CN102711765A - 激酶抑制剂 - Google Patents

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小约翰.W.汤顿
R.马格拉思林
I.塞拉菲莫瓦
M.S.科恩
R.米勒
V.帕维莱南
J.麦克法伦
S.克里什南
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Abstract

本发明公开了使用具有烯烃部分的激酶抑制剂来抑制激酶的方法。

Description

激酶抑制剂
相关申请的交叉引用
本申请依据35U.S.C.§1.119(e)，要求2009年11月16日提交的美国申请No.61/261,696和2010年4月30日提交的美国申请No.61/330,271的权益，出于所有目的将各自的全部内容通过引用方式并入。
关于在联邦资助的研究和开发下进行的发明的权利的声明
本发明在由National Institutes ofHealth授予的GM071434的政府资助下进行。政府具有本发明的某些权利。
技术领域
人基因组含有至少500种编码蛋白激酶的基因。事实上，蛋白激酶基因构成全部人基因的约2%。蛋白激酶修饰所有人蛋白的至多30%并且调节大多数的细胞途径，特别是涉及信号转导的那些途径。
因为对于细胞的深远的影响，蛋白激酶的活性受到高度调节。的确，未经调节的激酶活性经常导致与细胞生长、细胞运动和细胞死亡的控制相关的疾病，特别是癌症。目前正在进行大量研究以找到能够抑制特异性激酶从而治疗多种疾病的药物。一些这样的药物已经在临床使用中，包括Gleevec(伊马替尼)和Iressa(吉非替尼)。为了提高效能和选择性，已经开发了不可逆性亲电子抑制剂，其与半胱氨酸在激酶活性位点形成共价键。这些不可逆性激酶抑制剂的若干目前在临床试验中(例如，来那替尼(neratinib)、tovok)。然而，当用于治疗疾病时，通过抑制剂与蛋白质的不可逆结合的蛋白质的抑制经常导致毒性和/或免疫原性问题。因此，需要可逆性激酶抑制剂以抑制激酶，同时将毒性的风险最小化。本发明解决本领域中这些以及其它的需求。
发明内容
在第一方面，提供激酶抑制剂。在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式I的结构：
Figure BDA00001892012600021
在式I中，R1是取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基或者取代的或未取代的杂芳基。
L1是键、-C(O)-、-C(O)N(L3R2)-、-C(O)O-、-S(O)n-、-O-、-N(L3R2)-、-P(O)(OL3R2)O-、-SO2N(L3R2)-、-P(O)(NL3R2)N-、取代的或未取代的亚烷基、取代的或未取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基或者取代的或未取代的亚杂芳基。符号n是0、1或2。
L2是键、-C(O)-、-C(O)N(L3AR2A)-、-C(O)O-、-S(O)t-、-O-、-N(L3AR2A)-、-P(O)(OL3AR2A)O-、-SO2N(L3AR2A)-、-P(O)(NL3AR2A)N-、取代的或未取代的亚烷基、取代的或未取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基或者取代的或未取代的亚杂芳基。符号t是0、1或2。
L3和L3A独立地是键、取代的或未取代的亚烷基、取代的或未取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基或者取代的或未取代的亚杂芳基。符号w是0、1或2。
R2和R2A独立地是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基或者取代的或未取代的杂芳基。
E是吸电子基团或与L2一起形成吸电子基团。
在另一方面，提供抑制蛋白激酶的方法。所述方法包括使蛋白激酶与有效量的本文所提供的激酶抑制剂接触。激酶抑制剂可具有式I或式II (或本文所述的任何其实施方案)的结构。
在另一方面，在治疗需要这样的治疗的受试者中与激酶活性相关的疾病的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的本文提供的激酶抑制剂。激酶抑制剂可具有式I或式II(或本文所述的任何其实施方案)的结构。
附图说明
图1A和图1B提供使DMSO或化合物1-4(图1A)和化合物5-8(图1B)与人RSK2CTD在室温下一起温育1小时后的质谱结果。
图2示出在通过本文所公开的化合物的选择来抑制以及随后的透析之后RSK2CTD的激酶活性的恢复。图例：化合物6：格子花纹；化合物7：空心框；化合物1：黑框；化合物9：对角条纹。
图3示出如通过使用氟甲基酮化合物9(FMK)的竞争性标记测量的从完整折叠的RSK2CTD中的氰基丙烯酸酯或氰基丙烯酰胺(化合物4-7)的离解。左上图：空(empty)RSK2CTD的FMK标记的时间过程。右上图：可逆性共价抑制，化合物4-7的离解的时间过程。下图：对于指定的化合物的离解半衰期(分钟)的列表表示。
图4示出通过UV/可见光分光光度法的在RSK2和化合物7之间共价键形成的形成和逆转。上图：在化合物7与a)C436V RSK2；b)WT RSK2；c)WT RSK2和蛋白酶K；d)WT RSK2和SDS；以及e)WT RSK2和盐酸胍的反应后，归因于化合物7的归一化吸光度(400nm)。中图：单独在缓冲液中、或在RSK2的存在下或在RSK2和蛋白酶K的存在下(3小时温育)的化合物7的UV/可见光光谱。下图：单独在缓冲液中、或在RSK2的存在下或在RSK2和SDS的存在下(1分钟温育)的化合物7的UV/可见光光谱。
图5A示出化合物7与3M盐酸胍的温育的质谱分析。图5B示出在加入3M盐酸胍之前与RSK2CTD温育的化合物7的温育的质谱分析。
图6示出在HEK-293细胞中通过化合物5-7和化合物9的RSK2的Ser386的自身磷酸化抑制。图例：FMK 9(化合物9)：空心框；化合物7：黑框；化合物6：灰框；化合物5：对角条纹。下图：如本文所述，使用磷酸-Ser386RSK2和抗-HA抗体的蛋白质印迹分析。
图7示出基于如本文所述获得的X-射线结晶结构的化合物6、12或15(分别为上、中和下图)与RSK2的Cys-436结合的模式。
图8示出化合物40(上图)与RSK2的Cys-436结合和化合物55与cSrc的Cys-345结合的模式。
图9示出在稀释反应混合物之前和之后的1H NMR光谱。
图10示出在稀释之前和之后的氰基丙烯酰胺吸收光谱和吸光度值的图示。
具体实施方式
I.定义
本文所使用的缩写具有它们在化学和生物领域内常规的意思。本文所阐述的化学结构和式根据化学领域已知的化学价的标准法则来构建。
在取代基通过从左至右书写的它们的常规化学式规定时，它们等同地涵盖由从右至左书写结构得出的化学上相同的取代基，例如-CH2O-等同于-OCH2-。
除非另有说明，单独的或作为另外的取代基的一部分的术语“烷基”意思是直链(即未支化的)或支链或其组合，其可以是完全饱和的、单或多不饱和的以及可包括二价和多价基团，具有指定的碳原子数(即C1-C10意思是1至10个碳)。饱和的烷基的例子包括，但不限于，例如以下的基团：甲基、乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，异丁基，仲丁基，(环己基)甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和的烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和的烷基的例子包括，但不限于：乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁间二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基、以及高级同系物和异构体。烷氧基是通过氧连接体(-O-)连接至分子的其余部分的烷基。
单独的或作为另外的取代基的一部分的术语“亚烷基”意思是由烷基衍生的二价基团(例如但不限于-CH2CH2CH2CH2-)，并且进一步包括以下描述为“亚杂烷基”的那些基团。通常，烷基(或亚烷基)将具有1至24个碳原子，在本发明中优选具有10个或更少碳原子的那些基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是通常具有8个或更少碳原子的短链烷基或亚烷基。
除非另有说明，单独的或与另外的术语组合的术语“杂烷基”意思是由至少一个碳原子和至少一个选自O、N、P、Si和S的杂原子组成的稳定的直链或支链、或环状烃基团、或其组合，并且其中氮和硫原子可任选地被氧化且氮杂原子可任选地被季铵化。杂原子O、N、P和S以及Si可位于杂烷基的任意内部位置或烷基连接分子的剩余部分的位置。例子包括，但不限于：-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2,-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3、-CH=CH-N(CH3)-CH3、O-CH3、-O-CH2-CH3、和-CN。至多两个杂原子可以为连续的，例如-CH2-NH-OCH3。类似地，单独的或作为另外的取代基的一部分的术语“亚杂烷基”意思是由杂烷基衍生的二价基团，例如，但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于亚杂烷基，杂原子还可占据链末端之一或两者(例如，亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。而且，对于亚烷基和亚杂烷基连接基团，通过连接基团的式书写的方向未暗示连接基团的定向。例如，式-C(O)2R’-表示-C(O)2R’-和-R’C(O)2-。如上所述，如本文所使用的杂烷基包括通过杂原子连接至分子的其余部分的那些基团，例如-C(O)R’、-C(O)NR’、-NR’R”、-OR’、-SR’和/或-SO2R’。在列举“杂烷基”，随后列举具体杂烷基例如-NR’R”等的情况下，将理解术语杂烷基和-NR’R”不是重复的或互斥的。相反，列举具体杂烷基以增加清晰度。因此，在本文中术语“杂烷基”不应解释为排除具体杂烷基例如-NR’R”等。
除非另有说明，单独的或与其它术语组合的术语“环烷基”和“杂环烷基”分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。此外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环连接分子的其余部分的位置。环烷基的例子包括，但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的例子包括，但不限于：1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。单独的或作为另外取代基的一部分的“亚环烷基”和“亚杂环烷基”意思是分别由环烷基和杂环烷基衍生的二价基团。
除非另有说明，单独的或作为另外取代基的一部分的术语“卤代”或“卤素”意思是氟、氯、溴或碘原子。此外，诸如“卤代烷基”的术语意思是包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”意思是包括，但不限于：氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
术语“酰基”意思是-C(O)R，其中R是取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基或者取代的或未取代的杂芳基。
除非另有说明，术语“芳基”意思是多不饱和的芳香烃取代基，其可以是单环或多环(优选1至3个环)，所述多环是稠合至一起(即稠环芳基)或共价连接的。稠环芳基是指稠合至一起的多环，其中所述稠环的至少一个是芳基环。术语“杂芳基”是指含有一至四个选自N、O和S的杂原子的芳基(或者环)，其中氮和硫原子任选地被氧化，以及氮原子任选地被季铵化。因此，术语“杂芳基”包括稠环杂芳基(即稠合至一起的多环，其中所述稠环的至少一个是杂芳族环)。5,6-稠环亚杂芳基是指稠合至一起的两个环，其中一个环具有5元以及另一环具有6元，并且其中至少一个环是杂芳基环。类似地，6,6-稠环亚杂芳基是指稠合至一起的两个环，其中一个环具有6元以及另一环具有6元，并且其中至少一个环是杂芳基环。且6,5-稠环亚杂芳基是指稠合至一起的两个环，其中一个环具有6元以及另一环具有5元，并且其中至少一个环是杂芳基环。杂芳基可通过碳或杂原子连接至分子的其余部分。芳基和杂芳基的非限制性例子包括：苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基以及6-喹啉基。各上述芳基和杂芳基环体系的取代基选自下述的可接受的取代基。单独的或作为另外的取代基的一部分的“亚芳基”和“亚杂芳基”意思是分别由芳基和杂芳基衍生的二价基团。
为了简洁，当与其它术语(例如，芳氧基、芳硫基、芳基烷基)组合使用时，术语“芳基”包括如上所定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”意思是包括其中芳基连接至烷基的那些基团(例如，苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，所述烷基包括其中碳原子(例如，亚甲基)被诸如氧原子取代的那些烷基(例如，苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等)。
如本文所使用的术语“氧代”意思是双键结合至碳原子的氧。
如本文所使用的术语“烷基磺酰基”意思是具有式-S(O2)-R’的部分，其中R’是如上所定义的烷基。R’可具有规定数目的碳(例如“C1-C4烷基磺酰基”)。
以上术语(例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)各自意思是包括指定基团的取代的和未取代的形式。对于各类型的基团的优选的取代基在以下提供。
对于烷基和杂烷基基团(包括经常称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是选自但不限于下列的各种基团的一个或多个：-OR’、=O、=NR’、=N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”‘、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2，数量范围为0至(2m’+1)，其中m’是在这样的基团中碳原子的总数目。R’、R”、R”‘和R”“各自优选独立地指氢；取代的或未取代的杂烷基；取代的或未取代的环烷基；取代的或未取代的杂环烷基；取代的或未取代的芳基(例如，被1-3个卤素取代的芳基)；取代的或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或者芳基烷基。当本发明的化合物包含多于一个R基团时，例如，所述R基团各自独立地选择，如同各R’、R”、R’”和R””基团(当存在多于一个的这些基团时)一样。当R’和R”连接至相同的氮原子时，它们可与氮原子组合以形成4、5、6或7元环。例如，-NR’R”意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从取代基的上述讨论，本领域技术人员将理解，术语“烷基”意在包括含结合除氢基团外的基团的碳原子的基团，例如卤代烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)以及酰基(例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
类似于对于烷基基团描述的取代基，对于芳基和杂芳基的取代基是各种各样的且选自例如：卤素、-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”‘、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R’”、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基以及氟代(C1-C4)烷基，数量范围为0至在芳香族环体系上开放价态的总数量；以及其中R’、R”、R”‘和R””优选独立地选自氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基以及取代的或未取代的杂芳基。当本发明的化合物包含多于一个R基团时，例如，所述R基团各自独立地选择，如同各R’、R”、R’”和R”“基团(当存在多于一个的这些基团时)一样。
在芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基的两个可任选地形成式-T-C(O)-(CRR’)q-U-的环，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR’-或单键，以及q是0至3的整数。或者，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基的两个可任选地被式-A-(CH2)r-B-的取代基代替，其中A和B独立地是-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键，以及r是1至4的整数。这样形成的新环的单键之一可任选地被双键代替。或者，在芳基或杂芳基环的相邻原子上取代基的两个可任选地被式-(CRR’)s-X’-(C”R’”)d-的取代基代替，其中s和d独立地是0至3的整数，以及X’是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、或-S(O)2NR’。取代基R、R’、R”和R’”优选独立地选自氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基以及取代的或未取代的杂芳基。
如本文所使用的术语“杂原子”或“环杂原子”意思是包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、磷(P)和硅(Si)。
如本文所使用的“取代基”意思是选自下列部分的基团：
(A)-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、氧代、卤素、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基，以及
(B)被选自下列的至少一种取代基取代的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基：
(i)氧代、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、卤素、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基，以及
(ii)被选自下列的至少一种取代基取代的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基：
(a)氧代、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、卤素、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基，以及
(b)被选自氧代、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、卤素、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基和未取代的杂芳基的至少一种取代基取代的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。
如本文所使用的“大小受限的取代基”或“大小受限的取代基团”意思是选自对于“取代基”的上述全部取代基的基团，其中各取代的或未取代的烷基是取代的或未取代的C1-C20烷基；各取代的或未取代的杂烷基是取代的或未取代的2至20元的杂烷基；各取代的或未取代的环烷基是取代的或未取代的C4-C8环烷基；以及各取代的或未取代的杂环烷基是取代的或未取代的4至8元的杂环烷基。
如本文所使用的“低级取代基”或“低级取代基团”意思是选自对于“取代基”的上述全部取代基的基团，其中各取代的或未取代的烷基是取代的或未取代的C1-C8烷基；各取代的或未取代的杂烷基是取代的或未取代的2至8元的杂烷基；各取代的或未取代的环烷基是取代的或未取代的C5-C7环烷基；以及各取代的或未取代的杂环烷基是取代的或未取代的5至7元的杂环烷基。
术语“药学上可接受的盐”意在包括使用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐，取决于在本文所述的化合物上存在的具体取代基。当本发明的化合物含有相对酸性官能度时，通过使这样的化合物的中性形式与纯净或在适当的惰性溶剂中的足量的所需碱接触可获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的例子包括钠、钾、钙、铵、有机氨基、或镁盐、或类似的盐。当本发明的化合物含有相对碱性官能度时，通过使这样的化合物的中性形式与纯净或在适当的惰性溶剂中充量的所需酸接触可获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的例子包括由无机酸(如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等)衍生的那些，以及由相对无毒的有机酸(如醋酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、酞酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、草酸、甲磺酸等)衍生的盐。还包括氨基酸(诸如精氨酸等)的盐和有机酸(诸如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等)的盐(参见，例如Berge等,“Pharmaceutical Salts”,Journal of Pharmaceutical Science,1977,66,1-19)。本发明的一些具体化合物含有碱性和酸性官能度两者，这容许化合物转化为碱加成盐或酸加成盐。
因此，本发明的化合物可作为盐(例如与药学上可接受的酸的盐)存在。本发明包括这样的盐。这样的盐的例子包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、酒石酸盐(例如，(+)-酒石酸盐、(-)-酒石酸盐或其混合物，包括外消旋混合物)、琥珀酸盐、苯甲酸盐以及与氨基酸(诸如谷氨酸)的盐。这些盐可通过本领域技术人员已知方法来制备。
通过使盐与碱或酸接触以及以常规方式分离母体化合物来优选地再生化合物的中性形式。化合物的母体形式在一些物理性质(诸如在极性溶剂中的溶解性)上不同于各种盐形式。
除了盐形式，本发明提供前药形式的化合物。本文所述化合物的前药是在生理学条件下容易经历化学变化以提供本发明的化合物的那些化合物。此外，在离体(活体外)环境中，前药通过化学或生化方法可转化为本发明的化合物。例如，当置于具有合适的酶或化学试剂的透皮贴剂容器中时，前药可缓慢转化为本发明的化合物。
本发明的一些化合物可以非溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水合形式)存在。通常，溶剂化形式等同于非溶剂化形式并且涵盖在本发明的范围内。本发明的一些化合物可以多种结晶或非结晶的形式存在。通常，所有物理形式对于本发明所设想的用途是等同的并且旨在在本发明的范围内。
本发明的一些化合物具有不对称的碳原子(光学中心)或双键；外消旋物、非对映体、互变异构体、几何异构体以及单独的异构体均涵盖在本发明的范围内。本发明的化合物不包括本领域已知太不稳定而不能合成和/或分离的那些。
本发明的化合物还可在组成这样的化合物的原子的一个或多个处含有非天然比例的原子同位素。例如，可使用放射性同位素来放射性标记所述化合物，所述放射性同位素例如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)。无论是否为放射性，本发明的化合物的所有同位素变体均涵盖在本发明的范围内。
在本文所提供的化合物的取代基是“R-取代的”(例如R7-取代的)的情况下，意思是取代基视情况而定被命名的R基团(例如R7)的一个或多个取代。在一些实施方案中，取代基被命名的R基团的仅一个所取代。
术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指在损伤、病理或病症的治疗或改善中成功的任何标记，包括任何客观或主观参数，例如症状的减轻、缓解、减少或使得损伤、病理或病症对于患者来说更可忍受；变性或衰退速率的减缓；使变性的终点不太衰弱；改善患者的身体或精神健康。症状的治疗或改善可基于客观或主观参数，包括身体检查、神经精神学检查和/或精神病学评估的结果。例如，本文所展示的一些方法通过降低癌症的发生率、抑制其生长或引起癌症的缓解而成功地治疗癌症。
“有效量”是相对于缺乏激酶抑制剂足以有助于疾病的一种或多种症状的治疗、预防或者降低或者抑制活性或蛋白激酶的激酶抑制剂的量。在关于疾病治疗的引用的情况下，“有效量”也可称为“治疗有效量”。一种或多种症状的“降低”(以及该短语的语法等同物)意思是症状的严重性或频率的降低、或者症状的消除。药物的“预防有效量”是当对受试者施用时具有预期的预防效果的药物量，所述预防效果例如预防或延缓疾病的发作(或者再发)或者降低疾病或其症状的发作(或者再发)的可能性。完全预防效果不一定通过一次剂量的施用而发生，且可仅在一系列剂量的施用后发生。因此，预防有效量可以一次或多次施用而进行施用。如本文所使用的“活性降低量”是指相对于缺乏拮抗剂，降低酶活性所需的拮抗剂的量。如本文所使用的“功能破坏量”是指相对于缺乏拮抗剂，破坏破骨细胞或白细胞的功能所需的拮抗剂的量。
术语“激酶”、“蛋白激酶”等是指从供体分子(例如ATP)向底物转移磷酸基的酶。从供体向底物转移磷酸基的过程通常被称为磷酸化。在蛋白质磷酸化的范围中术语“底物”是指接受磷酸基以及因而被磷酸化的化合物(例如蛋白质)。
II.激酶抑制剂
在第一方面，提供激酶抑制剂。激酶抑制剂典型地是可逆性激酶抑制剂。在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式I的结构：
Figure BDA00001892012600111
在式I中，R1是取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或者-L1A-R1A。R1A是取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基。L1-R1和/或R1通常设计为在激酶ATP结合位点内嵌合和/或结合在激酶ATP结合位点内的氨基酸(例如激酶ATP结合位点部分)。
L1是键、-C(O)-、-C(O)N(L3R2)-、-C(O)O-、-S(O)n-、-O-、-N(L3R2)-、-P(O)(OL3R2)O-、-SO2N(L3R2)-、-P(O)(NL3R2)N-、取代的或未取代的亚烷基、取代的或未取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基或者取代的或未取代的亚杂芳基。符号n是0、1或2。在一些实施方案中，L1是键。L1A是键、-C(O)-、-C(O)N(L3′R2′)-、-C(O)O-、-S(O)n'-、-O-、-N(L3′R2′)-、-P(O)(OL3′R2′)O-、-SO2N(L3′R2′)-、-P(O)(NL3′R2′)N-、取代的或未取代的亚烷基、取代的或未取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基或者取代的或未取代的亚杂芳基。符号n'是0、1或2。
L2是键、-C(O)-、-C(O)N(L3AR2A)-、-C(O)O-、-S(O)t-、-O-、-N(L3AR2A)-、-P(O)(OL3AR2A)O-、-SO2N(L3AR2A)-、-P(O)(NL3AR2A)N-、取代的或未取代的亚烷基、取代的或未取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基或者取代的或未取代的亚杂芳基。t是0、1或2。
L3、L3′和L3A独立地是键、取代的或未取代的亚烷基、取代的或未取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基或者取代的或未取代的亚杂芳基。符号w是0、1或2。
R2、R2'和R2A独立地是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基或者取代的或未取代的杂芳基。
E是吸电子基团或与L2一起形成吸电子基团(例如-L2-E可形成吸电子基团)。在一些实施方案中，E是环A或者R4，其中R4和环A如下所定义。因此，E可以是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或者-L5A-R4A。E还可以是氢、R23A-取代的或未取代的烷基、R23A-取代的或未取代的杂烷基、R23A-取代的或未取代的环烷基、R23A-取代的或未取代的杂环烷基、R23A-取代的或未取代的芳基或者R23A-取代的或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，E是取代的或未取代的杂芳基(例如R23A-取代的或未取代的杂芳基)或者取代的或未取代的杂环烷基(例如R23A-取代的或未取代的杂环烷基)。
在一些实施方案中，在-L2-E是吸电子基团的情况下，E可简单地为氢。术语“吸电子基团”是指通过从邻近化学反应中心拉取负电荷来改变作用在该化学反应中心上的静电力的化学取代基。因此，吸电子基团从反应中心拉取电子。因此，反应中心与其在缺乏吸电子基团的情况相比而言略微显示更加为正。在一些实施方案中，化学反应中心是形成碳-碳双键(烯烃)的两个碳原子之一。在一些实施方案中，化学反应中心是连接到-L1-R1的烯烃碳。吸电子基团起作用以从该烯烃碳拉走电荷或电子，由此使烯烃碳是电子缺乏的(相对于缺乏吸电子基团)。由此使得缺电子的烯烃碳对于富电子的化学基团(如激酶活性位点半胱氨酸的巯基)是更反应性的。
