CN102712881A - 新颖的甘露聚糖酶变体 - Google Patents

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Abstract

本文公开内容提供了新颖的甘露聚糖酶变体，其具有不同于亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列，并且其具有一种或多种有利的性质，例如改进的热稳定性；温度/活性曲线；pH/活性曲线；比活性；以及pH/蛋白酶敏感性。新颖的甘露聚糖酶变体可用于并且用于酒精发酵工艺和/或生产，用于咖啡萃取和咖啡废料加工，作为食品和饲料的补充剂，用于酶辅助的纸浆漂白，在纺织工业中作为漂白和/或脱浆剂，用于通过水力压裂进行油井和气井增产，作为去垢剂，作为烘焙成分，用于除去生物膜以及用于递送系统中，用于谷粒加工，或用于用以生产生物燃料的可再生资源的加工，以及用于纺织、探油、清洁、洗涤、去垢剂以及纤维素纤维加工工业。

Description

新颖的甘露聚糖酶变体
发明领域
本文提供的技术涉及微生物甘露聚糖酶的经改进的变体，更具体地，涉及展示出甘露聚糖酶活性作为其主要酶活性的微生物酶；涉及编码所述甘露聚糖酶的核酸分子，含有所述核酸的载体、宿主细胞，以及生产甘露聚糖酶的方法；包含所述甘露聚糖酶的组合物；用于制备和生产此类酶的方法；以及涉及使用此类酶用于食品和饲料加工，用于咖啡萃取和咖啡废料加工，作为食品和饲料的补充剂，用于纸浆的酶辅助漂白，在纺织工业中作为漂白和/或脱浆剂，用于通过水力压裂(hydraulic fracturing)进行油井和气井增产(oil and gas well)，作为去垢剂，作为烘焙成分，用于除去生物膜以及用于递送系统中，用于谷粒加工，或用于用以生产生物燃料的可再生资源的加工，以及用于纺织、探油、清洁、洗涤、去垢剂以及纤维素纤维加工工业的方法。
发明背景
内-β-1，4-D-甘露聚糖酶(β-甘露聚糖酶；EC 3.2.1.78)在基于甘露聚糖的多糖中催化甘露糖苷键的随机水解。大多数β-甘露聚糖酶将寡糖降解为DP4(Biely和Tenkanen(1998)Enzymology of hemicellulose degradation，页25-47，在Harman和Kubiceck(ed)Trichoderma and Gliocladium，卷2，Taylor和Francis Ltd.London中)，但是，其已在甘露三糖上显示出残余活性，这指示了针对甘露糖结合在蛋白质上的至少四个亚位点。水解的主要终产物通常是甘露二糖和甘露三糖，虽然也产生显著量的甘露糖。一些β-甘露聚糖酶能降解结晶甘露聚糖。除水解外，若干β-甘露聚糖酶(包括来自里氏木霉的β-甘露聚糖酶)已显示出作为糖苷键受体的甘露糖或甘露二糖形成转糖苷产物。
β-甘露聚糖酶已分离自多种广泛的生物，包括细菌、真菌、植物和动物。虽然大多是细胞外的，一些β-甘露聚糖酶看起来是与细胞关联的。它们的表达通常是在甘露聚糖或半乳甘露聚糖上的生长所诱导的，但是，来自里氏木霉的β-甘露聚糖酶还可被纤维素诱导，虽然其表达被葡萄糖和其它单糖遏制。经常在相同生物中发现具有不同等电点的多种甘露聚糖酶，它们分别代表了来自不同基因的产物或来自相同基因的不同产物。
通常，β-甘露聚糖酶具有40℃至70℃之间的温和的温度最优值，除了来自嗜热生物的一些β-甘露聚糖酶(Politz等人(2000)A highlythermostable endo-1，4-β-mannanase from the marine bacteriumRhodothermus marinus；Appl.Microbiol.Biotechnol.53：715-721)。pH最优值在中性或酸性区中，例如对于来自里氏木霉的β-甘露聚糖酶而言pH5.0(Arisan-Atac等人(1993)Purification and characterisation of aβ-mannanase of Trichoderma reesei C-30；Appl.Microbiol.Biotechnol.39：58-62)。酶的分子量在30kD和80kD的范围内。
WO 002008009673公开了里氏木霉甘露聚糖酶的变体，其改进了热稳定性和低pH/胃蛋白酶抗性，以用于水解含有半乳甘露聚糖的植物材料(例如，棕榈仁渣(palm kernel expeller，PKE))以及用于动物饲料。
例如，热稳定性是在包含高温的造粒流程之前掺入饲料混合物中的饲料添加剂所需要的。此外，作为饲料添加剂应用的甘露聚糖酶需要是低pH稳定和胃蛋白酶稳定的，其必须在低pH下具有活性，以在(例如单胃动物的)胃中高效工作。
但是，在饲料工业中的趋势是日益增加造粒温度。目前，目标是在90℃至95℃造粒温度左右的酶稳定性，以使得能在所有工业相关的饲料生产车间使用酶。因此，具有改进的热稳定性的甘露聚糖酶的可用性将是高度有利的，因为其允许在具有高操作温度的车间中也使用该酶。
发明内容
在第一个方面，本文公开内容的实施方式提供了甘露聚糖酶变体，其具有与亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)不同的氨基酸序列，并且具有一种或多种有利的性质。此类性质可包括但不限于：有益的：热稳定性；温度/活性曲线；pH/活性曲线；比活性；以及pH/蛋白酶-敏感性。
在另一方面，本文公开内容的实施方式涉及包含下述甘露聚糖酶的甘露聚糖酶变体，所述甘露聚糖酶在选自66、215或259构成的组的一处或多处位置上含有取代，其中每个位置对应于亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的位置。
在另一方面，本文公开内容的实施方式涉及具有下述氨基酸序列的甘露聚糖酶变体，所述氨基酸序列与亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)不同，其较之SEQ ID NO：1的氨基酸序列包含变异201S、207F和274L以及位于对应于位置66、215或259的一处或多处位置上的至少一种变异。
在还一方面，本文公开内容的实施方式提供了编码本文公开的甘露聚糖酶变体的核酸，以及包含此类核酸的载体和宿主细胞。在其它一些实施方式中，序列被用于生产甘露聚糖酶变体的工艺中。
此外，本文公开内容的实施方式一般地涉及甘露聚糖酶变体用于消化半乳甘露聚糖的用途，特别是催化基于甘露聚糖的多糖中甘露糖苷键的随机水解。有利地，本文公开内容的甘露聚糖酶变体可用于工业应用，包括例如，用于淀粉液化和用于增强半乳甘露聚糖在食品和动物饲料中的消化的方法。有利地，根据本文公开内容的实施方式的甘露聚糖酶变体可用于并且用于酒精发酵工艺和/或生产，用于咖啡萃取和咖啡废料加工，作为食品和饲料的补充剂，用于纸浆的酶辅助漂白，在纺织工业中作为漂白和/或脱浆剂，用于通过水力压裂进行油井和气井增产，作为去垢剂，作为烘焙成分，用于除去生物膜以及用于递送系统中，用于谷粒加工，或用于用以生产生物燃料的可再生资源的加工，以及用于纺织、探油、清洁、洗涤、去垢剂以及纤维素纤维加工工业。
在其它一些方面，本文公开内容涉及包含本文所述的甘露聚糖酶变体的酶组合物，其中所述酶组合物可用于或用于商业应用。在一种实施方式中，酶组合物可以是动物饲料组合物。在其它一些实施方式中，酶组合物可用于淀粉水解(例如液化)工艺。在一种有利的实施方式中，变体和/或酶组合物可用于酒精发酵工艺。在另一些实施方式中，包含本文公开内容所包括的甘露聚糖酶的酶组合物将包括另外的酶，例如植酸酶、葡糖淀粉酶、α淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶及其组合。
在另一方面，本文公开内容的实施方式涉及在宿主细胞中生产甘露聚糖酶变体的方法，所述方法通过这样来进行：用DNA构建体转化宿主细胞，所述DNA构建体有利地包括在宿主细胞中具有转录活性的启动子，在允许所述甘露聚糖酶表达的合适的培养基中培养经转化的宿主细胞，以及生产所述甘露聚糖酶。该方法还可包括回收生产的甘露聚糖酶。在一种实施方式中，宿主细胞是真菌，例如木霉属(Trichoderma)(例如里氏木霉)，酵母，细菌或植物细胞。在本文公开内容的一种有利的实施方式中，甘露聚糖酶变体具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的序列或其变体、经修饰的形式、同源体、融合蛋白、功能等同物或片段。
在详细描述本文公开内容之前，应当理解，本文公开内容不仅限于所描述的设备的特定组成部分或者所描述的方法的工艺步骤，因为此类设备和方法是可变的。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，其并不意味着限制。应当注意，在用于本申请文件和所附权利要求中时，单数形式“一个/种”和“这个/种”(“a”、“an”和“the”)包括单数和复数指代，除非上下文有明确其它指示。此外还要理解，当给出数值界定的参数范围时，所述范围被视为包括这些界定值。
为在不过度加长申请文件的情况下提供全面的公开内容，申请人在此通过引用并入上文提到的每篇专利和专利申请，特别是WO 2008/009673的公开内容。
附图简述
图1显示了野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
图2显示了WO 2008/009673中公开的里氏木霉甘露聚糖酶变体V-31的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图3显示了WO 2008/009673中公开的另一里氏木霉甘露聚糖酶变体V-31/S3R的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。
图4显示了根据本文公开内容的一种有利的甘露聚糖酶变体TM-1的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
图5显示了根据本文公开内容的甘露聚糖酶变体TM-1(SEQ ID NO：4)的核酸序列(SEQ ID NO：5)。
图6显示了根据本文公开内容的另一有利的甘露聚糖酶TM-100变体的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。
图7显示了根据本文公开内容的另一有利的甘露聚糖酶变体TM-108的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。
图8显示了根据本文公开内容的另一有利的甘露聚糖酶变体TM-CBD-148的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。
图9显示了根据本文公开内容的另一有利的甘露聚糖酶变体TM-144的氨基酸片列(SEQ ID NO：9)。
图10显示了在热稳定性和活性方面对亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶与S3R变体的比较。
图11显示了纤维素结合结构域(CBD)的氨基酸序列。
发明详述
本文公开了里氏木霉甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)的变体以及编码可用于工业应用(包括用于蛋白水解、生物质降解和用于增强食品和/或动物饲料中含有的半乳甘露聚糖的消化的方法)的甘露聚糖酶的核酸。
特别地，根据本文公开内容的甘露聚糖酶变体较之所用的亲本甘露聚糖酶，显示出特别改进的热稳定性、pH/胃蛋白酶稳定性以及同时改进的或保持的比活性。这些特征使得它们特别有用于动物饲料、食品中的工业应用以及一般而言的植物材料中的半乳甘露聚糖降解。
本文公开内容揭示了具有源于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的氨基酸序列的酶或其变体、经修饰的形式、同源体、融合蛋白、功能等同物或片段，或包含一种或多种插入、缺失或突变或其任何组合的酶。根据本文公开内容的同源甘露聚糖酶包含优选与SEQ ID NO：1、更优选与SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9具有至少70％的序列同一性或优选至少80％、85％、90％、95％、97％或99％的序列同一性的任何酶。
本文公开内容的甘露聚糖酶变体具有甘露聚糖酶活性，并且具有由于包含一处或多处变异(包括取代、插入和缺失)而不同于亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列。
在一种有利的实施方式中，甘露聚糖酶变体的氨基酸序列较之SEQ IDNO：1的氨基酸至少包含变异201S、207F和274L，以及位于对应于位置66、215或259的一处或多处位置上的至少一种变异。例如，有利地，甘露聚糖酶变体中的变异可选自66P、215T和259R构成的组。
本文公开内容的一种有利的实施方式是根据SEQ ID NO：4的甘露聚糖酶变体或其变体、经修饰的形式、同源体、融合蛋白、功能等同物或片段，或包含一种或多种插入、缺失或突变或其任何组合的甘露聚糖酶变体，以及与SEQ ID NO：4的甘露聚糖酶至少具有最小百分比序列同一性和/或百分比同源性的甘露聚糖酶，其中所述最小百分比同一性和/或同源性为至少50％，至少60％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少93％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％。
