CN105087521A - 具提升酶产量及活性之甘露聚糖酶 - Google Patents

Abstract

本发明关于一种具提升酶产量及活性之甘露聚糖酶，其氨基酸序列系为将序列编号2第25位置之酪氨酸改以组氨酸取代修饰之序列。

Description

具提升酶产量及活性之甘露聚糖酶

技术领域

本申请系关于一种甘露聚糖酶，尤指一种具提升酶产量及活性之甘露聚糖酶。

背景技术

植物细胞壁主要由纤维素(cellulose)、半纤维素(hemicellulose)及木质素(lignin)三种物质所组成，其中以纤维素含量最多，半纤维素次之。甘露聚糖为半纤维素中的一个重要成份，甘露聚糖主要可分成四类:直链甘露聚糖(linearmannan)、葡萄甘露聚糖(glucomannan)、半乳甘露聚糖(galactomannan)和半乳葡萄甘露聚糖(galactoglucomannan)。这些多糖体主要是由甘露糖(mannose)为基本单位，以β-1,4-糖苷键(glycosidicbond)键结成骨架。内切性甘露聚糖酶(endo-β-mannanase)为分解自然界中大量存在的聚甘露醣的主要酵素之一，这类酵素能对β-1,4-糖苷键(glycosidicbond)进行随机水解作用。此甘露聚糖酶常见于许多细菌以及真菌之中。

近年来，随着自然界半纤维素资源的开发，甘露聚糖酶的工业利用价值也渐受重视，并且被广泛地应用于不同工业上，如：造纸工业、食品及饲料工业等。在纸浆及造纸业中，甘露聚糖酶可用来破坏半纤维素与木质素之键结，有利于木质素的去除，大幅降低漂白剂及氯的用量。在食品应用上，可以当作果汁饮料的澄清剂及降低咖啡豆加工时的黏度，减少蒸发浓缩的成本。而在动物饲料工业上可当做饲料添加剂，提高动物对饲料的转换率。然而针对不同工业的应用，甘露聚糖酶也需有符合其不同的适用条件与范围，例如:高耐热性、高活性及耐酸碱性等，如此在工业应用上才有其商业价值及竞争性。因此，找出符合不同工业上所需的酶蛋白也是目前学术及产业界持续努力的目标。

为了得到更符合需求的酶蛋白，目前大致上可分为两个方向去进行：其一是从自然界中筛选合适的酶基因，例如目前已从嗜碱菌Bacillussp.N16-5中分离出耐碱的甘露聚糖酶，其最适pH值为pH10.0；而具耐酸性的酶，则由嗜酸菌Aspergillussulphureus分离出来。另一个途径就是将现有已产业化的酶蛋白再加以进行基因改造，以符合不同产业的需求。

而现今改造酶蛋白主要有两大策略：其一是随机突变(randommutagenesis)或是将酶基因随机排列，再在特定的作用条件之下，筛选出更符合其作用条件的酶蛋白。举例来说，有学者将Armillariellatabescens的MAN47基因采取随机突变的易错聚合酶连锁反应(error-pronePCR)技术，将基因序列随意突变之后，送入Saccharomycescerevisiae系统表现。在筛选了100多株突变株后，得到比野生株更具耐酸碱性及耐高温的甘露聚糖酶。此策略的好处是无须深入研究酶的结构或作用机制，而是直接在特定的条件下随机去找出更好的酶蛋白。然而，缺点即是需要大量的人力以及时间去进行大量的筛选，并且此方法也需要有很好的大量筛选方法来配合。

另一种改造策略则是藉由研究酶的三维结构与作用机制，找出对于酶活性或特性具有关键性的氨基酸，并针对这些特定氨基酸进行定点突变与测试，进而得到功能性更强的改造酶蛋白。举例来说，Cartmell等人解出外切性甘露聚糖酶(exo-mannanase)CjMan26C蛋白立体结构后，发现其与内切性甘露聚糖酶CjMan26A在结构上有很高的相似度。经由结构相互比对分析后，发现CjMan26C有四个氨基酸在空间上的位置与CjMan26A有明显的不同，而此四个氨基酸皆位于靠近活性区的环状结构(loop)里。在经由突变了CjMan26C这四个氨基酸后，成功的将CjMan26C活性反应模式由外切性甘露聚糖酶转变为内切性甘露聚糖酶。由此可知，分析蛋白立体结构可提供许多有助于改造特性的信息，让研发人员可以只针对这些特定氨基酸来进行改造，减少大量人力筛选的时间，来得到适合不同工业产业应用的甘露聚糖酶。