E和-L2-E典型地是从反应中心烯烃碳充分吸电子以可逆地结合到激酶活性位点半胱氨酸的巯基(例如当激酶完全变性或部分变性时可测量地(以可测定的程度)可逆性地结合)的取代基。在以下所提供的测定和实施例中提供测试反应中心烯烃碳和激酶活性位点半胱氨酸的巯基(或硫醇化合物代用品(proxy))之间结合的可逆性的方法。
在一些实施方案中，-L2-E如在以下所阐述的式的之一中所阐述的。例如，在式II中，-L2-E是-C(O)X(L4-R3)z(L5-R4)；在式IIIc中-L2-NR3R4，在式IIIc中-L2-E是-WNR3R4等。因此，-L2-E可如在本文所提供的式中所阐述的以及与本文所提供的-L1-R1的定义和实施方案组合。类似地，-L1-R1可如在本文所提供的式(例如式IIIa至IIIe，其中-L1-R1包括吡咯并嘧啶基)中所阐述的以及与如本文所提供的-L2-E的定义组合。
能够从反应中心吸电子的基团的一些非限制性例子包括，但不限于：-NO2、-N(R2)、-N(R3)+、-N(H3)+、-SO3H、-SO3R’、-S(O2)R’(砜)、-S(O)R’(亚砜)、-S(O2)NH2(磺酰胺)、-SO2NHR’、-SO2NR’2、-PO(OR’)2、-PO3H2、-PO(NR’2)2、吡啶基(2-、3-、4-)、吡唑基、吲唑基、咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、噁唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、异噁唑基、苯并异噁唑基、三唑基、苯并三唑基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、嘧啶基、任选地稠合至5或6元杂芳基的具有C-N双键的5或6元杂芳基、吡啶基N-氧化物、-C≡N、-CX’3、-C(O)X’、-COOH、-COOR’、-C(O)R’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)NR’2、-C(O)H、-P(O)(OR’)OR”和X’，其中X’独立地是卤素(例如氯或氟)并且R、R’和R”独立地是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或类似的取代基(例如取代基、大小受限的取代基或低级取代基)。如本领域已知的，术语“吸电子基团”区别于“给电子基团”。
因此，在一些实施方案中，本文所提供的激酶抑制剂(例如以上式I或以下所提供的式的化合物)是可逆性激酶抑制剂，并且当蛋白激酶未变性、部分变性或完全变性时，可以从蛋白激酶可测量地离解。在一些实施方案中，仅当蛋白激酶是完全变性或部分变性的时，共价可逆性激酶抑制剂从蛋白激酶可测量地离解，但是当蛋白激酶是完整的(原封不动的)时，不会从蛋白激酶可测量地离解，或者相对于当蛋白激酶完全或部分变性(本文称为“共价可逆性的变性的激酶抑制剂”)时的离解，当蛋白激酶是完整的时离解慢至少10、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010倍。在一些实施方案中，当置于变性溶液如6N胍、1%SDS、50%MeCN或类似的蛋白变性剂中数秒或数分钟(例如30至120秒，如60秒)时，蛋白激酶变性或完全变性(即不完整的)。在一些实施方案中，在与激酶活性位点半胱氨酸残基共价结合后，本文所述的可逆性激酶抑制剂能够在使用6N胍、1%SDS、50%MeCN或类似的蛋白变性剂变性/展开激酶后在数秒或数分钟内从激酶离解。
在本文所提供的激酶抑制剂的一些实施方案中，如果L1是键且R1是(3-(4-氨基-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙-1-醇)-6-基，那么-L2-E不是-C(O)NH2。在其它实施方案中，在L1是键且R1是取代的4-氨基吡咯并嘧啶基的情况下，那么-L2-E不是-C(O)NH2。在其它实施方案中，在L1是键且R1是取代的吡咯并嘧啶基的情况下，那么-L2-E不是-C(O)NH2。在一些实施方案中，在L1是键且R1是取代的或未取代的吡咯并嘧啶基的情况下，那么-L2-E不是-C(O)NH2。在其它实施方案中，在R1是取代的或未取代的吡咯并嘧啶基的情况下，那么-L2-E不是-C(O)NH2。
在其它实施方案中，-L2-E不是-C(O)NH2。在其它实施方案中，-L2-E不是-C(O)OH或-C(O)OR’’，其中R”是未取代的C1-C10烷基(例如未取代的C1-C5烷基，如甲基)。在一些实施方案中，-L2-E不是-C(O)N(CH3)2或-C(O)NH(CH3)。
在以上式I或以下提供的式的一些实施方案中，R1和R1A独立地是R7-取代的或未取代的烷基、R7-取代的或未取代的杂烷基、R7-取代的或未取代的环烷基、R7-取代的或未取代的杂环烷基、R7-取代的或未取代的芳基或者R7-取代的或未取代的杂芳基。
R7独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R8-取代的或未取代的烷基、R8-取代的或未取代的杂烷基、R8-取代的或未取代的环烷基、R8-取代的或未取代的杂环烷基、R8-取代的或未取代的芳基、R8-取代的或未取代的杂芳基或者-L6-R7A。L6是-O-、-NH-、-C(O)-、-C(O)NH-、-S(O)m-或者-S(O)mNH-，其中m是0、1、或2。
R7A独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R8-取代的或未取代的烷基、R8-取代的或未取代的杂烷基、R8-取代的或未取代的环烷基、R8-取代的或未取代的杂环烷基、R8-取代的或未取代的芳基或者R8-取代的或未取代的杂芳基。R8独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R9-取代的或未取代的烷基、R9-取代的或未取代的杂烷基、R9-取代的或未取代的环烷基、R9-取代的或未取代的杂环烷基、R9-取代的或未取代的芳基、R9-取代的或未取代的杂芳基或者-L9-R9A。在一些实施方案中，R8独立地是-OH或者未取代的烷基。L9是-O-、-NH-、-C(O)-、-C(O)NH-、-S(O)m’-、或-S(O)m’NH-，其中m’是0、1、或2。
R9A独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R10-取代的或未取代的烷基、R10-取代的或未取代的杂烷基、R10-取代的或未取代的环烷基、R10-取代的或未取代的杂环烷基、R10-取代的或未取代的芳基或者R10-取代的或未取代的杂芳基。R9独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R10-取代的或未取代的烷基、R10-取代的或未取代的杂烷基、R10-取代的或未取代的环烷基、R10-取代的或未取代的杂环烷基、R10-取代的或未取代的芳基或者R10-取代的或未取代的杂芳基。R10独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或者未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R1和R1A独立地是R7-取代的或未取代的6,5稠环杂芳基、R7-取代的或未取代的5,6稠环杂芳基、R7-取代的或未取代的5,5稠环杂芳基、R7-取代的或未取代的6,6稠环杂芳基、或者R7-取代的或未取代的具有至少2(例如2至4)个环氮的5或6元杂芳基。在一些实施方案中，R1和R1A独立地是R7-取代的苯基、R7-取代的哌啶基、R7-取代的6元杂环烷基、R7-取代的或未取代的6,5稠环杂芳基、R7-取代的或未取代的5,6稠环杂芳基。R7可以是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、R8-取代的或未取代的烷基、R8-取代的或未取代的杂烷基、R8-取代的或未取代的环烷基、R8-取代的或未取代的杂环烷基、R8-取代的或未取代的芳基、或者R8-取代的或未取代的杂芳基或者-L6-R7A。R7A可以是R8-取代的或未取代的环烷基、R8-取代的或未取代的杂环烷基、R8-取代的或未取代的芳基或者R8-取代的或未取代的杂芳基。L6可以是-O-、-NH-、-C(O)-、-C(O)NH-、-S(O)m-或-S(O)mNH-。R8可以是-OH或者R9-取代的或未取代的烷基。在一些相关的实施方案中，R7独立地是R8-取代的或未取代的环烷基、R8-取代的或未取代的杂环烷基、R8-取代的或未取代的芳基、R8-取代的或未取代的杂芳基或者-L6-R7A。在其它相关的实施方案中，R7是R8-取代的或未取代的杂芳基或者-L6-R7A。L6可以是-C(O)-。R7A可以是R8-取代的或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R1或者R1A是取代的或未取代的杂芳基，例如R7-取代的或未取代的杂芳基。杂芳基可以是取代的或未取代的吡咯并嘧啶基、取代的或未取代的吲哚基、取代的或未取代的吡唑基、取代的或未取代的吲唑基、取代的或未取代的咪唑基、取代的或未取代的噻唑基、取代的或未取代的苯并噻唑基、取代的或未取代的噁唑基、取代的或未取代的苯并咪唑基、取代的或未取代的苯并噁唑基、取代的或未取代的异噁唑基、取代的或未取代的苯并异噁唑基、取代的或未取代的三唑基、取代的或未取代的苯并三唑基、取代的或未取代的喹啉基、取代的或未取代的异喹啉基、取代的或未取代的喹唑啉基、取代的或未取代的嘧啶基、取代的或未取代的吡啶基N-氧化物、取代的或未取代的呋喃基、取代的或未取代的噻吩基、取代的或未取代的苯并呋喃基、取代的或未取代的苯并噻吩基、取代的或未取代的咪唑并[1,2b]哒嗪基。在一些实施方案中，R1或者R1A是取代的或未取代的6,5稠环杂芳基、取代的或未取代的5,6稠环杂芳基、取代的或未取代的5,5稠环杂芳基或者取代的或未取代的6,6稠环杂芳基。在其它实施方案中，R1或者R1A是取代的或未取代的具有至少2(例如2至4)个环氮的5或6元杂芳基。如上所讨论，任何R1取代基可以为R7-取代的，包括在该段落中所列举的取代基。
R1和/或-L1-R1通常设计为激酶ATP结合位点部分。在本文中还发现，其中R1和/或-L1-R1通过sp2碳连接至化合物的其余部分的式I的化合物，该化合物的稳定性得到改善。如本文所使用的“激酶ATP结合位点部分”是能够在激酶ATP结合位点内嵌合和/或结合在激酶ATP结合位点内的氨基酸的部分。对于大量激酶，激酶ATP结合位点是众所周知的，并且可使用本领域通常采用的计算机建模技术从激酶的一级氨基酸结构中容易地测定。在一些实施方案中，-L1-R1是激酶ATP结合位点部分，并且缺电子烯烃碳结合到激酶活性位点半胱氨酸的巯基。因此，在一些实施方案中，本文所提供的激酶抑制剂结合到蛋白激酶的至少两个点：在ATP结合位点部分内的至少一个残基以及激酶活性位点半胱氨酸的巯基。在一些实施方案中，-L1-R1不具有式：
Figure BDA00001892012600171
在其它实施方案中，-L1-R1不是被羟基取代的苯基。在一些实施方案中，-L1-R1包括取代的或未取代的杂芳基或者取代的或未取代的亚杂芳基。
在一些实施方案中，L1-R1和/或R1是取代的或未取代的芳基或者取代的或未取代的杂芳基。在其它实施方案中，L1是键并且R1是取代的或未取代的芳基或者取代的或未取代的杂芳基。在其它实施方案中，L1是取代的或未取代的亚芳基或者取代的或未取代的亚杂芳基并且R1或者R1A是取代的或未取代的芳基或者取代的或未取代的杂芳基。例如，L1可以是取代的或未取代的亚芳基并且R1或者R1A可以是取代的或未取代的杂芳基。在相关的实施方案中，L1A是-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)O-、-S(O)-、-SO2-、-S-、-O-、-NH-或-SO2NH-。
在一些实施方案中，L1是键并且R1是R7-取代的苯基。在一些相关的实施方案中，R7是-L6-R7A或者R8-取代的或未取代的杂芳基，其中R7A是R8-取代的或未取代的杂芳基。在一些进一步相关的实施方案中，L6是键或-C(O)-。在其它相关的实施方案中，R8-取代的或未取代的杂芳基是R8-取代的或未取代的6,5稠环杂芳基或者R8-取代的或未取代的5,6稠环。
在其它实施方案中，L1是键并且R1是R7-取代的苯基、R7-取代的哌啶基、R7-取代的哌嗪基、R7-取代的吡咯烷基、R7-取代的哌啶基、R7-取代的氮杂环庚烷基或者R7-取代的氮杂环丁烷基。在一些相关的实施方案中，R7是-L6-R7A或者R8-取代的或未取代的杂芳基，其中R7A是R8-取代的或未取代的杂芳基。在一些进一步相关的实施方案中，L6是键或-C(O)-。在其它相关的实施方案中，R8-取代的或未取代的杂芳基是R8-取代的或未取代的6,5稠环杂芳基或者R8-取代的或未取代的5,6稠环。
在一些实施方案中，L1是取代的或未取代的亚芳基(例如亚苯基)并且R1或者R1A是取代的或未取代的杂芳基(例如R7-取代的)。在其它实施方案中，L1是取代的或未取代的亚杂芳基。
在以上式I或以下提供的式的一些实施方案中，L1是键、-C(O)-、-C(O)N(L3R2)-、-C(O)O-、-S(O)n-、-O-、-S-、-N(L3R2)-、-P(O)(OL3R2)O-、-SO2N(L3R2)-、-P(O)(NL3R2)N-、R11-取代的或未取代的亚烷基、R11-取代的或未取代的亚杂烷基、R11-取代的或未取代的亚环烷基、R11-取代的或未取代的亚杂环烷基、R11-取代的或未取代的亚芳基或者R11-取代的或未取代的亚杂芳基。L1A可以是键、-C(O)-、-C(O)N(L3′R2′)-、-C(O)O-、-S(O)n'-、-O-、-N(L3′R2′)-、-P(O)(OL3′R2′)O-、-SO2N(L3′R2′)-、-P(O)(NL3′R2′)N-、R11-取代的或未取代的亚烷基、R11-取代的或未取代的亚杂烷基、R11-取代的或未取代的亚环烷基、R11-取代的或未取代的亚杂环烷基、R11-取代的或未取代的亚芳基或者R11-取代的或未取代的亚杂芳基。
L1和L1A还可以独立地是键、R11-取代的或未取代的亚烷基、R11-取代的或未取代的亚杂烷基、R11-取代的或未取代的亚环烷基、R11-取代的或未取代的亚杂环烷基、R11-取代的或未取代的亚芳基或者R11-取代的或未取代的亚杂芳基。
R11独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R12-取代的或未取代的烷基、R12-取代的或未取代的杂烷基、R12-取代的或未取代的环烷基、R12-取代的或未取代的杂环烷基、R12-取代的或未取代的芳基或者R12-取代的或未取代的杂芳基。R12独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R13-取代的或未取代的烷基、R13-取代的或未取代的杂烷基、R13-取代的或未取代的环烷基、R13-取代的或未取代的杂环烷基、R13-取代的或未取代的芳基或者R13-取代的或未取代的杂芳基。R13独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R14-取代的或未取代的烷基、R14-取代的或未取代的杂烷基、R14-取代的或未取代的环烷基、R14-取代的或未取代的杂环烷基、R14-取代的或未取代的芳基、或者R14-取代的或未取代的杂芳基。R14独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或者未取代的杂芳基。
L2可以是键、-C(O)N(L3AR2A)-、-C(O)O-、-S(O)t-、-O-、-S-、-N(L3AR2A)-、-C(O)--P(O)(OL3R2))-、-SO2N(L3R2)-、-P(O)(NL3R2)N-、R19-取代的或未取代的亚烷基、R19-取代的或未取代的亚杂烷基、R19-取代的或未取代的亚环烷基、R19-取代的或未取代的亚杂环烷基、R19-取代的或未取代的亚芳基或者R19-取代的或未取代的亚杂芳基。
R19独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R20-取代的或未取代的烷基、R20-取代的或未取代的杂烷基、R20-取代的或未取代的环烷基、R20-取代的或未取代的杂环烷基、R20-取代的或未取代的芳基或者R20-取代的或未取代的杂芳基。R20独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R21-取代的或未取代的烷基、R21-取代的或未取代的杂烷基、R21-取代的或未取代的环烷基、R21-取代的或未取代的杂环烷基、R21-取代的或未取代的芳基或者R21-取代的或未取代的杂芳基。R21独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R22-取代的或未取代的烷基、R22-取代的或未取代的杂烷基、R22-取代的或未取代的环烷基、R22-取代的或未取代的杂环烷基、R22-取代的或未取代的芳基或者R22-取代的或未取代的杂芳基。R22独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或者未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，L3、L3′、和L3A独立地是键、R27-取代的或未取代的亚烷基、R27-取代的或未取代的亚杂烷基、R27-取代的或未取代的亚环烷基、R27-取代的或未取代的亚杂环烷基、R27-取代的或未取代的亚芳基或者R27-取代的或未取代的亚杂芳基。R27独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R28-取代的或未取代的烷基、R28-取代的或未取代的杂烷基、R28-取代的或未取代的环烷基、R28-取代的或未取代的杂环烷基、R28-取代的或未取代的芳基或者R28-取代的或未取代的杂芳基。R28独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R29-取代的或未取代的烷基、R29-取代的或未取代的杂烷基、R29-取代的或未取代的环烷基、R29-取代的或未取代的杂环烷基、R29-取代的或未取代的芳基或者R29-取代的或未取代的杂芳基。R29独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R30-取代的或未取代的烷基、R30-取代的或未取代的杂烷基、R30-取代的或未取代的环烷基、R30-取代的或未取代的杂环烷基、R30-取代的或未取代的芳基或者R30-取代的或未取代的杂芳基。R30独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或者未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R2、R2′、和R2A独立地是氢、R15-取代的或未取代的烷基、R15-取代的或未取代的杂烷基、R15-取代的或未取代的环烷基、R15-取代的或未取代的杂环烷基、R15-取代的或未取代的芳基或者R15-取代的或未取代的杂芳基。
R15独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R16-取代的或未取代的烷基、R16-取代的或未取代的杂烷基、R16-取代的或未取代的环烷基、R16-取代的或未取代的杂环烷基、R16-取代的或未取代的芳基、R16-取代的或未取代的杂芳基或者-L7-R15A。L7独立地是-O-、-C(O)-、-C(O)NH-、-S(O)y-或者-S(O)yNH-，其中y是0、1或2。R15A独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R16-取代的或未取代的烷基、R16-取代的或未取代的杂烷基、R16-取代的或未取代的环烷基、R16-取代的或未取代的杂环烷基、R16-取代的或未取代的芳基、R16-取代的或未取代的杂芳基。R16独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R17-取代的或未取代的烷基、R17-取代的或未取代的杂烷基、R17-取代的或未取代的环烷基、R17-取代的或未取代的杂环烷基、R17-取代的或未取代的芳基或者R17-取代的或未取代的杂芳基。R17独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R18-取代的或未取代的烷基、R18-取代的或未取代的杂烷基、R18-取代的或未取代的环烷基、R18-取代的或未取代的杂环烷基、R18-取代的或未取代的芳基或者R18-取代的或未取代的杂芳基。R18独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或者未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式II的结构：
Figure BDA00001892012600211
关于式II，W是-C(O)-或-S(O)2-，X是O或N，并且z是0或1，然而，条件是如果X是O，那么z是0。L1和R1如以上对于式I所公开的来定义。在一些实施方案中，X是N。在其它实施方案中，X是O。
R3是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基或者取代的或未取代的杂芳基。
R4是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或者-L5A-R4A。R4A是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基。R3和R4可与X结合在一起以形成取代的或未取代的杂环烷基或者取代的或未取代的杂芳基。R3和R4A可与X结合在一起以形成取代的或未取代的杂环烷基或者取代的或未取代的杂芳基。
L4和L5独立地是键、-C(O)-、-C(O)N(L3AR2A)-、-C(O)O-、-S(O)t-、-O-、-N(L3AR2A)-、-P(O)(OL3AR2A)O-、-SO2N(L3AR2A)-、-P(O)(NL3AR2A)N-、取代的或未取代的亚烷基、取代的或未取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基或者取代的或未取代的亚杂芳基。L3A、R2A、t如上所定义。L5A是键、-C(O)-、-C(O)N(L3A′R2A′)-、-C(O)O-、-S(O)t'-、-O-、-N(L3A′R2A′)-、-P(O)(OL3A′R2A′)O-、-SO2N(L3A′R2A′)-、-P(O)(NL3A′R2A′)N-、取代的或未取代的亚烷基、取代的或未取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基或者取代的或未取代的亚杂芳基。符号t'是0、1或2。
R2A'独立地是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基或者取代的或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，R2A′独立地是氢、R15-取代的或未取代的烷基、R15-取代的或未取代的杂烷基、R15-取代的或未取代的环烷基、R15-取代的或未取代的杂环烷基、R15-取代的或未取代的芳基或者R15-取代的或未取代的杂芳基。R15如上所定义。
L3A'独立地是键、取代的或未取代的亚烷基、取代的或未取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基或者取代的或未取代的亚杂芳基。在一些实施方案中，L3A′是键、R27-取代的或未取代的亚烷基、R27-取代的或未取代的亚杂烷基、R27-取代的或未取代的亚环烷基、R27-取代的或未取代的亚杂环烷基、R27-取代的或未取代的亚芳基或者R27-取代的或未取代的亚杂芳基。R27如上所定义。
在一些实施方案中，L4和L5独立地是键、-C(O)-、-C(O)N(L3AR2A)-、-C(O)O-、-S(O)t-、-O-、-N(L3AR2A)-、-P(O)(OL3AR2A)O-、-SO2N(L3AR2A)-、-P(O)(NL3AR2A)N-、R19-取代的或未取代的亚烷基、R19-取代的或未取代的亚杂烷基、R19-取代的或未取代的亚环烷基、R19-取代的或未取代的亚杂环烷基、R19-取代的或未取代的亚芳基或者R19-取代的或未取代的亚杂芳基。在一些实施方案中，L5A是键、-C(O)-、-C(O)N(L3A′R2A′)-、-C(O)O-、-S(O)t′-、-O-、-N(L3A′R2A′)-、-P(O)(OL3A′R2A′)O-、-SO2N(L3A′R2A′)-、-P(O)(NL3A′R2A′)N-、R19-取代的或未取代的亚烷基、R19-取代的或未取代的亚杂烷基、R19-取代的或未取代的亚环烷基、R19-取代的或未取代的亚杂环烷基、R19-取代的或未取代的亚芳基或者R19-取代的或未取代的亚杂芳基。R19如上所定义。
在一些实施方案中，L5-R4或L4-R3的至少一种包括取代的或未取代的杂芳基或者取代的或未取代的亚杂芳基。在一些实施方案中，L5-R4或L4-R3的一种包括取代的或未取代的杂芳基或者取代的或未取代的亚杂芳基。在一些实施方案中，L5-R4或L4-R3的一种是氢。
在一些实施方案中，如果L1是键并且R1是(3-(4-氨基-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙-1-醇)-6-基，那么R3和R4中至少一个不氢。
在式I或式II的一些实施方案中，R1或者R1A是R7-取代的或未取代的杂环烷基、R7-取代的或未取代的芳基或者R7-取代的或未取代的杂芳基，其中R7如上所述。
在一些实施方案中，R3是氢、R23-取代的或未取代的烷基、R23-取代的或未取代的杂烷基、R23-取代的或未取代的环烷基、R23-取代的或未取代的杂环烷基、R23-取代的或未取代的芳基或者R23-取代的或未取代的杂芳基。
R23独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R24-取代的或未取代的烷基、R24-取代的或未取代的杂烷基、R24-取代的或未取代的环烷基、R24-取代的或未取代的杂环烷基、R24-取代的或未取代的芳基、R24-取代的或未取代的杂芳基或者-L8-R23A'。L8独立地是-O-、-C(O)-、-C(O)NH-、-S(O)p-或-S(O)pNH-、其中p是0、1或2。R23A′独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R24-取代的或未取代的烷基、R24-取代的或未取代的杂烷基、R24-取代的或未取代的环烷基、R24-取代的或未取代的杂环烷基、R24-取代的或未取代的芳基、R24-取代的或未取代的杂芳基。R24独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R25-取代的或未取代的烷基、R25-取代的或未取代的杂烷基、R25-取代的或未取代的环烷基、R25-取代的或未取代的杂环烷基、R25-取代的或未取代的芳基或者R25-取代的或未取代的杂芳基。R25独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R26-取代的或未取代的烷基、R26-取代的或未取代的杂烷基、R26-取代的或未取代的环烷基、R26-取代的或未取代的杂环烷基、R26-取代的或未取代的芳基或者R26-取代的或未取代的杂芳基。R26独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或者未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R3和R4与X结合在一起以形成取代的或未取代的杂芳基或者取代的或未取代的杂环烷基(例如R23-取代的或未取代的杂芳基或者R23-取代的或未取代的杂环烷基)。在一些实施方案中，R3和R4与X结合在一起以形成4至8元的取代的或未取代的杂环烷基或者5至6元的取代的或未取代的杂芳基(例如其R23-取代的种类)。在一些实施方案中，R3和R4与X结合在一起以形成4至7元的取代的或未取代的杂环烷基或者5至6元的取代的或未取代的杂芳基(例如其R23-取代的种类)。在一些实施方案中，R3和R4与X结合在一起以形成5至7元的取代的或未取代的杂环烷基或者5至6元的取代的或未取代的杂芳基(例如其R23-取代的种类)。在一些实施方案中，R3和R4与X结合在一起以形成取代的或未取代的吗啉代、取代的或未取代的硫代吗啉代(或其经氧化的环)、取代的或未取代的吡啶基、取代的或未取代的吡嗪基、取代的或未取代的吡咯烷基、取代的或未取代的哌啶基、取代的或未取代的哌嗪基、取代的或未取代的吡咯烷基、取代的或未取代的氮杂环庚烷基或者取代的或未取代的氮杂环丁烷基(例如其R23-取代的取代基)。
在与式II相关的一些实施方案中，R4和R4A是氢、R23A-取代的或未取代的烷基、R23A-取代的或未取代的杂烷基、R23A-取代的或未取代的环烷基、R23A-取代的或未取代的杂环烷基、R23A-取代的或未取代的芳基或者R23A-取代的或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，R4和R4A不是氢。