在另一些有利的实施方式中，根据本文公开内容的甘露聚糖酶变体除包含变异201S、207F和274L之外以及对应于位置66、215或259的一处或多处位置上的变异之外还包含位置3和/或181上的变异(对应于SEQ IDNO：1的氨基酸序列的位置而言)。例如，位置3上的变异是3R，位置181上的变异是181A或181H(181/A/H)。
在另一些有利的实施方式中，根据本文公开内容的甘露聚糖酶变体包含变异201S、207F和274L以及至少还包含位于位置66、215和259上的变异(较之SEQ ID NO：1的氨基酸序列而言)。在一种有利的实例中，位置66、215和259上的变异分别是66P、215T和259R。
在另一实施方式中，较之SEQ ID NO：1的氨基酸序列，甘露聚糖酶变体除包含变异201S、207F和274L以及位置66、215和259上的变异之外，还包含位置上的变异，优选地，181A/H。在一种有利的实施方式中，甘露聚糖酶变体还包含位置3上的变异，例如3R。
在一种有利的实施方式中，根据本文公开内容的甘露聚糖酶变体的氨基酸序列至少包含变异201S、207F和274L，以及至少还包含在对应于位置66、215或259的一处或多处位置上的变异，以及下述一种或多种额外的变异，其中变异位置是31、97、113、146、149、173、181、280、282、331或344(较之SEQ.ID NO：1的氨基酸序列)。例如，变异是31Y、97R、113Y、146Q、149K、173H/T、181H/A、280S/L/R、282D、331S或344D。
本文公开内容的一些有利实施方式是下述甘露聚糖酶变体，所述变体与根据本文公开内容的甘露聚糖酶至少具有最小百分比序列同一性和/或百分比同源性，其中所述最小百分比同一性和/或同源性为至少50％，至少60％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少93％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％。
一些有利的实施方式是下述甘露聚糖酶变体，所述变体具有甘露聚糖酶活性，以及具有与亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQID NO：1)不同的氨基酸序列，其中所述甘露聚糖酶变体的氨基酸包含变异201S、207F和274L，以及至少还包含选自下组的变异，所述组由：
1)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D/N331S
2)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S
3)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
4)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
5)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
6)F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L
7)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R
8)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
9)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R
10)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D
11)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D/N331S
12)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L
13)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D
14)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280R/N282D
15)S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R
16)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D
17)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D
18)F31Y/S66P/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D
19)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L
20)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
21)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173T/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
22)F31Y/S66P/Q97R/N173T/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
23)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D
24)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D
25)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
26)S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D
27)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/N331S
28)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280R/N282D/N331S
29)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
30)S66P/Q97R/N113Y/N173T/V181A/A215T/Q259R
31)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S
32)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R
33)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/N331S
34)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280L
35)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280L
36)F31Y/S66P/Q97R/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
37)S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R/N282D
38)F31Y/S66P/Q97R/V181H/A215T/Q259R/N282D
39)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S
40)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S
41)S66P/V181H/A215T/Q259R/N282D
42)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N331S
43)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D
44)S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/N282D
45)S66P/V181H/A215T/Q259R
46)S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
47)F31Y/S66P/N173T/V181H/A215T/Q259R/N282D
48)F31Y/S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N344D
49)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
50)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
51)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S
52)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R
53)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S
54)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D
55)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
56)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R
57)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/N331S
58)F31Y/S66P/Q97R/N 173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
59)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S
60)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S
61)F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S
62)S66P/A215T/Q259R
63)S3R/S66P/A215T/Q259R
构成。
本文公开内容的实施方式还包括序列1)至63)中示出的任何甘露聚糖酶的变体，所述变体具有甘露聚糖酶活性，并且具有下述氨基酸序列，所述氨基酸序列较之序列1)至63)示出的每种甘露聚糖酶变体具有至少50％，至少60％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少93％，至少95％、至少96％，至少97％，至少98％和至少99％的百分比序列同一性和/或百分比同源性。
本文公开内容的另一些实施方式是选自下组的核酸分子，所述组由：
a)编码根据本文公开内容的甘露聚糖酶变体的核酸分子；
b)编码根据本文公开内容的甘露聚糖酶变体的衍生物的核酸分子，优选地所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基被保守取代；
c)核酸分子，其是SEQ ID NO：5所示的核酸分子的片断、变体、同源体、衍生物或片段；
d)核酸分子，其能在严格条件下与a)-c)中任何核酸分子杂交；
e)核酸分子，其能在严格条件下与a)-c)中任何核酸分子的互补序列杂交；
f)核酸分子，其与a)-e)中任何核酸分子具有至少95％的序列同一性，并且编码甘露聚糖酶，
g)核酸分子，其与a)-e)中任何核酸分子具有至少70％的序列同一性，并且编码甘露聚糖酶，
h)或a)-g)中任何核酸分子的互补序列
构成。
本文公开内容的其它一些实施方式是包含编码根据本文公开内容的甘露聚糖酶变体的核酸分子的载体和宿主细胞。
此外，一些实施方式是用于制备根据本文公开内容的甘露聚糖酶变体的方法，所述方法包括培养经转化的宿主细胞和从培养物中分离经修饰的甘露聚糖酶。
除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有与本文公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。Singleton，等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY，20 ED.，John Wiley和Sons，New York(1994)和Hale &Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)为技术人员提供了本文公开内容中所使用的很多术语的通用词典。
本文公开内容并不受本文公开的示例性方法和材料的限制，与本文所描述的这些相似或等同的任何方法和材料均可用于实践或测试本文公开内容的实施方式。数值范围包括限定该范围的数字。除非另有指明，分别地，核酸序列以5’至3’方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基到羧基方向从左到右书写。
