TWI512107B - 具提升酶產量及活性之甘露聚醣酶 - Google Patents

具提升酶產量及活性之甘露聚醣酶 Download PDF

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Description

具提升酶產量及活性之甘露聚醣酶
本案係關於一種甘露聚醣酶，尤指一種具提升酶產量及活性之甘露聚醣酶。
植物細胞壁主要由纖維素(cellulose)、半纖維素(hemicellulose)及木質素(lignin)三種物質所組成，其中以纖維素含量最多，半纖維素次之。甘露聚醣為半纖維素中的一個重要成份，甘露聚糖主要可分成四類：直鏈甘露聚醣(linear mannan)、葡萄甘露聚醣(glucomannan)、半乳甘露聚醣(galactomannan)和半乳葡萄甘露聚醣(galactoglucomannan)。這些多糖體主要是由甘露糖(mannose)為基本單位，以β-1,4-糖苷鍵(glycosidic bond)鍵結成骨架。內切性甘露聚醣酶(endo-β-mannanase)為分解自然界中大量存在的聚甘露醣的主要酵素之一，這類酵素能對β-1,4-糖苷鍵(glycosidic bond)進行隨機水解作用。此甘露聚醣酶常見於許多細菌以及真菌之中。
近年來，隨著自然界半纖維素資源的開發，甘露聚醣酶的工業利用價值也漸受重視，並且被廣泛地應用於不同工業上，如：造紙工業、食品及飼料工業等。在紙漿及造紙業中，甘露聚醣酶可用來破壞半纖維素與木質素之鍵結，有利於木質素的去除，大幅降低漂白劑及氯的用量。在食品應用上，可以當作果汁飲料的澄清劑及降低咖啡豆加工時的黏度，減少蒸發濃縮的 成本。而在動物飼料工業上可當做飼料添加劑，提高動物對飼料的轉換率。然而針對不同工業的應用，甘露聚醣酶也需有符合其不同的適用條件與範圍，例如：高耐熱性、高活性及耐酸鹼性等，如此在工業應用上才有其商業價值及競爭性。因此，找出符合不同工業上所需的酶蛋白也是目前學術及產業界持續努力的目標。
為了得到更符合需求的酶蛋白，目前大致上可分 為兩個方向去進行：其一是從自然界中篩選合適的酶基因，例如目前已從嗜鹼菌Bacillus sp.N16-5中分離出耐鹼的甘露聚醣酶，其最適pH值為pH 10.0；而具耐酸性的酶，則由嗜酸菌Aspergillus sulphureus 分離出來。另一個途徑就是將現有已產業化的酶蛋白再加以進行基因改造，以符合不同產業的需求。
而現今改造酶蛋白主要有兩大策略：其一是隨機 突變(random mutagenesis)或是將酶基因隨機排列，再在特定的作用條件之下，篩選出更符合其作用條件的酶蛋白。舉例來說，有學者將Armillariella tabescens 的MAN47基因採取隨機突變的易錯聚合酶連鎖反應(error-prone PCR)技術，將基因序列隨意突變之後，送入Saccharomyces cerevisiae 系統表現。在篩選了100多株突變株後，得到比野生株更具耐酸鹼性及耐高溫的甘露聚醣酶。 此策略的好處是無須深入研究酶的結構或作用機制，而是直接在特定的條件下隨機去找出更好的酶蛋白。然而，缺點即是需要大量的人力以及時間去進行大量的篩選，並且此方法也需要有很好的大量篩選方法來配合。
另一種改造策略則是藉由研究酶的三維結構與 作用機制，找出對於酶活性或特性具有關鍵性的胺基酸，並針對這些特定胺基酸進行定點突變與測試，進而得到功能性更強的改造酶蛋白。舉例來說，Cartmell等人解出外切性甘露聚醣酶 (exo-mannanase)Cj Man26C蛋白立體結構後，發現其與內切性甘露聚醣酶Cj Man26A在結構上有很高的相似度。經由結構相互比對分析後，發現Cj Man26C有四個胺基酸在空間上的位置與Cj Man26A有明顯的不同，而此四個胺基酸皆位於靠近活性區的環狀結構(loop)裡。在經由突變了Cj Man26C這四個胺基酸後，成功的將Cj Man26C活性反應模式由外切性甘露聚醣酶轉變為內切性甘露聚醣酶。由此可知，分析蛋白立體結構可提供許多有助於改造特性的資訊，讓研發人員可以只針對這些特定胺基酸來進行改造，減少大量人力篩選的時間，來得到適合不同工業產業應用的甘露聚醣酶。
