CN102715485B

CN102715485B - 采用酯酶Est_p1制备奶味香精的方法

Info

Publication number: CN102715485B
Application number: CN2012102108562A
Authority: CN
Inventors: 李颖; 彭晴; 关国华; 王旭
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2012-06-20
Filing date: 2012-06-20
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2032-06-20
Also published as: CN102715485A

Abstract

本发明涉及一种采用酯酶Est_p1制备奶味香精的方法。包括：在奶油底物中，添加含有酯酶Est_p1的缓冲液，进行酶解反应，得到奶味香精。所用酯酶Est_p1性质优良，制备方法操作简便，由此制备的奶味香精，无有机溶剂添加，无长链脂肪酸等不良口感，更能体现奶香产品的天然风味。

Description

采用酯酶Est_p1制备奶味香精的方法

技术领域

本发明涉及奶味香精技术领域，具体地，涉及一种采用酯酶Est_p1制备奶味香精的方法。

背景技术

奶味香精是食品工业中应用最广泛的香精之一，是食品工业中一种非常重要的添加剂，也是香精香料领域中投资最大、开发研究最为活跃的香精之一。奶味香精作为添加剂主要应用于冷食、饮料、焙烤食品、谷物食品、乳制品以及其他一些产品等食品中的增香。奶味香精虽不像氨基酸、糖和脂肪那样有营养作用，但它能明显提高奶香气强度、矫味并赋予令人愉悦的香气等作用，能赋予食品美好的嗅觉和味觉，可改善和提高食品的质量，起到了引起和促进食欲的作用，因而是食品中不可缺少的一部分。

乳脂肪是乳风味的重要来源，其主要成分是饱和脂肪酸甘油三酯、不饱和脂肪酸甘油三酯、酮酸甘油三酯、羟酸甘油三酯。酶法水解奶油制备奶味香精就是指把脂肪酶作用于奶油中的甘油三酯酶解成饱和及不饱和脂肪酸、酮酸和羟酸，赋予奶制品独特的风味。脂肪酸中挥发出的中短碳链脂肪酸（如丁酸，己酸，辛酸，癸酸，月桂酸）使产品具有一种独特强烈的奶风味，它们具有较高的香气贡献度，是构成乳香的主要成分。

然而目前应用于奶味香精领域中的脂肪酶，由于其水解乳脂肪范围较大，不仅能生成中长碳链脂肪酸，甚至能大量生成的长碳链脂肪酸（如棕榈酸，硬脂酸等），产物酸价过高从而影响了整个风味。而且由于以往的脂肪酶催化乳脂肪水解制备奶味香精工艺需要在非水体系中进行，即需要向反应体系中添加乙醇、丙酮等有机溶剂以保持脂肪酶的生物活性和反应效率。但会导致有机溶剂的味道在成品中不仅无法消除，而且还危害人体健康。

因此，需要开发一种用特别酶解制备得到奶味香精的方法，使得产品香气更加自然逼真且不影响口感，更有利于人体健康。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供一种采用酯酶Est_p1制备奶味香精的方法。

本发明的另一目的在于，提供一种由所述方法制备得到的奶味香精。

本发明所述的采用酯酶Est_p1制备奶味香精的方法，包括：在奶油底物中，添加含有酯酶Est_p1的缓冲液，进行酶解反应，得到奶味香精。

其中，添加酯酶Est_p1的量为0.2~1mg/g奶油底物。

其中，所述缓冲液为：Tri-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）缓冲液。

其中，所述缓冲液的浓度为：40~60mM，优选50mM。pH为8~9，优选8.0~8.57。

其中，酶解温度为：40~50℃，优选40~45℃。

其中，酶解时间为：4~16小时，优选8~16小时。

其中，酶解反应具体为摇床温育反应，其转速为200~300rpm。

本发明所述的用酯酶Est_p1制备奶味香精的方法，在酶解反应后，还包括酯酶失活处理，温度为60~70℃，时间为0.5~1小时。优选温度为70℃，时间为1小时。

其中，所述奶油为天然奶油。

其中，所述酯酶Est_p1被中国专利申请CN 200810226942.6公开，该酶来源于酯酶表达载体pET28a-est_p1，该载体含有est_p1基因，从中国南海底泥宏基因组文库中筛选得到。本发明酯酶Est_p1能专一水解碳链长度为2~12的酯类，具有较高的底物专一性。

