CN106916796A - 裂殖壶菌delta-12脂肪酸脱饱和酶相关序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及裂殖壶菌delta-12脂肪酸脱饱和酶相关序列及其应用。具体而言，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还涉及所述多肽的编码序列，含所述编码序列的核酸构建物，含所述构建物的宿主细胞，与野生型相比能生产亚油酸的裂壶藻及其制备方法，以及提高裂壶藻产C16:1、C18:2、C20:4或EPA的方法。

Description

裂殖壶菌delta-12脂肪酸脱饱和酶相关序列及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及裂殖壶菌delta-12脂肪酸脱饱和酶相关序列及其应用。

背景技术

△12脂肪酸脱饱和酶(脂肪酸脱氢酶或FAD2)是胞内膜结合酶，负责在单不饱和脂肪酸碳链的第12位和13位碳原子之间引入一个双键，形成多不饱和脂肪酸，是催化胞内油酸到亚油酸代谢途径的酶。

现已有多个△12脂肪酸脱饱和酶申请，如US20090186362，US20070254299，US20070028328，US20060263867，US20060263866，US20050043527，US20031072398，US9057083，US7262343，US7214491，US2009186362，US2003172398，WO2004104167，CN104212819，CN102220352，CN102199661，CN102021188。该基因一般用于构建产多不饱和脂肪酸重组微生物或植物，如杜邦公司CN200480019580.3中的重组酵母，澳大利亚联邦科学技术研究组织的CN200980154876.9和CN201210006139.8中的重组细胞，用于生产长链多不饱和脂肪酸；巴斯夫公司的CN200580007428.8中，构建的转基因植物生产多不饱和脂肪酸专利等等，都有用到△12脂肪酸脱饱和酶。虽然选作产脂重组生物的宿主大多都具备较高的产脂肪酸能力，但为了获得更高效率，突破宿主自身的代谢调控束缚，一般都需要以重组表达的方式，构建一整套的脂肪酸脱饱和、延长系统，包含△9，△12和/或△15三个脂肪酸脱饱和酶，实现亚油酸、亚麻酸合成的加强，然后根据产物的需要选择△6，或△6，△5，或△6，△5，△4脱饱和酶，用来特异地生产C18:4SDA，C20:4ARA，C20:5EPA，C22:6DHA等脂肪酸。基本上△12是改造必需的基因。

裂殖壶菌(Schizochytrium)又称裂壶藻，属于破囊壶菌科的一类海洋真菌。裂壶菌能够积累大量活性物质，如DHA、胡萝卜素、虾青素。采用葡萄糖或甘油做碳源发酵，细胞干重可达到150克/升，油脂占细胞干重能到70％以上，DHA占总脂肪酸35％以上，且主要以甘三酯形式存在，少量以卵磷脂形式存在〔魏萍等，裂殖壶菌发酵生产DHA研究进展，食品工业科技，2010，20:398-404〕。

裂殖壶菌内有两套脂肪酸合成途径，其中FAS(Fatty acid synthase)系统直接产物为C14:0和C16:0脂肪酸，然后通过脂肪酸延长、去饱和系统衍生为其他产物。PKS(polyketide synthase or PUFA synthase)系统直接产物为C22:5(DPA)和C22:6(DHA)。有研究者通过添加放射性底物的方式研究了裂壶藻内脂肪酸的代谢途径〔Lippmeier et al.Characterization of both polyunsaturatedfatty acid biosynthetic pathways in Schizochytrium sp.,Lipids,2009,44:621-630〕。该文章发现裂壶藻内无法检测到△9以及△12两种脂肪酸脱饱和酶的活性，但裂壶藻在多篇公开发表的发酵结果中可以检出油酸(△9脱饱和酶的产物)，但亚油酸始终未见报道，因此目前认为裂壶藻内不存在△12脱饱和酶，这是经典FAS产物衍生途径无法产生DHA的主要原因。

不过，有文章报道了裂壶藻亲缘菌破囊壶菌(Thraustochytrium)中发现了△12脂肪酸脱饱和酶〔Takanori Matsuda,et al.,The analysis of△12-fatty aciddesaturase function revealed that two distinct pathways are active fro the synthesisof polyunsaturated fatty acids in Thraustochytrium aureum ATCC 34304，Journalof lipid research,2012〕。