因此，本案欲藉由研究甘露聚醣酶的三維結構， 對一些特定的胺基酸進行基因突變，進而有效提升甘露聚醣酶在工業上應用的產業價值。
本案之目的在於改造現有甘露聚醣酶，利用結構 分析及定點突變技術，有效提升甘露聚醣酶之產量及活性，藉以增加甘露聚醣酶之工業應用價值。
為達上述目的，本案之一較佳實施態樣為為提供 一種甘露聚醣酶，其胺基酸序列係為將序列編號2第25位置之酪胺酸改以組胺酸取代修飾之序列。編碼該序列編號2之基因係篩選自黑麴菌(Aspergillus niger BK01)之甘露聚醣酶基因，該甘露聚醣酶係為耐熱性及耐酸性甘露聚醣酶，且其胺基酸序列係為序列編號4之胺基酸序列。又，該甘露聚醣酶係應用於食品工業、飼料工業、以及造紙工業。
第1圖顯示甘露聚醣酶ManBK的基因及胺基酸序列。
第2圖顯示甘露聚醣酶ManBK的蛋白立體結構圖與瑞氏木黴菌(Trichoderma reesei )的甘露聚醣酶與甘露二醣(mannobiose)結合的複合體結構的重疊結構圖。
第3圖顯示定點突變所採用的引子序列。
第4圖顯示甘露聚醣酶ManBK之Y25H突變型的基因及胺基酸序列。
第5圖顯示甘露聚醣酶的蛋白產量及活性測試結果。
第6圖顯示甘露聚醣酶的熱穩定性試驗結果。
體現本案特徵與優點的一些典型實施例將在後段的說明中詳細敘述。應理解的是本案能夠在不同的態樣上具有各種的變化，然其皆不脫離本案的範圍，且其中的說明及圖式在本質上係當作說明之用，而非用以限制本案。
本案係從黑麴菌(Aspergillus niger BK01)篩選出甘露聚醣酶(ManBK)基因，其所表現之甘露聚醣酶蛋白具高耐熱性及耐酸性，也因此具有潛在的工業應用價值。為了增加此耐熱性甘露聚醣酶的工業應用價值，本案首先利用X-ray結晶學技術，將此酶蛋白的三維立體結構解析出來，然後將此甘露聚醣酶結構與瑞氏木黴菌的甘露聚醣酶(57%蛋白序列相似度)與甘露二醣結合的複合體結構作重疊比對，並針對其活性區或具有關鍵性特性的胺基酸來做修改，以增進此酶蛋白的作用活性。以下將詳述本案改造甘露聚醣酶蛋白之方法及其所得到之改良甘露聚醣酶 蛋白。
首先，選擇黑麴菌(Aspergillus niger BK01)的甘 露聚醣酶(ManBK)基因作為目標基因，如第1圖所示，ManBK基因之全長為1038個鹼基(DNA序列以序列編號1標示)以及345個胺基酸(胺基酸序列以序列編號2標示)。將ManBK基因利用Xba I以及Nde I限制酶切位構築到pPICZαA載體中。構築步驟當中，聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)所用的引子為5’-GGTATTGAGGGTCGCGCGGCGGCGGCGGCGATGTCCTTCGCTTCCACTTCCG-3’(前置引子)及5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAGCGGAACCGATAGCAGC-3’(反置引子)。再將該重組質體轉形入一勝任細胞(competent cell)中，形成一野生型表達載體。
為了利用X-ray結晶學技術解出ManBK的蛋白 結構，首先利用Hampton公司的商業化篩選(screen kit)，其中配置了許多不同的養晶條件，大致包含了鹽類，如：氯化鈉(NaCl)、硫酸銨(Ammonium Sulfate)等；緩衝液，如：Tris、HEPES等；以及沉澱劑，如：polyethylene glycol(PEG)等。以10mg/ml濃度以上的蛋白質，在各個不同的養晶條件中，藉由蒸氣擴散法(vapor diffusion method)，在室溫下以座滴式(sitting drop method)進行養晶。找出適當的養晶條件後，再進而從其條件進行調整修正，例如：調整不同的鹽類及沉澱劑濃度，以找到最佳的養晶條件後，利用X-ray獲得繞射圖譜，最後利用分子置換法(molecular replacement method)，並經由電腦運算之後解出ManBK蛋白立體結構。