本文提供的标题并不是对本文公开内容的多个方面或实施方式的限制，本文公开内容应当参照作为整体的申请文件。因此，下面即将定义的术语将参照作为整体的申请文件而被更完整地定义。
在本文公开内容的一种实施方式中，甘露聚糖酶显示出较之WO2008/009673公开的甘露聚糖酶酶而言特别改进的热稳定性，以及同时还显示出改进的或保持的比活性。这些特征使得它们特别有用于动物饲料、食品中的工业应用以及特别有用于一般而言的植物材料中的半乳甘露聚糖降解。
因此，本文公开内容还涉及在里氏木霉生产甘露聚糖酶的方法，所述甘露聚糖酶在如动物的胃和上部肠(upper intesine)以及禽类的嗉囊、胃和上部肠中存在的低pH值下具有活性。本文公开内容的另一目标是提供可在造粒之前加入到动物饲料中的甘露聚糖酶，以允许精确和可再生的酶剂量，并且避免饲料制备中额外的喷雾步骤。
术语“甘露聚糖酶”指能水解由甘露糖单位构成的多糖链(甘露糖聚合物(mannopolymer)或多聚甘露糖(polymannose))的酶。“甘露聚糖酶”因此包含内切甘露聚糖酶和外切甘露聚糖酶两者，它们分别在聚合物的内部和从聚合物的末端来切割甘露糖聚合物。
术语“甘露聚糖酶的功能等同物”或“其功能等同物”表示，该酶必须具有与里氏木霉甘露聚糖酶大致相同的功能特征。
术语“经修饰的形式”或“变体”表示，该酶已从其原始形式(亲本/野生型，wt)经过修饰，但保留了与里氏木霉甘露聚糖酶相同的酶促功能特征。
术语“融合蛋白”包含通过在C-和/或N-末端共价融合额外的氨基酸序列而衍生自亲本甘露聚糖酶或其任何变体的所有蛋白。额外的氨基酸序列的来源和组成是天然来自任何活的生物或病毒的或可以是非天然的。
术语“功能片段”或“有效片段”表示里氏木霉甘露聚糖酶或其衍生物的保留了大致相同的酶促功能或效果的片段或部分。
根据本文公开内容的术语“同源甘露聚糖酶”包含与亲本甘露聚糖酶具有至少70％或者优选至少80％、85％、90％、95％、97％或99％的序列同一性的任何酶。
术语“多核苷酸”对应任何长度和任何序列的任何遗传材料，包含单链和双链的DNA和RNA分子，包括调控元件、结构基因、基因的组、质粒、完整基因组及其片段。
术语多核苷酸或多肽中的“位置”表示分别在多核苷酸或多肽的序列中特定的单个碱基或氨基酸。
术语“多肽”包括蛋白质例如酶，抗体等；中等长度的多肽，例如肽抑制剂，细胞因子等；以及短至氨基酸序列长度少于10的短肽，例如肽性受体配体，肽激素等。
术语“甘露聚糖酶变体”表示通过定点诱变或随机诱变、插入、缺失、重组和/或任何其它蛋白工程化方法获得的任何甘露聚糖酶分子，其导致产生氨基酸序列与亲本甘露聚糖酶有所不同的甘露聚糖酶。根据本文公开内容，术语“野生型甘露聚糖酶”、“野生型酶”或“野生型”描述了具有在自然界中发现的氨基酸序列的甘露聚糖酶或其片段。
“亲本甘露聚糖酶”可以是经分离的野生型甘露聚糖酶或其片段，或选自甘露聚糖酶文库的一种或多种甘露聚糖酶变体。
术语“甘露聚糖酶文库”描述了至少一种甘露聚糖酶变体或甘露聚糖酶的混合物，其中每种单种甘露聚糖酶，每种甘露聚糖酶变体分别被不同的多核苷酸序列编码。
术语“基因文库”指编码甘露聚糖酶文库的多核苷酸的文库。
术语“经分离的”描述了与其天然来源分开的任何分子。
术语“突变”指对单个或多个核苷酸三联体的取代或替换、对一个或多个密码子的插入或缺失、不同基因之间的同源或异源重组、在编码序列任一端的额外编码序列融合，或额外编码序列的插入或这些方法的任何组合，它们导致产生编码想要的蛋白的多核酸序列。因此，术语“突变”还指经一种或多种上述改变修饰的多核酸序列编码的多肽序列中的所有改变。氨基酸残基按照下表1中缩写为单字母编码或三字母编码。
术语“核酸分子”或“核酸”意欲表示任何单链或双链的cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA、PNAS或LNA来源的核酸分子。
术语“严格条件”指下述条件，在这样的条件下，探针将与其靶亚序列杂交，而不与其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将有所不同。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。通常，严格条件被选择为比给定离子强度和pH下针对特定序列的热熔点(Tm)低大约5℃。Tm是平衡时与靶序列互补的探针有50％与靶序列杂交的温度(在给定的离子强度、pH和核酸浓度下)。(因为靶序列通常过量存在，在Tm下，平衡时探针的50％被占据)。通常，严格条件将是下述这些，其中，盐浓度低于大约1.0M Na离子，通常，于pH 7.0至8.3大约0.01至1.0M Na离子(或其它盐)，温度为针对短探针(例如10至50个核苷酸)至少大约30℃和针对更长的探针至少大约60℃。严格条件还可通过添加去稳定试剂(例如甲酰胺等等)来获得。
术语“核酸分子的片段”意欲表示包含根据要求保护的序列之一的核酸分子的亚组(subset)的核酸。
这同样适用于术语“核酸分子的片断(fraction)”。
术语“核酸分子的变体”在本文中指与根据要求保护的序列之一的核酸分子结构和生物活性上基本相似的核酸分子。
术语“核酸分子的同源体”指下述核酸分子，其序列较之根据要求保护的序列之一的核酸分子而言具有一个或多个添加的、缺失的、取代的或经化学修饰的核苷酸，并且一直存在如下前提：同源体保持了与后者(即根据要求保护的序列之一的核酸分子)基本相同的结合性质。
术语“衍生物”在本文中使用时指与靶核酸序列(如根据要求保护的序列之一的核酸分子)具有相似的结合特征的核酸分子。
表1：氨基酸缩写
Figure BDA00001884725400141
Figure BDA00001884725400151
使用下述命名规则来描述突变或变异：位置；取代的氨基酸残基。根据该命名规则，例如，在位置20用甘氨酸残基取代丙氨酸残基被表示为20G。当给定位置的氨基酸残基被两个或多个备选氨基酸残基取代时，这些残基被逗号或斜线分开。例如，在位置30用甘氨酸或谷氨酸取代丙氨酸被表示为20G/E，或20G，20E。
此外，还可使用下述命名规则：蛋白骨架中的氨基酸残基；位置；取代的氨基酸残基。根据该命名规则，例如，在位置20用甘氨酸残基取代丙氨酸残基被表示为Ala20Gly或A20G，或20G。在同样的位置缺失丙氨酸被显示为Ala20＊或A20＊。插入另外的氨基酸残基(例如甘氨酸)被表示为Ala20AlaGly或A20AG。缺失连续一段氨基酸残基(例如位置20的丙氨酸和位置21的甘氨酸之间)被表示为Δ(Ala20-Gly21)或Δ(A20-G21)。当序列较之用于编号的亲本蛋白含有缺失时，在此类位置(例如缺失的位置20中的丙氨酸)的插入被表示为＊20Ala或＊20A。多个突变被加号或斜线分开。例如，位置20和21中分别取代丙氨酸和谷氨酸为甘氨酸和丝氨酸的两个突变被表示为A20G+E21S或A20G/E21S。当给定位置上的氨基酸残基被两个或多个备选的氨基酸残基取代时，这些残基被逗号或斜线分开。例如，用甘氨酸或谷氨酸取代位置30的丙氨酸被表示为A20G，E或A20G/E或A20G，A20E。当本文中鉴定了适于修饰的位置但没有建议任何特定的修饰的话，应当理解，任何氨基酸残基可取代该位置存在的氨基酸残基。因此，例如，当提到位置20的丙氨酸的修饰但无特指时，应当理解，丙氨酸可被缺失或取代为任何其它氨基酸残基(即，R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V中的任一)。
术语“保守突变”或“保守取代”分别表示本领域技术人员将认为是对第一突变来说保守的氨基酸突变。“保守”在本文上下文中表示在氨基酸特征方面相似的氨基酸。如果，例如，突变导致特定位置上产生脂肪族氨基酸残基(例如Leu)对非脂肪族氨基酸残基(例如Ser)的取代，则用不同的脂肪族氨基酸(例如Ile或Val)在相同位置进行取代被称为保守突变。其它氨基酸特征包括残基的大小、疏水性、极性、电荷、pK值和本领域已知的其它氨基酸特征。因此，保守突变可包括取代，例如碱性取代碱性、酸性取代酸性、极性取代极性，等等。由此衍生的氨基酸的组可能由于结构原因而是保守的。这些组可被描述为Venn图表的形式(Livingstone C.D.和Barton G.J.(1993)″Protein sequence alignments：a strategy for thehierarchical analysis of residue conservation″Comput.Appl Biosci.9：745-756；Taylor W.R.(1986)″The classification of amino acidconservation″J.Theor.Biol.119；205-218)。保守取代可例如根据下表来进行，下表描述了通常被接受的氨基酸Venn图表分组。
表2：Venn图表分组的氨基酸
Figure BDA00001884725400171
术语“催化活性”或“活性”定量描述了给定的底物在定义的反应条件下的转化。术语“残余活性”被定义为在某组条件下酶的催化活性与不同组的条件下催化活性之比。因此，残余活性ai被给为ai＝vi/v0，其中v指催化活性的任何量度，ai＊100是百分比表示的相对活性。术语“比活性”定量描述在定义的反应条件下催化活性/酶量(catalytic activity per amount ofenzyme)。
术语“热稳定性”(“thermostability”或“thermal stability”)或“温度稳定性”描述了蛋白经受有限的热暴露而不丢失其在较低温度下(例如在其活性可被测量的温度下)的活性的性质。
术语“pH稳定性”描述了蛋白经受对与其稳定性最优的pH显著偏差的pH值(例如，比pH最优值高或低一个pH单位以上)的有限暴露而不丢失其在其活性可被测量的条件下的活性的性质。
术语“蛋白水解稳定性”描述了蛋白在蛋白酶具有活性的条件下经受对蛋白酶的有限暴露而不丢失其在其活性可被测量的条件下的活性的性质。
术语“质粒”、“载体系统”或“表达载体”表示能体内或体外表达的构建体。在本文公开内容的上下文中，这些构建体可被用于将编码酶的基因引入宿主细胞中。
术语“宿主细胞”在关于本文公开内容时包括：包含上文所述的核酸分子或表达载体并且用于重组生产具有本文所定义的特定性质的酶或用于本文公开内容的方法中的任何细胞。
“失活温度”被定义为下述温度，在该温度下，孵育某持续时间以及随后冷却至室温后的甘露聚糖酶残余活性为在室温下以相同条件孵育相同持续时间的相同甘露聚糖酶的残余活性的50％。
术语“可再生资源”指被培养和收获的生物质底物，例如作物、稻草、木材和木制品。术语“生物燃料”指固体、液体或气体的由生物质构成或源于生物质的燃料，例如，生物柴油、生物气、植物油、生物乙醇、生物氢、生物二甲醚、生物甲醇、BTL(“生物质到液体”)-燃料、GTL(“气体到液体”)-燃料，等等。
术语“其功能等同物”表示，酶必须具有与里氏木霉甘露聚糖酶大致相同的功能性特征。术语“经修饰的形式”或“变体”表示该酶已从其原始形式经过修饰，但保留了与里氏木霉甘露聚糖酶相同的酶促功能特征。特别地，术语“变体”或“经修饰的形式”包括下述甘露聚糖酶，其具有源自亲本/野生型甘露聚糖酶的氨基酸序列的氨基酸序列，并且具有一处或多处氨基酸取代、插入、缺失或其任何组合(它们一起被称为突变)。
“融合蛋白”包含通过共价融合额外的氨基酸序列至亲本甘露聚糖酶的C-和/或N-末端而衍生自亲本甘露聚糖酶或其任何变体的所有蛋白。
“百分比序列同一性”在提到两条氨基酸或多核苷酸序列时表示对序列进行最优比对时两条序列中相同的残基的百分比。因此，80％氨基酸序列同一性表示两条被最优比对的多肽序列中氨基酸有80％是相同的。百分比同一性可例如通过在两条分子间进行直接的序列信息比较来测定，这通过下述方式进行：比对序列、计算两条被比对的序列间匹配的确切数目、除以较短序列的长度、以及将结果乘以100。易于获得的计算机程序可被用于辅助分析，例如ALIGN，Dayhoff，M.O.于″Atlas of Protein Sequenceand Structure″中，M.O.Dayhoff et.，Suppl.3：353-358，National BiomedicalResearch Foundation，Washington，DC，其改进了Smith和Waterman(1981)Advances in Appl.Math.2：482-489的局部同源性算法，用于肽分析。用于测定核苷酸序列同一性的程序可在Wisconsin序列分析软件包，Version 8(可从Genetics Computer Group，Madison，WI获得)中获得，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，它们也依赖于Smith和Waterman算法。这些程序易于以厂商推荐的和上文提到的Wisconsin序列分析软件包中描述的缺省参数5来利用。适于测定序列相似性的算法的例子是BLAST算法，其被描述于Altschul，等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中。用于进行BLAST分析的软件可通过National Center for BiotechnologyInformation(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)被公众获得。类似地，用于测定百分比同源性的计算机程序也是易于获得的。
“饲料”和“食品”分别表示意欲或适于分别被动物和人吃掉、摄入、消化的任何天然或人工膳食、餐膳等或此类餐膳的组分。