R23A是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R24A-取代的或未取代的烷基、R24A-取代的或未取代的杂烷基、R24A-取代的或未取代的环烷基、R24A-取代的或未取代的杂环烷基、R24A-取代的或未取代的芳基、R24A-取代的或未取代的杂芳基或者-L7A-R24B。L7A独立地是-O-、-C(O)-、-C(O)NH-、-S(O)y'-或-S(O)y'NH-，其中y'是0、1或2。R24B独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R24A-取代的或未取代的烷基、R24A-取代的或未取代的杂烷基、R24A-取代的或未取代的环烷基、R24A-取代的或未取代的杂环烷基、R24A-取代的或未取代的芳基、R24A-取代的或未取代的杂芳基。R24A独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R25A-取代的或未取代的烷基、R25A-取代的或未取代的杂烷基、R25A-取代的或未取代的环烷基、R25A-取代的或未取代的杂环烷基、R25A-取代的或未取代的芳基或者R25A-取代的或未取代的杂芳基。R25A独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R26A-取代的或未取代的烷基、R26A-取代的或未取代的杂烷基、R26A-取代的或未取代的环烷基、R26A-取代的或未取代的杂环烷基、R26A-取代的或未取代的芳基或者R26A-取代的或未取代的杂芳基。R26A独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或者未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R4或者R4A是R23A-取代的或未取代的烷基。在一些实施方案中，R3是取代的或未取代的吡啶基(2-、3-、4-)、取代的或未取代的吡唑基、取代的或未取代的吲唑基、取代的或未取代的咪唑基、取代的或未取代的噻唑基、取代的或未取代的苯并噻唑基、取代的或未取代的噁唑基、取代的或未取代的苯并咪唑基、取代的或未取代的苯并噁唑基、取代的或未取代的异噁唑基、取代的或未取代的苯并异噁唑基、取代的或未取代的三唑基、取代的或未取代的苯并三唑基、取代的或未取代的喹啉基、取代的或未取代的异喹啉基、取代的或未取代的喹唑啉基、取代的或未取代的嘧啶基、取代的或未取代的吡啶基N-氧化物或者任选稠合至5至6元杂芳基的取代的或未取代的具有至少一个环氮(例如C-N双键)的5或6元的杂芳基。在一些实施方案中，在前面句子中取代基被取代的情况下，取代基是R15-取代的。
进一步关于具有式II的结构的化合物，在一些实施方案中，L1、L4和L5独立地是键，并且R1是R7-取代的或未取代的杂环烷基、R7-取代的或未取代的芳基或者R7-取代的或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，R7独立地是-NH2、R8-取代的或未取代的烷基、R8-取代的或未取代的芳基、R8-取代的或未取代的杂芳基或者-L6-R7A。L6可以是-C(O)-。R7A可以是R8-取代的或未取代的烷基、R8-取代的或未取代的芳基、R8-取代的或未取代的杂芳基。R8可以是-OH或者R9-取代的或未取代的烷基。R4可以是氢或者R15-取代的或未取代的烷基，并且R3可以是氢或者R23-取代的或未取代的烷基。R3和R4可任选地与X结合在一起以形成4-7元的(例如5-7)元的杂环烷基(例如其R23取代的种类)。
在一些实施方案中，R7是R8-取代的或未取代的杂芳基或者-L6-R7A。L4可以是-C(O)-，并且R7A是R8-取代的或未取代的杂芳基。R7、R8、L6、R7A如上所定义。
在一些实施方案中，在具有式I或II的结构的化合物中，R1是R7-取代的苯基。在一些相关的实施方案中，R7是R8-取代的或未取代的杂芳基或者-L6-R7A。L6可以是-C(O)-，并且R7A可以是R8-取代的或未取代的杂芳基。在式II的进一步的实施方案中，R3和R4是氢。
在一些实施方案中，R7是R8-取代的或未取代的嘌呤基、R8-取代的或未取代的嘧啶基、R8-取代的或未取代的咪唑基、R8-取代的或未取代的1H-吡咯并[2,3-b]吡啶基、R8-取代的或未取代的嘧啶基、R8-取代的或未取代的1H-吲唑基或者R8-取代的或未取代的7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基。R7还可以是R8-取代的或未取代的吡咯并嘧啶基、R8-取代的或未取代的吲哚基、R8-取代的或未取代的吡唑基、R8-取代的或未取代的吲唑基、R8-取代的或未取代的咪唑基、R8-取代的或未取代的噻唑基、R8-取代的或未取代的苯并噻唑基、R8-取代的或未取代的噁唑基、R8-取代的或未取代的苯并咪唑基、R8-取代的或未取代的苯并噁唑基、R8-取代的或未取代的异噁唑基、R8-取代的或未取代的苯并异噁唑基、R8-取代的或未取代的三唑基、R8-取代的或未取代的苯并三唑基、R8-取代的或未取代的喹啉基、R8-取代的或未取代的异喹啉基、R8-取代的或未取代的喹唑啉基、R8-取代的或未取代的嘧啶基、R8-取代的或未取代的吡啶基N-氧化物、R8-取代的或未取代的呋喃基、R8-取代的或未取代的噻吩基、R8-取代的或未取代的苯并呋喃基、R8-取代的或未取代的苯并噻吩基、R8-取代的或未取代的咪唑并[1,2b]哒嗪基。在一些实施方案中，R1是R8-取代的或未取代的6,5稠环杂芳基、R8-取代的或未取代的5,6稠环杂芳基、R8-取代的或未取代的5,5稠环杂芳基或者R8-取代的或未取代的6,6稠环杂芳基。在其它实施方案中，R1是R8-取代的或未取代的具有至少2(例如2至4)个环氮的5或6元杂芳基。
在一些实施方案中，R7是-L4-R7A并且R7A是R8-取代的或未取代的1H-吡咯并[2,3-b]吡啶基。
在一些实施方案中，X是N，并且R1是R7-取代的6元的杂环烷基。R7可以是R8-取代的或未取代的杂芳基。R1可以是R7-取代的哌啶基。R7可以是R8-取代的或未取代的嘌呤基、R8-取代的或未取代的嘧啶基、R8-取代的或未取代的咪唑基、R8-取代的或未取代的1H-吡咯并[2,3-b]吡啶基、R8-取代的或未取代的嘧啶基、R8-取代的或未取代的1H-吲唑基或者R8-取代的或未取代的7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基。在一些实施方案中，R3和R4是氢。
在又一实施方案中，R1是R7-取代的或未取代的6,5稠环杂芳基或者R7-取代的或未取代的5,6稠环杂芳基。R7可以是-NH2、R8-取代的或未取代的烷基、R8-取代的或未取代的芳基，并且R8独立地是-OH或者未取代的烷基。在其它实施方案中，R1是R7-取代的或未取代的吲唑基或者R7-取代的或未取代的7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基。在一些实施方案中，R3和R4是氢。
在具有式I或II的结构的化合物的一些实施方案中，R1是R7-取代的或未取代的吲唑或者R7-取代的或未取代的7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基，R3是未取代的烷基，并且R4是氢。在进一步的实施方案中，R3是苯基甲基，并且R4是氢。在一些实施方案中，R3和R4与N结合以形成R23-取代的或未取代的吡咯烷基。
在设想具有式I或II的结构的化合物的一些实施方案中，X是O，R1是R7-取代的或未取代的6,5稠环杂芳基或者R7-取代的或未取代的5,6稠环杂芳基。R7可以是-NH2、R8-取代的或未取代的烷基或者R8-取代的或未取代的芳基。R8可以是-OH或者未取代的烷基，并且R3可以是未取代的烷基。在一些进一步的实施方案中，R1是R7-取代的7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶，并且R7是-NH2、R8-取代的或未取代的烷基或者R8-取代的或未取代的苯基。
在一些实施方案中，式II的-C(O)X(L4-R3)z(L5-R4)取代基是吸电子基团。因此，-C(O)X(L4-R3)z(L5-R4)能够从其连接的烯烃部分吸负电荷。在一些实施方案中，-C(O)X(L4-R3)z(L5-R4)能够从其连接的烯烃部分充分吸负电荷，以容许在烯烃碳和激酶活性位点半胱氨酸的巯基之间形成硫醇加合物，如本文所讨论的。
在式I和式II的一些实施方案中，R1是取代的或未取代的杂芳基。在其它实施方案中，R1是取代的或未取代的吡唑并嘧啶基(例如R7-取代的或未取代的吡唑并嘧啶基)。在其它实施方案中，R1是取代的或未取代的吡咯并嘧啶基(例如R7-取代的或未取代的吡咯并嘧啶基)。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有结构：
Figure BDA00001892012600271
在式IIIa中，z是从1至4的整数。L1、L2和R7如上所定义。在一些实施方案中，L1是键。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有结构：
Figure BDA00001892012600272
在式IIIb中，z是从1至4的整数。L1、L2、R3、R4和R7如上所定义。在一些实施方案中，L1是键。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有结构：
Figure BDA00001892012600281
在式IIIc中，W是-C(O)-或-S(O)2-，z是从1至4的整数。L1、R3、R4和R7如上所定义。在一些实施方案中，L1是键。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有结构：
在式IIId中，W是-C(O)-或-S(O)2-，z是从1至4的整数。L1、L2、R3、R4和R7如上所定义。在一些实施方案中，L1是键。在一些实施方案中，激酶抑制剂是化合物43、44、45、46、47、48、49和50。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有结构：
Figure BDA00001892012600283
在式IIIe中，W是-C(O)-或-S(O)2-，w是从1至5的整数(例如1)。L1、L2、R3、R4、R7和R8如上所定义。
在式I或式II的另一实施方案中，L1是取代的或未取代的亚芳基。在一些实施方案中，L1是取代的或未取代的亚苯基。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有结构：
Figure BDA00001892012600291
在式IVa中，R1、L2、E和R11如上所定义。符号q是从1至4的整数。在一些实施方案中，R11是氢。在一些实施方案中，R1是取代的或未取代的杂芳基。在进一步的实施方案中，R1是取代的或未取代的吡咯并嘧啶。在式IVa的一些实施方案中，R1是取代的或未取代的杂芳基，q是0，并且L1是取代的或未取代的亚苯基。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有结构：
Figure BDA00001892012600292
在式IVb中，R7、L2、E和R11如上所定义。符号q是从0至4的整数。在一些实施方案中，R11是氢。符号z是从1至4的整数。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有结构：
Figure BDA00001892012600293
在式IVc中，R7、L2和E如上所定义。符号z是从1至4的整数。在进一步的实施方案中，E是-NR3R4(如上所定义)。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有结构：
Figure BDA00001892012600301
在式IVd中，R7、L2、R3和R4如上所定义。符号z是从1至4的整数。在进一步的实施方案中，L2是-C(O)-。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有结构：
Figure BDA00001892012600302
在式IVe中，W是-C(O)-或-S(O)2-，R7、R3和R4如上所定义。符号z是从1至4的整数。在一些实施方案中，R7独立地是-NH2或者取代的或未取代的芳基。在一些实施方案中，R7之一是-NH2，且另一R7是取代的芳基。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有结构：
在式IVf中，W是-C(O)-或-S(O)2-，R7、R3和R4如上所定义。在一些进一步的实施方案中，R3和R4独立地是氢、未取代的或取代的烷基、或结合在一起以形成取代的或未取代的杂烷基。R7可以是取代的或未取代的苯基。一些实施方案中，激酶抑制剂是化合物51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或61。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有结构：
在式(Va)中，R1、L2和E如上所定义。在一些实施方案中，E是如上所定义的-NR3R4。L2可以是-C(O)-。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有结构：
在式Vb中，W是-C(O)-或-S(O)2-，R1、R3和R4如上所定义。在一些实施方案中，R1是取代的烷基。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有结构：
在式Vc中，W是-C(O)-或-S(O)2-，R3和R4如上所定义。在一些实施方案中，激酶抑制剂是化合物38或39。
在一些实施方案中，R1是取代的或未取代的吲唑基，并且激酶抑制剂具有以下式VIa的结构，其中R7如本文所定义。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式：
Figure BDA00001892012600314
在式VIa中，L2、E和R7如上所定义。符号z是从1至4的整数。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式：
Figure BDA00001892012600321
在式VIb中，W是-C(O)-或-S(O)2-，R3、R4和R7如上所定义。符号z是从1至4的整数。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式：
Figure BDA00001892012600322
在式VIc中，W是-C(O)-或-S(O)2-，R3、R4和R7如上所定义。在一些实施方案中，激酶抑制剂是化合物37、40、41或42。
在式I的另一实施方案中，L1是取代的或未取代的亚杂环烷基，L2是-C(O)-。在进一步的实施方案中，R1是取代的或未取代的杂芳基，E是-NR3R4。在一些实施方案中，L1是哌啶基。在进一步的实施方案中，R1是嘌呤基。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式：
在式(VII)中，W是-C(O)-或-S(O)2-，R3和R4如上所定义。在一些实施方案中，激酶抑制剂是化合物36。
激酶抑制剂可以是可逆性激酶抑制剂(如本文所讨论的)。在一些实施方案中，激酶抑制剂是可逆性变性激酶抑制剂(如本文所讨论的)。在一些实施方案中，激酶抑制剂是共价可逆性激酶抑制剂(如本文所讨论的)。在其它实施方案中，激酶抑制剂是共价可逆性变性激酶抑制剂(如本文所讨论的)。以及在一些实施方案中，激酶抑制剂是硫醇共价可逆性变性激酶抑制剂(如本文所讨论的)。
在一些实施方案中，本文所提供的式及其实施方案的化合物在pH 7.5(例如在37℃在磷酸盐缓冲盐水中)是稳定的。在一些实施方案中，在式I或II及其实施方案的化合物在pH 7.5下是稳定的时，化合物具有大于6小时、12小时、24小时或48小时的半衰期。在一些实施方案中，在本文所提供的式及其实施方案的化合物在pH 7.5下是稳定的时，化合物具有大于12小时的半衰期。在一些实施方案中，在本文所提供的式及其实施方案的化合物在pH 7.5下是稳定的时，化合物具有大于24小时的半衰期。在一些实施方案中，在本文所提供的式及其实施方案的化合物在pH 7.5下是稳定的时，化合物具有大于48小时的半衰期。在一些实施方案中，本文所提供的式及其实施方案的化合物在细胞内表现出激酶抑制。在一些实施方案中，细胞是原核生物或真核生物。细胞可以是真核生物(例如原生动物细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞)。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞、牛细胞、猪细胞、马细胞、狗细胞和猫细胞、小鼠细胞或者大鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。细胞可形成器官或有机体的一部分。在一些实施方案中，细胞不形成器官或有机体的一部分。
在一些实施方案中，在本文所提供的式的化合物中各上述取代的基团被至少一个取代基所取代。更具体而言，在一些实施方案中，在本文所提供的式的化合物中上述各取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基、取代的杂芳基、取代的亚烷基、取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基或者取代的或未取代的亚杂芳基被至少一个取代基所取代。在其它实施方案中，这些基团的至少一个或全部被至少一个大小受限的取代基所取代。或者，这些基团的至少一个或全部被至少一个低级取代基所取代。
在本文所提供的式的化合物的其它实施方式中，各取代的或未取代的烷基是取代的或未取代的C1-C20烷基；各取代的或未取代的杂烷基是取代的或未取代的2至20元杂烷基；各取代的或未取代的环烷基是取代的或未取代的C4-C8环烷基；各取代的或未取代的杂环烷基是取代的或未取代的4至8元杂环烷基；各取代的或未取代的亚烷基是取代的或未取代的C1-C20亚烷基；各取代的或未取代的亚杂烷基是取代的或未取代的2至20元亚杂烷基；各取代的或未取代的亚环烷基是取代的或未取代的C4-C8亚环烷基；并且各取代的或未取代的亚杂环烷基是取代的或未取代的4至8元亚杂环烷基。
或者，各取代的或未取代的烷基是取代的或未取代的C1-C8烷基；各取代的或未取代的杂烷基是取代的或未取代的2至8元杂烷基；各取代的或未取代的环烷基是取代的或未取代的C5-C7环烷基；各取代的或未取代的杂环烷基是取代的或未取代的5至7元杂环烷基；各取代的或未取代的亚烷基是取代的或未取代的C1-C8亚烷基；各取代的或未取代的亚杂烷基是取代的或未取代的2至8元亚杂烷基；各取代的或未取代的亚环烷基是取代的或未取代的C5-C6亚环烷基；并且各取代的或未取代的亚杂环烷基是取代的或未取代的5至7元亚杂环烷基。
在一些实施方案中，本文所提供的式的化合物是以下表1和或表2a-2e中所示出的化合物的一种或多种。在其它实施方案中，化合物是下面的一种或多种：
Figure BDA00001892012600341
Figure BDA00001892012600351
Figure BDA00001892012600361
Figure BDA00001892012600371
Figure BDA00001892012600381
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式VIII的结构：
Figure BDA00001892012600382
在式VIII和本文所提供的其它式中，环A是取代的或未取代的杂芳基，例如R31-取代的或未取代的杂芳基。R1和L1如上所定义。
R31是如上所定义的R23A，或者是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R33-取代的或未取代的烷基、R33-取代的或未取代的杂烷基、R33-取代的或未取代的环烷基、R33-取代的或未取代的杂环烷基、R33-取代的或未取代的芳基或者R33-取代的或未取代的杂芳基。
R33独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R34-取代的或未取代的烷基、R34-取代的或未取代的杂烷基、R34-取代的或未取代的环烷基、R34-取代的或未取代的杂环烷基、R34-取代的或未取代的芳基或者R34-取代的或未取代的杂芳基。
R34独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R35-取代的或未取代的烷基、R35-取代的或未取代的杂烷基、R35-取代的或未取代的环烷基、R35-取代的或未取代的杂环烷基、R35-取代的或未取代的芳基或者R35-取代的或未取代的杂芳基。
R35独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或者未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式IX的结构：
Figure BDA00001892012600391
在式IX中，环A是取代的或未取代的杂芳基，例如如上所述的R31-取代的或未取代的杂芳基。R1和L1如上所定义。
在以上式VIII和IX的一些实施方案中，环A是R31-取代的或未取代的杂芳基。在以上式VIII和IX的一些实施方案中，环A是五元的R31-取代的或未取代的杂芳基或者六元的R31-取代的或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式Xa的结构：
在式Xa中，当X1不是连接点时，X1是-C(R31R32)-、-N(R31)-、-S-或-O-。当X1是连接点时，那么X1是C(R31)或N。当不是连接点时，X2、X3、X4和X5独立地是-C(R31)=或-N=。当X2、X3、X4或X5是连接点时，那么作为连接点的X2、X3、X4或X5是C。X1、X2、X3、X4和X5的至少一者不是碳(即视情况而定，不是-C(R31R32)-、C(R31)或-C(R31)=)。例如，在一些实施方案中，X1、X2、X3、X4和X5的至少一者是氮(即视情况而定，-N(R31)-或-N=。典型地，X1、X2、X3、X4和X5的至少两者是碳(例如-C(R31R32)-、C(R31)或-C(R31)=)。
R31如上所定义。R32是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R33-取代的或未取代的烷基、R33-取代的或未取代的杂烷基、R33-取代的或未取代的环烷基、R33-取代的或未取代的杂环烷基、R33-取代的或未取代的芳基或者R33-取代的或未取代的杂芳基。R33如上所公开来定义。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式Xb的结构：
Figure BDA00001892012600401
在式Xb′中，X1是C(R31)或N。X2、X3、X4和X5独立地是-C(R31)=或-N=，然而，条件是X1、X2、X3、X4和X5的至少一者是N。典型地，X1、X2、X3、X4和X5的至少两者是碳。在式Xb″中，X2是C。X1是-C(R31R32)-、-N(R31)-、-S-或-O-。X3、X4和X5独立地是-C(R31)=或-N=，然而，条件是X1、X3、X4和X5的至少一者不是碳。L1、R1和R31如上所公开来定义。典型地，X1、X3、X4和X5的至少一者是碳。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式Xc的结构：
Figure BDA00001892012600402
在式Xc中，X3和X5独立地是-C(R31)=。L1、R1和R31如上所定义。在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式Xd的结构：
在式Xd中，X3、X4和X5独立地是-C(R31)=。L1、R1和R31如上公开所定义的。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式Xe的结构：
Figure BDA00001892012600404
在式Xe中，X4和X5独立地是-C(R31)=。X2是C。L1、R1和R31如上公开所定义的。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式Xf的结构：
在式Xf中，X4和X5独立地是-C(R31)=。L1、R1和R31如上公开所定义的。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式XIa的结构：
Figure BDA00001892012600412
在式XIa中，X6、X7、X8、X9和X10独立地是-C(R31)=、-N=或+N——O-，然而，条件是X6、X7、X8、X9和X10的至少一者是N或+N——O-。L1、R1和R31如上公开所定义的。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式XIb的结构：
在式XIb中，X6、X7、X9和X10独立地是-C(R31)=。X8是N或+N——O-。L1、R1和R31如上公开所定义的。
在一些实施方案中，激酶抑制剂具有式XIc的结构：
Figure BDA00001892012600414
(XIc)
在式XIc中，X6、X8、X9和X10独立地是-C(R31)=。X7是N或+N—O-。L1、R1和R31如上公开所定义的。
在以上式VIII和IX的一些实施方案中，环A是R31-取代的或未取代的呋喃基、R31-取代的或未取代的噻吩基、R31-取代的或未取代的吡咯基、R31-取代的或未取代的咪唑基、R31-取代的或未取代的吡唑基、R31-取代的或未取代的噁唑基、R31-取代的或未取代的异噁唑基、R31-取代的或未取代的噻唑基、R31-取代的或未取代的异噻唑基、R31-取代的或未取代的三唑基、R31-取代的或未取代的噁二唑基、R31-取代的或未取代的吡啶基、R31-取代的或未取代的嘧啶基、R31-取代的或未取代的哒嗪基、R31-取代的或未取代的吡咯啉基、R31-取代的或未取代的吡嗪基、R31-取代的或未取代的四唑基、R31-取代的或未取代的呋喃基、R31-取代的或未取代的二氢噻吩并吡唑基、R31-取代的或未取代的硫茚基、R31-取代的或未取代的咔唑基、R31-取代的或未取代的苯并噻吩基、R31-取代的或未取代的苯并呋喃基、R31-取代的或未取代的吲哚基、R31-取代的或未取代的喹啉基、R31-取代的或未取代的苯并三唑基、R31-取代的或未取代的苯并噻唑基、R31-取代的或未取代的苯并噁唑基、R31-取代的或未取代的苯并咪唑基、R31-取代的或未取代的异喹啉基、R31-取代的或未取代的异吲哚基、R31-取代的或未取代的吖啶基、R31-取代的或未取代的苯并异噁唑基(benzoisazolyl)。R31如上所公开来定义。
在以上式VIII、IX、Xa-Xf和XIa-XIc的一些实施方案中，R1是R7-取代的或未取代的杂环烷基、R7-取代的或未取代的芳基或者R7-取代的或未取代的杂芳基。L1是键。
在一些实施方案中，式I的化合物是以下表1、表2a-2e或下面化合物中阐述的一种或多种化合物：
Figure BDA00001892012600421
使用本领域公知的化学合成技术和在实施例部分中阐述的合成技术，本领域普通技术人员将能够合成式I的化合物。在另一方面，提供制备可逆性激酶抑制剂的方法。该方法包括修饰已知的非-可逆性或不可逆性激酶抑制剂以包含具有下式的取代基的步骤：
Figure BDA00001892012600441
W、L2、L4、L5、E、R3、R4、环A、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10以及z如上所定义。符号
Figure BDA00001892012600442
表示取代基与化合物的其余部分或固体载体的连接的点。
在另一方面，提供蛋白质加合物，其包含结合到本文所提供的激酶抑制剂的蛋白质。在一些实施方案中，所述加合物具有式：
Figure BDA00001892012600443
Figure BDA00001892012600451
Figure BDA00001892012600461
在蛋白质加合物式中的符号(例如W、E、R1、R3、R4、R7、R11、环A、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10等)如上所定义。符号Q表示蛋白质(例如肽)。连接到Q的硫典型地形成半胱氨酸氨基酸的一部分。在一些实施方案中，连接到抑制剂化合物的半胱氨酸是BTK的Cys-481、AK3的Cys-909或RSK2的Cys-436。
III.抑制蛋白激酶的方法
在另一方面，提供抑制蛋白激酶的方法。该方法包括使蛋白激酶与有效量的本文所提供的激酶抑制剂接触。激酶抑制剂可具有本文(或上述其任何实施方案)所提供的式的结构。在一些实施方案中，在细胞内进行抑制蛋白激酶的方法。因此，在一些实施方案中，提供在细胞内抑制蛋白激酶的方法。本方法包括使细胞与有效量的本文所提供的激酶抑制剂接触。激酶抑制剂可具有本文(或上述其任何实施方案)所提供的式的结构。在一些实施方案中，细胞是原核生物或真核生物。细胞可以是真核生物(例如原生动物细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞)。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞、牛细胞、猪细胞、马细胞、狗细胞和猫细胞、小鼠细胞或者大鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。细胞可形成器官或有机体的一部分。在一些实施方案中，细胞不形成器官或有机体的一部分。
激酶抑制剂可以是可逆性激酶抑制剂。可逆性激酶抑制剂是激酶抑制剂，如本文所公开的(例如本文所提供的式及其实施方案的化合物)；当蛋白激酶是完整的(即未变性的)或变性的(例如部分变性的或完全变性的)时，可逆性激酶抑制剂能够从蛋白激酶可测量地离解。“变性的”激酶是没有足以保留激酶活性的充分的三级或二级结构的激酶。“完整的”激酶是具有足以保留激酶活性的充分的三级或二级结构的激酶。因此，在一些实施方案中，抑制蛋白激酶的方法包括使蛋白激酶与可逆性激酶抑制剂接触并且使可逆性激酶抑制剂可逆地结合到活性位点半胱氨酸残基，从而抑制蛋白激酶。
在一些实施方案中，仅当蛋白激酶变性时，可逆性激酶抑制剂从蛋白激酶可测量地离解，但是当蛋白激酶为完整的时，不从蛋白激酶可测量地离解(或相对于当蛋白激酶变性时的离解来说离解慢至少1、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010倍)。如下的可逆性激酶抑制剂在本文中称为“可逆性变性激酶抑制剂”：所述可逆性激酶抑制剂仅当蛋白激酶变性时，从蛋白激酶可测量地离解(或相对于当蛋白激酶变性时的离解来说离解慢至少1、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010倍)，但是当蛋白激酶为完整时，不从蛋白激酶可测量地离解。在从激酶离解后，可逆性变性激酶抑制剂可结合到相同或另外的激酶。
