酸甲酯的一致(图42)。油酸向亚油酸的转化率为30.1±6.64％，没有发现对其它的脂肪酸组成的影响(图43)。
(2)经金黄色破囊壶菌来源的Δ5去饱和酶的表达的脂肪酸的变化
将实施例6(3)v.得到的转化体克隆培养3天后，进行脂肪酸甲酯的提取，使用GC分析mhneor和mhΔ5neor。并且，外源性Δ5去饱和酶向培养基中仅添加0.1mM的作为基质底物的为脂肪酸的ETA和DGTA，将其插入至网粘菌中，按照与酵母过剩表达实验同样的方法提取出脂肪酸后，进行GC分析。在GC分析中，使用气相色谱仪GC-2014(岛津制作所制)，以柱：HR-SS-10(30m×0.25mm；信和化工公司制)、柱温：150℃→(5℃/分钟)→220℃(10分钟)、载气：He(1.3mL/分钟)的条件进行。
通过导入的Δ5去饱和酶的作用转化了Aurantiochytrium sp.mh0186株中的内源性ETA，可知EPA的含有率与mhneor相比较提高了1.4倍左右(图44、表8)。并且，Δ5去饱和酶向培养基中仅添加0.1mM的作为底物的ETA和DGTA，将其插入至网粘菌中时，如同酵母Δ5去饱和酶表达实验中观察的那样，前体物质在网粘菌内被转化为EPA和AA，其含有率增加(表9、10)。并且，网粘菌中的前体物质的转化率较上述酵母的情况高，各自分别为ETA75.2％、DGLA62.9％。并且，本实验进行了3次以上的重现性确认实验，任何一次情况的结果均一致。
[表8]
[表9]
[表10]
实施例8
[向网粘菌的基因导入实验·2]
对于裂壶藻ATCC 28209、吾肯氏壶菌ATCC 28207、裂殖壶菌SEK210(NBRC102615)、裂殖壶菌SEK345(NBRC 102616)、Botryochytrium radiatum SEK353(NBRC104107)、和Parietichytrium sarkarianum SEK364进行基因导入实验。
(1)琼脂平板培养基中MIC的确定
向含有各种浓度G418的PDA琼脂平板培养基中滴入上述网粘菌类6株的预培养液5μl，于28℃培养7天后观察形成的菌落。其结果表明借鉴抗生素感受性的结果和真核生物转化体系中使用的选择标记基因，网粘菌类的转化体系中能够使用的选择标记基因是G418是有效的。
(2)金黄色破囊壶菌来源的泛素基因，和该基因表达调控区域的分离
金黄色破囊壶菌来源的泛素基因和该基因表达调控区域的分离按照与实施例3相同的方法进行。
(3)耐药性基因表达盒的制备
耐药性基因表达盒的制备按照与实施例4相同的方法进行。
(4)基因导入实验
进行使用基于泛素启动子·终止子的直链Neor表达盒(ub-Neor)的基因导入实验。该盒是这样：以实施例4-ii得到的pUBNeomycin r为模板，使用LAtaq Hot StartVersion(Takara Bio公司制)，进行使用1对寡核苷酸引物NeoF(序列表序列号78)/NeoR(序列表序列号79)的PCR，将得到的扩增产物凝胶纯化得到的物质。
基因导入实验用电穿孔法进行。即，使用GY液体培养基或H液体培养基，将网粘菌类于28℃、150rpm培养至对数增殖期前期～后期后，3500xg、4℃离心10分钟，除去上清液。将得到的菌体悬浮于灭菌1.75％海洋生物(Marine tech公司制)后，经再次离心操作洗涤菌体。然后，将5×106个细胞和导入DNA的ub-Neor悬浮于基因导入试剂NucleofectorR溶液L(amaxa公司制)，使用基因脉冲发生器(Gene Pulser)(Bio Rat Laboratories公司制；1mm间隙皿(gap cuvette))施加电脉冲(脉冲条件：50μF/50Ω/0.75kV，加压次数2次)。施加电脉冲后立刻加入1mlGY液体培养基，于28℃进行12小时培养。然后，将培养液涂布于含有2.0mg/ml(吾肯氏壶菌ATCC 28207、裂殖壶菌SEK210、和Parietichytrium sarkarianum SEK364)或1.0mg/ml(Botryochytrium radiatum SEK353、裂壶藻ATCC 28209和裂殖壶菌SEK345)的G418的PDA琼脂平板培养基中于28℃进行静置培养，观察赋予G418耐药性的转化体的菌落的形成。
