JP5795331B2 - 新規マンナナーゼ変異体 - Google Patents
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1) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D/N331S
2) S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S
3) F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
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7) S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R
8) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
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10) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D
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24) S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D
25) S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
26) S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D
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31) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S
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33) S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/N331S
34) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280L
35) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280L
36) F31Y/S66P/Q97R/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
37) S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R/N282D
38) F31Y/S66P/Q97R/V181H/A215T/Q259R/N282D
39) S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S
40) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S
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43) S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D
44) S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/N282D
45) S66P/V181H/A215T/Q259R
46) S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
47) F31Y/S66P/N173T/V181H/A215T/Q259R/N282D
48) F31Y/S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N344D
49) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
50) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
51) S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S
52) S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R
53) S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S
54) S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D
55) F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
56) S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R
57) S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/N331S
58) F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
59) S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S
60) S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S
61) F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S
62) S66P/A215T/ Q259R
63) S3R/S66P/A215T/ Q259R
からなる群より選択される変異とを含むマンナナーゼ変異体である。
a)本開示によるマンナナーゼ変異体をコードする核酸分子;
b)本開示によるマンナナーゼ変異体の誘導体をコードする核酸分子、好ましくは該誘導体において、一つ又は複数のアミノ酸残基が保存置換されている;
c)配列番号5に示す核酸分子のフラクション、変異体、相同体、誘導体又は断片である核酸分子;
d)a)〜c)の核酸分子のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸分子;
e)a)〜c)の核酸分子のいずれかの相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸分子;
f)a)〜e)の核酸分子のいずれかと少なくとも95%の配列同一性を有し、マンナナーゼをコードする核酸分子、
g)a)〜e)の核酸分子のいずれかと少なくとも70%の配列同一性を有し、マンナナーゼをコードする核酸分子、
h)又はa)〜g)の核酸分子のいずれかの相補体
からなる群より選択される核酸分子である。
1.より高い熱安定性及び/又は
2.より高い比活性及び/又は
3.低pHでの改善された安定性及び/又は
4.ペプシンのようなプロテアーゼによるタンパク質分解切断に対するより高い耐性;及び/又は
5.低pHでのより高い残存活性
のような酵素の改善された特性を導く。