在一些实施方案中，抑制蛋白激酶的方法包括使蛋白激酶与激酶抑制剂接触，其中激酶抑制剂以小于100nM的抑制常数抑制蛋白激酶。并且在蛋白激酶抑制剂是可逆性蛋白激酶抑制剂时，抑制蛋白激酶的方法包括使蛋白激酶与可逆性激酶抑制剂接触，其中可逆性激酶抑制剂以小于100nM的抑制常数抑制蛋白激酶。
在使用本文所述激酶抑制剂来抑制激酶(本文也称为蛋白激酶)时，它意味着与缺乏激酶抑制剂的激酶活性相比，当与激酶抑制剂接触时，激酶活性(即底物分子(例如蛋白质底物)的磷酸化)降低。在一些实施方案中，激酶抑制剂降低激酶活性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50、100、250、500、1000、5000、10,000、100,000、500,000、1,000,000或更多倍。在一些实施方案中，激酶抑制剂以小于100μM、10μM、5μM、1μM、500nM、250nM、100nM、75nM、50nM、10nM、1nM、500pM、250pM、100pM、75pM、50pM、25pM、10pM或1pM的抑制常数(Ki)抑制激酶的活性。在一些实施方案中，当在实施例部分中所阐述的条件下测量时，激酶抑制剂以小于100μM、10μM、5μM、1μM、500nM、250nM、100nM、75nM、50nM、25nM、10nM、1nM、500pM、250pM、100pM、75pM、50pM、25pM、10pM或1pM的IC50抑制激酶的活性。
在本文所提供的可逆性激酶抑制剂可逆地结合到活性位点半胱氨酸残基时，在活性位点半胱氨酸残基和可逆性激酶抑制剂之间形成可逆性结合(键)。可逆性结合典型地是共价键。如本文所使用的“共价可逆性激酶抑制剂”是指与激酶形成共价键的可逆性激酶抑制剂。在共价可逆性激酶抑制剂与活性位点半胱氨酸残基形成可逆性结合时，共价可逆性激酶抑制剂在本文称为“硫醇共价可逆性激酶抑制剂”。在一些实施方案中，仅当蛋白激酶变性时，共价可逆性激酶抑制剂从蛋白激酶可测量地离解，但是当蛋白激酶为完整的时，不从蛋白激酶可测量地离解(或相对于当蛋白激酶完全或部分变性时的离解来说离解慢至少1、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010倍)(本文称为“共价可逆性变性激酶抑制剂”)。在一些实施方案中，当置于变性溶液如6N胍、1%SDS、50%MeCN或类似的蛋白变性剂中数秒或数分钟(例如30至120秒，例如60秒)时，蛋白激酶变性(即不完整)。与活性位点半胱氨酸残基形成可逆性结合的共价可逆性变性激酶抑制剂称为“硫醇共价可逆性变性激酶抑制剂”。
在一些实施方案中，硫醇共价可逆性激酶抑制剂形成在半胱氨酸巯基与形成本文中所提供的式的化合物的碳-碳双键(即烯烃)的一部分的碳原子之间的结合(键)。因此，在一些实施方案中，活性位点半胱氨酸巯基的硫原子的电子攻击碳-碳双键(烯烃)的缺电子的碳原子。在一些实施方案中，碳-碳双键的缺电子的碳原子在吸电子氰基和本文所提供的式及其实施方案的激酶抑制剂的吸电子-L2-E取代基的远端(即连接到-L1-R1的碳)。以这种方式，形成硫醇加合物(例如与半胱氨酸的迈克尔(Michael)反应)。因此，在一些实施方案中，结合到烯烃部分的氰基和-L2-E吸电子基团的组合增强烯烃的反应性以与活性位点半胱氨酸残基形成硫醇加合物。在一些实施方案中，所得的硫醇加合物在约pH2至约pH7(例如约pH3)下是稳定的。在一些实施方案中，在如本文中所述共价结合到激酶活性位点半胱氨酸残基后，本文所述可逆性激酶抑制剂能够在使用6N胍、1%SDS、50%MeCN或类似的蛋白变性剂使激酶变性/展开后数秒或数分钟内从激酶离解。
在一些实施方案中，除了增强烯烃对于活性位点半胱氨酸巯基的反应性外，氰基和-L2-E吸电子基团起作用以增强所形成的硫醇加合物的可逆性。因此，在一些实施方案中，本文所阐述的可逆性激酶抑制剂是完全可逆的。术语“完全可逆的”意思是可逆性激酶抑制剂在其中激酶不变性的条件下表现出可测量的离解速率。在一些实施方案中，本文所提供的激酶抑制剂不是完全可逆的(即在其中激酶完整的条件下没有表现出可测量的离解速率)。可使用任何适当的方法(包括透析和质谱法)测量离解。测量离解的具体方法在以下实施例部分中阐述。
在一些实施方案中，可逆性变性激酶抑制剂可逆性地结合到除了可逆性变性激酶抑制剂抑制(或特异性抑制)的蛋白激酶的细胞组分。所述细胞组分可以为GSH、蛋白质或蛋白质片段，其不是靶向激酶(例如不包含活性位点半胱氨酸或不包含在ATP结合位点的充分近程内的活性位点半胱氨酸的激酶)、靶向激酶的蛋白质片段(例如已被消化使得与激酶可逆性变性激酶抑制剂的结合点的数目减少从而可逆性变性激酶抑制剂从激酶离解的激酶)。因此，在一些实施方案中，在激酶被部分或完全消化时，可逆性变性激酶抑制剂可测量地从激酶离解。可逆性变性激酶抑制剂可测量地从除了可逆性变性激酶抑制剂抑制的完整的全长蛋白激酶的细胞组分离解的能力可提供降低的毒性，包括降低的免疫原性毒性。在一些实施方案中，可逆性变性激酶抑制剂的-L1-R1基团是激酶ATP结合位点部分并且缺电子的烯烃碳结合到激酶活性位点半胱氨酸的巯基。因此，在一些实施方案中，本文所提供的激酶抑制剂结合到蛋白激酶的至少两点：在ATP结合位点部分内的至少一个残基以及激酶活性位点半胱氨酸的巯基。
在一些实施方案中，生理浓度的谷胱甘肽(例如5或10mM GSH)对于例如本文所提供的可逆性激酶抑制剂抑制蛋白激酶的能力具有很小或没有可测量的影响(例如可逆性变性激酶抑制剂仅可逆地结合到GSH，从而能够增加与靶激酶的结合)。在一些实施方案中，在生理浓度的谷胱甘肽(例如5或10mM GSH)的存在下，可逆性激酶抑制剂的IC50或Ki增加不超过20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.01%或0.001%。在其它实施方案中，可逆性激酶抑制剂的IC50或Ki未通过生理浓度的谷胱甘肽(例如5或10mM GSH)的存在而可测量地增加。在一些实施方案中，生理浓度的谷胱甘肽(例如5或10mM GSH)对于本文所提供的可逆性激酶抑制剂抑制蛋白激酶的能力具有很小或没有可测量的影响，其中可逆性激酶抑制剂以低浓度(例如小于100nM、75nM、50nM、25nM、10nM、5nM、3nM、1nM、500pM、250pM、100pM、75pM、50pM、25pM、10pM或1pM)存在。在一些实施方案中，生理浓度的谷胱甘肽(例如5或10mM GSH)对于本文所提供的可逆性激酶抑制剂抑制蛋白激酶的能力具有很小或没有可测量的影响，其中可逆性激酶抑制剂以小于10nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM的浓度存在。在一些实施方案中，生理浓度的谷胱甘肽(例如5或10mM GSH)对于本文所提供的可逆性激酶抑制剂抑制蛋白的能力具有很小或没有可测量的影响。
在一些实施方案中，生理浓度的三磷酸腺苷(例如1mM ATP)对于本文所提供的可逆性激酶抑制剂抑制蛋白激酶的能力具有很小或没有可测量的影响。在一些实施方案中，在生理浓度的三磷酸腺苷(例如1mM ATP)的存在下，可逆性激酶抑制剂的IC50或Ki增加不超过10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.01%或0.001%。在其它实施方案中，可逆性激酶抑制剂的IC50或Ki未通过生理浓度的三磷酸腺苷(例如1mMATP)的存在而可测量地增加。
在一些实施方案中，本文所提供的可逆性激酶抑制剂与GSH可逆地反应。在一些实施方案中，本文所提供的可逆性激酶抑制剂与GSH快速并可逆地反应。因此，在一些实施方案中，本文所提供的可逆性激酶抑制剂与GSH可逆地(例如快速并可逆地)反应，同时还可逆地结合到活性位点半胱氨酸残基(例如在小于10nM、5nM、4nM 3nM、2nM或1nM的浓度下)。GSH可处于生理浓度(例如5-10mM)。不受任何特定机械理论束缚，认为本文所提供的可逆性激酶抑制剂与细胞谷胱甘肽快速并可逆地反应的能力保护大部分非靶向细胞蛋白质免于可逆性激酶抑制剂的亲电子品质。
蛋白激酶可以是任何适当的激酶。在一些实施方案中，蛋白激酶包括在活性位点中的半胱氨酸残基。蛋白激酶活性位点是蛋白激酶的一部分，其中蛋白激酶底物被磷酸化。激酶活性位点典型地是含有结合到底物的氨基酸残基(本文还称为激酶活性位点结合残基)以及参与催化磷酸化反应的氨基酸残基(本文还称为激酶活性位点催化残基)的袋或裂隙。通过嵌入(配合到)激酶活性位点中以及破坏激酶使底物磷酸化的能力，本文所提供的可逆性激酶抑制剂能够抑制激酶催化作用。许多蛋白激酶的活性位点通过结构测定(例如X-射线结晶学或三维NMR技术)是本领域中已知的。在未测定三维结构的情况下，使用本领域公知的计算机软件建模程序通过一级氨基酸序列可测定蛋白激酶活性位点的结构。
如本领域已知的，使用本文所提供的激酶抑制剂抑制的蛋白激酶包括，但不限于：丝氨酸/苏氨酸-特异性蛋白激酶、酪氨酸-特异性蛋白激酶、受体酪氨酸激酶、受体缔合的酪氨酸激酶、组氨酸-特异性蛋白激酶以及天冬氨酸/谷氨酸-特异性蛋白激酶。在一些实施方案中，激酶是酪氨酸蛋白激酶或丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。激酶的例子包括SRC、YES、FGR、CHK2、FGFR1-4、BTK、EGFR、HER2、HER4、HER3、JAK3、PLK1-3、MPS1、RON、MEK1/2、ERK1/2、VEGFR、KIT、KDR、PDGFR、FLT3、CDK8、MEK7、ROR1、RSK1-4、MSK1/2、MEKK1、NEK2、MEK5、MNK1/2、MEK4、TGFbR2、ZAP70、WNK1-4、BMX、TEC、TXK、ITK、BLK、MK2/3、LIMK1、TNK1、CDK11、p70S6Kb、EphB3、ZAK以及NOK。
IV.治疗疾病的方法
在另一方面，在需要这样的治疗的受试者中治疗与激酶活性相关的疾病的方法。该方法包括向受试者施用有效量(例如治疗有效量)的具有本文所提供的式(或如上所述的其实施方案)的结构的化合物。
在一些实施方案中，与激酶活性相关的疾病是慢性病。疾病可以是癌症、癫痫、HIV感染、自身免疫性疾病(例如关节炎)、缺血性疾病(例如心脏病发作或中风)、中风、神经变性疾病、代谢病或炎症。在一些实施方案中，疾病是癌症，包括例如白血病、癌和肉瘤，例如脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、胰腺癌、头颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、黑素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和成神经管细胞瘤。另外的例子包括：霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、恶性胰岛素瘤(insulanoma)、恶性类癌、膀胱癌、恶变前的皮肤损伤、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌和外分泌胰腺的肿瘤。在一些实施方案中，疾病是肝癌、结肠癌、乳腺癌、黑素瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病或非小细胞肺癌。在一些实施方案中，疾病是已转移的癌症。在一些实施方案中，疾病是类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、硬皮病或多肌炎。在一些实施方案中，疾病是糖尿病、肥胖症或脂质紊乱(lipiddisorder)。在一些实施方案中，疾病可由传染物引起，如由细菌、寄生虫或病毒引起。在一些实施方案中，疾病是急性的，例如心肌梗死、中风或哮喘。在一些实施方案中，疾病是帕金森病或肌萎缩性侧索硬化。
V.测定
使用本领域已知的技术和本文所提供的指导，可容易地测定候选激酶抑制剂的抑制任何已知的蛋白激酶的能力。例如，为了评估激酶活性位点结合残基和/或激酶活性位点催化残基之间潜在的结合接触，可首先使用计算机建模技术测定具有本文或其实施方案所提供的式的结构的候选激酶抑制剂。这样的计算机建模技术还可称为硅(in silico)技术。如上所讨论的，对于其中一级氨基酸结构已知的任何激酶，激酶活性位点结合残基和/或激酶活性位点催化残基是已知的或容易确定的。特别地，可采用计算机建模技术以评估候选激酶抑制剂以缺电子的烯烃碳与激酶活性位点半胱氨酸残基反应以形成硫醇加合物的能力。例如，在激酶抑制剂缺电子的烯烃碳在激酶活性位点半胱氨酸巯基的
Figure BDA00001892012600521
内时，激酶抑制剂的效能和/或选择性可以改善(例如1000-10,000倍)。
同样地，可使用计算机建模技术评估候选激酶抑制剂在没有产生空间冲突(stearic clash)的情况下嵌合激酶活性位点中的能力。如上所述，在一些实施方案中，-R1或者-L-R1在激酶ATP结合位点内嵌合和/或与在激酶ATP结合位点内的氨基酸残基进行接触。因此，计算机建模技术可用于评估-R1或者-L-R1在激酶ATP结合位点内嵌合和/或与在激酶ATP结合位点内的氨基酸残基进行接触的能力。上述计算机建模测定可用于评估在本文或其实施方案所提供的式的结构内具有不同的一般化学骨架的候选激酶抑制剂的激酶抑制能力。以这种方式，在进行体外活性测定之前，使用计算机建模可评估新种类的化学骨架。
体外测定还可用于评估具有本文所提供的式及其实施方案的结构的候选激酶抑制剂的激酶抑制性质。体外激酶测定是本领域众所周知的。使用用于大量的激酶组的结合测定的高通量技术是已知的并且可用于快速评估大量的激酶抑制剂候选物。参见，例如Karaman等,Nat Biotechnol.2008年1月;26(1):127-32。
使用重组或天然存在的生物活性蛋白激酶还可鉴定和测试降低激酶催化活性的化合物。蛋白激酶可在天然细胞中发现、体外分离、或在细胞中共表达或表达。一些蛋白激酶使特定的底物特异性磷酸化。在特异性底物是已知的情况下，可测定候选激酶抑制剂降低特异性底物的磷酸化的能力。还可采用一般或非特异性激酶底物。
还可体外测试本文所提供的激酶抑制剂的抑制不含有活性位点半胱氨酸的激酶突变体的能力。激酶抑制剂降低具有活性位点半胱氨酸的激酶的催化活性的能力，同时不具有降低不含有活性位点半胱氨酸的激酶突变体的催化活性的能力(或具有可测量的降低的能力)，表明是通过结合到活性位点半胱氨酸来抑制激酶的激酶抑制剂。例如，RSK2的C436V突变体可对于针对野生型RSK2显示强烈抑制活性的一些激酶抑制剂(IC50>10uM)是耐受性的。该结果支持RSK2抑制需要在Cys436和抑制剂之间形成共价键的结论。
如上所述，E和-L2-E典型地是从反应中心烯烃碳充分吸电子以可逆性地结合到激酶活性位点半胱氨酸的巯基(例如当激酶部分或完全变性时)的取代基。通过测量激酶抑制剂从蛋白激酶(例如部分或完全变性)或从硫醇化合物(例如2-巯基乙醇(BME))的缔合和离解还可体外测试本文所提供的激酶抑制剂的可逆性地结合到蛋白激酶的活性位点半胱氨酸的能力。使用任何适当的方式，包括透析、质谱法、NMR和UV检测(对于更多细节参见实施例部分)，可测量本文所提供的激酶抑制剂的反应中心碳可逆性地结合到激酶活性位点半胱氨酸的巯基的能力。例如，通过检测硫醇化合物如BME的结合可测定激酶抑制剂。使用在结合到硫醇化合物时典型地变得较小UV活性的化合物的UV检测或通过使用质子NMR检测结合可评估所述结合。典型地，通过在硫醇化合物中滴定和检查在终点结合检测参数(例如UV活性或质子NMR)的变化进行测定。通过稀释来评估可逆性。具体的例子提供在以下实施例部分中(参见实施例82)。
还可体外测试本文所提供的激酶抑制剂的在pH 7.5下的稳定性。任何适当的方法可用于确定本文所示出激酶抑制剂在pH 7.5下的稳定性。适当的方法包括例如LC-MS(例如HPLC-MS)以及在激酶抑制剂包含生色团基团的情况下测量UV吸收的变化。使用高通量技术(例如用于同时扫描大量激酶抑制剂的多孔板)可测定UV吸收。使用在pH 7.5在37℃的磷酸盐-缓冲盐水可评估稳定性。可选择具有半衰期大于6小时、12小时、24小时或48小时的化合物。
细胞测定还可用于评估具有本文所提供的式或其实施方案的结构的候选激酶抑制剂的激酶抑制性质。细胞测定包括来自任何适当来源的细胞，包括植物和动物细胞(例如哺乳动物细胞)。细胞测定还可在人细胞中进行。激酶抑制的细胞测定是本领域众所周知的，且包括其中将激酶抑制剂递送至细胞(例如通过电穿孔、被动扩散、显微注射等)且测定激酶活性终点例如细胞底物磷酸化的量、细胞蛋白质的表达量或已知受所测量的特定激酶的催化活性影响的细胞表型的一些其他变化的方法。例如，使用检测抗体特异性或磷酸化的细胞底物，然后进行蛋白质印迹技术和使用任何适当方法的可视化(例如荧光标记抗体的荧光检测)，可评估特定细胞底物的磷酸化。
使用本领域已知的多种方法(例如在以下实施例部分所述的测定)可测量在本文所公开的激酶抑制剂的存在下蛋白激酶催化活性相对于在缺乏抑制剂的情况下的活性的降低。测定激酶活性的活性的其它方法是本领域已知的。适当的测定方法的选择充分在本领域普通技术人员的能力范围内。
一旦鉴定能够体外和/或在细胞内降低激酶催化活性的激酶抑制剂，可进一步测试化合物的在动物模型中(例如整个动物或动物器官)选择性地抑制激酶活性的能力。因此，可进一步测试激酶抑制剂在细胞模型或动物模型中导致与特定激酶活性相关的表型的可检测变化的能力。除了细胞培养物外，还可使用动物模型以测试激酶抑制剂治疗例如在动物模型中的癌症的能力。
VI．药物制剂
在另一方面，本发明提供包含本发明的激酶抑制剂化合物或与药学上可接受的赋形剂(例如载体)组合的激酶抑制剂化合物的药物组合物。
药物组合物包括本文所公开的抑制剂的旋光异构体、非对映体或药学上可接受的盐。例如，在一些实施方案中，药物组合物包含本发明的化合物和作为药学上可接受的盐的柠檬酸盐。包含在药物组合物中的激酶抑制剂可共价连接至载体部分，如上所述。或者，包含在药物组合物中激酶抑制剂不共价连接至载体部分。
如本文所使用的“药学上合适的载体”是指药物赋形剂，例如不与提取物有害地反应的适合肠内或胃肠外应用的药学上、生理上可接受的有机或无机载体物质。合适的药学上可接受的载体包括水、盐溶液(例如林格氏溶液)、醇、油、明胶和糖类(如乳糖、直链淀粉或淀粉)、脂肪酸酯、羟甲基纤维素以及聚乙烯基吡咯烷。这样的制剂可被杀菌，并且如果需要，可和不与本发明的化合物有害地反应的助剂混合，所述助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色和/或芳族物质等。
本发明的化合物可单独施用或可共同施用至患者。共同施用是指包括个别地或组合地(多于一种化合物)同时或顺序施用化合物。因此，当需要时，所述制剂还可与其它活性物质组合(例如以降低代谢性降解)。
A.制剂
可以各种口服、胃肠外和局部剂型来制备和施用本发明的激酶抑制剂。因此，本发明的化合物可通过注射(例如静脉内、肌内、皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内)来施用。而且，本文所述的化合物可通过吸入(例如鼻内)来施用。此外，本发明的化合物可透皮施用。还可设想，多种施用途径(例如，肌内、口服、透皮)可用于施用本发明的化合物。因此，本发明还提供包含药学上可接受的载体或赋形剂以及一种或多种本发明的化合物的药物组合物。
对于由本发明的化合物制备药物组合物，药学上可接受的载体可以是固体或液体。固体形式制剂包括粉末、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂以及可分散的颗粒。固体载体可以是一种或多种物质，其可用作稀释剂、芳香剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料。
在粉末中，载体是细碎的固体，其与细碎的活性组分混合。在片剂中，活性组分与具有必要结合性质的载体以合适的比例混合并压缩成所需形状和尺寸。
粉末和片剂优选地包含5%至70%的活性化合物。合适的载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。术语“制剂”旨在包括活性化合物与作为载体的包封材料的配制物，提供其中具有或没有其它载体的活性组分被载体包围的胶囊，所述载体因而与它相结合。类似地，包括扁囊剂和锭剂。片剂、粉末、胶囊、丸剂、扁囊剂和锭剂可用作适于口服施用的固体剂型。
对于制备栓剂，首先将低熔点蜡(如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物)熔化，且将活性组分均匀分散其中，如通过搅拌。然后将熔化的均匀混合物倒入便利尺寸的模具内，使其冷却，且从而固化。
液体形式制剂包括溶液、混悬液和乳剂，例如水或水/丙二醇溶液。对于胃肠外注射，液体制剂可以在水性聚乙二醇溶液中的溶液配制。
当需要或期望胃肠外应用时，对于本发明的化合物的特别合适的混合物是可注射的无菌溶液，优选为油性或水性溶液；以及混悬液；乳剂；或植入体，包括栓剂。尤其，用于胃肠外施用的载体包括葡萄糖、盐水、纯水、乙醇、甘油、丙二醇、花生油、芝麻油、聚氧乙烯-嵌段共聚物等的水性溶液。安瓿是方便的单位剂量。本发明的化合物还可并入脂质体中或通过透皮泵或贴剂来施用。适合在本发明使用的药物混合物包括在例如PharmaceuticalSciences(第17版,Mack Pub.Co.,Easton,PA)和WO 96/05309中描述的那些，两者的教导均在此通过引用并入。
适合口服使用的水性溶液可通过在水中溶解活性组分并且根据需要加入合适的着色剂、芳香剂、稳定剂和增稠剂来制备。通过在水中分散细碎的活性组分与粘性物质如天然或合成树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠以及其它众所周知的混悬剂可制备适合口服使用的水性混悬液。
还包括固体形式制剂，其意在使用前不久转化为用于口服施用的液体形式制剂。这样的液体形式包括溶液、混悬液和乳剂。除了活性组分外，这些制剂可含有着色剂、芳香剂、稳定剂、缓冲剂、人工和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
药物制剂优选为以单位剂型。在这样的形式中，制剂被细分为含有适当量的活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂、含有不连续量的制剂的包装，例如包装的片剂、胶囊以及在小瓶或安瓿中的粉末。而且，单位剂型本身可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂，或它可以是包装形式的适当数量的任何这些剂型。
根据活性组分的特定应用和效能，在单位剂量制剂中活性组分的量可从0.1mg至10000mg，更典型地从1.0mg至1000mg，最典型地从10mg至500mg改变或调整。如果需要，组合物还可含有其它相容的治疗剂。
一些化合物在水中可具有有限的溶解性，因此在组合物中可需要表面活性剂或其它适当的共溶剂。这样的共溶剂包括：聚山梨酯20、60和80；Pluronic F-68、F-84和P-103；环糊精；以及聚氧乙烯35蓖麻油。这样的共溶剂典型地以约0.01重量%至约2重量%的水平采用。
粘度大于简单水性溶液的粘度可为期望的以降低在对配制物调剂中的变化性、以降低配制物的混悬液或乳剂的组分的物理分离和/或改善配制物。这样的粘度增加剂(building agent)包括例如聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、硫酸软骨素及其盐、透明质酸及其盐、前述的组合。这样的试剂典型以约0.01重量%至约2重量%的水平采用。
本发明的组合物可另外包含提供持续释放和/或舒适的组分。这样的组分包括高分子量、阴离子黏膜样(mucomimetic)聚合物、凝胶化多糖和细碎的药物载体基质。这些组分在美国专利No.4,911,920；5,403,841；5,212,162；和4,861,760中更详细地讨论。出于所有目的将这些专利的所有内容全部通过引用并入本文。
B.有效剂量
本发明所提供的药物组合物包括其中以治疗有效量(即有效实现其预期目的的量)含有有效成分的组合物。对于特定应用有效的实际量尤其将取决于所治疗的病症。例如，当在治疗癌症的方法中施用时，这样的组合物将含有有效实现期望结果(例如减少受试者中癌细胞数量)的活性成分量。
施用至哺乳动物的剂量和频率(单或多剂量)可取决于多种因素而变化，所述多种因素包括无论哺乳动物是否患有另外的疾病，导致激酶活性提高的疾病，及施用途径；接受者的尺寸、年龄、性别、健康、体重、体重指数和饮食；所治疗疾病(例如，癌症)的症状的性质和程度，同时治疗的类型，所治疗疾病的并发症或其它健康相关问题。其它治疗方案或试剂可连同本发明的方法和化合物一起使用。
对于本文所述的任何化合物，可首先从细胞培养测定中确定治疗有效量。靶浓度将是能够降低例如使用所述方法测量的激酶催化活性水平的活性化合物的那些浓度。
在人中使用的治疗有效量可从动物模型确定。例如，可配制用于人的剂量以达到已发现在动物中有效的浓度。可通过监测激酶抑制以及将剂量上调或下调来调整用于人的剂量，如上所述。
取决于患者的需求和所采用的化合物，剂量可变化。在本发明的上下文中，施用至患者的剂量应足以影响随着时间在患者中的有益治疗反应。还通过任何不利副作用的存在、性质和程度来确定剂量的大小。通常，治疗以小于化合物的最佳剂量的较小剂量开始。此后，以小的增量增加剂量直至达到在情况下的最佳效果。在本发明的一个实施方案中，剂量范围是0.001%至10%w/v。在另一实施方案中，剂量范围是0.1%至5%w/v。
可单独调整剂量和间隔以提供对于所治疗的特定临床适应症有效的施用化合物的水平。这将提供与个体疾病状况的严重性相当的治疗方案。
利用本文所提供的教导，可设计有效的预防或治疗方案，其不导致大量毒性且完全有效地治疗由特定患者表现的临床症状。该设计应涉及通过考虑例如以下的因素的活性化合物的仔细选择：化合物效能、相对生物利用度、患者体重、不利副作用的存在和严重性、施用的优选方式以及所选择的试剂的毒性剖析图。
C.毒性
特定化合物的毒性和治疗作用之间的比率是其治疗指数并且可以表示为LD50(对群体的50%致死的化合物的量)和ED50(对群体的50%有效的化合物的量)之间的比率。优选表现出高治疗指数的化合物。从细胞培养测定和/或动物研究中获得的治疗指数可用于配制在人中使用的一系列剂量。这样的化合物的剂量优选地在一系列包括具有少量或无毒性的ED50的血浆浓度内。取决于采用的剂型和利用的施用途径，剂量可在该范围内变化。参见，例如Fingl等在：THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS,Ch.1,p.l,1975。可由个别医师依据患者病症和其中使用化合物的特定方法选择准确的配制物、施用途径和剂量。
D.其他的试剂和治疗模式
在一些实施方案中，本文所提供的激酶抑制剂可与其它治疗剂或治疗模式组合使用。在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗癌剂。治疗剂可以是化学治疗剂、生物剂、激素治疗剂或激酶抑制剂，其不是本文所提供的式(或其实施方案)的激酶抑制剂。另外的治疗剂可另外为烷化剂、蒽环类药物、单克隆抗体、细胞因子、核苷类似物、强的松、紫杉烷、雌激素、孕酮、激素拮抗剂、长春花生物碱、抗代谢药等。
在一些实施方案中，本文所提供的激酶抑制剂可与其它治疗模式(如辐射治疗和手术)组合使用。
VII.实施例
提供下面的实施例以说明、但不是限制要求保护的发明。
通用化学方法。在Waters Micromass ZQ 4000分光计上记录低分辨率电喷雾电离质谱(ESI+-MS)。使用Xterra MS C18柱(Waters)(在210nm、260nm和/或350nm下监测)以0.2ml min-1的流速在Waters AllianceHT LC/MS上进行LC/MS(MS:ESI+)。对于空气和水敏感性的反应，在使用前将玻璃器皿用烘箱或火焰干燥并且在氩气下进行反应。使用由Glass Contour,Inc.(LagunaBeach,CA)制造的溶剂纯化系统将二氯甲烷、二甲基甲酰胺、甲醇、四氢呋喃、甲苯和二异丙基胺干燥。除非另有说明，所有其它溶剂均是ACS化学级(Fisher)并且在没有进一步纯化的情况下使用。使用硅胶60F254玻璃板(EMScience)进行分析型和制备型薄层色谱法。使用230-400目硅胶(SelectoScientific)进行快速色谱法。使用COMBI-A C18预备柱(Peeke Scientific)(在210nm和260nm下监测)以10ml min-1的流速在Prostar 210(Varian)上进行制备型高效液相色谱法(HPLC)。
JAK2和JAK3激酶测定的通用程序。从Millipore购买活性JAK2(人，残基808-末端)和JAK3(人，残基781-末端)。将在8mM HEPES(pH 7.0)、200uM EDTA、10mM MgCl2、0.2mg/mL BSA、100uM ATP以及10mM GSH中的活性激酶(3nM)与抑制剂(8或10倍浓度，一式两份)在室温下预温育30分钟。通过加入0.3μCi/μL的γ-32P-ATP(6000Ci/mmol,NEN)和100uM肽底物(JAK3-tide，对于JAK3而言，或PDK-tide，对于JAK2而言，Millipore)引发激酶反应，然后在室温下温育30分钟。通过将5μL的各反应点至磷酸纤维素板上来测定激酶活性。将各斑点使用1%AcOH溶液洗涤一次、0.1%H3PO4溶液洗涤两次以及MeOH洗涤一次(每次洗涤5-10分钟)。将干燥的斑点暴露至储存磷光体屏30分钟以及通过Typhoon成像仪(GE Life Sciences)扫描。使用SPOT程序将数据定量(Knight,Z.等Nature Protocols,2(10),2459-66)并且使用GraphPad Prism 4.0软件绘图。
Btk激酶测定的通用程序。购买Btk(人，全长)(Invitrogen，目录号PV3363)以及如产品文献中规定的使用。将Btk(2nM最终浓度)与抑制剂(6或10倍浓度，一式两份)在室温下预温育30分钟。通过加入0.16μCi/μL的γ-32P-ATP(6000Ci/mmol,NEN)和0.2mg/mL底物(聚[Glu:Tyr],4:1Glu:Tyr)引发激酶反应，然后在室温下温育30分钟。通过将6μL的各反应点至磷酸纤维素板上来测定激酶活性。将各斑点使用1%AcOH溶液洗涤一次、0.1%H3PO4溶液洗涤两次以及MeOH洗涤一次(每次洗涤5-10分钟)。将干燥的斑点暴露至储存磷光体屏30分钟并且通过Typhoon成像仪(GE Life Sciences)扫描。使用ImageQuant(v.5.2,Molecular Dynamics)将数据定量并且使用GraphPadPrism 4.0软件绘图。