“食品或饲料添加剂”是意欲或适于被加入食品或饲料的化合物或多组分组合物。其可以但并不必须包含一种或多种化合物，例如，维生素、矿物质或饲料增强酶以及合适的载体和/或赋形剂，并且其通常以适于加入至动物饲料的形式提供。
经修饰的形式或变体可展示出较之亲本酶而言改变的酶特征。优选地，经修饰的形式或变体具有下述增强的表型中的一种或多种：增加的热稳定性；和/或增加的蛋白水解(例如抵挡胃蛋白酶的)稳定性；和/或增加的比活性和/或改进的低pH下稳定性。术语“功能性”或“有效”片段表示里氏木霉甘露聚糖酶的保留了大致相同的酶促功能或效果的片段或部分。
还应当理解，本文公开内容包含：通过较之遗传编码的氨基酸序列进行翻译后加工而衍生自本申请所述的亲本甘露聚糖酶及其所有变体的所有分子。这些翻译后修饰包含但不限于：对N-末端序列(例如前导序列和/或前序列(pro-sequence))进行蛋白水解切割，对C-末端延伸进行蛋白水解去除，N-和/或O-糖基化，脂化(lipidation)，酰化，脱酰胺化，焦谷氨酸盐/酯形成，磷酸化和/或其它修饰，或其任何组合(当它们在天然宿主或任何合适的表达宿主进行的生产/表达期间发生时)。这些翻译后修饰可以或可以不对本文研究的酶的物理或酶促性质造成影响。
优选地，所述改变导致酶的下述改进的性质，例如：
1.更高的热稳定性，和/或
2.更高的比活性，和/或
3.改进的低pH下稳定性，和/或
4.更高的对蛋白酶(例如胃蛋白酶)的蛋白水解切割的抗性；和/或
5.高的低pH下残余活性。
在本文公开内容的一些优选的实施方式中，经修饰的甘露聚糖酶在位置201、207、274、66、215、259、31、97、113、146、149、173、181、280、282、331或344(相对于SEQ ID NO：1给出的亲本/野生型甘露聚糖酶的编号而言)中一处或多处具有取代。这些位置特征在于在这些位置对酶进行的诱变导致想要的酶特征的改进。
还基本地，相对于亲本/野生型甘露聚糖酶的若干氨基酸取代本身和/或与其它组合均显示在热稳定性方面有益。这些取代示于表3中。此外，若干氨基酸取代也已显示出在pH稳定性、针对蛋白酶(特别是胃蛋白酶)的稳定性和/或比活性方面相当有益。这些取代示于表4中。
还在另一个方面，本文公开内容涉及核酸分子以及涉及选自下组的核酸分子的用途，所述组由
(a)编码根据上文所述的经修饰的甘露聚糖酶的核酸分子，
(b)编码根据上文所述的经修饰的甘露聚糖酶的衍生物的核酸分子，在所述衍生物中一个或多个氨基酸残基被保守取代；
(c)SEQ ID NO：5所示的核酸分子，
(d)核酸分子，其是SEQ ID NO：5所示的核酸分子的变体、同源体、衍生物或片段；
(e)核酸分子，其是SEQ ID NO：5示出的核酸分子的互补序列；
(f)核酸分子，其是SEQ ID NO：5所示的核酸分子的变体、同源体、衍生物或片段的互补序列；
(g)核酸分子，其能与SEQ ID NO：5示出的核酸分子杂交；
(h)核酸分子，其能与SEQ ID NO：5所示的核酸分子的变体、同源体、衍生物或片段杂交；
(i)核酸分子，其是能与SEQ ID NO：5示出的核酸分子杂交的核酸分子的互补序列；
(j)核酸分子，其是能与SEQ ID NO：5所示的核酸分子的变体、同源体、衍生物或片段杂交的核酸分子的互补序列；
(k)核酸分子，其能与SEQ ID NO：5示出的核酸分子的互补序列杂交；
(l)核酸分子，其能与SEQ ID NO：5所示的核酸分子的变体、同源体、衍生物或片段的互补序列杂交；
(m)核酸分子，其与a)-l)的核酸分子中的任一具有至少95％的序列同一性，并且编码甘露聚糖酶，
(n)核酸分子，其与a)-b)的核酸分子中的任一具有至少70％的序列同一性，并且编码甘露聚糖酶，和/或
(o)a)-n)的核酸分子中任一的片断或互补序列
构成。
如果核苷酸或核酸能在中等严格条件下(更优选地，高严格条件下，进一步更优选地，非常高的严格条件下)与上述核苷酸中之一杂交，则所述核苷酸或核酸被认为是与上述核苷酸中之一杂交的。
为制备杂交印迹，可使用用于印迹的标准分子生物学方案(例如用于DNA杂交的Southern印迹)。靶DNA的量取决于靶序列的相对丰度。如果使用纯的靶序列，相对每千碱基多核苷酸而言1至5皮克DNA是优选的。通常，检测极限是对于比活性109dpm/mg的放射性探针而言大约0.5pg DNA，这等同于在复杂基因组(例如人)的3.3mg基因组DNA中长度为500bp的单拷贝基因。实践中，将使用大约10mg的基因组DNA，例如用于针对含有本文公开内容的编码甘露聚糖酶的多核苷酸的生物(例如微生物)进行筛选。如果靶DNA是细菌的或是质粒，将必须相应稀释DNA以避免过度暴露。靶DNA被印迹化，例如通过点印，或者通过从电泳凝胶进行印迹化。优选的条件被描述于Membrane Transfer and DetectionMethods，Amersham International plc，UK.-PI/162/85/1中。Hybond N+正电尼龙膜是优选使用的(Amersham Life Science)。优选地，根据Pharmacia的“Ready to Go DNATM标记试剂盒”来制备探针，以制备＞1x109dpm/微克的探针。探针以每毫升杂交缓冲液1x106dpm的浓度用于杂交缓冲液中。优选地，将印迹在杂交缓冲液(6xSSC，5xReinhardt’s溶液以及0.5％SDS以及变性鲑鱼精DNA(至100mg/ml缓冲液))中于65℃预杂交1小时，接着在含有变性的经标记探针的杂交缓冲液中于振荡下在65℃杂交12小时。然后用合适体积的2xSSC，0.1％SDS的洗涤缓冲液(通常为50ml)在65℃对印迹洗30分钟，接着在合适体积的洗涤缓冲液(通常，50ml)中洗第二次，这可在相同的洗涤缓冲液(2xSSC，0.1％SDS)中(针对中等严格洗涤)，或在0.1％xSSC，0.1％SDS中(高严格性)于65℃洗10分钟，针对非常高严格性的洗涤，第二次洗涤可在70℃重复进行。
本文公开内容的核酸分子可包含编码SEQ ID NO：1或其有效片段或其变体、经修饰的形式、同源体或衍生物的核苷酸序列。
特别地，本文公开内容提供了包含编码本文所述的甘露聚糖酶或其同源体或衍生物的核酸序列的质粒或载体系统。优选地，质粒或载体系统包含编码氨基酸SEQ ID NO：4或与其至少75％同源的序列或其有效片段或者本文所述的SEQ ID NO：1的任何衍生物的核酸序列。合适地，质粒或载体系统是用于在微生物中表达SEQ ID NO：4或与其至少75％同源(相同)的序列中任何示出的核酸序列编码的任何酶的表达载体。本文中描述了合适的表达载体。此外，本文公开内容提供了用于表达本文所述的经修饰的酶或其变体或功能性片段中的任何的质粒或载体系统。本文中描述了合适的表达载体。
根据本文公开内容对甘露聚糖酶特征的改进针对在多种技术工艺中的用途，例如但不限于下述用途：作为食品和饲料产品的添加剂，用于食品和饲料加工、浆和纸的生产，以及用于通过水力压裂进行油/气井增产，生产药物的缓慢释放制剂或用于去垢剂中，特别是用于去除细菌生物膜中。特别地，改进针对这些或其它应用的条件下的酶稳定性和/或针对食品或饲料添加剂情况下胃转运期间的稳定性和/或针对在人或动物胃/或肠道中在上部胃肠道的酸性条件下的活性或稳定性。此类改进包含，在升高的温度(优选地，超过60℃的温度)下的稳定性增加，和/或针对蛋白水解消化(优选地，针对消化道中的蛋白酶)的稳定性增加，和/或低pH下的稳定性和/或低pH值下的活性和/或从大的含多聚甘露糖的碳水化合物释放甘露糖和/或寡聚甘露糖的一般效率的增加，以及其它参数。
通过酶的失活温度来定量在升高的温度下稳定性的增加。失活温度被定义为下述温度，在该温度下，孵育某持续时间以及随后冷却至室温后的甘露聚糖酶残余活性为在室温下以相同条件孵育相同时间的相同甘露聚糖酶的残余活性的50％。
热稳定性差异是以℃表示的、两种酶的失活温度之间的差异。在本文公开内容的一种优选的实施方式中，甘露聚糖酶变体应用于升高的温度下的工艺中，制造具有想要的更高的失活温度的甘露聚糖酶变体。
当与野生型甘露聚糖酶进行比较时，本文公开内容的甘露聚糖酶特征在于：在高于野生型甘露聚糖酶的失活温度的温度下进行热孵育后更高的残余活性，这提供了更高的工艺稳定性。
克隆里氏木霉甘露聚糖酶：除SEQ ID NO：1显示的里氏木霉甘露聚糖酶之外，还已经克隆了具有SEQ ID NO：1的序列但在位置3有丝氨酸到精氨酸的取代(突变S3R)的另一种里氏木霉甘露聚糖酶。将该甘露聚糖酶变体在热稳定性和从含有多聚甘露糖的底物释放甘露糖的催化活性方面与根据SEQ ID NO：1的里氏木霉甘露聚糖酶相比较。图10中显示的结果表明，S3R取代对于与本文公开内容相关的性质没有影响，其因此是中性突变(也见WO 2008/009673)。因此，在本文公开内容的上下文中，术语“wt”或“wt甘露聚糖酶”、“野生型甘露聚糖酶”或“里氏木霉甘露聚糖酶”应当被理解为包含根据SEQ ID NO：1的甘露聚糖酶和根据SEQ ID NO：1但额外具有中性突变S3R的甘露聚糖酶。
缓冲液中的热稳定性：在本文公开内容的一种优选的实施方式中，在＞60℃的温度孵育＞30分钟时，甘露聚糖酶变体具有增加的残余活性和/或失活温度。在一种更优选的实施方式中，在乙酸盐溶液中孵育45分钟后获得了增加的残余活性和/或失活温度。优选地，甘露聚糖酶变体的失活温度是＞68℃，更优选地，＞70℃或＞72℃或＞74℃，或最优选地＞84℃。表3中关于各突变给出了特定的失活温度。
融合蛋白：还应当理解，用于根据本文公开内容的用途的SEQ ID NO：1中揭示的氨基酸序列及本文中描述的其衍生物可作为N-和/或C-末端融合蛋白被生产，例如，以辅助提取、检测和/或纯化，和/或向甘露聚糖酶分子添加功能性质。融合蛋白伙伴可以是任何蛋白或肽，包括源于天然宿主的任何多肽序列、任何其它天然存在的氨基酸序列以及合成序列。融合蛋白伙伴的例子包括但不限于，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录活化结构域)、FLAG标签、MYC标签或本领域任何技术人员公知的其它标签。还可方便地在融合蛋白伙伴和感兴趣的蛋白序列之间包括进蛋白水解切割位点，以允许除去融合蛋白序列。优选地，融合蛋白将不妨碍感兴趣的蛋白序列的活性。
在本文公开内容的一种优选的实施方式中，甘露聚糖酶变体被融合至功能结构域，包括前导肽、前肽(propeptide)、结合结构域或催化结构域。
结合结构域可包括但不限于，多种特异性的碳水化合物结合结构域，它们提供了与应用甘露聚糖酶期间存在的碳水化合物组分的增加的亲和性。还考虑，融合伙伴结构域可包含酶活性结构域，例如支持甘露聚糖酶在生产想要的产物中的作用的活性，这通过提供作用于甘露聚糖酶催化反应的任何产物和/或底物的一种或多种组分上的活性来实现。催化结构域的非限制性例子包括：纤维素酶、半纤维素酶(例如木聚糖酶)、外切甘露聚糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳糖苷酶、果胶酶和/或其它活性，例如蛋白酶、脂肪酶、酸性磷酸酶和/或其它或其功能性片段。
接头：融合蛋白可任选地通过包含优选少于100个氨基酸(更优选少于50个氨基酸，少于30个氨基酸或者少于20个氨基酸)的接头序列与甘露聚糖酶相连。接头可简单地将甘露聚糖酶与融合结构域连接起来，而不显著影响组分的性质，或者其可任选具有针对意欲应用的功能重要性，这是由于其氨基酸组成、结构和/或在天然宿主或任何合适异源宿主中表达期间发生的翻译后修饰导致的。接头序列的来源可以是来自任何生物的氨基酸序列，或是任何合成的肽序列。
额外的蛋白：本文描述的用于根据本说明书的用途的甘露聚糖酶还可与一种或多种额外的感兴趣的蛋白(POIs)或感兴趣的核苷酸序列(NOIs)联合使用。POIs的非限制性例子包括：植酸酶、半纤维素酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、乳糖酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、纤维素酶、木糖苷酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖乙酰酯酶、半乳聚糖酶、外切甘露聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、果胶酯酶、聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶(rhamnogalacturonases)、漆酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质酶、蛋白酶、淀粉酶、磷酸酶、脂解酶、角质酶(cutinases)和/或其它。这些包括下述酶，例如，调节底物溶液/悬浮液的粘度，或增加多聚甘露糖底物的可接近性和/或溶解度的酶。NOI甚至可以是针对这些序列中的任何的反义序列。如上文所述，POI甚至可以是融合蛋白。POI甚至可以与分泌序列融合。在一种有利的实施方式中，根据本文公开内容的甘露聚糖酶变体至少与植酸酶联合使用。
其它一些序列也可促进分泌或增加分泌的POI的产量。此类序列可编码分子伴侣蛋白，例如英国专利申请9821198.0中描述的黑曲霉cyp B基因的产物。
出于多种原因，编码POI的NOI可被工程改造，以改变其活性，包括但不限于：改良其表达产物的表达和/或加工的变化。进一步举例而言，NOI还可被修饰，以优化在特定宿主细胞中的表达。还可能想要其它序列改变，以引入限制性酶识别位点。
编码POI的NOI可在其内部包括合成的或经修饰的核苷酸，例如甲基磷酸酯和硫代磷酸酯主链。
编码POI的NOI可被修饰，以增加细胞内稳定性和半寿期。可能的修饰包括但不限于，在分子的5’和/或3’端添加侧翼序列，或在分子主链内使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯键。