其结果，在使用直链DNAub-Neor的情况中，发现以～1.6×100cfu/μgDNA的效率显示G418耐药性的菌落的出现。并且，可知得到的转化体即使在不含有G418的GY液体培养基中5次次代培养后也能保持其G418耐药性，在以G418耐药性为指标的情况中，确认赋予的性质是稳定的。
(5)经以基因组DNA为模板的PCR的转化体的评价
用含有1.0和2.0mg/mlG418的GY液体培养基培养得到的转化体，野生株用不含有G418的GY液体培养基培养。使用ISOPLANT(Nacalai Tesque公司制)，从两株菌体进行基因组DNA的提取。然后，以得到的基因组DNA为模板，经使用KOD FX(东洋纺生命科学公司制)的PCR进行Neor的扩增。使用的寡核苷酸引物是NeoF(序列表序列号78)/NeoR(序列表序列号79)(PCR循环：94℃2分钟/98℃10秒，68℃30秒，72℃2分钟，30次循环/4℃)。
该结果是在转化体中，观察到野生株中看不到的Neor特异性扩增(图45)。由此表明，导入的ub-Neor插入到染色体DNA上。
实施例9
[金黄色破囊壶菌中ω3去饱和酶基因的表达]
[实施例9-1]SV40终止子序列的亚克隆
以pcDNA3.1Myc-His载体为模板，通过PrimeSTAR聚合酶(Takara Bio公司制)扩增SV40终止子序列。使用的PCR引物按照如下所述，RH058设定于SV40终止子序列上，其含有BgIII和BamHI连接子序列。RH052设定于SV40终止子序列上，含有BgIII序列。[RH058：34mer：5’-CAG ATC TGG ATC CGC GAA ATG ACCGAC CAA GCG A-3’(序列号：80)，RH052：24mer：5’-ACG CAA TTA ATG TGA GAT CTA GCT-3’(序列号：81)]。用下述条件扩增后，克隆于pGEM-T easy vector(Promega公司制)。[PCR循环：98℃2分钟/98℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，30次循环/72℃1分钟]。在大肠杆菌中扩增后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit确认序列。将其命名为pRH27。
含有亚克隆的SV40终止子序列(342bp，序列号：82)的质粒(pRH27)如图46所示。
[实施例9-2]耐杀稻瘟菌素基因盒的制备
以金黄色破囊壶菌ATCC34304的基因组DNA为模板，通过PrimeSTAR GC聚合酶扩增泛素启动子序列(618bp，序列号83)。使用的PCR引物如下所述，RH053设定于泛素启动子序列上，含有BgHI连接子序列。RH048含有泛素启动子序列和耐杀稻瘟菌素基因序列。[RH053：36mer：5’-CCC AGA TCT GCC GCA GCG CCTGGT GCA CCC GCC GGG-3’(序列号：84)，RH048：58mer：5’-CTT CTT GAG ACAAAG GCT TGG CCA TGT TGG CTA GTG TTG CTT AGG TCG CTT GCT GCTG-3’(序列号：85)]。[PCR循环：98℃2分钟/98℃10秒，68℃1分钟，30次循环/68℃1分钟]。
以pTracer-CMV/Bsd/lacZ为模板，通过PrimeSTAR GC聚合酶扩增耐杀稻瘟菌素基因(432bp，序列号：86)。使用的PCR引物如下所述，RH047含有泛素启动子序列和耐杀稻瘟菌素基因序列。RH049含有耐杀稻瘟菌素基因序列，具有BgIII连接子序列。[RH047：54mer：5’-AGC GAC CTA AGC AAC ACT AGC CAA CATGGC CAA GCC TTT GTC TCA AGA AGA ATC-3’(序列号：87)，RH049：38mer：5’-CCC AGA TCT TAG CCC TCC CAC ACA TAA CCA GAG GGCAG-3’(序列号：88)]。[PCR循环：98℃2分钟/98℃10秒，68℃1分钟，30次循环/68℃1分钟]。