发明内容

本发明从裂壶藻基因组中扩增出△12-脱饱和酶的基因，并将之构建到裂壶藻内进行内源性表达。结果在重组裂壶藻胞内检测到了亚油酸，而野生型菌或转化有其他脂肪酸脱饱和酶的重组裂壶藻中未能检出。表明该基因具有△12-脱饱和酶活性。

具体而言，本发明提供一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明第二方面提供一种多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成。

本发明还提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本发明所述的多核苷酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体或表达载体。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物含有35S启动子。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物以pGAPZαA质粒为骨架。

本发明还提供一种宿主细胞，所述细胞含有本发明所述核酸构建物。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为植物细胞。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为微生物细胞。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。

本发明还提供一种裂壶藻，所述裂壶藻与野生型相比能产生亚油酸。

在一个或多个实施方案中，所述裂壶藻含有含本发明所述的多核苷酸序列的核酸构建物。

在一个或多个实施方案中，与野生型相比，所述裂壶藻产C16:1、C18:2、C20:4和/或EPA的能力提高。

本发明还提供一种制备产亚油酸的裂壶藻的方法，所述方法包括将含本发明的多核苷酸序列的核酸构建物转入所述裂壶藻细胞中的步骤。

本发明还提供一种提高裂壶藻产C16:1、C18:2、C20:4和/或EPA的方法，所述方法包括将含本发明的多核苷酸序列的核酸构建物转入所述裂壶藻细胞中的步骤。

附图说明

图1显示DHA的产生途径。裂壶藻脂肪酸的合成天然地被阻断在C18:2的产生这一步，18:3、18:4、20:3、20:4、20:5等功能性脂肪酸无法合成，FAS产物的脂肪酸停留在功能较弱的C16:0阶段。

图2显示本发明载体酶切产物的1％琼脂糖凝胶电泳结果。M为Takara公司DL5000DNA marker。1-4泳道分别为12des-1,12des-2,12des-3，12des-4四个克隆提取得到的重组质粒酶切结果。

图3显示本发明一个载体的结构图谱。

图4显示在NCBI上用SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列进行BlastP分析的结果。同源比对结果表明，本发明所述蛋白属于膜结合的脂肪酸脱饱和酶家族。

图5显示本发明氨基酸序列的同源性对比结果。结果显示，同源性最高的目标为Thrausotchytrium aureum的△12脂肪酸脱饱和酶，氨基酸一致性最高为47％。

图6显示为重组裂壶藻菌落PCR检验的电泳照片。A中M为Takara公司DL5000DNA Marker。1-8泳道分别为S12des-1，S12des-2，S12des-3，S12des-4，S12des-5，S12des-6，S12des-7，S12des-8，8个抗性阳性菌落PCR检验结果。B中M为Takara公司DL5000DNA Marker。4-1,4-2，4-3，4-4，4-5，4-6，4-7，4-8分别为转化有4des基因的重组裂壶藻菌落PCR检验电泳。5-1，5-2，5-3，5-4，5-5，5-6，分别为转化有5des基因的重组裂壶藻菌落PCR检验电泳。

图7显示分别对野生型(WT)以及分别转入了△4脱饱和酶、△5脱饱和酶和△12脱饱和酶的重组菌的脂质气相色谱分析结果。

具体实施方式

裂壶藻脂肪酸的合成天然地被阻断在C18:2的产生这一步，18:3、18:4、20:3、20:4、20:5等功能性脂肪酸无法合成，FAS产物的脂肪酸停留在功能较弱的C16:0阶段。本发明发现裂壶藻中△12脱饱和酶基因。该基因的发现，使基于裂壶藻FAS系统的脂肪酸组成优化成为可能。通过该基因活性的加强，促进FAS系统产物向传统多不饱和脂肪酸合成途径的转移，充分发挥裂壶藻高效产脂的性能，从而得到DHA+功能油脂的优秀生产菌株。

本发明的△12脱饱和酶具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明还包括在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的基础上用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时所获得的多肽。这种保守性取代通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。

本发明因此包括在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO：2所具备的脂肪酸脱饱和酶活性的由SEQ ID NO:2衍生的多肽。所述几个通常为10个以内，优选8个以内，更优选5个以内。

本领域技术人员可采用常规的技术手段判断SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中哪些氨基酸残基可被取代或删除。例如，通过比对来自不同种属、活性相同或类似或明显不同的序列，可以判断这些序列中哪些氨基酸残基是可以被取代或删除。可采用本领域常规的方法(包括本发明所公开的方法)验证这样的序列是否具备本发明所述的酶活。