实施例1.3-(4-(9H-嘌呤-6-基)苯基)-2-氰基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600611
向在6mL THF中1-四氢吡喃-1-基-6-(对甲酰基苯基)嘌呤(Donald,A.等J.Med.Chem.2007,50，2289-2292)(170mg,0.55mmol)的溶液中加入20滴的水性1N HCl。将反应在室温下搅拌过夜。在18小时后，形成白色沉淀物，并且如TLC所测定的，所有起始物料已消耗。使用EtOAc稀释反应，使用饱和NaHCO3洗涤，然后将有机层经Na2SO4干燥。旋转蒸发得到100mg(81%)作为淡黄色固体的2，其在没有进一步纯化下继续进行。精确质量：224.07，M/z测试值：225.3(M+H)+。
将在THF(0.5mL)中脱保护的6-(对甲酰基苯基)-嘌呤(10.9mg,0.049mmol)、2-氰基乙酰胺(5.4mg,0.064mmol)和PPh3(13mg,0.049mmol)的浆料在密封的小瓶中加热至80℃。在80℃下将混合物搅拌12小时，并在真空中浓缩。使用9:1CH2Cl2:MeOH在二氧化硅上对残余物进行层析，得到9.6mg(87%)作为淡黄色固体的3-(4-(9H-嘌呤-6-基)苯基)-2-氰基丙烯酰胺(E/Z异构体的混合物)。精确质量：290.09，M/z测试值：291.3(M+H)+。
实施例2.4-(1-甲苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)苯甲醛。
Figure BDA00001892012600612
将在5:1二噁烷:水(2mL)中的3-溴-1-甲苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(100mg,0.29mmol)、4-甲酰苯基硼酸(66mg,0.44mmol)和K2CO3(126mg,0.87mmol)的浆料在微波小瓶中进行氩气脱气30分钟。加入Pd(PPh3)4(33mg,0.029mmol)和使用氩气吹扫容器。将小瓶在微波反应器中加热至150℃15分钟，冷却至室温，使用EtOAc稀释，使用水洗涤，有机层用Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。使用1:1己烷:EtOAc在二氧化硅上对残余物进行层析，得到92mg(86%)作为黄色固体的4-(1-甲苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)苯甲醛。
实施例3.4-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)苯甲醛。
Figure BDA00001892012600621
向在2:1THF:MeOH(2mL)中4-(1-甲苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)苯甲醛(162mg,0.45mmol)的溶液中加入Cs2CO3(435mg,1.34mmol)。在加入碳酸盐碱时溶液变黄，且在室温下搅拌18小时。在通过TLC监测，起始物料完全消耗后，将浅橙色溶液在真空中浓缩，将残余物溶于10mL水中，并将所得的浆料剧烈搅拌30分钟。将黄色沉淀过滤，用水洗涤，并在真空下干燥，得到74mg作为亮黄色固体的4-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)苯甲醛。精确质量：222.08,M/z测试值：223.3(M+H)+。
实施例4.3-(4-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)苯基)-2-氰基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600622
向在1:1THF:MeOH中4-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)苯甲醛(8mg,0.036mmol)的浆料中加入2-氰基乙酰胺(4mg,0.043mmol)和PPh3(5mg,0.018mmol)。将反应混合物加热至80℃48小时，并在经LCMS监测的产物的大量生成后，将反应浓缩并溶于少量的THF中。加入EtOH，并将所得的黄色沉淀过滤且在真空下干燥，得到1.2mg作为亮黄色固体的3-(4-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)苯基)-2-氰基丙烯酰胺(E/Z异构体的混合物)。精确质量：288.30,M/z测试值：289.3(M+H)+。
实施例5.3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)苯甲醛。
在氩气下在火焰干燥的圆底烧瓶中将7-吖吲哚(182mg,1.5mmol)和AlCl3(945mg,7.4mmol)在干燥的CH2Cl2(50mL)中合并。使不均匀的黄色混合物在室温下搅拌一小时，在该时间在氩气的正压下经由注射器将3-甲酰基苯甲酰氯(505mg,2.9mmol)逐滴加入。混合物缓慢变成半透明黄色溶液。在室温下搅拌另外两小时后，将MeOH(~20mL)缓慢加入以猝灭过量的酰氯。在真空中去除溶剂并且使用9:1EtOAc:MeOH在二氧化硅上对残余物进行层析，得到42mg(11%)作为白色固体的3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)苯甲醛。精确质量：250.07,M/z测试值：251.3(M+H)+。
实施例6.3-(3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)苯基)-2-氰基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600632
向在THF(1mL)中3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)苯甲醛(19.5mg,0.08mmol)的溶液中加入2-氰基乙酰胺(15mg,0.17mmol)和哌啶(10μL,0.096mmol)，并将浆料在80℃下搅拌三小时，产生白色沉淀。通过过滤来收集沉淀，得到1.5mg(6%)作为白色固体的3-(3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)苯基)-2-氰基丙烯酰胺(E/Z异构体的混合物)。精确质量：316.10，M/z测试值：317.3(M+H)+。
实施例7.2-氰基-3-(1H-吲唑-5-基)丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600641
向在THF(2mL)中5-甲酰-1H-吲唑(102.5mg,0.7mmol)的溶液中加入2-氰基乙酰胺(75mg,0.9mmol)和哌啶(20μL,0.2mmol)。将反应在室温下搅拌18小时，随后加入一刮勺尖端(spatula-tip)的氰基乙酰胺。将反应搅拌另外三小时且黄色固体开始沉淀。将反应过滤，然后使用THF洗涤固体并在真空中干燥，得到65mg(44%)作为黄色固体的2-氰基-3-(1H-吲唑-5-基)丙烯酰胺(E/Z异构体的混合物)。精确质量：212.07,M/z测试值：213.4(M+H)+。
实施例8.3-(1H-吲唑-5-基)-2-(吡咯烷-1-羰基)丙烯腈。
Figure BDA00001892012600642
向在THF(2mL)中6-甲酰-1H-吲唑(115mg,0.8mmol)的溶液中加入2-氰基-N-异丙基乙酰胺(100mg,0.7mmol)和DBU(130μL,1.05mmol)。将所得的棕色溶液在室温下搅拌18小时，通过TLC监测。将另外一刮勺尖端的2-氰基-N-异丙基乙酰胺加入，并将反应搅拌另外18小时，产生了很少的其他产物。将反应浓缩，溶于少量EtOAc中，并通过制备型TLC纯化，得到43mg(20%)的作为无定型棕褐色固体的3-(1H-吲唑-6-基)-2-(吡咯烷-1-羰基)丙烯腈(E/Z异构体的混合物)。精确质量：266.12,M/z测试值：267.5(M+H)+。
实施例9.2-氰基-3-(1H-吲唑-6-基)丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600651
向在THF(2mL)中6-甲酰-1H-吲唑(102.5mg,0.7mmol)的溶液加入2-氰基乙酰胺(78.2mg,0.7mmol)和哌啶(50μL,0.5mmol)。将反应在室温下搅拌18小时，产生白色沉淀。将反应过滤，并使用THF洗涤固体且在真空中干燥，得到69mg(46%)作为白色固体的2-氰基-3-(1H-吲唑-6-基)丙烯酰胺(E/Z异构体的混合物)。精确质量：212.07,M/z测试值：213.4(M+H)+。
实施例10.2-氰基-3-(1H-吲唑-6-基)-N-甲基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600652
向在THF(1mL)中6-甲酰-1H-吲唑(103.5mg,0.7mmol)的溶液中加入2-氰基-N-甲基乙酰胺(70mg,0.7mmol)和DBU(130μL,1.05mmol)。在加入DBU时，黄色浆料立即变成清澈橙色溶液，随后迅速产生橙色沉淀。在室温下搅拌一小时后，将反应浓缩，溶于少量的1:1EtOAc:H2O中并剧烈声处理以破碎残余物。将所得的固体过滤，使用EtOAc和H2O洗涤并干燥，得到21mg(13%)作为棕褐色固体的2-氰基-3-(1H-吲唑-6-基)-N-甲基丙烯酰胺(E/Z异构体的混合物)。精确质量：226.09,M/z测试值：227.4(M+H)+。
实施例11.2-氰基-3-(1H-吲唑-6-基)-N-异丙基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600653
向在THF(1mL)中6-甲酰-1H-吲唑(101.5mg,0.7mmol)的溶液中加入2-氰基-N-异丙基乙酰胺(99.9mg,0.8mmol)和DBU(130μL,1.05mmol)。在1小时后，通过TLC监测，观察到起始物料完全消耗。使用EtOAc将反应稀释并且使用H2O和盐水洗涤。将己烷缓慢加入至剩余有机层直至形成浅色沉淀，将其通过过滤收集，得到48mg(27%)作为白色固体的2-氰基-3-(1H-吲唑-6-基)-N-异丙基丙烯酰胺(E/Z异构体的混合物)。
实施例12.(1-(9H-嘌呤-6-基)哌啶-4-基)甲醇。
Figure BDA00001892012600661
将6-氯嘌呤(509mg,3.2mmol)、4-哌啶甲醇(737mg,6.4mmol)和Et3N(2.25mL,25.6mmol)溶解在n-BuOH(30mL)中并且在密封的容器中加热至100℃。将浅橙色溶液加热过夜，冷却至室温，并且浓缩，得到棕褐色固体。使用3:1己烷:MeOH(10mL)将残余物磨碎，并且在真空中干燥，得到401mg(57%)作为亮白色固体的(1-(9H-嘌呤-6-基)哌啶-4-基)甲醇。
实施例13.1-(9H-嘌呤-6-基)哌啶-4-甲醛。
Figure BDA00001892012600662
将(1-(9H-嘌呤-6-基)哌啶-4-基)甲醇(250mg,1.1mmol)和Dess-Martinperiodinane(700mg,1.65mmol)在干燥的CH2Cl2(30mL)中合并，并将浆料剧烈搅拌直至它变成黄色、不均匀液体。将在CH2Cl2(20mL)中的水(20μL)逐滴加入反应中，在加入~1摩尔当量的水时其变得混浊。在剧烈搅拌另外30分钟后，将反应混合物在EtOAc(~100mL)中稀释，并用1∶1饱和的NaS2O4:NaHCO3、水和盐水洗涤。使用EtOAc对水性层进行反萃取，合并的有机层用Na2SO4干燥并且浓缩。使用9:1CH2Cl2:MeOH残余物在二氧化硅上对残余物进行层析，得到124mg(48%)作为蜡状、无色固体的1-(9H-嘌呤-6-基)哌啶-4-甲醛。
实施例14.3-(1-(9H-嘌呤-6-基)哌啶-4-基)-2-氰基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600671
将1-(9H-嘌呤-6-基)哌啶-4-甲醛(11.2mg,0.048mmol)、2-氰基乙酰胺(6mg,0.071mmol)和PPh3(6mg,0.023mmol)在THF(1mL)中合并，并且在密封的小瓶中加热至80℃。在加热18小时后，已经形成白色沉淀，但TLC表明存在大量的起始物料。将一刮勺尖端的2-氰基乙酰胺加入反应中，并将其在80℃下搅拌另外18小时。将反应冷却，且通过过滤收集沉淀，得到6mg(46%)作为白色固体的3-(1-(9H-嘌呤-6-基)哌啶-4-基)-2-氰基丙烯酰胺(E/Z异构体的混合物)。精确质量：297.13,M/z测试值：298.3(M+H)+。
实施例15.2-(2-氧代-2-对甲苯基乙基)异二氢吲哚-1，3-二酮。
Figure BDA00001892012600672
将2-溴-1-对甲苯基乙酮(20g,93.8mmol)溶解在100mL DMF中。将邻苯二酰胺钾(19.9g,103.2mmol)加入并将反应在室温下搅拌3小时。使用CH3Cl将反应稀释至总体积200mL，并且产物从溶液中沉淀。通过过滤收集沉淀的产物。将剩余的滤液浓缩，再溶解在100mL CH3Cl中，然后用水、饱和的碳酸氢钠和盐水洗涤。用CH2Cl2+10%MeOH对水性层进行萃取，并将所得的有机层经Na2SO4干燥和在真空中浓缩。获得的2-(2-氧代-2-对甲苯基乙基)异二氢吲哚-1,3-二酮的总量是24.4g(94%产率)。
实施例16.2-氨基-4-对甲苯基-1H-吡咯-3-腈。
Figure BDA00001892012600681
向在MeOH(22.5ml)/48%w/v水性NaOH(3.5ml)/H2O(7.5ml)中丙二腈(1.23g,18.6mmol)的溶液中加入2-(2-氧代-2-对甲苯基乙基)异二氢吲哚-1,3-二酮(4g,14.3mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时，此后产物从溶液中沉淀。通过过滤收集固体并用水洗涤。向剩余的滤液中加入水，并将所得的沉淀滤出且与产物合并。将固体产物在真空下干燥过夜，得到2.3g(82%产率)的2-氨基-4-对甲苯基-1H-吡咯-3-腈。
实施例17.N-3-氰基-4-对甲苯基-1H-吡咯-2-基亚胺甲酸甲酯。
向在原甲酸三乙酯(10ml)中2-氨基-4-对甲苯基-1H-吡咯-3-腈(2.3g,11.6mmol)的溶液中加入醋酸酐(110μ1，1.1mmol)并且将混合物回流1小时。在冷却至室温后，将溶剂在真空中去除。将2.88g(99%产率)的粗N-3-氰基-4-对甲苯基-1H-吡咯-2-基亚胺甲酸甲酯与甲苯共沸干燥并且直接继续进行下一步。
实施例18.N’-(3-氰基-4-对甲苯基-1H-吡咯-2-基)甲脒。
Figure BDA00001892012600683
将粗N-3-氰基-4-对甲苯基-1H-吡咯-2-基亚胺甲酸甲酯(2.88g,11.5mmol)溶解在MeOH(80ml)中7N NH3中并且在加盖的圆底烧瓶中在室温下搅拌4小时。将溶剂在真空中除去，并将粗N’-(3-氰基-4-对甲苯基-1H-吡咯-2-基)甲脒产物在高度真空下干燥过夜，得到2.27g(88%产率)的产物。
实施例19.5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺。
将N’-(3-氰基-4-对甲苯基-1H-吡咯-2-基)甲脒(2.27g,10.2mmol)溶解在MeOH(30ml)中并且加热以回流。将甲醇钠(1.5m，在MeOH中25重量%，5.1mmol)加入，并且将反应在回流下搅拌3小时，此后产物从溶液中沉淀。在冷却至室温后，通过过滤将固体分离并且在高度真空下干燥，得到2.3g(100%)作为棕褐色固体的纯5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺。
实施例20.7-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺。
Figure BDA00001892012600692
向在DMF(120mL)中5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(5.01g,22.3mmol)的0°C浆料中加入NaH(0.98g的60%油分散体,24.6mmol)，并且对所得的混合物加温至室温。在搅拌30分钟后，将3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基碘化物(7.38g,24.6mmol)在10分钟内逐滴加入。在搅拌另外4小时后，通过加入100ml水将反应猝灭，然后将沉淀的产物过滤并且在高度真空下干燥，得到7.78g(88%产率)的7-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺。精确质量396.23；测试值397.5[M+H]+。
实施例21.6-溴-7-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺。
Figure BDA00001892012600701
向在DMF(20ml)中7-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(1.22g,3mmol)的溶液中加入N-溴丁二酰亚胺(0.65g,3.6mmol)并且将混合物在避光下搅拌24小时。用EtOAc(25ml)将反应稀释并且用水和盐水洗涤。将合并的有机部分经无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩和通过快速柱色谱法(40%乙酸乙酯/己烷)来纯化，得到0.9g(62%产率)的6-溴-7-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺。精确质量：474.15；测试值475[M]+和477[M+2]+。
实施例22.7-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基)-5-对甲苯基-6-乙烯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺。
Figure BDA00001892012600702
向在甲苯(30ml)中6-溴-7-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(1.0g,2.1mmol)的溶液中加入三丁基乙烯基锡(0.8ml,2.73mmol)。使氩气鼓泡通过溶液10分钟。将四(三苯基膦)合钯(244mg,0.21mmol)快速加入，并且使氩气鼓泡通过溶液另外10分钟。然后将反应在回流下搅拌3小时。将反应通过Celite过滤，并且将滤液浓缩。通过快速柱色谱法将产物在50%EtOAc/己烷中纯化，得到浅黄色残余物，将其由苯冻干，得到757mg(85%产率)作为浅黄色粉末的7-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基)-5-对甲苯基-6-乙烯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺。精确质量422.25；测试值423.1[M+H]+。
实施例23.4-氨基-7-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛。
Figure BDA00001892012600711
向在3:1THF:H2O(11.3ml)中7-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基)-5-对甲苯基-6-乙烯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(760mg,1.8mmol)的溶液在氮气下逐滴加入四氧化锇(1.75ml，0.18mmol，在t-BuOH中2.5%)。在室温下将反应在氩气下搅拌20分钟。在30分钟的时间段内将高碘酸钠(860mg，3.6mmol，溶解在2.4ml温水中)逐滴加入反应中。将反应在室温下搅拌1.5小时，然后用乙酸乙酯稀释。用饱和的水性硫代硫酸钠洗涤有机层，然后用乙酸乙酯对水性层进行反萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥、过滤和浓缩。通过快速柱色谱法将残余物在50%EtOAc/己烷中纯化，得到417mg(55%产率)的带黄色的油，其在静置时固化。精确质量424.23；测试值425.1[M+H]+。
实施例24.3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基丙烯酸甲酯。
Figure BDA00001892012600712
向在干燥THF(1.5ml)中4-氨基-7-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛(52mg,0.123mmol)的溶液中加入DBU(22μl,0.147mmol)和2-氰基乙酸甲酯(13mg,0.135mmol)。将反应在室温下搅拌1小时，此后转化达到90%。将反应浓缩，并且通过制备型薄层色谱法使残余物在50%EtOAc/己烷中纯化，得到51mg(80%产率)的作为黄色膜的TBS-保护的氰基丙烯酸酯。向在THF(1.5ml)中TBS-保护的氰基丙烯酸酯(51mg,0.098mmol)的溶液中加入1N HCl水溶液(500μl)。将反应在室温下搅拌1小时，然后使用乙酸乙酯稀释。使用饱和水性碳酸氢钠和盐水洗涤有机层，然后经硫酸钠干燥、过滤和浓缩。通过从甲醇/己烷(1:3)中沉淀来纯化黄色残余物，得到12mg(25%产率)作为黄色固体的3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基丙烯酸甲酯(E/Z异构体的混合物)。精确质量391.16；测试值392.0[M+H]+。
实施例25.3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基丙烯酸叔丁酯。
Figure BDA00001892012600721
向在干燥THF(2ml)中4-氨基-7-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛(100mg,0.235mmol)的溶液中加入DBU(45μl,0.306mmol)和2-氰基乙酸叔丁酯(34μl,0.235mmol)。将反应在室温下搅拌2小时，此后用乙酸乙酯将它稀释。用水性0.1N HCl溶液和盐水洗涤有机层，然后经硫酸钠干燥、过滤和浓缩。使残余物通过快速柱色谱法在50%EtOAc/己烷中并且然后通过HPLC纯化(在35分钟内梯度30-100%MeOH，10ml min-1流速，保留时间9.34分钟)来纯化，得到21.3mg(21%产率)的3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基丙烯酸叔丁酯(E/Z异构体的混合物)。化学式：C24H27N5O3，精确质量433.21；测试值434.1[M+H]+。
实施例26.3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600731
向在干燥THF(2ml)和异丙醇(1ml)中4-氨基-7-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛(120mg,0.283mmol)的溶液中加入哌啶(28μl,0.283mmol)和2-氰基乙酰胺(23mg,0.283mmol)。将反应在室温下搅拌16小时，此后加入另外等量的2-氰基乙酰胺和哌啶。在10天后，用乙酸乙酯使反应稀释，并且用水洗涤有机层且然后经硫酸钠干燥、过滤和浓缩。将粗残余物溶解在3ml干燥THF中并加入1.2ml的1N HCl。将反应搅拌1.5小时，然后用乙酸乙酯稀释。用饱和水性碳酸氢钠洗涤有机层，随后用盐水洗涤，然后经硫酸钠干燥、过滤和浓缩。通过快速柱色谱法使残余物在3-5%MeOH/DCM中纯化，得到38mg(42%产率)作为黄色粉末的3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基丙烯酰胺(E/Z异构体的混合物)。精确质量：376.16；测试值377.4[M+H]+。
实施例27.2-氰基-N-苄基乙酰胺。
Figure BDA00001892012600732
向在DMF中二异丙基乙基胺(506μl,3mmol)和苄胺(327μl,3mmol)的搅拌溶液中加入氰基乙酸(85mg,1mmol)、EDC(625mg,3mmol)和HOBt(208mg,1.5mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。然后用乙醚使反应稀释，并且将有机层用1N HCl洗涤两次和用盐水洗涤一次。将有机层经硫酸钠干燥、过滤和通过旋转蒸发浓缩。将清澈的残余物由苯冻干，得到无需进一步纯化的24mg(14%产率)的灰白色粉末。
实施例28.2-氰基-N-异丙基乙酰胺。
在0℃下向搅拌氰基乙酸甲酯(2.0g,20mmol)中逐滴加入异丙胺(1.7ml,20mmol)，保持温度低于10℃。将反应在0℃下搅拌1小时，此后加入2ml的15%水性NaOH并且将反应在室温下搅拌5分钟。用乙酸乙酯使混合物稀释并用水洗涤。将有机层经硫酸钠干燥、过滤和浓缩，得到无需进一步纯化的1.06g(42%产率)的白色固体。参考:Basheer,A.等.J.Org.Chem.(2007),72:5297-5312。
实施例29.3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-N-苄基-2-氰基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600742
向在干燥THF(1ml)中4-氨基-7-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛(58mg,0.138mmol)的溶液中加入哌啶(29μl,0.276mmol)和N-苄基氰基乙酰胺(24mg,0.138mmol)。将反应在室温下搅拌2天，此后转化达到50%并且终止。将反应浓缩，并且使残余物通过快速柱色谱法在50%EtOAc/己烷中纯化，得到黄色粉末，将其溶解在THF(1ml)中并且加入100μl 1N HCl。将反应在室温下搅拌1小时，用乙酸乙酯稀释，并且将层分离。用饱和水性碳酸氢钠洗涤有机层，随后用盐水洗涤，然后经硫酸钠干燥、过滤和浓缩。通过使用100%EtOAc至5%MeOH/EtOAc洗脱的快速柱色谱法使黄色油纯化，得到黄色残余物，将其由苯冻干，得到9.8mg(46%产率)作为黄色粉末的3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-N-苄基-2-氰基丙烯酰胺(E/Z异构体的混合物)。精确质量：466.21；测试值：467.5[M+H]+。
实施例30.3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基-N-异丙基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600751
向在干燥THF(1.5ml)中4-氨基-7-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛(100mg,0.236mmol)的溶液中加入哌啶(50μl,0.476mmol)和N-异丙基氰基乙酰胺(60mg,0.476mmol)。将反应在室温下搅拌4天，此后转化达到50%。将反应浓缩，并且通过快速柱色谱法使残余物在50%EtOAc/己烷中纯化，得到黄色泡沫，将其溶解在THF(1ml)和1N HCl(100μl)中。将反应在室温下搅拌1.5小时，用乙酸乙酯稀释，然后将层分离。用饱和水性碳酸氢钠洗涤有机层，随后用盐水洗涤，然后经硫酸钠干燥、过滤和浓缩。使用100%EtOAc至5%MeOH/EtOAc洗脱的快速柱色谱法使黄色油纯化，得到黄色油，将其由苯冻干，得到26mg(54%产率)作为黄色粉末的3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基-N-异丙基丙烯酰胺(E/Z异构体的混合物)。精确质量：418.21；测试值：419.5[M+H]+。
实施例31.6-溴-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺。
将5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(1.5g,6.7mmol)溶解在热DMF中，然后使其冷却至室温。随着在20分钟内分部分地加入NBS(1.4g,8.04mmol)，将浑浊的混悬液在氩气下且在避光下搅拌。在加入后一小时溶液变清澈并且沉淀开始形成。在2小时后，将反应过滤，并用DMF洗涤固体。将合并的滤液浓缩并且在水中搅拌10分钟，得到第二批固体。将灰色固体合并，得到1.464g(72%产率)。
实施例32.5-对甲苯基-6-乙烯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺。
Figure BDA00001892012600761
向6-溴-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(500mg,1.65mmol)的搅拌溶液中加入三丁基乙烯基锡烷(579μl,1.98mmol)并且对溶液脱气5分钟。加入四(三苯基膦)合钯(134mg,0.116mg)，然后使反应进行回流和搅拌过夜。将反应混合物通过Celite垫过滤，并用热甲苯洗涤固体3次。将滤液浓缩并将残余物从EtOAc/己烷再结晶，得到190mg(46%产率)的灰色固体。
实施例33.(E)-3-(4-氨基-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基丙烯酰胺.