甘露聚糖酶基因的表达：为生产甘露聚糖酶，可从公开的序列来化学合成编码酶的DNA，或者可从具有该基因的宿主细胞直接获得所述DNA(例如通过cDNA文库筛选或PCR扩增)。可通过标准分子克隆技术，将甘露聚糖酶基因包括进表达盒，和/或克隆进合适的表达载体。此类表达盒或载体通常含有协助起始和终止转录的序列(例如启动子和终止子)，并且可含有可选择标记。盒还可包含正或负链mRNA，它们的表达可包括或可不包括mRNA翻译之前的扩增步骤。待表达的甘露聚糖酶基因可含有或不含有蛋白的某些结构域，例如多种特异性的聚合物结合结构域(例如碳水化合物结合结构域)。表达盒或载体可被引入合适的表达宿主细胞，所述细胞然后将表达相应的甘露聚糖酶基因。特别合适的表达宿主是细菌表达宿主属，包括埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(Escherichiacoli))，假单胞菌属(Pseudomonas)(例如荧光假单细胞菌(P.fluorescens)或石油脱硫菌(P.stutzerei))，变形杆菌属(Proteus)(例如奇异变形杆菌(Proteus mirabilis))，罗尔斯顿菌属(Ralstonia)(例如富养产碱菌(Ralstonia eutropha))，链霉菌属(Streptomyces)，葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如肉葡萄球菌(S.carnosus))，乳球菌属(Lactococcus)(例如乳酸乳球菌(L.lactis))，乳酸细菌或芽孢杆菌属(Bacillus)(枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)等等)。还特别合适的是酵母表达宿主，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。尤其合适的是真菌表达宿主，例如黑曲霉(Aspergillus niger)，Chrysosporium lucknowense，曲霉属(Aspergillus)(例如米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)、构巢曲霉(A.nidulans)、等等)或里氏木霉。还合适的是哺乳动物表达宿主，例如小鼠(例如NS0)、中国仓鼠卵巢(CHO)或小仓鼠肾(BHK)细胞系，转基因哺乳动物系统，例如兔、山羊或牛，其它真核宿主，例如昆虫细胞，或病毒表达系统，例如噬菌体(如M13、T7噬菌体或Lambda)，或病毒，例如杆状病毒表达系统，或植物。
通过多种转化方法将甘露聚糖酶基因引入表达宿主细胞，所述方法包括但不限于：电穿孔，脂类辅助转化或转染(“脂转染”)，化学介导的转染(例如CaCl和/或CaP)，乙酸锂介导的转化(例如宿主细胞原生质体的)，生物射弹“基因枪”转化，PEG介导的转化(例如宿主细胞原生质体的)，原生质体融合(例如，使用细菌或真核原生质体)、脂质体介导的转化，根癌农杆菌、腺病毒或其它病毒或噬菌体转化或转导。
或者，酶变体在细胞内表达。任选地，在酶变体细胞内表达后，或使用信号序列(例如上文提到的那些)分泌进周质空间后，可使用渗透或裂解步骤，来将甘露聚糖酶释放进上清液。对膜障碍的破坏可通过使用机械方式(例如超声波)、压力处理(French压)、空腔化或使用膜消化酶(例如溶菌酶或酶混合物)来实现。作为另一备选，可使用合适的无细胞表达系统，以无细胞方式表达编码甘露聚糖酶的基因。例如，将来自大肠杆菌细胞的S30提取物用于该目的，或可商业获得的系统(例如Roche AppliedScience，Inc.的CECF技术)。在无细胞系统中，通常，在启动子辅助下转录感兴趣的基因，但是进行连接以形成环状表达载体则是任选的。还可外源添加或产生RNA，而不在无细胞系统中转录和翻译。用于体外表达和执行所有上述表达系统的表达构建体的构型是本领域技术人员能力内熟知的。
克隆和表达里氏木霉甘露聚糖酶基因的上述方法适于工业规模表达，也适用于用于评估经突变变体的高通量筛选。
纯化：如上文所述，甘露聚糖酶蛋白可在多种表达系统中表达，并且因此，必须选择合适的下游加工和纯化流程。感兴趣的蛋白可分泌进细胞外或周质空间，或者细胞内表达。在本文公开内容的一种有利的实施方式中，甘露聚糖酶变体在微生物宿主中表达，蛋白分泌进周质或细胞外空间。表达甘露聚糖酶变体的细胞被本领域任何技术人员公知的方法保存，例如但不限于低温贮藏。使用标准发酵方法，以合适的体积制备表达生物的培养物。在一种优选的实施方式中，从低温贮藏物中接种用于蛋白表达的培养物，培养物的体积在合适的容器中连续增加。在一种优选的实施方式中，细胞生长于发酵罐中，任选地，控制生长条件，例如pH、温度、氧和/或养分供应。纯化的第一步包含使用若干技术中的一种或多种将细胞与上清液分开，所述技术例如沉降、微过滤、离心、絮凝或其它。在一种优选的实施方式中，应用的方法是微过滤。在细胞内表达的情况下，对细胞进行导致蛋白从细胞内空间释放的处理。这些处理可包含例如压力、酶促、渗透冲击、冷冻、超声或其它处理，以产生细胞提取物，可对细胞提取物进行进一步纯化或可不进行。
在本文公开内容的一种有利的实施方式中，蛋白分泌进上清液中，任选的纯化步骤包含通过超滤浓缩上清液。从上清液或从浓缩的上清液对蛋白进行进一步的纯化可用下述若干方法中的一种或多种来进行，所述方法包含萃取或分级分离方法，例如硫酸铵或乙醇或酸沉淀，或色谱方法，包括但不限于离子交换、疏水相互作用、羟磷灰石、通过凝胶过滤进行尺寸分级分离、磷酸纤维素或凝集素色谱以及亲和色谱或它们的任何组合。在一种更优选的方法中，通过金属螯合物亲和色谱来纯化加上了亲和标签的蛋白，以获得高纯度的蛋白。
优选的纯化方法产生了＞30％的蛋白纯度，在一种更优选的方法中，纯度是＞50％、＞60％、＞70％或＞80％。在一种进一步更优选的方法中，纯度是＞90％，在一种还更优选的方法中，纯度是＞95％，以及在一种最优选的方法中，纯度是＞98％。
在本文公开内容的另一有利的实施方式中，通过下述若干技术方法中的任意一种，对上清液或通过超滤经部分纯化的上清液或经浓缩和/或渗滤的上清液进行干燥，所述方法例如但不限于喷雾干燥、冻干、倒灌风蒸发(down-draught evaporation)、薄层蒸发(thin-layer evaporation)、离心蒸发、带式干燥(conveyer drying)或它们的任何组合。
在本文公开内容的另一种有利的实施方式中，包括表达的甘露聚糖酶变体的经发酵的细胞悬浮液作为整体被干燥，其中使用下述工艺，例如但不限于：流床干燥、带式干燥、喷雾干燥或转鼓式干燥(drum drying)或它们的任何组合。
制剂：通常，甘露聚糖酶或本文描述的任何衍生物的组合物可以是液体的或是干燥的。液体组合物可仅包含甘露聚糖酶或包含与其它蛋白或酶组合的甘露聚糖酶，并且可含有支持甘露聚糖酶或组合物中其它蛋白或酶的稳定性和/或活性的添加剂。这些包括但不限于甘油、山梨糖醇、丙二醇、盐类、糖类、防腐剂、pH缓冲剂和碳水化合物。通常，液体组合物是水性的或基于油的浆体、悬浮液或溶液。
可通过喷雾干燥、冻干、倒灌风蒸发、薄层蒸发、离心蒸发、带式干燥或它们的任何组合，从任何液体组合物(包括发酵上清液或细胞悬浮液或细胞提取物)产生干燥的组合物。干燥的组合物可以是合适尺寸的颗粒，所述尺寸与进一步下游应用(例如食品或饲料加工)相容，或有资格作为食品或动物饲料的组分。
在干燥之前，可向液体组合物中加入填充剂(bulking agent)，其能在干燥之后有效增强干燥组合物的性质，例如由于填充剂保护酶抵挡环境因素而提供更高的热稳定性，更好的技术操作性质等等。
一旦获得了干燥的制剂，可使用团聚技术来制备团聚颗粒，例如在剪切混合仪中，期间将填料材料和酶共团聚，以形成颗粒。通过使载体材料的核吸收酶或用酶涂覆它来制备吸收颗粒。典型的填料材料包括硫酸二钠、高岭土、滑石、硅酸铝镁和纤维素纤维。任选地，粘合剂(例如糊精)也可包括进团聚颗粒。典型的载体材料包括淀粉，例如木薯、玉米、马铃薯、稻和小麦的形式，或者可以使用盐类。
任选地，用涂覆混合物来涂覆颗粒。此类混合物包含涂覆剂，优选地，疏水涂覆剂，例如氢化棕榈油和牛油，以及如果需要的话，其它添加剂，例如碳酸钙和高岭土。
在一种特别优选的实施方式中，包含本文公开内容的甘露聚糖酶的组合物意欲用于食品和饲料加工中的应用，或者作为食品和饲料的补充剂。在这种情况下，甘露聚糖酶组合物可额外含有其它取代物，例如着色剂、香味化合物、稳定剂、维生素、矿物质、其它饲料或食品增强酶，等等。这特别应用于所谓的预混合物。根据本文公开内容的食品添加剂可与其它食品组分组合，以生产经加工的食品产品。此类其它食品组分包括一种或多种其它(优选地，热稳定的)酶补充剂、维生素食品添加剂和矿物质食品添加剂。然后，可将得到的包括可能若干不同类型的化合物的组合食品添加剂以合适的量与其它食品组分(例如谷物或植物蛋白)混合，以形成经加工的食品产品。将这些组分加工成食品产品可使用目前可获得的任何方法来进行。
在本文公开内容的一种有利的实施方式中，甘露聚糖酶组合物额外包含有效量的一种或多种饲料或食品增强酶，特别是选自下组的，所述组由植酸酶、半纤维素酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、乳糖酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、纤维素酶、木糖苷酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖乙酰酯酶、半乳聚糖酶、外切甘露聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、果胶酯酶、聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、漆酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质酶、蛋白酶、淀粉酶、磷酸酶、脂解酶、角质酶和/或其它构成但不限于这些。
本文公开内容的甘露聚糖酶的制剂用于加工和/或制造食品或动物饲料。
技术应用：本发明包括甘露聚糖酶衍生物作为用于促进含有寡聚甘露糖的食品材料降解由此释放潜在有益的寡聚甘露糖或其衍生物的食品添加剂或消化助剂的用途。
食品和饲料加工领域的另一应用是对甘露寡糖(作为来自PKE的用于饲料和食品的重要益生元)的生产。通过用甘露聚糖酶处理PKE或其它含半乳甘露聚糖的组分，产生了甘露寡糖和D-甘露糖。甘露寡糖被用作为饲料和食品的益生元组分：甘露寡糖促进益生菌(例如双歧杆菌属(Bifidobacteria)和乳杆菌属(Lactobacillus)的种)的生长，抑制肠道菌沙门氏菌属(Salmonella)的生长，中和凝集素的抗营养性质，并可用于制药工业。此外，甘露寡糖以及尤其是甘露糖疑似是饲料中的免疫激发组分。
食品和饲料加工领域的另一应用是对水果细胞壁中含有甘露聚糖的组分的切割，以改进果汁回收，这例如通过在压榨流程之前向菠萝、柠檬、柑橘、来檬、葡萄柚中添加所述酶来实现。一种有利的应用是根据本文公开内容的甘露聚糖酶变体在烘焙工艺(例如用于曲奇、面包等等)中的用途。
食品和饲料加工领域的另一应用是根据本文公开内容的甘露聚糖酶用于棕榈仁油提取的产量改进的用途。压榨后，棕榈仁渣中剩余的油含量在5-12％之间。可通过化学提取将该残余部分进一步降低至大约3％。通过应用根据本文公开内容的甘露聚糖酶，可快速增加脂肪的释放，由此提供改进的工艺。此外，得到的棕榈仁渣将是更高品质的，这是因为已知是饲料中抗营养组分的半乳甘露聚糖纤维的含量降低了。
食品和饲料加工领域的另一应用是从PKE或其它含有半乳甘露聚糖的组分递送D-甘露糖。棕榈仁粉含有大约20％的甘露糖，它们结合为半乳甘露聚糖纤维。用甘露聚糖酶对PKE、干椰肉或其它含有半乳甘露聚糖的原物质的处理导致D-甘露糖的释放。甘露糖及其衍生物是食品(例如低卡路里饮食食品产品)、药物(甘露糖能治愈所有尿道感染中的超过90％)、化妆品、纺织品中以及聚合物的制造中使用的成分。由于供应有限，较之其它更常见的六糖，甘露糖目前非常贵，其供应稀少。D-甘露糖也可用作为生产甘露糖醇的原材料。甘露糖醇本身通过还原衍生自甘露糖，这要比果糖的转化产量高得多并且更少副产物。甘露糖醇是广泛用于食品和制药工业的多元醇，因为其具有独特的功能性质：甘露糖醇用作为增甜剂，用于药物制剂(咀嚼片和颗粒粉末)，用于生产口香糖，作为用于食品的增稠剂、织构剂(texturing agent)和防结块剂，用作为渗透活性(osmoactive)药物和糖尿病食品组分。
此外，在食品和饲料加工的上述范畴内，提供了根据本文公开内容的甘露聚糖酶用于通过孵育瓜尔胶(guar gum)或豆角胶(locust bean gum)对半乳甘露聚糖进行部分水解的用途。得到的水解产物作为织构组分用于食品和酿造工业，以及用于制药应用。
糖类的生产：本文公开内容中描述的甘露聚糖酶特别有用于从含有多聚甘露糖的植物材料(例如棕榈仁、椰子、魔芋(konjac)、豆角胶、瓜尔胶和大豆)生产糖类或寡糖。优选的是植物材料例如棕榈仁粉、棕榈仁渣、干椰肉粉(copra meal)、干椰肉粒(copra pellets)和大豆皮(soy beanhull)。
在一种特别优选的实施方式中，根据本文公开内容的甘露聚糖酶应用于生产甘露糖和甘露糖聚合物，例如，甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖(mannotetraose)、甘露五糖、甘露六糖、甘露七糖、甘露八糖、甘露九糖(mannononaose)以及甘露糖的更高级聚合物和/或其衍生物。还优选的是具有不同比例的半乳糖和甘露糖(范围从1至0.05)的其半乳糖基甘露寡糖。