以序列号83和86为模板使用RH053(序列号：85)和RH049(序列号：88)进行融合PCR。酶使用LA taq Hot start version用下述条件扩增后在BgHI中消化。[PCR循环：94℃2分钟/94℃20秒，55℃30秒，68℃1分钟，30次循环/68℃1分钟。但是从55℃向68℃设为1℃/10秒](图47)。
在BgHI中消化如上所述的融合的破囊壶菌ATCC34304来源的泛素启动子-pTracer-CMV/Bsd/lacZ来源的耐杀稻瘟菌素基因(1000bp，序列号：89)，将其连接于实施例9-1记载的pRH27(图46)的BamHl位点上。将得到的质粒在大肠杆菌中扩增后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit确认序列。将其命名为pRH38。
制备的耐杀稻瘟菌素基因盒(pRH38)如图48所示。
[实施例9-3]
水霉属异枝水霉(Saprolegnia diclina)来源的ω3去饱和酶基因的克隆和基因表达质粒的制备
以金黄色破囊壶菌ATCC 34304的基因组DNA为模板，通过LA taq GC II聚合酶扩增泛素启动子序列(较长)(812bp，序列号：90)。使用的PCR引物如下所述，TM042设定于RH053(实施例9-2，序列号：84)的上游的泛素启动子序列上，含有KpnI连接子序列。TM043含有泛素启动子序列和异枝水霉来源的ω3去饱和酶基因序列。[TM042：29mer：5’-TCG GTA CCC GTT AGAACG CGT AAT AC-3’(序列号：91)，TM043：45mer：5’-TTC GTC TTA TCC TCA GTC ATG TTG GCT AGT GTT GCTTAG GTC GCT-3’(序列号：92)]。[PCR循环：96℃2分钟/98℃20秒，60℃30秒，72℃1分钟，30次循环/72℃1分钟]。
然后，用每1L的含有D-葡萄糖31.8g、酵母提取物10.6g的培养基(用去离子水调节)培养异枝水霉。将对数增殖期后期的细胞于4℃、3500xg离心5分钟制成颗粒，用液氮冷冻裂解。苯酚提取细胞裂解液后，用乙醇使其沉淀，将沉淀溶解于TE溶液。将在TE溶液中溶解的核酸于37℃用RNAase处理30分钟，分解RNA，再次苯酚提取后，用乙醇使其沉淀，将沉淀溶解于TE溶液中。测定A260/280，计算出DNA纯度和浓度。以由此得到的异枝水霉的基因组DNA为模板，通过LAtaq GC II聚合酶扩增异枝水霉来源的ω3去饱和酶基因序列(1116bp，序列号：93)。使用的PCR引物如下所述，TM044含有泛素启动子序列和异枝水霉来源的ω3去饱和酶基因序列。TM045含有异枝水霉来源的ω3去饱和酶基因序列和泛素终止子。[TM044：43mer：5’-CCT AAG CAA CAC TAG CCA ACA TGA CTG AGG ATAAGA CGA AGG T-3’(序列号：94)，TM045：40mer：5’-ATA CTA CAG ATA GCT TAGTTT TAG TCC GAC TTG GCC TTG G-3’(序列号：95)]。[PCR循环：96℃2分钟/98℃20秒，60℃30秒，72℃1分钟30秒，30次循环/72℃1分钟30秒]。
以金黄色破囊壶菌ATCC 34304基因组DNA为模板，通过LA taq GC II聚合酶扩增泛素终止子序列(614bp，序列号：96)。使用的PCR引物如下所述，TM046含有异枝水霉来源的ω3去饱和酶基因序列和泛素终止子。TM047设定于泛素终止子序列上，含有KpnI连接子序列。[TM046：44mer：5’-CCA AGG CCA AGT CGG ACTAAA ACT AAG CTA TCT GTA GTA TGT GC-3’(序列号：97)，TM047：45mer：5’-TCGGTA CCA CCG CGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACT GCA GTT-3’(序列号：98)]。[PCR循环：96℃2分钟/98℃20秒，60℃30秒，72℃1分钟，30次循环/72℃1分钟]。