此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。本发明氨基酸序列的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。使用的标签例子包括Poly-Arg，如RRRRR；Poly-His 2-10个(通常6个)，如HHHHHH；FLAG，即DYKDDDDK；Strep-TagII，即WSHPQFEK；和C-myc，即WQKLISEEDL。应理解，这些氨基酸序列的存在不会影响到所得多肽的活性。因此，本发明也包括在本发明多肽的C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸所得的多肽，这些多肽仍具有本文所述的pNPPC水解活性。

因此，本发明也包括与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％，更优选至少99％序列相同性的氨基酸序列。可采用常规的手段计算比对的两条序列的序列相同性，例如，采用NCBI提供BLASTP，采用默认参数进行比对。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本申请包括本发明多肽的编码序列。SEQ ID NO:1显示了本发明多肽的编码序列之一。所述“编码序列”包括与SEQ ID NO:1高度同源的序列或在严格条件下与SEQ ID NO：1杂交的核苷酸序列或与上述分子高度同源的家族基因分子。编码本发明多肽的序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码包含SEQID NO：2所示的氨基酸序列，但与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有差别的核苷酸序列。

编码本发明多肽的序列包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明的多肽的编码序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可先采用常规的技术手段从裂壶藻中获取基因组DNA，然后再根据本发明所公开的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，用于从裂壶藻基因组DNA中扩增出△12脱饱和酶基因。

因此，本发明也包括本发明编码序列的片段，所述片段通常长10～40个碱基，能作为引物或探针使用。“片段”在本文中指全长序列的连续的一部分序列。

本发明另一方面也涉及一对引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和4所示。

本发明也涉及包括核酸构建物，该核酸构建物含有本发明的编码序列以及与该编码序列操作性连接并指导该编码序列在宿主细胞中在合适的条件下表达的一个或多个调控序列。编码本发明多肽的多核苷酸可以各种方式被操作，以保证该多肽的表达。在其插入载体之前该多核苷酸序列的操作可能根据该表达载体而是合乎需要或必需的。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

调控序列可以是合适的启动子序列，为由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列包含接到多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。适用于本发明的启动子序列例子包括35S启动子。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，为由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。签到序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

调控序列也可以是编码与多肽的氨基酸末端连接的氨基酸序列并且指导该编码的多肽进入细胞分泌途径的信号肽编码区。核苷酸序列编码序列的5′端可固有地包含天然连接具有编码分泌多肽的编码区节段的翻译阅读框的信号肽编码区。备选地，编码序列的5′端可包含与该编码区外源的信号肽编码区。当编码序列非天然地包含信号肽编码区时，可能需要外来的信号肽编码区。备选地，外来的信号肽编码区可简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区，即分泌进入培养基，都可用于本发明。

本发明也涉及包括本发明多核苷酸的重组表达载体。在此各种核酸和调控序列可被连接在一起以产生可能包括一个或多个容许在这种位点插入或取代该编码多肽的核苷酸序列的方便限制性位点的重组表达载体。在制造表达载体时，编码序列位于载体中以使得该编码序列可操作地连接用于表达适当调控序列。

重组表达载体可以是能够方便地经受重组DNA方法并且可导致感兴趣的核苷酸序列表达的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与其中被导入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性或闭合的环形质粒。

载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于保证自我复制的任何方式。备选地，载体可以是当被导入宿主细胞时，整合到基因组中并且与其已经被整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可使用一起包含将被导入宿主细胞基因组的总DNA的单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒，或转座子。

本发明的载体优选包含一个或多个容许容易选择转化、转染、转导等细胞的可选择标记。可选择的标记是基因，其产物提供对抗生素或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型等。

本发明的载体优选包含容许该载体整合进入宿主细胞基因组或该载体在细胞中独立于基因组自主个复制的元件。

一个以上拷贝的本发明的多核苷酸可被插入宿主细胞以增加该基因产物的产量。多核苷酸拷贝数的增加可通过将至少一个附加拷贝的序列整合进入宿主细胞基因组或通过包括可扩增的选择标记基因和该多核苷酸来获得，其中包含扩增拷贝的选择标记基因并且由此包含附加拷贝多核苷酸的细胞可通过在存在适当的选择剂时培养该细胞来筛选。