在本文公开内容的另一优选的实施方式中，糖类由甘露糖和葡萄糖构成，并且被称为葡甘露聚糖。这些多元醇可由2、3、4、5、6、7、8、9或更多个甘露糖和/或葡萄糖单体构成，其中甘露糖含量为1/15、1/14、1/13、1/12、1/11、1/10、1/9、1/8、1/7、1/6、1/5、1/4、1/3、1/2、1、2/3、3/4、3/5、4/5、5/6、2/7、3/7、4/7、5/7、6/7、3/8、5/8、7/8、2/9、4/9、3/10、2/11、4/11、3/12、2/13或1/14。还特别优选的是不同比例的半乳糖和甘露糖(范围从1至0.05)的其半乳糖基葡甘露寡糖。
在本文公开内容的另一优选的实施方式中，甘露聚糖酶与其它碳水化合物酶组合使用，例如葡聚糖酶，和/或木聚糖酶，和/或α-半乳糖苷酶，和/或纤维素酶，用于水解植物材料以产生糖类。
在本文公开内容的一种更优选的实施方式中，对含有多聚甘露糖的植物材料的水解导致产生展示出益生元功能性的糖类。产生这些糖类，以促进益生菌(已知支持健康免疫系统的细菌)的生长。此类细菌的例子是双歧杆菌。已知的双歧杆菌是青春双歧杆菌(B.adolescensis)、角双歧杆菌(B.angulatum)、动物双歧杆菌(B.animalis)、星状双歧杆菌(B.asteroides)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、牛双歧杆菌(B.boum)、短双歧杆菌(B.breve)、链状双歧杆菌(B.catenulatum)、小猪双歧杆菌(B.choerinum)、棒状双歧杆菌(B.coryneforme)、兔双歧杆菌(B.cuniculi)、齿双歧杆菌(B.dentium)、高卢双歧杆菌(B.gallicum)、鸡双歧杆菌(B.gallinarum)、印度双歧杆菌(B.indicum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、长双歧杆菌(B.longum)、大双歧杆菌(B.magnum)、瘤胃双歧杆菌(B.merycicum)、最小双歧杆菌(B.minimum)、假链状双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)、假长双岐杆菌(B.pseudolongum)、小鸡双歧杆菌(B.pullorum)、反刍双歧杆菌(B.ruminantium)、世纪双歧杆菌(B.saeculare)、B.scardovii、细长双歧杆菌(B.subtile)、嗜热酸双歧杆菌(B.thermacidophilum)和嗜热双歧杆菌(B.thermophilum)。
咖啡萃取：根据本文公开内容描述的甘露聚糖酶有用于水解液体咖啡萃取物中存在的半乳甘露聚糖。在本文公开内容的一种优选的实施方式中，甘露聚糖酶被用于抑制在对液体咖啡萃取物冷冻干燥期间发生的凝胶的形成。萃取物的减少的粘度降低了干燥期间的能量消耗。在本文公开内容的一种进一步更优选的实施方式中，甘露聚糖酶以被固定的形式使用，这降低了酶的消耗，并且防止了咖啡萃取物的污染。
在本文上下文中，另一感兴趣的应用是根据本文公开内容的甘露聚糖酶用于从咖啡废料生产甘露糖或甘露寡糖以获得更高价值的产品的用途。如前文所述，甘露聚糖酶从咖啡废料中释放甘露糖或寡糖，这是高价值的功能性饲料和食品组分。在咖啡饮料工业中，用过的咖啡渣滓通常被用作为燃料或作为工业废料被处理。经烘焙的咖啡含有1.8-4.4％的甘露聚糖。因此，用过的咖啡渣滓含有大量的β-甘露聚糖，其可通过酶促水解被转化为甘露寡糖。从咖啡甘露聚糖获得的甘露寡糖被认为能降低人的血清脂类水平(Jpn J food eng 6(2005))。
动物饲料：若干抗营养因素限制了特定的植物材料在制备动物饲料和用于人的食品中的用途。含有寡甘露聚糖(例如甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖)的植物材料被描述为能降低动物对营养性化合物(例如矿物质、维生素、糖类和脂肪)的可消化性和吸收。负面作用特别是因为甘露糖聚合物的高粘度以及甘露糖聚合物吸收营养性化合物的能力导致的。可通过使用甘露糖聚合物降解酶(即甘露聚糖酶)来消除/降低这些作用，这由此允许含有高得多的比例的甘露糖聚合物的廉价植物材料用于饲料，由此降低了成本。此外，通过甘露聚糖酶的活性，使得甘露糖聚合物破裂成单糖，其可易于被同化并且提供额外的能量。为使用酶作为用于例如单胃动物(例如禽类或猪)的有效饲料补充剂，其必须要在胃中是稳定的。这意味着其必须在低pH(大约pH 2-3)下稳定，并且，此外，其还必须能在该低pH下抵挡胃蛋白酶。此外，此类酶需要在低pH下有活性(大约pH 3.0)，以在胃中有效。本文公开内容中提供的甘露聚糖酶满足所有这些标准，而不像其它甘露聚糖酶酶，例如来自里氏木霉的野生型甘露聚糖酶在低pH下不稳定，特别是在低pH下对胃蛋白酶不稳定。因此，本文公开内容提供的甘露聚糖酶尤其适合于其中酶必须要在动物中有活性的饲料应用。
根据本文公开内容的甘露聚糖酶可用作为用于单胃动物(例如禽类和猪)的饲料以及用于人类食品的添加剂。但是饲料也可提供给鸭、鹅以及牛、犬、山羊、马、猫以及甲壳类和鱼类。甘露聚糖酶还可用于对饲料进行预处理，以代替将其加入到饲料中。
在本文公开内容的一种有利的实施方式中，甘露聚糖酶被加入到用于断奶仔猪(weaning pigs)、保育猪(nursery pigs)、小猪(piglet)、肥育猪(fattening pigs)、生长猪(growing pigs)、成猪(finishing pigs)、蛋母鸡、嫩鸡(broiler chicks)、火鸡的饲料中。
在本文公开内容的一种有利的实施方式中，甘露聚糖酶是由植物材料(例如棕榈仁、椰子、魔芋、豆角胶、瓜尔胶、大豆、大麦、燕麦、亚麻、小麦、玉米、亚麻籽、柑橘果肉、棉籽、落花生、油菜籽、向日葵、豌豆、羽扇豆)和维生素以及矿物质构成的饲料的添加剂。在本文公开内容的一种进一步更优选的实施方式中，甘露聚糖酶是部分由棕榈仁粉、棕榈仁渣、干椰肉粉、干椰肉粒和/或大豆皮构成的饲料的添加剂。
在本文公开内容的一种更有利的实施方式中，甘露聚糖酶与选自下组的其它酶组合用于制备饲料，所述组由植酸酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、果胶酶、木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、半乳聚糖酶、内切葡聚糖酶、木糖苷酶、角质酶、脂肪酶和/或磷脂酶构成但不限于这些。与额外的酶一起或不与它们一起，甘露聚糖酶还可与矿物质、维生素和其它典型的饲料补充剂组合使用。
因为根据本文公开内容的甘露聚糖酶是热稳定的酶，它们可经受热，而不丢失显著的活性。因此，甘露聚糖酶可用于生产造粒的饲料的工艺，该工艺中，会在造粒步骤之前向饲料混合物应用热，如在多种商业制丸磨(pellet mills)中的那样。甘露聚糖酶可在造粒步骤之前加入至其它饲料成分中，或可在造粒步骤之后加入到已经形成的饲料团粒(pellet)中。
本文公开内容的另一优选实施方式中，甘露聚糖酶用于尤其要喂饲给处于不希望抗生素的环境下的动物的动物饲料。
在一种有利的实施方式中，甘露聚糖酶用于部分由棕榈仁粉、棕榈仁渣、干椰肉粉、干椰肉粒和/或大豆皮构成的动物饲料。在一种最优选的实施方式中，甘露聚糖酶用于部分由棕榈仁粉、棕榈仁渣、干椰肉粉、干椰肉粒和/或大豆皮构成的用于嫩鸡的动物饲料。
纸浆工业：根据本文公开内容的甘露聚糖酶可用于对纸浆(例如化学浆、半化学浆、牛皮纸浆(kraft pulp)、机械浆或通过亚硫酸盐方法制备的浆)的酶辅助漂白。纸浆还可以是完全不含氯的用氧、臭氧、过氧化氢或过氧酸漂白的纸浆。
在本文公开内容的一种有利的实施方式中，甘露聚糖酶用于酶辅助的纸浆漂白，所述纸浆是通过经改良的制浆方法或连续制浆方法生产的，其展示出低木质素含量。
在本文公开内容的另一有利的实施方式中，此类应用中的甘露聚糖酶可以单独应用，或者优选与木聚糖酶和/或内切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纤维二糖水解酶组合应用。
纺织工业中的漂白和/或脱浆剂：根据本文公开内容的甘露聚糖酶也可用于对非棉质的纤维质纤维、纱线或织物(包含亚麻、黄麻、苎麻或亚麻布)进行漂白，这通过将纤维、纱线或织物与根据本文公开内容的甘露聚糖酶在适于产生纤维、纱线或织物变白的条件下一起孵育给定的时间来实现。对半纤维素的降解改进了织物的漂白工艺。
在使用含有染料和生物聚合物(例如瓜尔胶)作为增浓剂(thickener)的印刷糊料(printing paste)的纺织品印刷中，通过在存在甘露聚糖酶时洗涤经印刷的纺织品，可大为高效地除去增浓剂和过量的染料。对增浓剂的酶促破坏减少了工艺时间以及获得满意的纺织品品质所需的水和能量的量。
根据本文公开内容的甘露聚糖酶可用于对从例如合成纤维(其中半乳甘露聚糖，例如瓜尔胶或豆角胶，经常用作为上浆剂)制造的织物进行脱浆。
通过水力压裂对油井和气井增产：根据本文公开内容的甘露聚糖酶可用于用在油井或气井增产的水力压裂方法中。在此甘露聚糖酶作为液压机流体(基于甘露糖聚合物或由甘露糖聚合物构成，并且通常含有沙)中的液化剂发挥作用。
因为根据本文公开内容的甘露聚糖酶是热稳定的酶，它们优选用于在高温下进行的水力压裂应用。
在本文公开内容的另一有利的实施方式中，在水力压裂应用中的甘露聚糖酶的液化活性受环境条件(例如pH和温度)控制(抑制或促进)。
去垢剂：根据本文公开内容的甘露聚糖酶可用于去垢剂组合物，以协助除去含有甘露糖聚合物的污渍(stain)/污迹(soil)。在本文公开内容的一种优选的实施方式中，甘露聚糖酶与来自淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶和内切葡聚糖酶的组的其它酶组合用于去垢剂组合物。
除去生物膜：本文公开内容中描述的甘露聚糖酶可用于除去含有甘露糖聚合物的生物膜。优选地，对于此类应用而言，甘露聚糖酶与去垢剂和/或来自α-半乳糖苷酶、果胶酶、木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、半乳聚糖酶、内切葡聚糖酶、木糖苷酶、角质酶和脂肪酶的组的其它酶组合使用。
递送系统：根据本文公开内容的甘露聚糖酶可用于靶向和/或时间依赖性的物质递送。这通过使用基于甘露糖聚合物凝胶(包含并转运物质)的系统来实现。甘露聚糖酶在此类系统中的功能是：由于凝胶的环境(例如活化甘露聚糖酶的pH和/或温度)的特定改变，通过部分或完全降解凝胶来受控释放物质。
在本文公开内容的一种有利的实施方式中，甘露聚糖酶用于在制药应用中靶向递送药物。
可再生资源，即，被培养和收获的生物质底物，例如作物、稻草、木材和木制品，正获得越来越多的关注，因为它们是生产生物燃料(即，固体、液体或气体的燃料，例如，生物柴油、生物气、植物油、生物乙醇、生物丁醇、生物氢、生物二甲醚、生物甲醇、BTL(“生物质到液体”)-燃料、GTL(“气体到液体”)-燃料等等)的合适底物。在第一代的生物燃料中，使用从食品工业建立的方法转化所述植物，即，挤榨所述植物，以获得植物油，或将含淀粉的谷粒转化为糖随后用酵母进行发酵，以获得生物乙醇。这意味着，仅所述植物的能量储备(即，脂肪和/或淀粉)被利用了。这导致不良的能量产量或不良的每英亩生物燃料生产量。在第二代生物燃料中，不仅所述植物的能量储备被利用了，该手段还倾向于利用植物的全部生物质。
在本上下文中，根据本文公开内容的方法可用于将含有半纤维素的植物生物质转化为糖类，糖类可被特定的酵母(例如酵母属种)或细菌菌株和其它微生物代谢，以生产发酵产品。这些发酵产品可以是燃料，例如生物乙醇、生物丁醇，但也可以是构件分子，例如3-羟基丙酸、天冬氨酸、木糖醇和葡萄糖酸。关于可源于糖类的更多构件分子，见(Werpy和Petersen(2004)Top Value Added Chemicals from Biomass：Volume1-Results of Screening for Potential Candidates from Sugars andSynthesis Gas.National Renewable Energy Laboratory ReportNREL/TP-510-35523，图3和表8)。
其它可能用途包含：在根据本文公开内容的甘露聚糖酶的帮助下对已从可再生资源获得的产品进行催化加工。这包括：将均在根据本文公开内容的甘露聚糖酶帮助下获得的葡萄糖和/或果糖加工为2.5-二甲基呋喃，这是杂环化合物，其被认为具有比生物乙醇好得多的燃料性质，因为其具有高40％的能量密度、化学稳定并且不溶于水。
所述手段从根据本文公开内容的甘露聚糖酶的改进性质(特别是增强的热稳定性)获得了很大的好处。这意味着生物质向糖的各种转化可在高温条件下进行，这加速了各工艺，并且因此使得它们在经济上更为高效。
在发明人的近期实验中，棕榈仁渣(PKE)底物被用于喂饲酵母(酿酒酵母)。所述底物含有大约37％的半乳甘露聚糖。其显示，经根据本文公开内容的两种甘露聚糖酶(即，变体B、变体C和/或变体31)处理的PKE释放出大量的糖类，这因此较之未经处理的PKE而言实现了改进的酵母生长。这是对上述假设的清楚暗示，即，根据本文公开内容的甘露聚糖酶可以是增强例如从可再生资源生产生物乙醇的产量的有用工具见例如WO 2008/009673中的实施例19)。
根据本文公开内容的甘露聚糖酶的所有所述用途具有下述共同点：这些手段从根据本文公开内容的甘露聚糖酶的改进性质(特别是增强的热稳定性和增强的对低pH值和蛋白酶的抗性的方面)获得相当的益处。