本发明提供的奶味香精，是由上述方法制备而成，无有机溶剂添加，无长链脂肪酸等不良口感。

本发明提供一种在水体系中制备奶味香精的方法，并由其制备的奶味香精。所用酯酶Est_p1性质优良，制备方法操作简便，由此制备的奶味香精，无有机溶剂添加，无长链脂肪酸等不良口感，更能体现奶香产品的天然风味。

本发明的有益效果具体在于：本发明采用新型酯酶Est_p1，与传统脂肪酶水解获得天然奶味香精的工艺相比，本发明所用酯酶不仅对于天然奶油中碳链长度较短的乳脂肪具有极高的专一性，在不影响奶油口感风味的基础上，极大地增加了奶油的天然奶香；而且整个反应仅需在水体系中进行，无需添加有机溶剂。在制备方法中，以0.2~1mg/g底物的酶量添加到天然奶油中，酶解温度为40~50℃，酶解时间为4~16小时，能通过控制酶解条件得到不同风味程度的奶味香精。此外，制备得到的奶味香精其香气更加自然逼真，有利于人体健康，适于大规模推广应用。

附图说明

图1为原料奶油脂肪酸特征离子流量图。

图2为由实施例2制得的奶味香精脂肪酸特征离子流量图。

图3为脂肪酸标准品特征离子流量图。

图4为pH对Est_p1活性的影响。

图5为Est_p1的pH稳定性。

图6为温度对Est_p1活性的影响。

图7为Est_p1的温度稳定性。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明的酯酶Est_p1可由中国专利申请CN 200810226942.6公开内容获得。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所用试剂均可从市场上购买得到。

实施例1：Est_p1蛋白的诱导表达及纯化

本例采用Ni-agarose亲和层析纯化（pET表达系统）目的蛋白，具体步骤如下：

1）诱导培养

将表达菌株接种到装有5mL LB（含kan 50μg/mL）的试管中，37℃、转速250rpm、培养至OD600≈0.5。以1%（V/V）接种量将菌液转接到500mL同样的培养基中，当OD600为0.5~1.0之间时，加入IPTG至终浓度为0.5mM诱导12~15小时。

2）蛋白粗提

将经诱导的培养物10000g、4℃、离心10分钟收集细胞，用裂解缓冲液洗涤2次。溶于30mL裂解缓冲液中，超声波破碎细胞（240伏特，3秒超声波破壁，7秒间歇，60个循环）后，离心（15000g、4℃、10分钟），取上清。

3）蛋白纯化

i．向柱子内添加1mL Ni-agarose，用10倍体积双蒸水洗涤，并用适量裂解缓冲液平衡柱子。

ii．将Ni-agarose取出，与蛋白粗提液以体积比1：4混合，转速200rpm，冰浴结合1小时。

iii．将结合后的Ni-agarose与蛋白粗提液重新添加到柱子中，用50倍体积的裂解缓冲液平衡柱子。

iv．用50倍体积的清洗缓冲液洗去未结合的蛋白，直到流出液中蛋白含量为零。

v．用5倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱。用1.5mL离心管，每管收集10滴。

vi．洗脱结束后进行柱体保存。依次用10倍柱体积的0.3M乙酸、10%甘油、双蒸水洗涤，30%乙醇浸泡，4℃保存。

vi．电泳分析目的蛋白，将合乎要求的蛋白透析，进行后续工艺。

裂解缓冲液：50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM咪唑，用NaOH调pH至8.0。

清洗缓冲液：50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑，用NaOH调pH至8.0。

洗脱缓冲液：50mM NaH2PO4、300mM NaCl、50mM咪唑，用NaOH调pH至8.0。

透析缓冲液：50mM NaH2PO4、300mM NaCl，用NaOH调pH至8.0。

纯化后的Est_p1采用pNP-C4测定底物所测得的比酶活达到1083.4U/mg，最适反应pH为8.57，最适反应温度为40℃，在pH6~8以及0~40℃下有良好的稳定性。

图4~6显示：

图4：pH对Est_p1活性的影响。纵坐标表示相对酶活力，横坐标表示pH范围。五种pH缓冲液分别为柠檬酸（citric acid）（●），MOPS（○），Tris-HCl（▲），CHES（□）和CAPS（■）。

图5：Est_p1的pH稳定性。纵坐标表示相对酶活力，横坐标表示pH范围。在各pH条件下的放置时间分别为90和400min。

图6：温度对Est_p1活性的影响。纵坐标表示相对酶活力，横坐标表示温度范围。左上角图示为阿累尼乌斯曲线图。

图7：Est_p1的温度稳定性。纵坐标表示相对酶活力，横坐标表示时间。

实施例2：奶味香精的制备

在0.5g的天然奶油中，加入500μL含有0.25mg酯酶Est_p1的Tri-HCl缓冲液（50mM，pH 8.57），密封处理，40℃，200rpm摇床温育反应8小时。