将在叔丁醇(136μl,0.013mmol)中四氧化锇的2.5%溶液(w/v)逐滴加入到在3:1THF/H2O(5.2ml)中5-对甲苯基-6-乙烯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(190mg,0.68mmol)的搅拌溶液中。将混悬液在室温下搅拌10分钟，随后逐滴加入混悬在1ml H2O中的NaIO4(262mg,1.224mmol)。然后将反应在室温下搅拌过夜。用乙酸乙酯使反应稀释并且用饱和水性硫代硫酸钠猝灭。将有机层分离，并且用乙酸乙酯对水性层萃取3次。将合并的有机层浓缩，得到黄色固体，将其溶解在2:1异丙醇/THF(3ml)中。向该溶液中加入氰基乙酰胺(30mg,0.359mmol)和哌啶(35μl,0.359mmol)。将反应在室温下搅拌过夜，在此期间形成黄色沉淀。将其过滤，得到46mg(41%产率，两步)的2-氰基-3-(7-对甲苯基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-6-基)丙烯酰胺。精确质量：318.12；测试值：319.00[M+H]+。
实施例34.(E)-3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)丙烯腈。
Figure BDA00001892012600771
向火焰干燥的烧瓶中加入7-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基)-6-甲酰-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氨基甲酸叔丁酯(218mg,0.416mmol)、(三苯基亚正膦基)乙腈(500.9mg,1.664mmol)和干燥CH2Cl2(10ml)。在室温下将反应在氩气下搅拌16小时，此后将反应浓缩，并且通过快速柱色谱法使粗残余物在25%EtOAc/己烷中纯化，得到196mg(87%产率)的作为异构体混合物的3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)丙烯腈。将3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)丙烯腈(80mg,0.139mmol)溶解在2ml CH2Cl2并且冷却至0°C，此后加入2ml的TFA。将反应在0°C下搅拌1小时，然后使其达到室温。在16小时后，将反应浓缩，并且将粗残余物溶解在3ml干燥THF中并加入1N HCl。将反应搅拌15小时，然后用乙酸乙酯稀释，并且将有机层用饱和水性碳酸氢钠洗涤，随后用盐水洗涤，然后经硫酸钠干燥、过滤和浓缩。通过快速柱色谱法使残余物在3%MeOH/DCM中纯化，得到9.1mg(19%产率)的(E)-3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)丙烯腈和24.6mg(53%产率)的(Z)-3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)丙烯腈。化学式C19H19N5O；精确质量：333.16；测试值334.5[M+H]+。
实施例35.3-(1-(9H-嘌呤-6-基)哌啶-4-基)-2-氰基-N-甲基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600781
将1-(9H-嘌呤-6-基)哌啶-4-甲醛(17mg,0.086mmol)、2-氰基-甲基乙酰胺(11mg,0.112mmol)和PPh3(28mg,0.106mmol)在THF(1mL)中合并并且在密封的小瓶中加热至110℃。在加热18小时后，用EtOAc(2mL)稀释反应混合物并用水(1mL)洗涤。将有机层浓缩，并进行制备型TLC(用9:1CH2Cl2:MeOH洗脱)，得到6mg(23%)作为白色固体的3-(1-(9H-嘌呤-6-基)哌啶-4-基)-2-氰基-N-甲基丙烯酰胺。精确质量：311.15,M/z测试值：312.05(M+H)+。
实施例36.2-氰基-3-(1H-吲唑-5-基)-N,N-二甲基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600782
向在THF(1mL)中6-甲酰-1H-吲唑(101mg,0.7mmol)的溶液中加入2-氰基-N-二甲基乙酰胺(80mg,0.7mmol)和DBU(67μL,0.7mmol)。将所得的棕色溶液在室温下搅拌18小时，随后在60℃下搅拌4小时。残留起始物料，所以将反应搅拌另外18小时，产生很少量其他产物。将反应浓缩，溶于少量的EtOAc，并通过过滤收集所得的白色沉淀，得到30mg作为白色固体的2-氰基-3-(1H-吲唑-5-基)-N，N-二甲基丙烯酰胺(19%)。精确质量：240.10,M/z测试值：241.09(M+H)+。
实施例37.3-(3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)苯基)-2-氰基-N-甲基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600791
向在THF(1mL)中3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)苯甲醛(47mg,0.2mmol)的溶液中加入2-氰基乙酰胺(19mg,0.2mmol)和DBU(20μL,0.2mmol)，并将浆料在室温下搅拌五分钟。将几滴MeOH加入反应以阻止胶质沉淀粘到壁上，并且将反应搅拌过夜，产生带黄色的沉淀。通过过滤来收集沉淀，得到8mg(12%)作为白色固体的3-(3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)苯基)-2-氰基-N-甲基丙烯酰胺。精确质量：330.11,M/z测试值：331.05(M+H)+。
实施例38.3-(3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)苯基)-2-氰基-N,N-二甲基丙烯酰胺
Figure BDA00001892012600792
向在THF(1mL)中3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)苯甲醛(47mg,0.2mmol)的溶液中加入2-氰基乙酰胺(19mg,0.2mmol)和DBU(20μL,0.2mmol)，并将浆料在室温下搅拌数小时，在此时棕色浆料变成清澈黄色溶液。第二天，将反应浓缩至棕色、蜡状固体，在EtOAc:MeOH(2:1)中再悬浮，并且通过过滤收集所得到沉淀，得到12mg(17%)作为白色固体的3-(3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)苯基)-2-氰基-N，N-二甲基丙烯酰胺。精确质量：344.13,M/z测试值：345.09(M+H)+。
实施例39.3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吲唑-5-甲醛
将3-碘-5-甲酰基吲唑(210mg,0.735mmol)、三甲氧基苯基硼酸(187mg,0.882mmol)和K2CO3(309mg,2.21mmol)在5:1二噁烷:H2O(2mL)中合并并且用鼓泡氩气进行脱气20分钟。加入Pd(PPh3)4(123mg,0.106mmol)，并用氩气吹扫反应容器。对反应在150℃下进行微波处理15分钟。将粗反应混合物用EtOAc(20mL)稀释，用1M HCl(10mL)、水(10mL)和盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并浓缩。将残余物在二氧化硅上纯化，用3:2Hex:EtOAc洗脱，并且将含有产物的不纯部分浓缩为黄色固体。将该黄色固体悬浮在EtOAc中，并且过滤白色固体，得到140mg(83%)作为白色固体的3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吲唑-5-甲醛。
实施例40.2-氰基-3-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吲唑-5-基)丙烯酰胺。
向在THF(1mL)中3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吲唑-5-甲醛(52.0mg,0.16mmol)和2-氰基乙酰胺(13.2mg,0.16mmol)的溶液中加入DBU(16μL,0.16mmol)。在加入DBU时，无色溶液变成亮黄色，并在15分钟的过程内缓慢变成鲜红色。在四小时后，将反应混合物溶于EtOAc(10mL)中，并用1MHCl(10mL)、NaHCO3(10mL)和盐水(10mL)洗涤。将有机层浓缩并通过使用9:1CH2Cl2:MeOH洗脱的制备型TLC纯化，得到5.3mg(9%)作为亮黄色固体的2-氰基-3-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吲唑-5-基)丙烯酰胺。精确质量：378.13,M/z测试值：379.03(M+H)+。
实施例41.2-氰基-N-甲基-3-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吲唑-5-基)丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600811
向在THF(1mL)中3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吲唑-5-甲醛(30mg,0.100mmol)和2-氰基-N-甲基乙酰胺(9.6mg,0.100mmol)的溶液中加入DBU(10μL,0.10mmol)。在加入DBU时，无色溶液变成亮黄色，并在15分钟的过程内缓慢变成鲜红色。在四小时后，将反应混合物溶于EtOAc(10mL)中，并且用1M HCl(10mL)、NaHCO3(10mL)和盐水(10mL)洗涤。将有机层浓缩并通过使用9:1CH2Cl2:MeOH洗脱的制备型TLC纯化，得到17mg(43%)作为亮黄色固体的2-氰基-N-甲基-3-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吲唑-5-基)丙烯酰胺。精确质量：392.15,M/z测试值：393.07(M+H)+。
实施例42.2-氰基-N,N-二甲基-3-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吲唑-5-基)丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600812
向在THF(1mL)中3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吲唑-5-甲醛(50mg,0.16mmol)和2-氰基-N-甲基乙酰胺(17.6mg,0.16mmol)的溶液中加入DBU(16μL,0.16mmol)。在加入DBU时，无色溶液变成亮黄色，并在15分钟的过程内缓慢变成鲜红色。在四小时后，将反应混合物溶于EtOAc(10mL)中，并用1M HCl(10mL)、NaHCO3(10mL)和盐水(10mL)洗涤。将有机层浓缩并且通过使用9:1CH2Cl2:MeOH洗脱的制备型TLC纯化，得到17mg(26%)作为亮黄色固体的2-氰基-N，N-二甲基-3-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吲唑-5-基)丙烯酰胺。精确质量：406.16,M/z测试值：407.05(M+H)+。
实施例43.4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛。
Figure BDA00001892012600821
向在二氯甲烷(12mL)中4-二-叔丁基氧基羰基氨基-7-(3-叔丁基二甲基甲硅烷氧基丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛(1.43g,2.28mmol)的溶液中加入TFA(5mL)。将反应混合物维持在环境温度下12小时，然后在减压下浓缩。将残余物再溶解在THF(12mL)中，并且加入1M水性HCl(4mL)。将反应混合物在环境温度下搅拌24小时，并且然后使用EtOAc(50mL)和饱和水性NaHCO3(50mL)稀释。分离相，并且用EtOAc(50mL)萃取水相。用盐水(50mL)洗涤合并的有机萃取物，然后在减压下浓缩。将残余物与苯(50mL)共沸，并且在真空中干燥，得到0.99g的脱保护的醛(湿)，将其在没有进一步纯化下使用。
实施例44.吖丁啶(X=H)和3-羟基吖丁啶(X=OH)氰基乙酰胺。
Figure BDA00001892012600822
将在EtOH(6mL)中氰基乙酸乙酯(1.0当量)、吖丁啶(X=H)或3-羟基吖丁啶(X=OH)盐酸盐(1.1当量)以及三乙胺(1.5当量)在80℃下加热6小时。将反应混合物浓缩，并且使残余物在EtOAc(25mL)和DI水(25mL)之间分配。使用EtOAc(2×30mL)萃取水相。将合并的有机萃取物干燥(Na2SO4)和浓缩，得到残余物，将其通过硅胶层析法(对于X=H，4:1EtOAc/己烷；对于X=OH，16:1EtOAc/MeOH)纯化，得到期望的氰基乙酰胺。氰基乙酸乙酯(550mg,4.86mmol)和吖丁啶盐酸盐(500mg)得到196.5mg(33%产率)的吖丁啶氰基乙酰胺。氰基乙酸乙酯(469.4mg,4.15mmol)和3-羟基吖丁啶盐酸盐(500mg)得到89mg(15%产率)的吖丁啶氰基乙酰胺。
实施例45.氰基丙烯酰胺的合成。
Figure BDA00001892012600831
合成氰基丙烯酰胺衍生物的一般程序：将4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛(1.0当量)、适当的氰基乙酰胺(1.2-1.5当量)和DBU(1.5-2.0当量)在THF(2mL)中在环境温度下搅拌1-3天。然后将反应混合物浓缩并且通过制备型TLC纯化，得到作为(E)-和(Z)-异构体混合物的氰基丙烯酰胺。
实施例45a.3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基-N,N-二甲基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600832
从N,N-二甲基氰基乙酰胺制备的化合物。参见Basheer,A.;Yamataka,H.;Ammal,S.C.;Rappoport,Z.J.Org.Chem.2007,72,5297-5312。产量：33.8mg(24%,E:Z=1.7:1)。ESI-MS:405.2(MH+)。
实施例45b.3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基-N-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600841
从2-氰基-N-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)乙酰胺制备的化合物。参见Santilli,A.A.;Osdene,T.S.J.Org.Chem.1964,29,2066-2068。产量：17.2mg(39%),ESI-MS:449.2(MH+)。
实施例45c.3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基-N,N-二乙基丙烯酰胺。
从N,N-二乙基氰基乙酰胺制备的化合物。参见Wang,K.;Nguyen,K.;Huang,Y.;A.J.Comb.Chem.2009,11,920-927。产量：9.2mg(8%),ESI-MS:433.2(MH+)。
实施例45d.3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-(吡咯烷-1-羰基)丙烯腈。
Figure BDA00001892012600844
该化合物从N-(2-氰基乙酰基)吡咯烷制备。参见Wang等,Id。产量：1.6mg(3%),ESI-MS:431.2(MH+)。
实施例45e.3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-(吖丁啶-1-羰基)丙烯腈。
Figure BDA00001892012600851
产量：16.5mg(32%)，ESI-MS:417.2(MH+)。
实施例45f.3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-(3-羟基吖丁啶-1-羰基)丙烯腈。
Figure BDA00001892012600852
产量：20.1mg(38%),ESI-MS:433.2(MH+)。
实施例45g.(E)-3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-(4-甲基哌嗪-1-羰基)丙烯腈。
Figure BDA00001892012600853
从N-(2-氰基乙酰基)-N’-甲基哌嗪制备的化合物。参见Proenca,F.;Costa,M.Green Chem.2008,10,995-998。产量：15.7mg(25%),ESI-MS:460.2(MH+)。
实施例46.3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基-N-环丙基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600861
向在预先冷却至0-5℃的THF中4-叔丁基氧基羰基氨基-7-(3-叔丁基二甲基甲硅烷氧基丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛(101mg,0.1925mmol)和N-环丙基氰基乙酰胺3(47.8mg,2.0当量)的溶液中加入DBU(58μL,2.0当量)。使反应混合物加温至环境温度并搅拌1小时，然后维持在-20℃下12小时。将反应混合物浓缩，并通过硅胶层析法(2:1己烷/EtOAc)纯化，得到53.2mg(E:Z=2:1,44%产率)的作为黄色油的中间体保护的氰基丙烯酰胺。将该油溶解在CH2Cl2(3mL)中，并加入TFA(1.5mL)。在20-25℃下16小时后，将反应混合物浓缩，并且将残余物再溶解在THF(6mL)中，并且加入1M HCl水溶液(2mL)。使反应混合物维持在环境温度下8小时，然后使用饱和NaHCO3水溶液(20mL)和盐水(30mL)猝灭，并且用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的EtOAc萃取物干燥(MgSO4)和浓缩，并且通过制备型TLC(3:1甲苯/IPA，0.5cm板，2次洗脱)纯化得到的油，得到作为黄色油的氰基丙烯酰胺(26mg，在2步74%产率)。
实施例47.1-(4-氯苯基)-2-(3-(羟甲基)苯基氨基)乙酮。
Figure BDA00001892012600862
向装配有磁力搅拌棒的100mL圆底烧瓶装入3-氨基苄醇(1.58g,12.85mmol)、碳酸钾(3.05g,22.1mmol)和N，N’-二甲基甲酰胺(10mL)。将浆料搅拌，同时分部分地加入2-溴-4’-氯苯乙酮(2.85g,12.2mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。用水(80mL)将反应稀释，然后将所得的沉淀通过过滤收集，使用水洗涤，并且在真空中干燥，得到产物(2.89g,86%产率)。
实施例48.2-氨基-4-(4-氯苯基)-1-(3-(羟基甲基)苯基)-1H-吡咯-3-腈。
Figure BDA00001892012600871
向装配有磁力搅拌棒的250mL圆底烧瓶装入1-(4-氯苯基)-2-(3-(羟甲基)苯基氨基)乙酮(2.88g,10.4mmol)、氢氧化钾(85%)(1.8g,27mmol)、丙二腈(1.32g,20mmol)、水(5mL)和甲醇(50mL)。使混合物回流1.5小时，在这段时间内形成沉淀。用水(50mL)将混合物稀释，并将沉淀通过过滤收集，用水洗涤，并在真空中干燥，得到产物(1.68g,50%产率)。
实施例49.(3-(4-氨基-5-(4-氯苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯基)甲醇。
Figure BDA00001892012600872
向装配有磁力搅拌棒的250mL圆底烧瓶装入2-氨基-4-(4-氯苯基)-1-(3-(羟甲基)苯基)-1H-吡咯-3-腈(1.60g,4.9mmol)、原甲酸三乙酯(5mL)和对甲苯磺酸一水合物(5mg)。将溶液加热至100℃45分钟。在减压下将过量的原甲酸三乙酯去除，并且将所得的油短暂地在真空中干燥。向所得的固体加入氨(7M的甲醇溶液，20mL)，然后将烧瓶紧紧盖上。将溶液在室温下搅拌3小时。将溶液在减压下浓缩和在甲醇(10mL)中再溶解。将溶液加热至80℃，并且逐滴加入甲醇钠(25%w/v的甲醇溶液，1mL)。将混合物回流2小时，冷却至室温并且通过加入水来猝灭。用乙酸乙酯(3×50mL)萃取溶液。将有机层经硫酸钠干燥、过滤和在减压下浓缩。通过硅胶层析法(洗脱1:1EtOAc/Hex至100%EtOAc)纯化所得的油。将含有中间产物的部分合并以及在减压下浓缩。将所得的红棕色油溶解在甲醇(50mL)中，并且加入盐酸1M(50mL)。将溶液在室温下搅拌1小时。使溶液在乙酸乙酯和水之间分配并用乙酸乙酯萃取。使有机层经硫酸钠干燥、过滤和在减压下浓缩，得到作为淡黄色固体的产物。
实施例50.3-(4-氨基-5-(4-氯苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯甲醛。
Figure BDA00001892012600881
向装配有磁力搅拌棒的20mL小瓶装入(3-(4-氨基-5-(4-氯苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯基)甲醇(145mg,0.4mmol)、三乙胺(0.4mL,2.8mmol)和二甲基亚砜(2mL)。将在DMSO(1.2mL)中三氧化硫·吡啶(200mg,1.3mmol)的溶液加入小瓶，并且将所得的溶液在室温下搅拌1小时。加入盐酸(1M,10mL)并且将溶液搅拌另外10分钟。将所得沉淀通过过滤收集，用水洗涤，并且在真空中干燥，得到作为白色固体的产物(162mg,>99%产率)。
实施例51.(E)-3-(3-(4-氨基-5-(4-氯苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯基)-2-氰基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600882
向装配有磁力搅拌棒的20mL小瓶装入3-(4-氨基-5-(4-氯苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯甲醛(13mg,0.04mmol)、2-氰基乙酰胺(4mg,0.05mmol)、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(5mg,0.03mmol)和四氢呋喃(1mL)。将反应混合物加热至50℃24小时。如通过薄层色谱法测定的，残留起始物料，所以加入乙酸哌啶(5mg,0.03mmol)和2-丙醇(0.5mL)，并且将溶液加热至60℃另外24小时。使所得到溶液在稀释NaHCO3和EtOAc之间分配。使用EtOAc萃取溶液，并且使有机层经硫酸钠干燥、过滤和在减压下浓缩。通过硅胶层析法(洗脱3:1EtOAc/Hex至100%EtOAc)纯化所得的残余物，得到作为白色固体的产物(2mg,13%产率)。精确质量：414.10。M/z测试值：415.1(M+H)+。
实施例52.(E)-3-(3-(4-氨基-5-(4-氯苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯基)-2-氰基-N,N-二甲基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600891
向装配有磁力搅拌棒的20mL小瓶装入3-(4-氨基-5-(4-氯苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯甲醛(35mg,0.10mmol)、N，N’-二甲基-2-氰基乙酰胺(12mg,0.11mmol)、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(5mg,0.03mmol)和2-丙醇(1mL)。将反应混合物加热至60℃24小时。如通过薄层色谱法测定的，仅存在起始物料，所以将溶液加热至80℃另外24小时。将溶液在减压下浓缩并且将所得的残余物再次溶解在DMSO(0.8mL)中且通过RP-HPLC(梯度：在25分钟内20-95%MeCN/水及0.1%TFA，保留时间~6.8分钟)将产物纯化。将含有产物的部分合并并且在减压下去除溶剂，且通过硅胶层析法(用EtOAc洗脱)纯化所得的固体。收集作为白色固体的产物(6.1mg,14%产率)。精确质量：442.13。M/z测试值：443.0(M+H)+。
实施例53.(E)-3-(3-(4-氨基-5-(4-氯苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯基)-2-(吖丁啶-1-羰基)丙烯腈。
Figure BDA00001892012600901
向装配有磁力搅拌棒的20mL小瓶装入3-(4-氨基-5-(4-氯苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯甲醛(15mg,0.04mmol)、3-(吖丁啶-1-基)-3-氧代丙腈(12mg,0.1mmol)、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(5mg,0.03mmol)和2-丙醇(1mL)。将反应混合物加热至60℃24小时。将溶液在减压下浓缩，并且通过硅胶层析法(洗脱100%EtOAc至10%MeOH/EtOAc)纯化所得的残余物。收集作为白色固体的产物(16mg,82%产率)。精确质量：454.13。M/z测试值：455.0(M+H)+。
实施例54.(E)-3-(3-(4-氨基-5-(4-氯苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯基)-2-(吡咯烷-1-羰基)丙烯腈。