这主要是由于下述事实：所述用途中的大多数发生于具有不利条件的环境中，例如在主要是低pH值的哺乳动物消化道中，或在被用于加速、协助或经济上优化水解工艺(例如如上文所述将可再生资源转化为糖类)的升高的温度下。
下述方法和实施例仅用于阐述目的而被提供，并且不意欲以任何方式限制本文公开内容的范围。
方法和实施例
在下述实施例中，提供了本文公开内容的材料和方法，包括测定通过所述方法获得的酶的催化性质。应当理解，这些实施例仅用于阐述的目的，它们不应被解释为以任何方式限制本文公开的内容。就所有目的而言，本文提到的所有公开文本、专利和专利申请都通过引用以其整体并入本文。
实施例1：通过His标签纯化甘露聚糖酶
使用C末端融合至甘露聚糖酶的6xHis标签来进行对没有碳水化合物结合结构域(CBD)的甘露聚糖酶的纯化。
在SC-半乳糖培养基中，于30℃在摇瓶中，对经编码加上6xHis标签的甘露聚糖酶的质粒转化的酿酒酵母培养72小时。通过离心从2升培养基中移出细胞，使用5kDa截断值(cut-off)的膜，通过超滤对上清液进行40倍浓缩。随后使用相同的截断值，对浓缩物进行渗滤，用于缓冲液交换(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH 5.0)，并浓缩至终体积为培养物体积的1/40。将浓缩物滤经0.45μm的膜，恰在上样到金属亲和柱(BD-Talon，BD-Bioscience)之前将pH调节至8.0。用若干床体积的渗滤缓冲液(pH 8.0)来洗柱。用0％至100％缓冲液B的梯度洗脱甘露聚糖酶，其中缓冲液B含有50mM NaH2PO4、300mM NaCl和250mM咪唑，pH为6.0。通过SDS PAGE分析洗脱的蛋白样品。合并含有甘露聚糖酶的级分，针对含有50mM NaOAc，pH 5.0的缓冲液透析。针对蛋白检测，使用280nm处的吸光度，用反相色谱控制甘露聚糖酶样品的纯度。
实施例2：纯化具有C-末端CBD的甘露聚糖酶
使用阴离子交换和疏水相互作用色谱来进行对具有C-末端CBD的甘露聚糖酶的纯化。具体而言，于30℃，在摇瓶中，将经编码各甘露聚糖酶的质粒转化的酿酒酵母在SC-半乳糖培养基中培养72小时。通过离心将细胞从5L培养基中移出，使用10kDa截断值的膜，通过超滤对上清液进行浓缩和缓冲液交换(缓冲液A：20mM Triss(羟甲基)-氨基甲烷，pH 8.6)。最后产生了缓冲液A中的200ml甘露聚糖酶浓缩物。将溶液应用到经缓冲液A平衡过的6.3ml TSKgel SuperQ-5PW(30)柱(Tosoh Bioscience)上。用若干柱体积的缓冲液A洗柱。随后用超过120ml的0至100％缓冲液B(20mM Triss(羟甲基)-氨基甲烷，pH 8.6，1M NaCl)的线性梯度对甘露聚糖酶进行洗脱。通过SDS PAGE分析洗脱的蛋白样品。合并含有甘露聚糖酶的级分，用3M硫酸铵溶液进行1∶1稀释，并将其上样到经(缓冲液C：50mM NaOAc，pH 5.0，1.5M硫酸铵)平衡的8.8ml TSK GelPhenyl-5PW(20)柱(Tosoh Bioscience)上。用缓冲液C洗柱。用超过100ml的0至100％缓冲液D(50mM NaOAc，pH 5.0)的线性梯度进行甘露聚糖酶洗脱。通过SDS PAGE分析洗脱的蛋白样品。合并含有甘露聚糖酶的级分，针对缓冲液D进行透析。针对蛋白检测，使用280nm处的吸光度，用反相色谱控制甘露聚糖酶样品的纯度。
实施例3：产生和表征甘露聚糖酶变体
使用用于诱变编码甘露聚糖酶蛋白的DNA的不同方法来产生甘露聚糖酶变体，所述方法例如是盒或PCR诱变或者本领域公知的其它诱变方法。这些方法包括Morinaga等人，Biotechnology 2：646-649(1984)中和Nelson和Long，Analytical Biochemistry 180：147-151(1989)中所公开的方法或WO 92/18645中描述的错误阈值诱变(Error Threshold Mutagenesis)方法。对于诱变PCR而言，Cadwell和Joyce，PCR Methods Appl.3：136-140(1994)公开了另一合适方法。
在下述表达宿主中的一种或多种中异源表达甘露聚糖酶变体：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。
实施例4：测定温度稳定性
通过其失活温度来表征甘露聚糖酶变体的温度稳定性。通过测量在不同温度下孵育之后甘露聚糖酶的残余活性来测定失活温度。通过在对甘露聚糖酶样品有或没有之前的温度挑战的情况下测量甘露聚糖酶活性来测定残余活性。更详细地来说，在多种温度下，在50mM NaOAc缓冲液，pH5.0和0.025％ Triton-X-100中对甘露聚糖酶样品孵育45分钟。随后，使用AZCL-半乳甘露聚糖(carob，Megazyme)作为底物，测定甘露聚糖酶活性。为实现此目的，将甘露聚糖酶样品和甘露聚糖酶校正系列(经纯化的根据Seq.ID No 3的甘露聚糖酶，其具有C-末端的6xHisTag)与1mg/mlAZCL-半乳甘露聚糖、50mM NaOAc，pH 5.0和0.1％Triton-X-100在37℃孵育60分钟。随后将来自AZCL-半乳甘露聚糖检验的上清液转移到96孔微滴定板中，在标准读板仪中于590nm处测定吸光度。将针对甘露聚糖酶校正系列的吸光度数据对酶浓度作图。使用通过对针对甘露聚糖酶标准系列的数据进行合适的曲线拟合产生的等式，来计算其它甘露聚糖酶样品的活性。因此，甘露聚糖酶样品的活性被表示为甘露聚糖酶校正系列的活性当量。
甘露聚糖酶的失活温度被定义为下述温度，在该温度下，甘露聚糖酶的残余活性较之在相同条件但在室温下孵育的相同甘露聚糖酶的残余活性而言为50％。合适的话，从活性数据进行外推和插值法，以确定对应50％残余活性的温度。通过用两种酶的失活温度相减，来计算以[℃]表示的温度稳定性差异(TD)。
表3：针对甘露聚糖酶变体，以[℃]表示的温度稳定性差异(TD)。示出的变体基于Seq.ID No 3，并且携带C-末端的6xHis标签或碳水化合物结合结构域(CBD，Seq.ID No 10，图11)。示出的取代被引入Seq.ID No3。温度稳定性差异(TD)被定义为(变体的失活温度)-(Seq.ID No 3的失活温度)，其中变体和具有Seq.ID No 3的酶均具有相同的C-末端标签。具有Seq.ID No 3的携带C-末端CBD的酶展示出74.6℃的失活温度。具有Seq.ID No 3的携带C-末端6xHis标签的酶展示出75.7℃的失活温度。
Figure BDA00001884725400411
Figure BDA00001884725400421
Figure BDA00001884725400431
Figure BDA00001884725400441
实施例5：比活性
使用根据实施例1和2的经纯化的酶来测定甘露聚糖酶的比活性。甘露聚糖酶活性被定义为来自半乳甘露聚糖的还原糖的释出。通过在280nm的光密度(OD)测量来测定甘露聚糖酶蛋白。
详细地说，将经纯化的甘露聚糖酶样品稀释于50mM NaOAc，pH 5.0中。加入半乳甘露聚糖carob(低粘度，Megazyme)溶液，产生0.7％(w/v)半乳甘露聚糖、50mM NaOAc、pH 5.0和大约10μg/ml甘露聚糖酶蛋白的终浓度。于37℃对溶液孵育16小时。
随后，按照下文所述测定还原糖的量。将一份(part)半乳甘露聚糖检验或给定的甘露糖溶液与一份含有1％(w/v)二硝基水杨酸(DNSA)、30％(w/v)酒石酸钠钾和0.4M NaOH的溶液混合。在99℃对混合物孵育10分钟，再在4℃孵育5分钟。最后，在540nm处测量吸光度。通过将甘露糖标准样品的吸光度数据对甘露糖浓度作图，来计算还原糖当量(作为甘露糖当量)。使用通过对针对甘露糖标准样品的数据进行合适的曲线拟合产生的等式，来计算针对样品的还原糖当量的量。
从在280nm处的制品光密度和针对每种甘露聚糖酶变体的分别的消光系数，来计算甘露聚糖酶浓度。根据Gill和von Hippel，AnalyticalBiochemistry 182：319-326(1989)提供的方法，基于蛋白的氨基酸组成，计算消光系数。
如上文所述，根据本文公开内容的甘露聚糖酶的比活性以每mg甘露聚糖酶蛋白在底物半乳甘露聚糖carob上的nkat来表示。一个nkat的活性被定义为每秒一纳摩尔还原糖的释出。
表4：甘露聚糖酶变体的比活性。示出的变体基于Seq.ID No 3，并且携带C-末端的6xHis标签或碳水化合物结合结构域(CBD，Seq.ID No 10)。示出的取代被引入Seq.ID No 3。比活性值被定义为(变体的比活性)/(参照的比活性)。该情况下，参照是来自Seq.ID No 3并且具有与各变体中所存在的相同的C-末端标签的甘露聚糖酶。具有C-末端6xHis标签的参照具有1228nkat/mg的比活性，具有C-末端CBD的参照具有535nkat/mg的比活性。
Figure BDA00001884725400451
实施例6：低pH/胃蛋白酶稳定性
为测定甘露聚糖酶的低pH/胃蛋白酶稳定性，于30℃，在摇瓶中，将经编码各甘露聚糖酶的质粒转化的酿酒酵母在SC-半乳糖培养基中培养72小时。通过离心移出细胞，分离和浓缩上清液，例如通过以10kDa截断值的膜进行超滤进行10倍浓缩。稀释经浓缩的上清液，例如，在经高压灭菌的含有30g/l马铃薯汁液水、30g/l玉米浸泡液(steep liquor)、5g/l硫酸铵、15g/l KH2PO4、10g/l豆角胶和20g/l纤维素(Avicell)的溶液中稀释10倍。将经稀释的甘露聚糖酶样品与胃蛋白酶检验(200mM甘氨酸-HCl，pH 1.5，5mg/ml经胃蛋白酶预消化的BSA，2mM CaCl2和0.5mg/ml胃蛋白酶)以1∶1混合，并在37℃孵育2小时。混合物的pH为pH 2.45。此外，产生对照样品。为实现此目的，将相同的经稀释甘露聚糖酶样品与对照检验(100mM NaOAc，pH 5.2，5mg/ml经胃蛋白酶预消化的BSA和2mM CaCl2)1∶1混合，并在37℃孵育2小时。混合物的pH为pH 5.2。
为进行甘露聚糖酶活性测定，将一份上述混合物或者甘露聚糖酶校正系列(根据Seq.ID No 3的、具有C-末端6xHis标签的经纯化的甘露聚糖酶)与14份的AZCL-半乳甘露聚糖检验(200mM NaOAc，pH 5.0，0.1％Triton-X-100，1％ AZCL-半乳甘露聚糖carob(Megazyme))混合，并在37℃孵育60分钟。离心样品，并针对在590nm处的吸光度分析上清液。将针对甘露聚糖酶校正系列的吸光度数据对酶浓度作图。使用通过对针对甘露聚糖酶校正系列的数据进行合适的曲线拟合产生的等式，计算其它甘露聚糖酶样品的活性。因此，甘露聚糖酶样品的活性被表示为甘露聚糖酶校正系列的活性当量。
甘露聚糖酶的残余活性被计算为下述比例：
(在胃蛋白酶检验中孵育后的甘露聚糖酶活性)/(在对照检验中孵育后的甘露聚糖酶活性)
表5：甘露聚糖酶变体的低pH/胃蛋白酶稳定性。示出的变体基于Seq.ID No 3，并且在C末端携带碳水化合物结合结构域(CBD，Seq.ID No 10)。示出的取代被引入Seq.ID No 3。根据Seq.ID No 1的、具有C-末端CBD的参照甘露聚糖酶展示出39％的残余活性。
Figure BDA00001884725400471
实施例7：比较里氏木霉甘露聚糖酶和变体S3R
将SEQ ID NO：1所示的里氏木霉甘露聚糖酶的温度稳定性与甘露糖生产与通过引入取代S3R(位置3的丝氨酸变为精氨酸)而源于SEQ IDNO：1的甘露聚糖酶变体进行比较。实验和结果详细描述于WO2008/009673(实施例8，100-101页；图1B)和图10中。
序列表，自由文本
SEQ ID NO 1：野生型里氏木霉甘露聚糖酶的片段/氨基酸
SEQ ID NO 2：WO 2008/009673中公开的甘露聚糖酶变体V-31/氨基酸
SEQ ID NO 3：WO 2008/009673中公开的甘露聚糖酶变体V-31/S3R/氨基酸
SEQ ID NO 4：甘露聚糖酶变体TM-1/氨基酸
SEQ ID NO 5：甘露聚糖酶变体TM-1/DNA
SEQ ID NO 6：甘露聚糖酶TM-100/氨基酸
SEQ ID NO 7：甘露聚糖酶变体TM-108/氨基酸
SEQ ID NO 8：甘露聚糖酶变体TM-CBD-148/氨基酸
SEQ ID NO 9：甘露聚糖酶变体TM-144/氨基酸
SEQ ID NO 9：CBD/氨基酸
Figure IDA00001884726300011
Figure IDA00001884726300021
Figure IDA00001884726300031
Figure IDA00001884726300041
Figure IDA00001884726300051
Figure IDA00001884726300061
Figure IDA00001884726300071
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Figure IDA00001884726300091
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Figure IDA00001884726300111
Figure IDA00001884726300121

Claims (26)

1.甘露聚糖酶变体，其较之甘露聚糖酶SEQ ID NO：3而言具有至少3℃的改进的热稳定性。
2.权利要求1的甘露聚糖酶变体，其中所述改进的热稳定性在大约4℃至大约9.3℃的范围内。