第2圖即顯示本案利用X-ray結晶學技術解出的 ManBK蛋白立體結構圖與瑞氏木黴菌的甘露聚醣酶的重疊結構 圖，其中瑞氏木黴菌的甘露聚醣酶結構是與甘露二醣結合的複合體結構。ManBK蛋白立體結構屬於(β/α)8 barrel摺疊(fold)，其結構內部由8個β-sheet形成桶狀構造，外部則被8個α-helix圍繞著。藉由研究甘露聚醣酶結構，本案針對其活性區或具有關鍵性特性的三十多個胺基酸來做修改。根據蛋白結構重疊比對的結果，ManBK蛋白序列第25個位置的酪胺酸(Y25)位於蛋白立體結構中的活性區內，故被選擇作為進行定點突變的位置之一，且發現針對Y25來進行定點突變能提升甘露聚醣酶之蛋白產量及活性。其它的突變沒有增強蛋白產量及活性的效果，在此即不再贅述。以下即說明本案定點突變、蛋白表現及活性測試方法。
本案係利用定點突變技術(site-directed mutagenesis)以野生甘露聚醣酶基因做為模版進行聚合酶連鎖反應步驟，當中所用的突變引子如第3圖所示，該突變引子係設計為可將甘露聚醣酶第25個胺基酸由酪胺酸(Tyrosine)突變成組胺酸(Histidine)。接著加入Dpn I限制酶於37℃下作用，將原始模板去除，再把突變質體送入大腸桿菌勝任細胞中以抗生素(Ampicillin)作初步篩選，並藉由DNA定序步驟確認成功突變基因。因此，本案構築了一個突變株Y25H，Y25H意指為甘露聚醣酶第25個胺基酸由酪胺酸突變成組胺酸，而此突變株的序列列於第4圖中，其中突變株Y25H的DNA序列以序列編號3標示，胺基酸序列則以序列編號4標示。
接著在畢赤酵母中表現重組甘露聚醣酶基因，其係將甘露聚醣酶之野生型及突變型的重組基因利用Pme I把DNA質體進行線性化之後，藉由電轉步驟將DNA送入畢赤酵母內。接著將菌液塗於含有100μg/ml Zeocin抗生素的YPD培養基於30℃下進行培養兩天。再挑選菌落並接種到5ml YPD於30℃下 培養，再次接種到50ml BMGY中於30℃下培養至隔天。接著，將培養基換成含有0.5%甲醇的20ml BMMY以誘導蛋白表達，同樣培養於30℃下。每隔24小時取樣並補充0.5%甲醇。在經過4天的蛋白質誘導表現之後，將菌液以3500rpm轉離心並收集上清液用以準備下一步的純化。
藉由快速蛋白質液相層析儀(fast protein liquid chromatography,FPLC)純化收集好的野生型及突變型甘露聚醣酶上清液。依序利用鎳離子層析管柱以及DEAE陰離子交換管柱分離出蛋白純度達95%以上的野生型及突變型甘露聚醣酶蛋白，並以5mg/ml濃度在25mM Tris；150mM NaCl；pH 7.5條件下保存於-80℃。DEAE陰離子交換管柱分離出蛋白純度達95%以上的野生型及突變型甘露聚醣酶蛋白，並以5mg/ml濃度在25mM Tris；150mM NaCl；pH 7.5條件下保存於-80℃。
為了驗證野生型與突變型甘露聚醣酶的差異，本 案進一步測量其蛋白產量、酶活性及熱穩定性。甘露聚醣酶的活性測試方式主要是將0.3%刺槐豆膠(locust bean gum)與適當濃度的酶蛋白，其緩衝液為0.05M pH 5.3的檸檬酸溶液，以9：1比例混合一起，在50℃下反應5分鐘。接著加入1.5倍體積的1% DNS於100℃沸水中作用5分鐘，以停止反應且呈色。在OD540波長測定吸光值，再換算成酶活性單位(unit)。其中酶活性的標準曲線是由甘露糖標準溶液0-14μmol/ml之間制定，而1unit的定義為每分鐘釋放1μmole產物所需的酶蛋白量。
第5圖顯示甘露聚醣酶的蛋白產量及活性測試 結果。野生型ManBK基因與Y25H突變型基因係分別送入畢赤酵母內表達，再檢測其細胞外酶蛋白產量及活性。結果發現，將Y25突變成組胺酸的突變型Y25H其蛋白產量遠高於野生型甘露 聚醣酶，約為野生型的1.68倍，且活性也明顯地高於野生型甘露聚醣酶，約為野生型的1.5倍。