因此，本申请欲藉由研究甘露聚糖酶的三维结构，对一些特定的氨基酸进行基因突变，进而有效提升甘露聚糖酶在工业上应用的产业价值。

发明内容

本申请之目的在于改造现有甘露聚糖酶，利用结构分析及定点突变技术，有效提升甘露聚糖酶之产量及活性，藉以增加甘露聚糖酶之工业应用价值。

为达上述目的，本申请之一较佳实施态样为为提供一种甘露聚糖酶，其氨基酸序列系为将序列编号2第25位置之酪氨酸改以组氨酸取代修饰之序列。编码该序列编号2之基因系筛选自黑曲菌(AspergillusnigerBK01)之甘露聚糖酶基因，该甘露聚糖酶系为耐热性及耐酸性甘露聚糖酶，且其氨基酸序列系为序列编号4之氨基酸序列。又，该甘露聚糖酶系应用于食品工业、饲料工业、以及造纸工业。

附图说明

第1图显示甘露聚糖酶ManBK的基因及氨基酸序列。

第2图显示甘露聚糖酶ManBK的蛋白立体结构图与瑞氏木霉菌(Trichodermareesei)的甘露聚糖酶与甘露二醣(mannobiose)结合的复合体结构的重迭结构图。

第3图显示定点突变所采用的引物序列。

第4图显示甘露聚糖酶ManBK之Y25H突变型的基因及氨基酸序列。

第5图显示甘露聚糖酶的蛋白产量及活性测试结果。

第6图显示甘露聚糖酶的热稳定性试验结果。

实施方式

体现本申请特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本申请能够在不同的态样上具有各种的变化，然其皆不脱离本申请的范围，且其中的说明及图式在本质上系当作说明之用，而非用以限制本申请。

本申请系从黑曲菌(AspergillusnigerBK01)筛选出甘露聚糖酶(ManBK)基因，其所表现之甘露聚糖酶蛋白具高耐热性及耐酸性，也因此具有潜在的工业应用价值。为了增加此耐热性甘露聚糖酶的工业应用价值，本申请首先利用X-ray结晶学技术，将此酶蛋白的三维立体结构解析出来，然后将此甘露聚糖酶结构与瑞氏木霉菌的甘露聚糖酶(57％蛋白序列相似度)与甘露二醣结合的复合体结构作重迭比对，并针对其活性区或具有关键性特性的氨基酸来做修改，以增进此酶蛋白的作用活性。以下将详述本申请改造甘露聚糖酶蛋白之方法及其所得到之改良甘露聚糖酶蛋白。

首先，选择黑曲菌(AspergillusnigerBK01)的甘露聚糖酶(ManBK)基因作为目标基因，如第1图所示，ManBK基因之全长为1038个碱基(DNA序列以序列编号1标示)以及345个氨基酸(氨基酸序列以序列编号2标示)。将ManBK基因利用XbaI以及NdeI限制酶切位构筑到pPICZαA载体中。构筑步骤当中，聚合酶连锁反应(polymerasechainreaction,PCR)所用的引物为5’-GGTATTGAGGGTCGCGCGGCGGCGGCGGCGATGTCCTTCGCTTCCACTTCCG-3’(前置引物)及5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAGCGGAACCGATAGCAGC-3’(反置引物)。再将该重组质体转形入一胜任细胞(competentcell)中，形成一野生型表达载体。