本发明的载体优选包含人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。

本发明的表达载体更为优选包含有连续6个组氨酸序列的小肽，有利于蛋白质的提取和纯化。

本发明也涉及包括被用于重组生产多肽的本发明多核苷酸的重组宿主细胞。包括本发明多核苷酸的载体被导入宿主细胞以使得该载体如早先说明的作为染色体的组成部分或作为染色体外的自我复制载体来维持。宿主细胞的选择很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是植物细胞或单细胞微生物或非单细胞微生物。单细胞微生物例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌等；或链霉菌细胞，例如钱青紫链霉菌；或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌和假单胞菌属。在优选的方面，细菌宿主是枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和大肠杆菌细胞。

宿主细胞也可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物、酵母或真菌细胞。在优选的方面，宿主细胞是真菌细胞，如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门等。

在更优选的方面，宿主细胞是原核细胞。如在此使用的“原核细胞”包括假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链霉菌属(Streptomyces)以及埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。在更为优选的方面，宿主细胞是假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属以及埃希氏菌属的细胞。

在最优选的方面，宿主细胞是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、大肠杆菌(Escherichia coli)以及变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)等。在另外最优选方面，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。

本发明还包括一种裂壶藻，与野生型相比，所述裂壶藻能产生亚油酸(C18:2)。优选的是，与野生型相比，所述裂壶藻产C16:1、C18:2、C20:4、或EPA的能力提高。

“野生型”裂壶藻在本文中指购自ATCC，编号ATCC20888的裂壶藻。

本发明的裂壶藻优选含有含本发明所述的多核苷酸序列的核酸构建物。

可采用常规的转染方法将含本发明多核苷酸序列的核酸构建物转入裂壶藻中。转染通常分为瞬时转染和稳定转染。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天。稳定转染中，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。转染的技术手段包括化学转染和物理转染，前者如DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法和人工脂质体法，后者如显微注射、电穿孔和基因枪等。

本发明还提供一种制备产亚油酸的裂壶藻的方法，所述方法包括将含本发明的多核苷酸序列的核酸构建物转入所述裂壶藻细胞中的步骤。

本发明还提供一种提高裂壶藻产C16:1、C18:2、C20:4和/或EPA的方法，所述方法包括将含本发明的多核苷酸序列的核酸构建物转入所述裂壶藻细胞中的步骤。

本发明上述方法中，在将含本发明多核苷酸序列的核酸构建物转入裂壶藻细胞中后，可采用常规的发酵裂壶藻的方法进行发酵，从而制备获得含有C18:2、C16:1、C20:4和EPA的脂质。

下文将以具体实施例的方式描述本发明。应理解，本发明并不限于这些具体的实施方式。实施例中所采用的反应试剂、条件等，除非另有说明，否则为本领域常规的试剂、条件等。

实施例1

接种裂壶藻(Schizochytrium sp.ATCC 20888)到50ml YPD液体培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，pH 6.5)中培养48h，4℃4000rpm离心5min收集菌体并用去离子水洗涤2遍，将菌体在液氮中磨碎，然后使用Takara公司MiniBEST Universal Genomic DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

以基因组DNA为模板，分别使用引物12U：

aagcggcggccgcatgtgcaaggtcgagaccaag(SEQ ID NO:3)及引物12D：

gttctagaacgaggacctttgc(SEQ ID NO:4)；使用引物4U：

aaagcggccgcatgacggtcgggtacgacgag(SEQ ID NO:5)及引物4D：

aaatctagaacagcccgcgccgcatgc(SEQ ID NO:6)；使用引物5U：

aaagcggccgcatgggcaagggcagcgag(SEQ ID NO:7)；5D：

aaatctagaacgtcgcgcttggcgtcgccgac(SEQ ID NO:8)及Takara公司LA-taq酶扩增疑似△12脱饱和酶基因，△4脱饱和酶基因，△5脱饱和酶基因。通过引物，在这三个基因扩增产物的5’端引入NotI限制性内切酶位点，在3’端引入XbaI限制性内切酶位点。

PCR体系为50ul，组成为水13.5ul、2×GC I缓冲液25ul、dNTPs 6ul、引物各2ul(20μM母液)、LA-Tag 0.5ul，模板1ul。

PCR扩增程序为：98℃变性5分钟；12个循环的热不对称PCR：95℃30秒、63℃30、72℃1.5min、95℃30秒、63℃30、72℃1min、95℃30秒、44℃30、72℃1.5min；72℃10分钟。