由此法制备的奶味香精，感官评定结果为奶香味自然，醇厚，香韵丰富。

实施例3：奶味香精的制备

在5g的天然奶油中，加入5mL含有2.5mg酯酶Est_p1的Tri-HCl缓冲液（50mM，pH 8.57），密封处理，40℃，200rpm摇床温育反应8小时。

实施例4：奶味香精的制备

在0.5g的天然奶油中，加入500μL含有0.1mg酯酶Est_p1的Tris-HCl缓冲液（50mM，pH 8.5），密封处理，40℃，250rpm摇床温育反应16小时。

实施例5：奶味香精的制备

在0.5g的天然奶油中，加入500μL含有0.5mg酯酶Est_p1的Tris-HCl缓冲液（50mM，pH 8.0），密封处理，45℃，300rpm摇床温育反应8小时。

实施例6：奶味香精的制备

在实施例2~5的基础上，在摇床温育反应后，进行酯酶失活处理，具体方式为：将制备所得奶味香精放入恒温培养箱，温度70℃，时间1h。处理使酯酶Est_p1完全失活且挥发性脂肪酸在密封瓶中达到饱和蒸汽压，以便进行分析与鉴定。

试验例：奶味香精的分析与鉴定

运用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析奶味香精，确定其致香成分。

取实施例2所制备得到的奶味香精样品于10mL样品瓶中，密封处理。进样前用针加入2mL无水乙醇，目的是减少水体系比重，将瓶中下层水体系置换到原料奶油的上方，有利于水体系中致香成分的挥发并测定。将样品放于70℃平衡1小时，快速取上层气体，进样1mL。

GC条件：

色谱柱：石英毛细管柱DB-5MS，30m×0.25μm×0.25mm；氮气压力10kPa；程序升温：初始温度45℃，保持5min，以5℃/min升到250℃，保持3min。进样口温度为200℃。

MS条件：

离子源温度230℃，接口温度250℃，扫描范围50~250amu，无溶剂延迟。

顶空进样分析结果：如图1~3所示。奶味香精主要成分是：丁酸，己酸，辛酸，癸酸，月桂酸和肉豆蔻酸中的一种或几种。

本发明奶味香精致香成分鉴定结果如下表所示：

由上表可以看出：制备前奶味香精中短链脂肪酸（C₂~C₁₂）在原料奶油中的相对含量为8.2%，制备后的相对含量为15.91%，增长了7.71%。其他奶味香精制备方法的实施例条件都在酶的适宜范围内，效果与实施例2相当。

本发明采用酯酶Est_p1水解制备奶味香精，在水体系中进行，以天然奶油为原料，经过酶解工艺后制成香气组成以中短碳链脂肪酸为主的奶味香精，无长链脂肪酸的不良气味及口感，无有机溶剂添加，是奶香加香的理想选择。这种方法的优点是采用对中短碳链具有专一识别性的酯酶，该酶区别于应用在传统工艺中的脂肪酶，无需在非水介质就能实现乳脂肪的水解，使产品奶香浓郁，有益健康。

气相色谱-质谱法（GC-MS）进行定性定量分析，香精控制的一种理想的方法，此法操作简单、快速、准确，达到了香精质控的要求，能较准确的对香精中致香成分进行分析测定，且重复性好，运用气相色谱-质谱联用技术分析奶味香精，确定其致香组分，对天然奶味香精的快速开发具有重要意义。

综上所述，本发明所提供的酯酶Est_p1适合应用于奶味香精领域，奶味香精制备方法操作简便。该酶对乳脂肪水解作用专一，由此制备的奶味香精香气天然逼真，而且改善了传统的酶解方法中需要添加有机溶剂的缺点，适于大规模推广应用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种采用酯酶Est_p1制备奶味香精的方法，采用的是：在奶油底物中，添加含有酯酶Est_p1的缓冲液，进行酶解反应，得到奶味香精；添加酯酶Est_p1的量为0.2～1mg/g奶油底物；

酶解温度为：40～45℃，酶解时间为：8～16小时；

酶解反应具体为摇床温育反应，其转速为200～300rpm；

该方法在酶解反应后，还具有酯酶失活处理的步骤，酯酶失活温度为70℃，时间为1小时。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的浓度为：40～60mM，pH为8～9。

4.由权利要求1～3任意一项所述方法制备得到的奶味香精。