在熱穩定性方面，甘露聚醣酶的耐熱試驗主要是 將相同蛋白濃度的野生型與突變型酶蛋白分別在50℃至90℃之間，以間隔5℃之不同溫度下熱處理2分鐘，並在冰上冷卻5分鐘後測量其殘存活性，其活性測試標準步驟如上所述。
第6圖顯示甘露聚醣酶的熱穩定性試驗結果。結 果顯示，Y25H突變型蛋白與野生型蛋白(WT)的熱穩定性並沒有很大差異。舉例來說，在80℃的熱處理後，野生型及Y25H突變型蛋白皆維持其原始活性的80%，顯示將Y25突變成組胺酸的突變型Y25H並不會影響其原本的耐熱特性。
此外，本案亦將野生型ManBK基因及Y25H突 變型基因分別送入畢赤酵母表達系統中表達，並進行了50L模擬工業生產的醱酵試驗。而在50L醱酵的結果中，Y25H突變蛋白的產量及活性也是明顯地高於野生型，其總活性產量提升了大約1.5倍。換言之，不論是在小量搖瓶或是大量生產的醱酵技術上，突變後的甘露聚醣酶蛋白產量及活性皆明顯高於野生型。因此，對於一些需要耐熱甘露聚醣酶所參與的工業而言，單一突變的Y25H活性較高，在工業應用上能降低其生產成本並增加其應用在產業上的競爭力。
綜上所述，為了提升甘露聚醣酶之蛋白產量及活 性，本案係將甘露聚醣酶ManBK的三維立體結構解析出來，並針對位於蛋白立體結構活性區內的Y25進行定點突變，將其由酪胺酸突變成組胺酸，而此Y25H突變型可有效增進甘露聚醣酶之蛋白產量及活性，而且酶本身的熱穩定性也不會受到影響，故在工業應用上能降低其生產成本並增加其應用在產業上的競爭力。 此外，由於此甘露聚醣酶具高耐熱性，可應用在許多具高溫製程的工業上，一旦酶產量及活性被提升，就相對使得成本下降及利潤提高。因此，本案利用基因改造的方式成功地增加甘露聚醣酶之酶產量及活性，也相對地減少了製程成本，進而有效提升高耐熱性甘露聚醣酶在工業上應用的產業價值。由於上述優點係為習知技術所不及者，故本案之具提升酶活性之甘露聚醣極具產業價值，爰依法提出申請。
本案得由熟習此技術之人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。
<110> 基酵生物科技股份有限公司
<120> 具提升酶產量及活性之甘露聚醣酶
<160> 4
<210> 1
<211> 1038
<212> DNA
<213> 黑麴菌(Aspergillus niger BK01)
<400> 1
<210> 2
<211> 345
<212> PRT
<213> 黑麴菌(Aspergillus niger BK01)
<400> 2
<210> 3
<211> 1038
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
<210> 4
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4

Claims (7)

  1. 一種甘露聚醣酶，其胺基酸序列係為將序列編號2第25位置之酪胺酸改以組胺酸取代修飾之序列。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之甘露聚醣酶，其中編碼該序列編號2之基因係篩選自黑麴菌(Aspergillus niger BK01)之甘露聚醣酶基因。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之甘露聚醣酶，其中該甘露聚醣酶係為耐熱性及耐酸性甘露聚醣酶。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之甘露聚醣酶，其中該甘露聚醣酶之胺基酸序列係為序列編號4之胺基酸序列。
  5. 一種編碼如申請專利範圍第1項所述之甘露聚醣酶之核酸分子。
  6. 一種重組質體，其係包含如申請專利範圍第5項所述之核酸分子。
  7. 一種如申請專利範圍第1-4項中任意一項所述之甘露聚醣酶的用途，其係用於製造食品、製造飼料、或造紙。
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