PCR产物使用Omega公司Cycle Pure试剂盒纯化，纯化物经1％琼脂糖凝胶电泳检验。然后使用NEB公司NotI-HF酶切，酶切体系为水25μl，4#缓冲液10μl，PCR产物60μl，NotI–HF 5μl，酶切在37℃水浴中进行2h。使用Omega公司Cycle Pure试剂盒纯化酶切的产物，纯化物用去离子水洗脱成30μl。

使用引物35SU：aaaAGATCTaatggcgaatgctagagcagctt(SEQ ID NO:9)及，35SD：aaccatggtcaagagtcccccgtgttctctcc(SEQ ID NO:10)及，以pCAMBIA1301(Cambia公司)质粒为模板，扩增35S启动子片段。

PCR体系为PCR体系为PCR体系为水18.1μl，dNTPs(各2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液2.5μl，20uM引物各1μl，0.4μl Ex-Taq DNA聚合酶。

PCR反应条件为：95℃5分钟；30个循环的95℃50s、52℃40s、72℃30s；72℃10min。

PCR产物使用Omega公司Cycle Pure试剂盒纯化回收后，使用NEB公司NotI-HF限制性内切酶单切，体系为：水23μl；3#缓冲液5μl；PCR产物20μl；酶2μl。37℃酶切2h。然后使用Omega公司CyclePure试剂盒回收纯化，获得35S启动子酶切的片段。

使用Fermentas公司T4DNA连接酶将基因酶切片段与35S启动子酶切载体连起来，连接体系为：水15.5μl，10×T4DNA连接酶缓冲液2μl，基因片段2μl，载体片段0.5μl。连接条件为16℃2h。取连接物1μl作为模板，进行PCR扩增，使用引物35SU及12D；35SU及4D；35SU及5D分别扩增12des、4des、5des的35s-基因构建片段。PCR体系为水18.1μl，dNTPs(各2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液2.5μl，20uM引物各1μl，0.4μl Ex-Taq DNA聚合酶，模板1μl；PCR反应条件为：95℃5分钟；30个循环的95℃50s、52℃40s、72℃90s；72℃10min。

PCR产物使用Omega公司Cycle Pure试剂盒纯化回收得到35s-12des片段，35s-4des片段，35s-5des片段，然后使用NEB公司BglII、XbaI限制性内切酶双切，体系为：水20μl；3#缓冲液5μl；PCR产物20μl；酶各2.5μl。37℃酶切2h。

然后使用Omega公司Cycle Pure试剂盒回收纯化，获得35S启动子-基因的连接片段酶切物。同时使用BglII、XbaI双酶切pGAPZαA质粒，酶切体系为水20μl；3#缓冲液5μl；PCR产物20μl；酶各2.5μl。37℃酶切2h。然后使用Omega公司CyclePure试剂盒回收纯化，得到载体酶切物。

使用Fermentas公司T4DNA连接酶将35S-12des、35S-4des、35S-5des酶切片段与载体酶切载物连起来，连接体系为：水15.5μl，10×T4DNA连接酶缓冲液2μl，基因片段2μl，载体片段0.5μl。连接条件为16℃2h。

连接物取10ul加入到200ul大肠杆菌DH5α感受态(Takara公司D9057)中，轻柔混匀，冰浴30分钟后42℃水浴热激90秒，立即冰浴2分钟并加入800ul新鲜LB培养液(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0)，37℃摇床200rpm振荡培养40分钟后涂布50ul到LB平板(LB培养液加1.8％琼脂粉，含zeocin 50ug/ml)，置37℃培养箱培养过夜。

随机接种4株具抗性的菌落到5ml LB培养液中(含50ug/ml zeocin)，37℃摇床200rpm振荡培养过夜，使用Axygen质粒提取试剂盒提取质粒，并使用BglII、XbaI双酶切鉴定，酶切体系为：水11μl；3#缓冲液2μl；质粒产物6μl；酶各1μl。同时酶切pGAPAαA空质粒对照。酶切在37℃水浴中保温2h。酶切产物直接使用1％琼脂糖凝胶电泳检验。酶切产物理论大小为1.9kb的基因片段+2.3kb的剩余载体。电泳结果如图2所示，载体图谱如图3所示。