为了利用X-ray结晶学技术解出ManBK的蛋白结构，首先利用Hampton公司的商业化筛选(screenkit)，其中配置了许多不同的养晶条件，大致包含了盐类，如：氯化钠(NaCl)、硫酸铵(AmmoniumSulfate)等；缓冲液，如：Tris、HEPES等；以及沉淀剂，如：polyethyleneglycol(PEG)等。以10mg/ml浓度以上的蛋白质，在各个不同的养晶条件中，藉由蒸气扩散法(vapordiffusionmethod)，在室温下以座滴式(sittingdropmethod)进行养晶。找出适当的养晶条件后，再进而从其条件进行调整修正，例如：调整不同的盐类及沉淀剂浓度，以找到最佳的养晶条件后，利用X-ray获得绕射图谱，最后利用分子置换法(molecularreplacementmethod)，并经由计算机运算之后解出ManBK蛋白立体结构。

第2图即显示本申请利用X-ray结晶学技术解出的ManBK蛋白立体结构图与瑞氏木霉菌的甘露聚糖酶的重迭结构图，其中瑞氏木霉菌的甘露聚糖酶结构是与甘露二醣结合的复合体结构。ManBK蛋白立体结构属于(β/α)8barrel折迭(fold)，其结构内部由8个β-sheet形成桶状构造，外部则被8个α-helix围绕着。藉由研究甘露聚糖酶结构，本申请针对其活性区或具有关键性特性的三十多个氨基酸来做修改。根据蛋白结构重迭比对的结果，ManBK蛋白序列第25个位置的酪氨酸(Y25)位于蛋白立体结构中的活性区内，故被选择作为进行定点突变的位置之一，且发现针对Y25来进行定点突变能提升甘露聚糖酶之蛋白产量及活性。其它的突变没有增强蛋白产量及活性的效果，在此即不再赘述。以下即说明本申请定点突变、蛋白表现及活性测试方法。

本申请系利用定点突变技术(site-directedmutagenesis)以野生甘露聚糖酶基因做为模版进行聚合酶连锁反应步骤，当中所用的突变引物如第3图所示，该突变引物系设计为可将甘露聚糖酶第25个氨基酸由酪氨酸(Tyrosine)突变成组氨酸(Histidine)。接着加入DpnI限制酶于37℃下作用，将原始模板去除，再把突变质体送入大肠杆菌胜任细胞中以抗生素(Ampicillin)作初步筛选，并藉由DNA定序步骤确认成功突变基因。因此，本申请构筑了一个突变株Y25H，Y25H意指为甘露聚糖酶第25个氨基酸由酪氨酸突变成组氨酸，而此突变株的序列列于第4图中，其中突变株Y25H的DNA序列以序列编号3标示，氨基酸序列则以序列编号4标示。

接着在毕赤酵母中表现重组甘露聚糖酶基因，其系将甘露聚糖酶之野生型及突变型的重组基因利用PmeI把DNA质体进行线性化之后，藉由电转步骤将DNA送入毕赤酵母内。接着将菌液涂于含有100μg/mlZeocin抗生素的YPD培养基于30℃下进行培养两天。再挑选菌落并接种到5mlYPD于30℃下培养，再次接种到50mlBMGY中于30℃下培养至隔天。接着，将培养基换成含有0.5％甲醇的20mlBMMY以诱导蛋白表达，同样培养于30℃下。每隔24小时取样并补充0.5％甲醇。在经过4天的蛋白质诱导表现之后，将菌液以3500rpm转离心并收集上清液用以准备下一步的纯化。

藉由快速蛋白质液相层析仪(fastproteinliquidchromatography,FPLC)纯化收集好的野生型及突变型甘露聚糖酶上清液。依序利用镍离子层析管柱以及DEAE阴离子交换管柱分离出蛋白纯度达95％以上的野生型及突变型甘露聚糖酶蛋白，并以5mg/ml浓度在25mMTris；150mMNaCl；pH7.5条件下保存于-80℃。DEAE阴离子交换管柱分离出蛋白纯度达95％以上的野生型及突变型甘露聚糖酶蛋白，并以5mg/ml浓度在25mMTris；150mMNaCl；pH7.5条件下保存于-80℃。