向装配有磁力搅拌棒的20mL小瓶装入3-(4-氨基-5-(4-氯苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯甲醛(15mg,0.04mmol)、3-氧代-3-(吡咯烷-1-基)丙腈(14mg,0.1mmol)、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(5mg,0.03mmol)和2-丙醇(1mL)。将反应混合物加热至60℃24小时。将溶液在减压下浓缩，并且通过硅胶层析法(洗脱100%EtOAc至10%MeOH/EtOAc)纯化所得的残余物。收集作为白色固体的产物(12mg,59%产率)。精确质量：468.15。M/z测试值：469.1(M+H)+。
实施例55.(E)-3-(3-(4-氨基-5-(4-氯苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯基)-2-(3-羟基吖丁啶-1-羰基)丙烯腈。
Figure BDA00001892012600911
向装配有磁力搅拌棒的20mL小瓶装入3-(4-氨基-5-(4-氯苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯甲醛(15mg,0.04mmol)、3-(3-羟基吖丁啶-1-基)-3-氧代丙腈(14mg,0.1mmol)、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(5mg,0.03mmol)和2-丙醇(1mL)。将反应混合物加热至60℃24小时。将溶液在减压下浓缩，并通过硅胶层析法(洗脱100%EtOAc至10%MeOH/EtOAc)纯化所得的残余物。收集作为白色固体的产物(13mg,64%产率)。精确质量：470.13。M/z测试值：471.0(M+H)+。
实施例56.(E)-3-(3-(4-氨基-5-(4-氯苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯基)-2-(4-甲基哌嗪-1-羰基)丙烯腈。
Figure BDA00001892012600912
向装配有磁力搅拌棒的20mL小瓶装入3-(4-氨基-5-(4-氯苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯甲醛(16mg,0.05mmol)、3-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-氧代丙腈(17mg,0.11mmol)、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(5mg,0.03mmol)和2-丙醇(1mL)。将反应混合物加热至60℃24小时。如通过薄层色谱法测定的，仅存在起始物料，所以将溶液加热至70℃另外24小时。将溶液在减压下浓缩，并且将所得的残余物再溶解在DMSO(0.8mL)中，并且通过RP-HPLC(梯度：在25分钟内5-80%MeCN/水及0.1%TFA)纯化化合物。收集作为白色固体的产物(3mg,13%产率)。精确质量：497.17。M/z测试值：498.1(M+H)+。
实施例57.2-(3-(羟甲基)苯基氨基)-1-(4-苯氧基苯基)乙酮。
向装配有磁力搅拌棒的100mL圆底烧瓶装入3-氨基苄醇(1.3g,10.6mmol)、碳酸钾(1.4g,10.1mmol)和N，N’-二甲基甲酰胺(15mL)。搅拌浆料，同时分批加入2-溴-4’-氯苯乙酮(3.04g,10.4mmol)。将混合物加热至50℃并搅拌2小时。使反应混合物在EtOAc和水之间分配，并且然后用EtOAc萃取。将有机层合并，经硫酸钠干燥、过滤并在减压下浓缩。通过硅胶层析法(洗脱1:3EtOAc/己烷至1:1EtOAc/己烷)纯化所得的残余物。收集作为白色固体的产物(1.39g,40%产率)。
实施例58.2-氨基-1-(3-(羟甲基)苯基)-4-(4-苯氧基苯基)-1H-吡咯-3-腈。
Figure BDA00001892012600922
向装配有磁力搅拌棒的圆底烧瓶装入2-(3-(羟甲基)苯基氨基)-1-(4-苯氧基苯基)乙酮(1.39g,4.17mmol)、溶解在水(3mL)中的氢氧化钾(85%)(0.8g,12mmol)、丙二腈(0.50g,7.6mmol)和甲醇(15mL)。将混合物加热至80℃2小时。使反应混合物在EtOAc和水之间分配，并且然后用EtOAc萃取。将有机层合并，经硫酸钠干燥、过滤和在减压下浓缩。通过硅胶层析法纯化所得的残余物，得到产物(0.91g,57%产率)。精确质量：381.15M/z测试值：382.1(M+H)+。
实施例59.(3-(4-氨基-5-(4-苯氧基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯基)甲醇。
Figure BDA00001892012600931
向装配有磁力搅拌棒的100mL圆底烧瓶装入2-氨基-1-(3-(羟甲基)苯基)-4-(4-苯氧基苯基)-1H-吡咯-3-腈2-氨基-4-(4-氯苯基)-1-(3-(羟甲基)苯基)-1H-吡咯-3-腈(0.91g,2.7mmol)、原甲酸三乙酯(3mL)和对甲苯磺酸一水合物(10mg)。将溶液加热至100℃1.5小时。使反应混合物在EtOAc和水之间分配。将有机层用5%NaHCO3洗涤，并且然后经硫酸钠干燥、过滤和在减压下浓缩。通过硅胶层析法(洗脱20%至40%EtOAc/Hex)纯化所得的残余物。在减压下浓缩所得油并且在氨/甲醇溶液(7M,10mL)中再溶解，并且将烧瓶紧紧盖上和在室温下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩并且在氨/甲醇溶液(7M,10mL)中再溶解，将烧瓶紧紧盖上和在室温下搅拌另外2小时。将溶液在减压下浓缩并且在甲醇(20mL)中再溶解，并且加入甲醇钠(在甲醇中25%w/v，1mL)。将混合物回流2小时，冷却至室温，并且通过加入盐酸(1M,10mL)猝灭。使溶液在室温下搅拌1小时。通过加入碳酸氢钠中和反应溶液，并且然后用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。使有机层经硫酸钠干燥、过滤和在减压下浓缩。通过硅胶层析法(洗脱100%EtOAc至10%MeOH/EtOAc)纯化所得油，得到作为亮黄色固体的产物(0.38g,38%产率)。
实施例60.3-(4-氨基-5-(4-苯氧基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯甲醛。
Figure BDA00001892012600941
向装配有磁力搅拌棒的20mL小瓶装入(3-(4-氨基-5-(4-苯氧基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯基)甲醇(207mg,0.51mmol)、三乙胺(0.5mL,3.6mmol)和二甲亚砜(2.5mL)。将在DMSO(1.5mL)中三氧化硫·吡啶(245mg,1.6mmol)的溶液加入小瓶中，并且将所得的溶液在室温下搅拌1小时。加入盐酸(1M,5mL)并且将溶液搅拌另外5分钟。使所得的溶液在EtOAc和水之间分配，并且用盐酸(1M,2×)、碳酸氢钠(5%,1×)、水(3×)和盐水(1×)洗涤有机层。然后使有机层经硫酸钠干燥、过滤和在减压下浓缩。通过硅胶层析法(洗脱100%EtOAc至10%MeOH/EtOAc)纯化所得的残余物，得到作为白色固体的产物(141mg,68%产率)。精确质量：406.14.M/z测试值：407.1(M+H)+。
实施例61.合成(E)-3-(3-(4-氨基-5-(4-苯氧基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯基)-2-氰基-丙烯酰胺的一般方法。
实施例61a.(E)-3-(3-(4-氨基-5-(4-苯氧基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯基)-2-氰基-N,N-二甲基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600942
向装配有磁力搅拌棒的20mL小瓶装入3-(4-氨基-5-(4-苯氧基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯甲醛(20mg,0.05mmol)、适当的氰基乙酰胺(0.05mmol)、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(5mg,0.03mmol)和2-丙醇(1mL)。将反应混合物加热至60℃18小时。将溶液在减压下浓缩，并将所得的残余物再溶解在DMSO(0.8mL)中，并且通过RP-HPLC(梯度：在25分钟内20-95%MeCN/水及0.1%TFA)纯化产物。产物是白色固体(4.2mg,17%产率)。精确质量：500.20。M/z测试值：501.3(M+H)+。
实施例61b.(E)-3-(3-(4-氨基-5-(4-苯氧基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯基)-2-(4-甲基哌嗪-1-羰基)丙烯腈。
Figure BDA00001892012600951
采用上述程序，合成命名的化合物。化合物是白色固体(9.2mg,34%产率)。精确质量：555.24。M/z测试值：556.1(M+H)+。
实施例61c.(E)-3-(3-(4-氨基-5-(4-苯氧基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯基)-2-(3-羟基吖丁啶-1-羰基)丙烯腈。
Figure BDA00001892012600952
采用上述程序，合成命名的化合物。产物是白色固体(9.7mg,37%产率)。精确质量：528.19。M/z测试值：529.2(M+H)+。
实施例61d.(E)-3-(3-(4-氨基-5-(4-苯氧基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯基)-2-氰基丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600961
采用上述程序，合成命名的化合物。化合物是淡黄色固体(6.8mg,29%产率)。精确质量：472.16。M/z测试值：473.0(M+H)+。
实施例62.2-氰基-N-(2-羟乙基)乙酰胺。
Figure BDA00001892012600962
向装配有磁力搅拌棒的100mL圆底烧瓶装入氰基乙酸甲酯(4.94g,49.9mmol)和乙醇胺(3.01g,49.8mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，在此时将溶液在减压下浓缩并且在真空中干燥，得到作为白色固体的产物(6.91g,>99%产率)。
实施例63.(E)-3-(3-(4-氨基-5-(4-苯氧基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯基)-2-氰基-N-(2-羟乙基)丙烯酰胺。
Figure BDA00001892012600963
向装配有磁力搅拌棒的4mL小瓶装入3-(4-氨基-5-(4-苯氧基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯甲醛(9mg,0.02mmol)、2-氰基-N-(2-羟乙基)乙酰胺(4mg,0.03mmol)、乙酸哌啶(1mg,0.01mmol)和2-丙醇(0.5mL)。将反应混合物加热至60℃24小时。将溶液在减压下浓缩，并且通过硅胶层析法(洗脱100%EtOAc至10%MeOH/EtOAc)纯化所得的残余物，得到产物，其通过RP-HPLC(梯度：在25分钟内20-95%MeCN/水及0.1%TFA)进一步纯化，得到作为白色固体的产物(3.1mg,27%产率)。精确质量：516.19。M/z测试值：517.0(M+H)+。
实施例64.抑制常数的确定。
方法：RSK2CTD和His6-ERK2如所述(Cohen等,Science,308:1318)表达和纯化。如之前所述，RSK2CTD的C436V突变体通过Quikchange诱变(Stratagene)产生，并且在激酶活性测定中区别于WT RSK2CTD。WT和C436V RSK2CTD(10μM)通过在20mM HEPES[pH 8.0]、10mM MgCl2、2.5mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)、0.2mg/mL BSA和200μM ATP中的His6-ERK2(10μM)来在22°C活化30分钟。将在20mM HEPES[pH 8.0]、10mM MgCl2、2.5mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)、0.25mg/mL BSA和100μM ATP中活化的RSK2CTD(5nM)与抑制剂(10倍浓度，一式两份)一起预温育30分钟。通过加入5μCi的[γ-32P]ATP(6000Ci/mmol,NEN)和167μM肽底物(RRQLFRGFSFVAK)(SEQ ID NO:1)引发激酶反应，并且在室温下进行30分钟。通过将5μL的各反应点至已使用在0.1%H3PO4中1M NaCl预洗涤的硝化纤维的干燥板上来测定激酶活性。将硝化纤维板用1%AcOH溶液洗涤一次，并且用在0.1%H3PO4中1M NaCl的溶液洗涤两次(每次洗涤5-10分钟)。将干燥的斑点暴露于储存磷光体屏30分钟并通过Typhoon成像仪(GELife Sciences)扫描。使用SPOT程序(Knight,Z.等Nature Protocols,2:2459-66)来定量数据，并且使用GraphPad Prism 4.0软件来确定IC50值。
结果：表1提供亲电性吡咯并[2,3-d]嘧啶1-8对WT RSK2和C436VRSK2C-末端激酶结构域(CTD)的半最大抑制浓度(以μM表示的IC50)。还测试了化合物4-6在10mM还原的谷胱甘肽(GSH)存在下的RSK2CTD抑制。尽管与氰基丙烯酸酯/氰基丙烯酰胺4-6可逆地反应(通过在350-400nm下UV/可见光谱监测与化合物4-6的GSH反应)以及存在一百万倍浓度的RSK2CTD，但是谷胱甘肽对于4-6的抑制效能没有影响。与在Cys436和4-8的氰基丙烯酸酯和氰基丙烯酰胺部分的亲电性β-碳之间的共价加合物的形成一致，半胱氨酸-436至缬氨酸(C436V)的突变导致>1000-倍的抑制效能损失。最终，与化合物1-3相比，氰基丙烯酸酯和氰基丙烯酰胺4-8显著更有效，这是基于更常规的迈克尔受体(乙烯基酮、丙烯酸酯、丙烯腈)。N/d，未测定。
表1.选择的化合物和RSK2种类的IC50值。
IC50(μM)
Figure BDA00001892012600981
Figure BDA00001892012600982
实施例65.RSK2CTD与化合物1-8反应的质谱法
方法：使RSK2CTD(人RSK2,399-740)在大肠杆菌(E.coli)中表达为在His6-标记的融合蛋白并且通过Ni/NTA亲和色谱法纯化，随后进行His6-标记的分裂，并且通过大小排阻色谱法进一步纯化。将RSK2CTD(5μM)与指定的化合物(25μM，5当量)在缓冲液(25mM HEPES[pH 8.0]、100mM NaCl、10mM MgCl2)中在室温下温育1小时。通过加入等体积的0.4%甲酸终止反应，并且通过液相色谱法(Microtrap C18蛋白柱[Michrom Bioresources]、5%MeCN、0.2%甲酸，0.25mL/分钟；用95%MeCN、0.2%甲酸洗脱)和在线ESI质谱法(LCT Premier,Waters)分析样品。使用MassLynx重叠合法软件来测定RSK2CTD和亲电性吡咯并[2,3-d]嘧啶加合物的分子量，并且以柱状图形式示出。
结果：如在图1A和图1B中所示，尽管作为RSK2抑制剂的较高效能，但氰基丙烯酸酯和氰基丙烯酰胺4-8没有不可逆性地修饰RSK2C-末端激酶结构域(CTD)，如通过高分辨率质谱法分析所揭示的。吡咯并[2,3-d]嘧啶1-3含有常规的亲电子“弹头(warhead)”，并且如预期地，与RSK2形成不可逆性的1:1加合物。该结论由在质谱中形成对应RSK2CTD的分子量加上亲电子化合物的分子量的新峰来支持(图1A)。注意由于丙烯酸酯/丙烯腈弹头的较低的固有亲电性，相对应烯酮1，通过丙烯酸酯2和丙烯腈3的RSK2CTD修饰慢一些。
如通过对应于未修饰的RSK2CTD的质谱中单峰的存在所示的，与化合物1-3不同，氰基丙烯酸酯和氰基丙烯酰胺抑制剂4-8不与RSK2CTD形成不可逆性加合物。尽管缺乏不可逆性RSK2修饰，化合物4-8是比不可逆性抑制剂1-3显著更有效的RSK2激酶活性抑制剂(表1)。RSK2(C436V)的Cys436Val突变体对化合物4-8的敏感性低~1000-倍(表1)，表明强效抑制需要Cys436。总之，这些数据表明：所有均含有氰基丙烯酸酯或氰基丙烯酰胺亲电体的化合物4-8通过在氰基丙烯酸酯/氰基丙烯酰胺部分的亲电子β-碳和RSK2的Cys436之间形成可逆性共价键来抑制RSK2激酶活性。对于该类亲电体(氰基丙烯酸酯和氰基丙烯酰胺)抑制的可逆性共价机制的另外的证据提供如下。
实施例66.在透析时RSK2CTD活性的恢复
方法：将指定的吡咯并[2,3-d]嘧啶(1μM)加入在含有20mM HEPES[pH8.0]、10mM MgCl2、2.5mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)、0.25mg/mL BSA以及100μM ATP的缓冲液中RSK2CTD(50nM，用1当量ERK2预活化)的溶液。在室温下60分钟后，将反应转移至透析盒(0.1-0.5mL Slide-A-Lyzer,MWCO10kDa,Pierce)，并且在4℃下针对2L缓冲液(20mM Hepes[pH8.0]、10mMMgCl2、1mM DTT)透析。在2小时后更换透析缓冲液，并且然后每24小时进行更换直至实验结束。每24小时从透析盒中取出等分试样，在液氮中闪冻，并且随后一式三份地分析RSK2激酶活性。各样品的激酶活性对该时间点的DMSO对照进行归一化并且表示为平均值±SD。
结果：如图2中所示，在透析时RSK2CTD激酶活性从由吡咯并[2,3-d]嘧啶6和7的抑制中恢复，表明6和7是可逆性抑制剂。在图2中的数据显示：在4℃大规模(extensive)透析时，RSK2激酶活性以时间依赖性方式从由过量(20当量,1.0μM)的氰基丙烯酰胺6(~60%恢复)和7(~25%恢复)的抑制中恢复。因此，氰基丙烯酰胺6和7是在这些条件(在4°C透析)下分别具有~3天和>4天的离解半衰期的RSK2的缓慢离解、可逆性抑制剂。注意离解在室温下更快并且在不可逆性竞争物的存在下进行至完成(参见图3)。与以氰基丙烯酰胺6和7观察到的激酶活性部分恢复相反，在4天的透析过程中RSK2CTD保持被烯酮1和氟甲基酮9完全抑制，进一步证实这些化合物是不可逆性抑制剂。这些结果与LCMS数据一致，其显示烯酮1(图1A)和氟甲基酮9(图3)与RSK2不可逆地反应，而氰基丙烯酸酯和氰基丙烯酰胺没有形成不可逆性RSK2加合物。氰基丙烯酸酯-和氰基丙烯酰胺-取代的吡咯并[2,3-d]嘧啶与RSK2形成缓慢离解、完全可逆性复合物的进一步证明提供在图3中。
实施例67.可逆性共价抑制剂的离解动力学
方法：将在20mM HEPES[pH 8.0]、10mM MgCl2、100mM NaCl、2.5mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)和0.2mg/mL BSA中的RSK2CTD(5μM)与10μM的抑制剂1、4-7(或DMSO对照)在室温下预温育60分钟。然后加入FMK9(100μM)，并且在不同时间点(0.5-1500分钟)取出等分试样，并且通过与等体积的0.4%甲酸混合立即猝灭。如图1中所述，使用LCT Premier质谱仪和MassLynx重叠合法软件通过LCMS来分析样品。将在各时间点下对应于空RSK2CTD(在如下的情况下：用4-7预处理；用烯酮1预处理产生预期的质量位移，其在加入FMK后不改变)和FMK-修饰的RSK2CTD的峰积分，以及将FMK加合物百分比绘图为时间的函数(在图3的左侧的图中表示为“离解%”)。图3的右侧的图显示缺乏任何竞争物下的FMK标记动力学。动力学数据(%FMK加合物对时间)拟合至单指数(single exponential)(PRISM 4.0)，得到示出在表中的离解半衰期。对照实验显示在这些条件下C436V RSK2未被FMK 9修饰。
结果：如图3中所示，如通过使用氟甲基酮9的竞争性标记所测量的，氰基丙烯酸酯/氰基丙烯酰胺4-7从完整、折叠的RSK2CTD中以数小时的半衰期离解。如通过RSK2CTD的LCMS分析(图3，左上图)所揭示的，大的摩尔过量的氟甲基酮9(100μM，20当量；在图3中“FMK”)快速且不可逆地修饰RSK2CTD(t1<2分钟)。相反，当首先用氰基丙烯酸酯/氰基丙烯酰胺4-7(2.0当量)处理RSK2CTD时，由随后使用FMK 9(100μM，20当量)处理导致的修饰要慢很多，半衰期(t1/2)为42-245分钟(图3，右上图)。因为通过FMK 9的apo-RSK2CTD的修饰在小于2分钟内发生，所以观察到的预结合至化合物4-7的RSK2的FMK修饰速率大约等于预结合的氰基丙烯酸酯/氰基丙烯酰胺的离解速率。甲基乙烯酮1(常规的迈克尔受体)在这些条件下不离解，并且即使在24小时后未观察到FMK标记(图3)。这些数据与图2中透析实验一致并且揭示氰基丙烯酸酯/氰基丙烯酰胺4-7以1-4小时的离解半衰期从完整的、功能性RSK2CTD中缓慢但完全地离解。数据进一步揭示通过修饰酯和酰胺取代基可调整氰基丙烯酸酯/氰基丙烯酰胺抑制剂的“脱离速率(off-rate)”。N-异丙基氰基丙烯酰胺具有最低的脱离速率，这与体外和在基于细胞的测定中的强效RSK2抑制活性一致(参见表1和图6)。
实施例68.Cys436和化合物7之间的共价键形成
方法：向在磷酸盐-缓冲盐水(PBS)中氰基丙烯酰胺7(1.0当量,100-200μM)的溶液中加入WT RSK2CTD、C436V RSK2CTD(1.5当量)或单独的缓冲液。在室温下10分钟后，获得UV/可见光吸收光谱(NanoDrop 1000分光光度计)。将SDS(2%的最终浓度)、胍(最终浓度3M,pH8)或蛋白酶K(基于RSK2CTD的0.02当量)加入，并且在室温下1分钟(SDS，盐酸胍)或在37°C下3小时(蛋白酶K)后记录UV/可见光吸收光谱。来自蛋白酶K和SDS加入实验的光谱分别显示在中图和下图中。在各实验中，在400nm下的吸光度值对在单独的缓冲液中氰基丙烯酰胺7的值归一化并且绘制为条形图。对照实验显示SDS、胍和蛋白酶K都没有影响氰基丙烯酰胺7在400nm下的吸收光谱。
结果：如在图4中所示，在RSK2变性或蛋白水解消化时，Cys436和氰基丙烯酰胺7之间的共价键在数秒内逆转。通过UV/可见光吸收光谱法，我们监测到在RSK2和氰基丙烯酰胺7之间的共价键形成和逆转。如对于与杂芳族体系共轭的氰基丙烯酰胺部分所预期的，氰基丙烯酰胺7吸收具有在~400nm的峰的可见光(图4，中图和下图)。加入过量RSK2CTD(1.5当量)至氰基丙烯酰胺7导致400nm峰的完全消失，表明通过Cys436的亲核攻击破坏氰基丙烯酰胺生色团。相反，加入携带C436V突变的RSK2CTD对于氰基丙烯酰胺7的吸收光谱没有影响(图4，条形图)。该对照进一步证实我们如下的解释：400nm峰的丧失起因于在RSK2的Cys436和化合物7的氰基丙烯酰胺部分的亲电子β-碳之间共价键的形成。
我们使用三种独立的方法以破坏结合到氰基丙烯酰胺7的RSK2激酶结构域的折叠状态：(1)0.02当量蛋白酶K(“Prot K”)，一种将折叠的蛋白质消化为小肽的非特异性蛋白酶；(2)2%十二烷基硫酸钠(“SDS”)，一种充分表征的蛋质变性洗涤剂；以及(3)3M盐酸胍(“Guan”)，一种破坏大部分蛋白质的天然三维折叠的离液剂。所有三种蛋白质变性剂导致400nm吸收峰的再现，表明Cys436和氰基丙烯酰胺7之间的共价键已破坏。共价键逆转在数秒内发生，与RSK2变性(通过SDS和盐酸胍)或蛋白水解消化(用0.02当量蛋白酶K的完全消化在~3小时内进行)相伴随。对于使用蛋白酶K和SDS的实验分别在中图和下图中显示吸收光谱(因为使用不同浓度的氰基丙烯酰胺7，因此在两个实验中的绝对吸光度值是不同的)。将所有三种情况下的吸光度值对在单独的缓冲液中氰基丙烯酰胺7的吸光度归一化，并且显示在条形图中。图5显示源于类似实验LCMS色谱，提供蛋白质变性剂加入在氰基丙烯酰胺7和RSK2CTD之间形成的共价复合物导致氰基丙烯酰胺7的定量释放。
我们的数据表明氰基丙烯酰胺抑制剂不太可能与细胞蛋白质形成永久的共价加合物，因为一旦蛋白解折叠和/或被蛋白水解消化(用于引起延迟免疫反应的可能的前提条件)，共价键变得动力学和热力学不稳定并且快速离解。我们以在氰基丙烯酰胺7和RSK2CTD之间的高亲和性(纳摩尔至皮摩尔)复合物证实该行为，其中离解半衰期从折叠状态的~3小时变化至在激酶结构域变性时的小于1分钟。与这些观察一致，谷胱甘肽(含有大量的半胱氨酸的肽)与化合物4-8(通过UV/可见光光谱显示)形成快速离解的共价加合物，如通过(1)在稀释时氰基丙烯酸酯/氰基丙烯酰胺生色团的快速恢复、以及(2)在10mM谷胱甘肽的存在下未受干扰的RSK2抑制效能所示的(表1)。据我们所知，蛋白硫醇/亲电体加合物的共价键离解速率对于蛋白质折叠状态的依赖性尚未被描述过。
实施例69.在RSK2CTD/化合物7复合物变性后化合物7的恢复。
方法：在缺乏或存在RSK2CTD(300μM)下将氰基丙烯酰胺7(250μM)以50μL的总体积温育10分钟。加入盐酸胍(50μL,6M,pH 8)并且将内容物温和地混合1分钟，此后加入乙腈至最终浓度50%。将溶液过滤(0.2μm孔尺寸)和通过LCMS(20μL注入，Waters XTerra MS C18柱，在20分钟内5-70%MeCN/水+0.1%甲酸；Waters 2695Alliance Separations Module,WatersMicromass ZQ质谱仪)分析。
结果：如在图5A和图5B中所示，与图4中光谱数据一致，LCMS分析揭示在使用3M胍的RSK2CTD/氰基丙烯酰胺7复合物变性后的氰基丙烯酰胺7的定量恢复。第一色谱(图5A)(λ=350nm)显示溶解在缓冲液中的氰基丙烯酰胺7及3M盐酸胍。第二色谱(图5B)(λ=350nm)显示在使用3M盐酸胍处理RSK2CTD/氰基丙烯酰胺7复合物后纯氰基丙烯酰胺7的恢复。在两样品中都观察到分别对应于氰基丙烯酰胺7的E-和Z-异构体的两主峰。在对照和RSK2CTD-处理的样品中峰面积类似，表明在用胍变性后氰基丙烯酰胺7的定量恢复。各峰的MS分析证明其为E-或Z-氰基丙烯酰胺7的身份(计算的MW，418.2；观察的[M+H],419.1)。
实施例70.Ser386的RSK2自身磷酸化抑制