(a)上記の記載による改変マンナナーゼをコードする核酸分子、
(b)上記の記載による改変マンナナーゼの誘導体をコードする核酸分子であって、該誘導体において、一つ又は複数のアミノ酸残基が保存置換されている核酸分子;
(c)配列番号5として示す核酸分子、
(d)配列番号5として示す核酸分子の変異体、相同体、誘導体又は断片である核酸分子;
(e)配列番号5に示す核酸分子の相補体である核酸分子;
(f)配列番号5として示す核酸分子の変異体、相同体、誘導体又は断片の相補体である核酸分子;
(g)配列番号5に示す核酸分子とハイブリダイズできる核酸分子;
(h)配列番号5として示す核酸分子の変異体、相同体、誘導体又は断片とハイブリダイズできる核酸分子;
(i)配列番号5に示す核酸分子とハイブリダイズできる核酸分子の相補体である核酸分子;
(j)配列番号5として示す核酸分子の変異体、相同体、誘導体又は断片とハイブリダイズできる核酸分子の相補体である核酸分子;
(k)配列番号5に示す核酸分子の相補体とハイブリダイズできる核酸分子;
(l)配列番号5として示す核酸分子の変異体、相同体、誘導体又は断片の相補体とハイブリダイズできる核酸分子、
(m)a)〜l)の核酸分子のいずれかと少なくとも95%の配列同一性を有し、マンナナーゼをコードする核酸分子、
(n)a)〜b)の核酸分子のいずれかと少なくとも70%の配列同一性を有し、マンナナーゼをコードする核酸分子、及び/或いは
(o)a)〜n)の核酸分子のいずれかのフラクション又は相補体
からなる群より選択される核酸分子及び核酸分子の使用に関する。
以下の実施例では、方法により得られる酵素の触媒特性の決定を含む本開示の材料及び方法を示す。これらの実施例は、説明の目的だけのためであり、いずれの様式でも本開示を限定すると解釈されないと理解される。本明細書で引用する全ての出版物、特許及び特許出願は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。
糖質結合ドメイン(CBD)を有さないマンナナーゼ酵素の精製を、マンナナーゼ酵素にC末端で融合した6×Hisタグを用いて行った。
C末端CBDを有するマンナナーゼ酵素の精製を、アニオン交換及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて行った。詳細には、各マンナナーゼ酵素をコードするプラスミドで形質転換したエス・サッカロミセスを、振とうフラスコ中で、30℃にて72時間、SC-ガラクトース培養培地中で培養した。5リットル培養培地からの細胞を遠心分離により除去し、上清を、10 kDaカットオフメンブレンを用いる限外濾過による濃縮及び緩衝液交換(緩衝液A: 20 mM Tris(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、pH 8.6)に供した。最終的に、緩衝液A中の200 mlのマンナナーゼ濃縮物を得た。溶液を、緩衝液Aで平衡化した6.3 ml TSKgel SuperQ-5PW(30)カラム(Tosoh Bioscience)に加えた。カラムを、数カラム容量の緩衝液Aで洗浄した。その後に、マンナナーゼ酵素を、120 mlにわたる0%から100%までの緩衝液B(20 mM Tris(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、pH 8.6、1M NaCl)の直線勾配で溶出した。溶出されたタンパク質試料をSDS PAGEにより分析した。マンナナーゼを含有する画分をプールし、3M硫酸アンモニウム溶液で1:1に希釈し、平衡化した(緩衝液C: 50 mM NaOAc、pH 5.0、1.5M硫酸アンモニウム) 8.8ml TSK Gel Phenyl-5PW(20)カラム(Tosoh Bioscience)に載せた。カラムを緩衝液Cで洗浄した。マンナナーゼの溶出は、100mlにわたる0から100%までの緩衝液D(50 mM NaOAc、pH 5.0)の直線勾配により行った。溶出されたタンパク質試料をSDS PAGEにより分析した。マンナナーゼを含有する画分をプールし、緩衝液Dに対して透析した。マンナナーゼ試料の純度を、タンパク質検出のために280nmでの吸光度を用いる逆相クロマトグラフィーを用いて制御した。
マンナナーゼ変異体を、カセット又はPCR突然変異誘発又は当該技術において公知のその他の突然変異誘発法のような、マンナナーゼタンパク質をコードするDNAの突然変異誘発について異なる方法を用いて作製した。これらの方法は、Morinagaら、Biotechnology 2:646〜649頁(1984)、並びにNelson及びLong、Analytical Biochemistry 180:147〜151頁(1989)に開示される方法、又はWO 92/18645に記載されるエラー閾値突然変異誘発(Error Threshold Mutagenesis)プロトコールを含む。突然変異誘発PCRについて、別の適切な方法は、Cadwell及びJoyce、PCR Methods Appl. 3:136〜140頁(1994)により開示されている。
マンナナーゼ変異体の温度安定性を、それらの不活性化温度により特徴づける。不活性化温度は、異なる温度でのインキュベーションの後にマンナナーゼ酵素の残存活性を測定することにより決定した。残存活性は、マンナナーゼ活性を、マンナナーゼ試料に対して予め温度攻撃するか又はせずに測定することにより決定した。より詳細には、マンナナーゼ試料を、50 mM NaOAc緩衝液、pH 5.0及び0.025% Triton-X-100中で45分間、様々な温度でインキュベートした。その後に、マンナナーゼ活性を、AZCL-ガラクトマンナン(イナゴマメ、Megazyme)を基質として用いて決定した。このために、マンナナーゼ試料及びマンナナーゼ酵素較正シリーズ(C末端6×Hisタグを有する配列番号3による精製マンナナーゼ)を、1 mg/ml AZCL-ガラクトマンナン、50 mM NaOAc、pH 5.0及び0.1% Triton-X-100と60分間、37℃にてインキュベートした。AZCL-ガラクトマンナンアッセイからの上清を、その後、96ウェルマイクロタイタープレートに移し、吸光度を、590 nmにて標準的なプレートリーダーにおいて決定した。マンナナーゼ酵素較正シリーズについての吸光度データを、酵素濃度に対してプロットした。他のマンナナーゼ試料の活性を、マンナナーゼ酵素標準物質シリーズについてのデータの適当な曲線の当てはめにより作製した等式を用いて計算した。よって、マンナナーゼ試料の活性は、マンナナーゼ酵素較正シリーズの活性当量として表す。
マンナナーゼ酵素の比活性を、実施例1及び2による精製酵素を用いて決定した。マンナナーゼ活性は、ガラクトマンナンからの還元糖の遊離として定義した。マンナナーゼタンパク質は、280 nmでの光学密度(OD)測定により決定した。