为了验证野生型与突变型甘露聚糖酶的差异，本申请进一步测量其蛋白产量、酶活性及热稳定性。甘露聚糖酶的活性测试方式主要是将0.3％刺槐豆胶(locustbeangum)与适当浓度的酶蛋白，其缓冲液为0.05MpH5.3的柠檬酸溶液，以9：1比例混合一起，在50℃下反应5分钟。接着加入1.5倍体积的1％DNS于100℃沸水中作用5分钟，以停止反应且呈色。在OD540波长测定吸光值，再换算成酶活性单位(unit)。其中酶活性的标准曲线是由甘露糖标准溶液0-14μmol/ml之间制定，而1unit的定义为每分钟释放1μmole产物所需的酶蛋白量。

第5图显示甘露聚糖酶的蛋白产量及活性测试结果。野生型ManBK基因与Y25H突变型基因系分别送入毕赤酵母内表达，再检测其细胞外酶蛋白产量及活性。结果发现，将Y25突变成组氨酸的突变型Y25H其蛋白产量远高于野生型甘露聚糖酶，约为野生型的1.68倍，且活性也明显地高于野生型甘露聚糖酶，约为野生型的1.5倍。

在热稳定性方面，甘露聚糖酶的耐热试验主要是将相同蛋白浓度的野生型与突变型酶蛋白分别在50℃至90℃之间，以间隔5℃之不同温度下热处理2分钟，并在冰上冷却5分钟后测量其残存活性，其活性测试标准步骤如上所述。

第6图显示甘露聚糖酶的热稳定性试验结果。结果显示，Y25H突变型蛋白与野生型蛋白(WT)的热稳定性并没有很大差异。举例来说，在80℃的热处理后，野生型及Y25H突变型蛋白皆维持其原始活性的80％，显示将Y25突变成组氨酸的突变型Y25H并不会影响其原本的耐热特性。

此外，本申请亦将野生型ManBK基因及Y25H突变型基因分别送入毕赤酵母表达系统中表达，并进行了50L模拟工业生产的酦酵试验。而在50L酦酵的结果中，Y25H突变蛋白的产量及活性也是明显地高于野生型，其总活性产量提升了大约1.5倍。换言之，不论是在小量摇瓶或是大量生产的酦酵技术上，突变后的甘露聚糖酶蛋白产量及活性皆明显高于野生型。因此，对于一些需要耐热甘露聚糖酶所参与的工业而言，单一突变的Y25H活性较高，在工业应用上能降低其生产成本并增加其应用在产业上的竞争力。

综上所述，为了提升甘露聚糖酶之蛋白产量及活性，本申请系将甘露聚糖酶ManBK的三维立体结构解析出来，并针对位于蛋白立体结构活性区内的Y25进行定点突变，将其由酪氨酸突变成组氨酸，而此Y25H突变型可有效增进甘露聚糖酶之蛋白产量及活性，而且酶本身的热稳定性也不会受到影响，故在工业应用上能降低其生产成本并增加其应用在产业上的竞争力。此外，由于此甘露聚糖酶具高耐热性，可应用在许多具高温制程的工业上，一旦酶产量及活性被提升，就相对使得成本下降及利润提高。因此，本申请利用基因改造的方式成功地增加甘露聚糖酶之酶产量及活性，也相对地减少了制程成本，进而有效提升高耐热性甘露聚糖酶在工业上应用的产业价值。由于上述优点系为习知技术所不及者，故本申请之具提升酶活性之甘露聚糖极具产业价值。

本领域技术人员对本申请所作的任何修饰，均不脱离所附权利要求书的保护范围。

Claims (7)

1.一种甘露聚糖酶，其氨基酸序列系为将序列编号2第25位置之酪氨酸改以组氨酸取代修饰之序列。

2.根据权利要求1之甘露聚糖酶，其中编码该序列编号2之基因系筛选自黑曲菌(AspergillusnigerBK01)之甘露聚糖酶基因。

3.根据权利要求1之甘露聚糖酶，其中该甘露聚糖酶系为耐热性及耐酸性甘露聚糖酶。

4.根据权利要求1之甘露聚糖酶，其中该甘露聚糖酶之氨基酸序列系为序列编号4之氨基酸序列。

5.一种编码权利要求1所述之甘露聚糖酶之核酸分子。

6.一种重组质体，其系包含权利要求5所述之核酸分子。

7.一种如权利要求1-4中任意一项所述之甘露聚糖酶在工业中的应用，其中该工业系选自食品工业、饲料工业、以及造纸工业。