以序列号90、93、96为模板，使用TM042(序列号：91)和TM047(序列号：98)进行融合PCR。酶是使用LAtaq GC II聚合酶，按照以下条件扩增。[PCR循环：96℃2分钟/98℃20秒，55℃30秒，68℃3分钟，30次循环/68℃3分钟。但是，从55℃向68℃设为10℃/10秒](图49，2463bp，序列号：99)。
以实施例9-2记载的pRH38(图48)为模板，使用RH084(序列号：100，序列后述)和RH052(实施例9-1，序列号：101)，进行PCR。RH084设定于泛素启动子上，具有KpnI连接子序列。RH052设定于SV40终止子序列上，具有BgIII连接子。酶使用LAtaq Hot Strat version，以下述条件扩增后，克隆于pGEM-T easy载体。[RH084：36mer：5’-CCC GGT ACC GCC GCA GCG CCT GGT GCA CCC GCCGGG-3’(序列号：100)]。[PCR循环：98℃2分钟/98℃10秒，68℃1分钟30秒，30次循环/68℃3分钟]。在大肠杆菌中扩增后，使用染料终止子循环测序试剂盒(Dye Terminator Cycle Sequencing Kit)确认序列。将其命名为pRH45(图50)。
将图49中融合的金黄色破囊壶菌ATCC 34304来源的泛素启动子-异枝水霉来源的ω3去饱和酶基因-金黄色破囊壶菌ATCC 34304来源的泛素终止子(序列号：99)在Kpnl中消化，将其连接于pRH45(图50)的KpnI位点。在大肠杆菌中扩增得到的质粒后，使用染料终止子循环测序试剂盒(Dye Terminator Cycle Sequencing Kit)确认序列。将其命名为pRH48。
制备的异枝水霉来源的ω3去饱和酶基因表达质粒(pRH48)如图51所示。
[实施例9-4]向金黄色破囊壶菌的水霉属来源的ω3去饱和酶表达盒质粒的导入
以实施例9-3制备的靶标载体作为模板，以TM042(实施例9-3，序列号：91)和RH052(实施例9-1，序列表：81)作为引物使用，经Prime STAR Max聚合酶扩增DNA。[PCR循环：94℃30秒，72℃1分钟，5次循环/94℃30秒，70℃30秒，72℃1分钟，5次循环/94℃30秒，68℃30秒，72℃1分钟，25次循环/72℃2分钟]。通过1.0％的琼脂糖凝胶回收扩增产物，用乙醇使其沉淀，将沉淀溶解于0.1×TE中。测定A260/280，计算出DNA浓度。经PCR得到的导入片段是3777bp，其排列成泛素启动子-ω3去饱和酶基因-泛素终止子-泛素启动子-耐杀稻瘟菌素基因序列-SV40终止子的序列(序列号：101)。
在GY培养基中培养金黄色破囊壶菌4天，在基因导入中使用有对数增殖期的细胞。对于相当于OD600＝1～1.5的细胞，经基因枪法(微载体：0.6微米的金粒子、靶距离6cm、膛真空26mmHg、爆破片：1100PSI)导入0.625？gDNA片段。将基因导入的细胞在4～6小时的恢复时间后，涂布于含有0.2mg/ml杀稻瘟菌素的PDA琼脂平板培养基中。
每射入一次，得到20至30个耐药菌株。
[实施例9-5]水霉属来源的ω3去饱和酶基因表达株的获得
从实施例9-4得到的ω3去饱和酶基因表达株提取基因组DNA后，测定A260/280，计算出DNA浓度。将其作为模板，使用LAtaq Hot start version进行基因组结构确认的PCR。使用的引物的位置、扩增中使用的组合、扩增产物的预计大小如图52所示。TM042(实施例9-3，序列号：91)设定于泛素启动子上，TM049(实施例9-2，序列号：88)设定于耐杀稻瘟菌素基因上。[PCR循环：98℃2分钟/98℃10秒，68℃4分钟，30次循环/68℃7分钟]。