マンナナーゼ酵素の低pH/ペプシン安定性を決定するために、各マンナナーゼ酵素をコードするプラスミドで形質転換したエス・サッカロミセスを、振とうフラスコ中で、30℃にて72時間、SC-ガラクトース培養培地中で培養した。細胞を遠心分離により除去し、上清を分離して、例えば10倍に、10 kDaカットオフメンブレンを用いる限外濾過により濃縮した。濃縮上清を、例えば10倍に、30g/lバレイショ搾汁、30g/lコーンスティープリカー、5g/l硫酸アンモニウム、15g/l KH2PO4、10g/lローカストビーンガム及び20g/lセルロース(Avicell)を含有する、オートクレーブした溶液中で希釈した。希釈マンナナーゼ試料を、ペプシンアッセイ(200 mMグリシン-HCl、pH1.5、5mg/mlペプシン予備消化BSA、2mM CaCl2及び0.5 mg/mlペプシン)と1:1で混合し、2時間、37℃にてインキュベートした。混合物のpHは、pH 2.45であった。さらに、対照試料を作製した。このために、同じ希釈マンナナーゼ試料を、対照アッセイ(100mM NaOAc、pH 5.2、5mg/mlペプシン予備消化BSA及び2mM CaCl2)と1:1で混合し、2時間、37℃にてインキュベートした。混合物のpHは、pH 5.2であった。
(ペプシンアッセイ中でのインキュベーション後のマンナナーゼ活性)/(対照アッセイ中でのインキュベーション後のマンナナーゼ活性)。
配列番号1に示すトリコデルマ・リーゼイマンナナーゼの温度安定性及びマンノース生成を、置換S3R(3位にてセリンからアルギニンへ)を導入することにより配列番号1から導いたマンナナーゼ変異体と比較した。実験及び結果は、WO 2008/009673(実施例8、100〜101頁;図1B)及び図10に詳細に記載する。
配列番号2:WO 2008/009673に開示されるマンナナーゼ変異体V-31/アミノ酸
配列番号3:WO 2008/009673に開示されるマンナナーゼ変異体V-31/S3R/アミノ酸
配列番号4:マンナナーゼ変異体TM-1/アミノ酸
配列番号5:マンナナーゼ変異体TM-1/DNA
配列番号6:マンナナーゼTM-100/アミノ酸
配列番号7:マンナナーゼ変異体TM-108/アミノ酸
配列番号8:マンナナーゼ変異体TM-CBD-148/アミノ酸
配列番号9:マンナナーゼ変異体TM-144/アミノ酸
配列番号9:CBD/アミノ酸
Claims (8)
- マンナナーゼ活性と、親/野生型トリコデルマ・リーゼイマンナナーゼのアミノ酸配列(配列番号1)から変異したアミノ酸配列とを有するマンナナーゼ変異体であって、マンナナーゼ変異体のアミノ酸が、201S、207F及び274Lの変異と、少なくとも、
1) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D/N331S
2) S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S
3) F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
4) F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
5) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
6) F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L
7) S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R
8) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S
9) S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R
10) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D
11) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D/N331S
12) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L
13) F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D
14) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280R/N282D
15) S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R
16) S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D
17) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D
18) F31Y/S66P/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D
19) F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L
20) S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
21) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173T/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
22) F31Y/S66P/Q97R/N173T/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D
23) F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D
24) S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D
49) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D
からなる群より選択される変異とを含む、マンナナーゼ変異体。 - 請求項1に記載のマンナナーゼ変異体をコードする核酸分子。
- 請求項2に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項3に記載のベクターで形質転換され、かつ/又は請求項2に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
- 配列番号5の配列を有する核酸分子。
- 請求項1に記載のマンナナーゼ変異体を調製する方法であって、請求項4に記載の宿主細胞を培養するステップと、培養物からマンナナーゼ変異体を単離するステップとを含む方法。
- 食物及び飼料加工のため、食物及び飼料への補充物質として、紙パルプの酵素補助漂白のため、水圧破砕による油井及びガス井刺激のため、洗浄剤として、生物膜の除去のため、又は薬物の標的化送達のために適切な、請求項1に記載のマンナナーゼ変異体を含む組成物。
- 食物及び飼料加工のため、
コーヒー抽出のため、
コーヒー廃棄物の加工のため、
食物及び飼料への補充物質として、
紙パルプの酵素補助漂白のため、
繊維産業における漂白剤及び/又は糊抜き剤として、
水圧破砕による油井及びガス井刺激のため、
洗浄剤として、
生物膜の除去のため、
薬物の標的化送達のため、並びに/或いは
バイオ燃料の生産を意図する再生可能資源の加工のための、
請求項1に記載のマンナナーゼ変異体の使用。
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