3.权利要求1或2的甘露聚糖酶变体，其中所述改进的热稳定性在大约5.7℃至大约9.3℃的范围内。
4.甘露聚糖酶变体，其较之甘露聚糖酶SEQ ID NO：3而言具有至少107％的改进的比活性。
5.权利要求4的甘露聚糖酶变体，其中所述改进的比活性在大约107％至大约212％的范围内。
6.甘露聚糖酶变体，其具有甘露聚糖酶活性，并且具有与亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)不同的氨基酸序列，其中，所述甘露聚糖酶变体的氨基酸包含变异201S、207F和274L，以及位于对应于位置66、215或259的一处或多处位置的变异。
7.权利要求6的甘露聚糖酶变体，其中所述甘露聚糖酶变体还包含变异3R。
8.权利要求6或7的甘露聚糖酶变体，其中所述甘露聚糖酶变体还包含变异181A/H。
9.权利要求6至8中任意一项的甘露聚糖酶变体，其中所述甘露聚糖酶变体至少包含位于对应于位置66、215和259的位置处的变异。
10.权利要求6至8中任意一项的甘露聚糖酶变体，其中所述甘露聚糖酶变体至少包含位于对应于位置3、66、215和259的位置处的变异。
11.权利要求6至8中任意一项的甘露聚糖酶变体，其中所述甘露聚糖酶变体至少包含位于对应于位置3、66、181、215和259的位置处的变异。
12.权利要求6至11中任意一项的甘露聚糖酶变体，其中位于位置66、215或259中一处或多处的变异分别是66P、215T和259R。
13.权利要求6至12中任意一项的甘露聚糖酶变体，其中位于位置3、66、215或259中一处或多处的所述变异分别是3R、66P、215T和259R。
14.权利要求6至13中任意一项的甘露聚糖酶变体，其中位于位置3、66、215或259中一处或多处的所述变异分别是3R、66P、181A/H、215T和259R。
15.权利要求6至14中任意一项的甘露聚糖酶变体，其中所述甘露聚糖酶变体还包含一处或多处另外的变异，其中所述变异位置是31、97、113、146、149、173、181、280、282、331或344。
16.权利要求6至15中任意一项的甘露聚糖酶变体，其中所述变异是31Y、97R、113Y、146Q、149K、173H/T、181H/A、280S/L/R、282D、331S或344D。
17.甘露聚糖酶，其与权利要求1至16的甘露聚糖酶具有至少最小百分比序列同一性和/或百分比同源性，其中所述最小百分比同一性和/或同源性为至少50％，至少60％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少93％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％。
18.甘露聚糖酶变体，其具有甘露聚糖酶活性，并且具有与亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)不同的氨基酸序列，其中，所述甘露聚糖酶变体的氨基酸包含变异201S、207F和274L，以及至少地选自下组的变异，所述组由
1)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D/N331S
2)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S
3)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
4)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
5)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
6)F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L
7)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R
8)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
9)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R
10)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D
11)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D/N331S
12)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L
13)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D
14)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280R/N282D
15)S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R
16)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D
17)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D
18)F31Y/S66P/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D
19)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L
20)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
21)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173T/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
22)F31Y/S66P/Q97R/N173T/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
23)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D
24)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D
25)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
26)S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D
27)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/N331S
28)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280R/N282D/N331S
29)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
30)S66P/Q97R/N113Y/N173T/V181A/A215T/Q259R
31)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S
32)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R
33)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/N331S
34)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280L
35)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280L
36)F31Y/S66P/Q97R/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
37)S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R/N282D
38)F31Y/S66P/Q97R/V181H/A215T/Q259R/N282D
39)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S
40)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S
41)S66P/V181H/A215T/Q259R/N282D
42)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N331S
43)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D
44)S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/N282D
45)S66P/V181H/A215T/Q259R
46)S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
47)F31Y/S66P/N173T/V181H/A215T/Q259R/N282D
48)F31Y/S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N344D
49)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
50)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
51)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S
52)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R
53)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S
54)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D
55)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
56)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R
57)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/N331S
58)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
59)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S
60)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S
61)F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S
62)S66P/A215T/Q259R
63)S3R/S66P/A215T/Q259R构成。
19.核酸分子，其选自下组，所述组由
i)编码根据权利要求1-18中任意一项的甘露聚糖酶的核酸分子；
j)编码根据权利要求1-18中任意一项的经修饰的甘露聚糖酶的衍生物的核酸分子，优选地所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基被保守取代；
k)核酸分子，其是SEQ ID NO：5所示的核酸分子的片断、变体、同源体、衍生物或片段；
l)核酸分子，其能在严格条件下与a)-d)中任何核酸分子杂交；
m)核酸分子，其能在严格条件下与a)-d)中任何核酸分子的互补序列杂交；
n)核酸分子，其与a)-f)中任何核酸分子具有至少95％的序列同一性，并且编码甘露聚糖酶；
o)核酸分子，其与a)-f)中任何核酸分子具有至少70％的序列同一性，并且编码甘露聚糖酶；
p)或a)-h)中任何核酸分子的互补序列
构成。
20.包含权利要求19的核酸分子的载体。
21.宿主细胞，其用权利要求20的载体转化和/或包含权利要求19的核酸分子。
22.SEQ ID NO：5的核酸分子。
23.用于制备根据权利要求1至18中任意一项所述的经修饰的甘露聚糖酶的方法，所述方法包括培养权利要求21的宿主细胞以及从培养物中分离所述经修饰的甘露聚糖酶。
24.组合物，其包含根据权利要求1至18中任意一项所述的经修饰的甘露聚糖酶。
25.权利要求24的组合物，其适用于食品和饲料加工，作为食品和饲料的补充剂，用于酶辅助的纸浆漂白，用于通过水力压裂的油井和气井增产，作为去垢剂，用于除去生物膜，或者用于递送系统中。
26.根据权利要求1至9中任意一项所述的经修饰的甘露聚糖酶的用途
●用于食品和饲料加工，
●用于咖啡萃取，
●用于咖啡废料加工，
●作为食品和饲料的补充剂，
●用于酶辅助的纸浆漂白，
●作为纺织工业中的漂白剂和/或脱浆剂，
●用于通过水力压裂的油井和气井增产，
●作为去垢剂，
●用于除去生物膜，
●用于递送系统中，和/或
●用于加工意欲用于生产生物燃料的可再生资源。
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