能够确认扩增为预计大小的带(图53)。能够分离导入的表达片段被稳定地导入基因组中的菌株。
[实施例9-6]在金黄色破囊壶菌中通过ω3去饱和酶表达的脂肪酸组成的变化
培养金黄色破囊壶菌和实施例9-5中得到的ω3去饱和酶表达株，冷冻干燥后，将脂肪酸甲酯化，使用GC分析。在GC分析中使用气相色谱仪GC-2014(岛津制作所制)，用以下条件进行：柱：HR-SS-10(30m×0.25mm；信和化工公司制)、柱温：150℃→(5℃/分钟)→220℃(10分钟)、载气：He(1.3mL/分钟)。
发现了在ω3去饱和酶表达株中n-6系列的脂肪酸减少、向n-3系列的脂肪酸增加的倾向(图54)。并且，在图55中显示将野生株作为100％时的比例。
其结果是，花生四烯酸减少至约1/10，DPA减少至约1/7，而且，EPA增加至约1.8倍，DHA增加至约1.2倍。
工业实用性
通过本发明，以下成为可能：改变原生藻菌产生的脂肪酸的组成，提供使原生藻菌中蓄积大量脂肪酸的方法，以较高的效率制造多不饱和脂肪酸。
Claims (22)
1.一种原生藻菌的转化方法，其特征在于向原生藻菌中导入外源基因。
2.根据权利要求1所述的原生藻菌的转化方法，其中所述原生藻菌为网粘菌类。
3.根据权利要求2所述的原生藻菌的转化方法，其中所述网粘菌类为属于网粘菌属Labyrinthula、交链孢霉属Altornia、Aplanochytrium属、Japonochytrium属、Labyrinthuloides属、裂殖壶菌属Schizochytrium、Aurantiochytrium属、破囊壶菌属Thraustochytrium、吾肯氏壶菌属Ulkenia、Oblongichytrium属、Botryochytrium属、Parietichytrium属、或Sicyoidochytrium属的微生物。
4.根据权利要求1-3任一项所述的原生藻菌的转化方法，其中所述微生物是裂殖壶菌Schizochytrium sp.M-8株(FERM P-19755)、金黄色破囊壶菌Thraustochytriumaureum ATCC34304、破囊壶菌Thraustochytrium sp.ATCC26185、裂殖壶菌Schizochytrium sp.AL1Ac、裂壶藻Schizochytrium aggregatum ATCC 28209、吾肯氏壶菌Ulkenia sp.ATCC28207、裂殖壶菌Schizochytrium sp.SEK210(NBRC 102615)、裂殖壶菌Schizochytrium sp.SEK345(NBRC 102616)、Botryochytrium radiatumSEK353(NBRC 104107)、或Parietichytrium sarkarianum SEK364(FERMABP-11298)。
5.根据权利要求1-4任一项所述的原生藻菌的转化方法，其中所述外源基因是与抗生素耐药性、发色蛋白质、和/或脂肪酸不饱和化酶相关联的基因。
6.根据权利要求1-5任一项所述的原生藻菌的转化方法，其中所述脂肪酸不饱和化酶相关联的基因是Δ5去饱和酶基因、Δ12去饱和酶基因、和/或ω3去饱和酶基因。
7.根据权利要求1-6任一项所述的原生藻菌的转化方法，其特征在于通过电穿孔法或基因枪法导入外源基因。
8.一种改变原生藻菌的脂肪酸组成的方法，其特征在于导入脂肪酸不饱和化酶基因，表达该脂肪酸不饱和化酶基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述脂肪酸不饱和化酶是去饱和酶。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述脂肪酸不饱和化酶是Δ5去饱和酶、Δ12去饱和酶基因、或ω3去饱和酶。