将载体送出测序，所得序列如SEQ ID NO:1所示。推测的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

将上述氨基酸序列在NCBI上进行BlastP分析，同源比对结果如图4所示。结果表明，该基因属于膜结合的脂肪酸脱饱和酶家族。

同源性最高的目标为Thrausotchytrium aureum的△12脂肪酸脱饱和酶，氨基酸一致性最高为47％，如图5所示。

实施例2

按照CN02812059所述的方法，将所构建的载体使用基因枪法转化到裂壶藻细胞中。转化后的细胞涂布在含100ug/ml博莱霉素的平板(2％葡萄糖，1％酵母粉，2％蛋白胨，1.8％海盐，2％琼脂)，于28℃培养箱中培养4天。

将抗性菌落转接到筛选平板上，再次进行培养。直至菌落长出。挑选单菌落进行菌落PCR。在无菌PCR中加入10μl无菌的0.5％Triton x-100水溶液，挑裂壶藻单菌落进去并悬浮均匀，将PCR管水浴煮沸10min，稍微离心后取上清作为模板，进行菌落PCR扩增。PCR使用引物对35SU及AOXTT引物：GGCAAATGGCATTCTGACAT(SEQ ID NO:11)，PCR体系为水33.5μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，AOXTT 1μl，35SU1μl，rTaq酶0.5μl，模板5μl。PCR程序为PCR反应条件为：95℃5分钟；30个循环的95℃50s、50℃40s、72℃2min；72℃10min。所得PCR检验阳性的菌标记为12des。按照相同的步骤，得到4des、5des的重组裂壶藻。分别为表达疑似△4脂肪酸脱饱和酶基因的重组裂壶藻，表达疑似△5脂肪酸脱饱和酶基因的重组裂壶藻。

挑选菌落PCR阳性的裂壶藻S12des-1，S4des-1及S5des-1，接种到种子培养基中(2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母粉，1.8％海盐，pH6.5)，28℃200rpm摇床培养2天得到种子液。然后按10％的比例转接到发酵培养基中(2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母粉，1.8％海盐，pH6.5)，28℃200rpm培养4天。

室温下，于4000rpm离心5min收集细胞，60℃烘箱烘干，并在研钵中磨成粉。按照文献公开的方法(蒋霞敏，郑亦周，14种微藻总脂含量和脂肪酸组成研究，《水生生物学报》，2003，27(3):243-247)提取脂质并甲酯化，进行气象色谱分析。

显然，野生型菌株(WT)以及转化有其他脱饱和酶基因的重组菌(△4脱饱和酶，△5脱饱和酶)都没有检出亚油酸(C18:2)，而转化有△12脱饱和酶的重组菌有亚油酸的明显变化，油酸的含量显著降低。表明本发明所获基因有△12脂肪酸脱饱和的活力。此外，C16:1的含量也显著增加，怀疑该基因可能还有△9脱饱和酶的活力。

几株藻内脂肪酸组成为：

Claims (10)

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种多核苷酸序列，选自：

(1)编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸序列；

(2)(1)所述的多核苷酸序列的互补序列；和

(3)(1)或(2)所述多核苷酸序列的长10－40个碱基的片段。

3.如权利要求2所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。

4.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物含有权利要求2－3中任一项所述的多核苷酸序列，优选地，所述多核苷酸序列为克隆载体或表达载体。

5.如权利要求4所述的核酸构建物，其特征在于，

所述核酸构建物含有35S启动子，或

所述核酸构建物以pGAPZαA质粒为骨架。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求4或5所述的核酸构建物，优选地，所述宿主细胞为植物或微生物细胞，更优选为大肠杆菌细胞。

7.一种裂壶藻，其特征在于，所述裂壶藻与野生型相比能生产亚油酸。

8.如权利要求7所述的裂壶藻，其特征在于，所述裂壶藻具有以下一个或多个特征：

所述裂壶藻含有权利要求4或5所述的核酸构建物；和

与野生型相比，所述裂壶藻产C16:1、C18:2、C20:4和/或EPA的能力提高。

9.一种制备产亚油酸的裂壶藻的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求4或5所述的核酸构建物转入所述裂壶藻细胞中的步骤。

10.一种提高裂壶藻产C16:1、C18:2、C20:4和/或EPA的方法，所述方法包括将权利要求4或5所述的核酸构建物转入所述裂壶藻细胞中的步骤。