11.根据权利要求8-10任一项所述的方法，其中所述原生藻菌为网粘菌类。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述网粘菌类为属于网粘菌属Labyrinthula、交链孢霉属Altornia、Aplanochytrium属、Japonochytrium属、Labyrinthuloides属、裂殖壶菌属Schizochytrium、Aurantiochytrium属、破囊壶菌属Thraustochytrium、吾肯氏壶菌属Ulkenia、Oblongichytrium属、Botryochytrium属、Parietichytrium属、或Sicyoidochytrium属的微生物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述微生物是裂殖壶菌Schizochytriumsp.M-8株(FERM P-19755)、金黄色破囊壶菌Thraustochytrium aureum ATCC34304、破囊壶菌Thraustochytrium sp.ATCC26185、裂殖壶菌Schizochytrium sp.AL1Ac、裂壶藻Schizochytrium aggregatum ATCC 28209、吾肯氏壶菌Ulkenia sp.ATCC28207、裂殖壶菌Schizochytrium sp.SEK210(NBRC 102615)、裂殖壶菌Schizochytrium sp.SEK345(NBRC 102616)、Botryochytrium radiatum SEK353(NBRC 104107)、或Parietichytrium sarkarianum SEK364(FERM ABP-11298)。
14.通过权利要求8-13任一项所述的方法，使原生藻菌大量地蓄积脂肪酸的方法。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述脂肪酸为不饱和脂肪酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述不饱和脂肪酸为碳原子数是18～22的不饱和脂肪酸。
17.通过权利要求14-16任一项所述的方法得到的脂肪酸。
18.以脂肪酸组成的改变为目的的被转化的原生藻菌。
19.以使脂肪酸大量蓄积为目的的被转化的原生藻菌。
20.根据权利要求18或19所述的原生藻菌，其为网粘菌类。
21.根据权利要求20所述的原生藻菌，其中所述网粘菌类为属于网粘菌属Labyrinthula、交链孢霉属Altornia、Aplanochytrium属、Japonochytrium属、Labyrinthuloides属、裂殖壶菌属Schizochytrium、Aurantiochytrium属、破囊壶菌属Thraustochytrium、吾肯氏壶菌属Ulkenia、Oblongichytrium属、Botryochytrium属、Parietichytrium属、或Sicyoidochytrium属的微生物。
22.根据权利要求21所述的原生藻菌，其中所述微生物是裂殖壶菌Schizochytrium sp.M-8株(FERM P-19755)、金黄色破囊壶菌Thraustochytriumaureum ATCC34304、破囊壶菌Thraustochytrium sp.ATCC26185、裂殖壶菌Schizochytrium sp.AL1Ac、裂壶藻Schizochytrium aggregatum ATCC 28209、吾肯氏壶菌Ulkenia sp.ATCC28207、裂殖壶菌Schizochytrium sp.SEK210(NBRC 102615)、裂殖壶菌Schizochytrium sp.SEK345(NBRC 102616)、Botryochytrium radiatumSEK353(NBRC 104107)、或Parietichytrium sarkarianum SEK364(FERMABP-11298)。
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