方法：根据生产商方案使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用编码HA-标记的RSK2的pMT2表达载体转染在75cm2烧瓶(~80%汇合)中的HEK-293细胞。在12小时后，使细胞受胰蛋白酶作用，并以600,000细胞/孔(于10%血清的DMEM中)接种至6-孔板。在另外的16小时后，以4小时去掉细胞的血清，然后在无血清DMEM中用指定浓度的抑制剂处理2小时。在抑制剂处理后，用豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(PMA)(100ng/ml)刺激细胞30分钟，然后用2mL冷PBS洗涤，并且在-80°C冻在板上。将细胞解冻并且刮至具有蛋白酶(Complete,Roche)和磷酸酶(Cocktails 1和2,Sigma-Aldrich)抑制剂的80μL的溶解(lysis)缓冲液(20mM Hepes pH 7.9、450mM NaCl、25%甘油、3mM MgCl2、0.5mM EDTA)中。通过离心分离来清除溶解产物(lysate)并且通过Bradford测定量化来归一化。将Laemmli样品缓冲液加入溶解产物中，并且将蛋白通过10%SDS-PAGE分离且通过使用磷-Ser386RSK2(1:500稀释，兔mAb，细胞信号#9335)和抗-HA(1:1000稀释，12CA5小鼠单克隆，Roche)抗体的蛋白质印迹来分析。在LI-COR Odyssey成像系统(LI-COR Biosciences)中记录图像，并使用LI-COR软件对带强度积分。对于各条件，计算磷-Ser386信号与HA-RSK2信号的比率并表示为DMSO对照值(+PMA)的百分比。这些数据显示在图中。
结果：如图6中所示，氰基丙烯酸酯5和氰基丙烯酰胺6与7抑制在哺乳动物细胞中Ser386的RSK2自身磷酸化。注意在所有测试的抑制剂中N-异丙基氰基丙烯酰胺7是最有效的(IC50<30nM)，而氰基丙烯酰胺6具有弱的活性(IC50~1000nM)。数据显示氰基丙烯酸酯和氰基丙烯酰胺抑制剂为细胞渗透性的并且对于与高细胞内浓度的ATP和谷胱甘肽竞争是足够有效的。
实施例71.对于抑制治疗相关蛋白质的活化烯烃的一般效用的测定
方法：对于RSK2激酶测定，参见以上实施例64。如前所述(Knapp S.等J.BiolChem.,2007,282:6833-6842)表达和纯化全长人T175A NEK2(称为“NEK2”)。NEK2的C22V突变体通过Quikchange诱变(Stratagene)产生，并且在激酶活性测定中区别于NEK2。将在20mM Hepes,pH 7.6、10mMMgCl2、1mM EDTA、0.2mg/mLBSA和100μM ATP中的NEK2激酶(60nM)与抑制剂(8-10倍浓度，一式两份)在室温下预温育30分钟。通过加入0.4μCi/μL的γ-32P-ATP(6000Ci/mmol,NEN)和2.37mg/mL β-酪蛋白(Sigma)引发激酶反应，并在室温下温育30分钟。
将在20mM Hepes,pH 7.6、10mM MgCl2、1mMEDTA、0.2mg/mL BSA和100μM ATP中的人PLK1(Millipore,目录号14-777M)(7.2nM)与抑制剂(8-10倍浓度，一式两份)在室温下预温育30分钟。通过加入0.4μCi/μL的γ-32P-ATP(6000Ci/mmol,NEN)和0.5mg/mL去磷酸化的α-酪蛋白(Sigma)引发激酶反应，并且在室温下温育30分钟。通过将5μL的各反应点至使用在0.1%H3PO4中1M NaCl预洗涤的硝化纤维干燥板上来测定激酶活性。在点上各激酶反应后，使用1%AcOH溶液洗涤硝化纤维板一次。通过将5μL的各反应点至已使用在0.1%H3PO4中1M NaCl预洗涤的硝化纤维干燥板上来测定激酶活性。将硝化纤维板使用1%AcOH溶液洗涤一次，并且使用在0.1%H3PO4的1M NaCl溶液洗涤两次(每次洗涤5-10分钟)。将干燥的斑点暴露于储存磷光体屏30分钟并通过Typhoon成像仪(GE Life Sciences)扫描。使用SPOT程序(Knight,Z.等Nature Protocols,2:2459-66)来定量数据，并且使用GraphPad Prism 4.0软件来测定IC50值。
结果：为了测试包括氰基丙烯酰胺的活化烯烃(“迈克尔受体”)的一般效用，如抑制治疗相关蛋白的半胱氨酸靶向部分，我们合成被通常在激酶抑制剂药物中发现的杂环(例如，吖吲哚、吲唑、吡啶、吡唑、联芳基化合物)取代的一组氰基丙烯酰胺。我们还合成在携带腈的碳上未取代的丙烯腈(表2a，条目28和30)或在携带腈的碳上被非甲酰胺吸电子基团取代的丙烯腈(表2a，条目19-21、31、32)。评估这些新型化合物体外抑制下面激酶的能力：WTRSK2、C436V RSK2、WT NEK2、C22V NEK2和/或PLK1。注意这些激酶的野生型形式在ATP结合位点的类似位置处，对于“富甘氨酸”环的紧接C-末端，都具有半胱氨酸。
从这些数据，我们得出结论：(1)改变杂环的结构显著影响氰基丙烯酰胺和丙烯腈的激酶抑制效能和选择性。因此，甚至这些相对简单“片段”(MW<300)显示急剧的结构-活性关系。(2)在携带腈的碳上被第二吸电子基团(例如，甲酰胺)取代的丙烯腈比在携带腈的碳上含有氢的简单丙烯腈更有效(在表2a中比较条目30对31和22；在表1中条目3对4-8)。(3)在测试时，RSK2和NEK2的Cys至Val突变体比WT酶的敏感性差10-100倍，与分别涉及RSK2和NEK2的Cys436和Cys22的共价修饰的抑制机制一致。该概念进一步得到来自表2a的结合至两种不同氰基丙烯酰胺片段的RSK2的x-射线共结晶结构的支持。所述结构明确显示RSK2的Cys436与氰基丙烯酰胺部分的亲电子β-碳形成共价键(参见图7)。
表2a.IC50值(μM)。
Figure BDA00001892012601071
Figure BDA00001892012601081
Figure BDA00001892012601091
表2b.化合物的IC50值(μM)。
Figure BDA00001892012601101
Figure BDA00001892012601111
表2c.化合物的IC50值(μM)。
Figure BDA00001892012601112
Figure BDA00001892012601121
Figure BDA00001892012601131
表2d.化合物的IC50值(μM)。
Figure BDA00001892012601132
Figure BDA00001892012601141
Figure BDA00001892012601151
表2e.化合物的IC50值(μM)。
实施例72.在RSK2CTD ATP位点的X-射线结晶学和结合模式
方法：如上所述表达和纯化RSK2CTD(参见图1A和图1B的描述)并且在20mM HEPES pH 8.0、50mM NaCl中浓缩至20mg/ml。然后将氰基丙烯酰胺6、12或15(1μl的在100%DMSO中10mM储备溶液)加入到19μl的RSK2CTD，得到在5%DMSO中的19mg/ml蛋白质和0.5mM抑制剂。然后通过在20°C下混合1μl的蛋白质/抑制剂复合物与1μl的由0.1MHEPES pH 7.0、10%PEG3350、50mM硫酸铵组成的沉淀剂溶液使复合物的结晶以悬滴生长。典型地，结晶在1-2天内生长至最大尺寸。然后将结晶转移至冷冻保护剂溶液(LV Cryo Oil,Mitegen LLC,Ithaca,NY)并且在100°K下液氮流中冷冻。所述结晶属于空间群P41212，晶胞参数a=47.5
Figure BDA00001892012601163
b=47.5
Figure BDA00001892012601164
c=291.5
Figure BDA00001892012601165
在Lawrence Berkeley National Laboratory的Advanced Light Source的8.2.1束线上收集所有数据集。将衍射数据使用程序XDS(Kabsh,W.1993)积分和换算。RSK2CTD/抑制剂复合物的结构通过如下解出(solve)：使用数据进行分子置换为2.4
Figure BDA00001892012601171
(氰基丙烯酰胺6)、2.1(氰基丙烯酰胺12)和2.1
Figure BDA00001892012601173
(氰基丙烯酰胺15)以及蛋白质数据库(Protein Data Bank)结构2qr8作为程序MolRep(Vagin等,1997)的搜索模型，随后进行若干轮使用程序COOT(EmsleyP,Cowtan K.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.2004)和REFMAC5(GN,Vagin AA,Dodson EJ.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.1997)的手动重建和限制性精修(restrained refinement)。
当附接至三种不同的激酶抑制剂骨架时，氰基丙烯酰胺结合到RSK2CTD的ATP结合袋(binding pocket)并且与Cys-436形成共价键。我们解出结合到三种氰基丙烯酰胺抑制剂的RSK2CTD的共结晶结构：吡咯并-嘧啶6(表1)、吖吲哚12(表2)和吲唑15(表2)。这些化合物是RSK2激酶活性的强效抑制剂，并且Cys-436至Val的突变赋予显著抗性(表1和表2)。6、12和15的共结晶结构揭示在激酶/抑制剂共结晶结构中典型地观察到的非共价相互作用；例如，在抑制剂中杂原子与RSK2Met-496的骨架NH之间的氢键。对于各氰基丙烯酰胺抑制剂，Cys-436的硫醇与氰基丙烯酰胺部分的β-碳之间的共价键是清晰可见的(图7，使用PyMol从结构坐标文件产生)。除了在表2中示出的数据，在图7中显示的共结晶结构支持以下概念：当在携带腈的碳上用吸电子基团(例如，甲酰胺)取代时，丙烯腈是“便携式”半胱氨酸-靶向部分，其可附接到不同激酶结合骨架，以实现进行与活性位点半胱氨酸的可逆性共价键的强效抑制剂(纳摩尔亲和性)。吲唑化合物40与RSK2的Cys-436的结合示出在图8的上图中。
实施例73.cSrc的克隆、蛋白质表达、纯化和结晶
如所述(Blair等,Nat.Chem.Biol.,2007)，表达和纯化鸡cSrc(S345C突变体)的激酶结构域并且在20mM Tris pH 7.5、100mM NaCl、1mM DTT、5%甘油中浓缩至3mg/ml。将蛋白质(3mg/mL)与具有2%DMSO的抑制剂(200μM)在冰上温育10分钟。然后通过在20°C下混合1μl的蛋白质/抑制剂-复合物与1μl的由100mM MES、50mM NaOAc、2%PEG(4000),pH 6.5组成的沉淀剂溶液使复合物的结晶以悬滴生长。典型地，结晶在1-2天作为薄板生长至最大尺寸。然后将结晶转移至由用25%甘油补充的母液组成的冷冻保护剂溶液中，并且在100K下液氮流中冷冻。
数据收集和结构解析。结晶属于空间群P1，晶胞参数a=42.0
Figure BDA00001892012601174
b=63.2
Figure BDA00001892012601181
c=73.1α=100.9°；β=90.8°；γ=90.0°。在Berkeley National Laboratory的Advanced Light Source的8.2.1束线上收集所有数据集。将衍射数据使用程序XDS(Kabsh,W.1993)积分和换算。cSRC/抑制剂复合物的结构通过如下解出：使用数据进行分子置换为2.3
Figure BDA00001892012601183
和结构3en4作为程序MolRep中的搜索模型，随后进行若干轮使用程序COOT和REFMAC5的手动重建和限制性精修。吡咯并嘧啶化合物55与cSrc的Cys-345的结合示出在图8的下图中。
实施例74.cSrc激酶测定的一般程序
如所述(Blair等,Nat.Chem.Biol.,2007)，表达和纯化野生型和S345C突变体cSrc激酶结构域。将纯化的cSrc激酶(2nM最终浓度)与抑制剂(6或10倍浓度，一式两份)在具有200μM ATP和1mg/mL BSA的激酶缓冲液(20mM HEPES pH 7.4、10mM MgCl2、0.2mM EDTA)中在室温下预温育30分钟。通过加入0.05μCi/μL的γ-32P-ATP(6000Ci/mmol,NEN)和0.1mM底物肽(LEIYGEFKKK)(SEQ ID NO:2)引发激酶反应，并且在室温下温育30分钟。通过将6μL的各反应点至磷酸纤维素板上来测定激酶活性。将各斑点使用1%AcOH溶液洗涤一次，使用0.1%H3PO4溶液洗涤两次，并且使用MeOH洗涤一次(每次洗涤5-10分钟)。将干燥的斑点暴露与储存磷光体屏30分钟并且通过Typhoon成像仪(GE Life Sciences)扫描。使用ImageQuant(v.5.2,Molecular Dynamics)来定量数据并且使用GraphPad Prism 4.0软件绘图。
实施例75.2-氰基-N-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)-3-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吲唑-5-基)丙烯酰胺
Figure BDA00001892012601184
向在THF(1mL)中3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吲唑-5-甲醛(48mg,0.16mmol)和2-氰基-N-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)乙酰胺(23mg,0.16mmol)的溶液中加入DBU(16μL,0.16mmol)。在1小时后无色溶液缓慢变成鲜橙色。将反应混合物浓缩并且通过使用EtOAc洗脱的制备型TLC纯化，得到44mg(61%)作为亮黄色固体的2-氰基-N-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)-3-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吲唑-5-基)丙烯酰胺。精确质量：450.19；M/z测试值：451.23(M+H)+。
实施例76.3-(吡啶-3-基)-1H-吲唑-5-甲醛
Figure BDA00001892012601191
将3-碘-5-甲酰吲唑(206mg,0.735mmol)、吡啶-3-基硼酸(106mg,0.882mmol)和K2CO3(330mg,2.21mmol)在5:1二噁烷:H2O(2mL)中合并并且使用鼓泡氩气进行脱气20分钟。加入Pd(PPh3)4(91mg,0.074mmol)，并且再次使用氩气吹扫反应容器。然后在130℃下对反应进行微波处理45分钟。用EtOAc(20mL)将粗反应混合物稀释，并且用1M HCl(20mL)洗涤两次。用1MNaOH中和合并的水性洗涤液并用三部分EtOAc(75mL)来萃取，将其在减压下浓缩，得到42mg(26%)作为黄色固体的3-(吡啶-3-基)-1H-吲唑-5-甲醛。
实施例77.2-氰基-3-(3-(吡啶-3-基)-1H-吲唑-5-基)丙烯酰胺
Figure BDA00001892012601192
向在THF(1mL)中3-(吡啶-3-基)-1H-吲唑-5-甲醛(30mg,0.134mmol)和2-氰基-N-甲基乙酰胺(12mg,0.134mmol)的溶液中加入DBU(13μL,0.134mmol)。在加入DBU时，无色浆料缓慢变成亮黄色且可溶的。当所有固体溶解时，将粗反应混合物浓缩并且通过使用95:5:1EtOAc:MeOH:TEA洗脱的制备型TLC纯化，得到7mg(18%)作为亮黄色固体的2-氰基-3-(3-(吡啶-3-基)-1H-吲唑-5-基)丙烯酰胺。精确质量：289.10,M/z测试值：290.01(M+H)+。
实施例78.(E)-3-(3-(4-氨基-5-(4-苯氧基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯基)-2-氰基-N-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)丙烯酰胺
向装配有磁力搅拌棒的4mL小瓶装入3-(4-氨基-5-(4-苯氧基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)苯甲醛(5mg，0.01mmol)、2-氰基-N-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)乙酰胺(5mg,0.03mmol)、乙酸哌啶(2mg,0.02mmol)和2-丙醇(0.5mL)。将反应混合物加热至60℃24小时。将溶液在减压下浓缩，并且通过硅胶层析法(洗脱100%EtOAc至10%MeOH/EtOAc)纯化所得的残余物，得到产物，其通过RP-HPLC(梯度：在25分钟内20-95%MeCN/水及0.1%TFA)进一步纯化，得到作为白色固体的产物(1.5mg,22%产率)。精确质量：544.22。M/z测试值：545.0(M+H)+。
实施例79.4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛
Figure BDA00001892012601202
向在二氯甲烷(12mL)中4-二-叔丁基氧基羰基氨基-7-(3-叔丁基二甲基甲硅烷氧基丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛(1.43g,2.28mmol)的溶液中加入TFA(5mL)。使反应混合物在环境温度下维持12小时，然后在减压下浓缩。将残余物再溶解在THF(12mL)中，然后加入1M水性HCl(4mL)。将反应混合物在环境温度下搅拌24小时，然后用EtOAc(50mL)和饱和水性NaHCO3(50mL)稀释。将相分离并且用EtOAc(50mL)来萃取水相。使用盐水(50mL)洗涤合并的有机萃取物，然后在减压下浓缩。使残余物与苯(50mL)共沸，并且在真空中干燥，得到0.99g的脱保护的醛(湿)，其在没有进一步纯化下使用。
实施例80.氰基乙酰胺和杂芳基乙腈的合成
如以前所述合成3-吗啉代-3-氧代丙腈、2-氰基-N-(2-(二甲基氨基)乙基)-N-甲基乙酰胺(Wang,K.;Nguyen,K.;Huang,Y.;
Figure BDA00001892012601211
A.J.Comb.Chem.2009,11,920-927)和2-氰基-N-(1,3-二羟基-2-甲基丙-2-基)乙酰胺(Santilli,A.A.;Osdene,T.S.J.Org.Chem.1964,29,2066-2068)。
1.4-氰基甲基吡啶-1-氧化物
Figure BDA00001892012601212
向在氯仿(12mL)中4-氰基甲基吡啶盐酸盐(689.2mg,4.458mmol)的浆料中加入在H2O(2mL)中的NaHCO3(538mg,5.35mmol,1.4当量)，引起冒泡。一旦气体产生减少，一次性加入间氯过苯甲酸(1.25g,6.69mmol,1.6当量)。将反应混合物在环境温度下搅拌24小时，然后使用硅胶浓缩和通过硅胶层析法(在CH2Cl2中12.5至25%IPA)纯化，得到129mg(22%产率)作为红色半固体的N-氧化物。
2.2-氰基-N-(2-羟乙基)-N-甲基乙酰胺
Figure BDA00001892012601213
向在乙醇(12mL)中氰基乙酸甲酯(6.27g,63.3mmol)的溶液中加入2-(甲基氨基)乙醇(5.6mL,69.6mmol,1.1当量)。将反应混合物加热至70℃4小时，然后冷却至环境温度，并且在减压下浓缩。粗残余物的硅胶层析(EtOAc)，得到8.76g(97%产率)作为琥珀色油的2-氰基-N-(2-羟乙基)-N-甲基乙酰胺。
3.N-叔丁基-2-氰基乙酰胺
向冷却至0℃的CH2Cl2(20mL)中叔丁胺(3.7mL,35.4mmol,2.0当量)和碳酸钠(3.75g,35.4mmol,2.0当量)的浆料中在5分钟内加入在CH2Cl2(10mL)中氯乙酰氯(1.4mL,17.7mmol,1.0当量)的溶液。一旦加入完成，使反应混合物加温至环境温度并且搅拌45分钟，然后过滤。使用CH2Cl2(50mL)洗涤滤饼。将合并的滤液和洗涤液浓缩，得到作为白色固体的中间体叔丁基-2-氯乙酰胺，将其在没有任何进一步纯化下继续进行下一步。将叔丁基-2-氯乙酰胺溶解在DMF(12mL)中，并且加入2.31g(35.4mmol,2.0当量)的细碎的KCN。将反应混合物加热至70℃2小时，并且然后过滤。使用EtOAc(2×30mL)洗涤滤饼。将合并的洗涤液和滤液浓缩，得到琥珀色油。通过硅胶层析法(在己烷中40%EtOAc)的纯化，得到具有作为杂质的DMF的作为半固体的叔丁基-2-氰基乙酰胺。将该半固体溶解在EtOAc(100mL)中并且用水(3×70mL)洗涤。用EtOAc(100mL)萃取合并的水性洗涤液。将合并的EtOAc溶液用盐水(70mL)洗涤，干燥(MgSO4)和浓缩，得到作为灰白色固体的分析纯的叔丁基-2-氰基乙酰胺(1.88g,76%产率,2步)。
4.N-1-金刚烷基-2-氰基乙酰胺
Figure BDA00001892012601222
在20-25℃下，向CH2Cl2(17mL)中1-金刚烷基胺(2.80g,18.5mmol,1.5当量)和碳酸钠(2.62g,24.7mmol,2.0当量)的浆料中在5分钟内加入CH2Cl2(5mL)中氯乙酰氯(1.24mL,12.3mmol,1.0当量)的溶液。一旦加入完成，将反应混合物搅拌10分钟并且用CH2Cl2(10mL)稀释以更有效的搅拌。在2小时后，将反应混合物过滤。使用CH2Cl2(20mL)洗涤滤饼。将合并的滤液和洗涤液浓缩，得到作为白色固体的中间体1-金刚烷基-2-氯乙酰胺，将其在没有任何进一步纯化下继续进行下一步。将1-金刚烷基-2-氯乙酰胺溶解在DMF(6mL)中，并且加入1.61g(24.7mmol,2.0当量)的细碎的KCN。将反应混合物加热至70℃14小时，然后冷却至环境温度。用EtOAc(100mL)来稀释反应混合物并且用水(3×60mL)洗涤。用EtOAc(70mL)萃取合并的水性洗涤液。将合并的EtOAc溶液用盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)和浓缩，得到残余物。通过硅胶层析法(在己烷中25%EtOAc)的纯化，得到作为白色固体的1-金刚烷基-2-氯乙酰胺(500mg，18%产率)和1-金刚烷基-2-氰基乙酰胺(491mg，18%产率，2步)。
5.1-氰基-N-异丙基甲磺酰胺
向在冷却至0-5℃的THF(20mL)中1-氰基甲磺酰氯(Sammes,M.P.;Wylie,C.M.;Hoggett,J.G.J.Chem.Soc.(C),1971,2151-2155)(3.25g,23.3mmol,1.0当量)的溶液中在10分钟内加入异丙胺(5.0mL,58.2mmol,2.5当量)。然后使反应混合物加温至环境温度。在12小时后，使反应混合物通过Celite过滤。用MeCN(50mL)洗涤滤饼。将洗涤液与滤液合并并且浓缩，得到残余物，其通过硅胶层析法(在己烷中25%EtOAc)纯化后，得到1.55g(41%产率)作为琥珀色油的1-氰基-N-异丙基甲磺酰胺。
6.烯丙基-2-(2-氰基乙酰氨基)-2-甲基丙酸酯
将在丙烯醇(30mL)中2-氨基-2-甲基丙酸(Aib,2.05g,19.9mmol)和对甲苯磺酸一水合物(5.11g,26.9mmol,1.35当量)的浆料加热至90℃24小时，然后冷却至环境温度。将反应混合物浓缩以去除丙烯醇，并且然后用CH2Cl2(100mL)和饱和水性碳酸钠(100mL)稀释。将相分离并且用CH2Cl2(100mL)萃取水相。将合并的有机萃取物使用盐水(100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)和浓缩，得到作为棕色油的粗Aib-烯丙基酯(2.84g，定量的产量)，其在没有进一步纯化下继续进行下一步。
向在冷却至0-5℃的CH2Cl2(8mL)中氰基乙酸(500mg,5.88mmol,1.0当量)、N，N-二异丙基乙基胺(3.1mL,17.6mmol,3.0当量)和Aib-烯丙基酯(1.26g,8.82mmol,1.5当量)的溶液中在3分钟内加入在CH2Cl2(7mL)中N,N’-二环己基碳二亚胺(1.82g,8.82mmol,1.5当量)的溶液。将反应混合物在0-5℃下搅拌40分钟，并且然后加温至环境温度。在24小时后，用EtOAc(100mL)稀释反应混合物并且用0.5M HCl(50mL)洗涤，并将有机相通过Celite过滤以去除沉淀的固体。将滤液用盐水(50mL)洗涤，干燥(Na2SO4)和浓缩，得到棕色固体，其通过硅胶层析法(在己烷中50%EtOAc)纯化，得到648mg(53%产率)作为白色固体的烯丙基-2-(2-氰基乙酰氨基)-2-甲基丙酸酯。
7.2-氰基-N’,N’-二甲基乙酰肼
Figure BDA00001892012601241
向在2-丙醇(12mL)中氰基乙酸甲酯(5.48g,55.3mmol,1.0当量)的溶液中加入N，N-二甲基肼(8.4mL,110.6mmol,2.0当量)。将反应混合物在环境温度下搅拌20小时，然后浓缩，得到红色固体，其在Et2O(50mL)中调成浆料，过滤和干燥，得到作为橙红色固体的酰肼(4.52g,64%产率)。通过硅胶层析法(在己烷中50%EtOAc，然后EtOAc)的固体的一部分的另外纯化，得到1.68g作为灰白色固体的分析纯的酰肼。
8.2-氰基-N-甲氧基乙酰胺
向在2-丙醇(5mL)中氰基乙酸甲酯(1.21g,12.2mmol,1.0当量)和O-甲基羟基胺盐酸盐(2.02g,24.2mmol,1.9当量)中加入三乙胺(5.1mL,36.3mmol,3.0当量)。将反应混合物加热至70℃3小时，并且然后热过滤。用2-丙醇(3×5mL)洗涤滤饼。将合并的洗涤液和滤液浓缩，并且通过硅胶层析法(在己烷中70%EtOAc)将得到的残余物纯化，得到作为白色固体的2-氰基-N-甲氧基乙酰胺(673mg,48%产率)。
9.2-(1H-吡唑-1-基)乙腈
Figure BDA00001892012601251
向在MeCN(21mL)中吡唑(1.04g,15.3mmol,1.0当量)和碳酸铯(7.47g,22.9mmol,1.5当量)的浆料中在3分钟内加入氯乙腈(1.16mL,18.3mmol,1.2当量)。将反应混合物在环境温度下搅拌2小时并且过滤。用MeCN(2×20mL)洗涤滤饼。将合并的滤液和洗涤液浓缩，并且通过硅胶层析法(在己烷中25%EtOAc)将获得的残余物纯化，得到1.23g(75%产率)作为无色油的2-(1H-吡唑-1-基)乙腈。
10.2-(1H-1,2,3-三唑-1-基)乙腈
Figure BDA00001892012601252
向在MeCN(8mL)中1H-1,2,3-三唑(261.4mg,3.79mmol,1.0当量)和碳酸钾(785mg,5.68mmol,1.5当量)的浆料中在3分钟内加入在MeCN(4mL)中溴乙腈(303μL,4.54mmol,1.2当量)的溶液。将反应混合物在环境温度下搅拌2小时并且过滤。用MeCN(30mL)洗涤滤饼。将合并的滤液和洗涤液浓缩，并且通过硅胶层析法(在己烷中50%EtOAc)将获得的残余物纯化，得到211mg(52%产率)作为无色油的2-(1H-1,2,3-三唑-1-基)乙腈。
11.吖丁啶(X=H)和3-羟基吖丁啶(X=OH)氰基乙酰胺
Figure BDA00001892012601253
将在EtOH(6mL)中氰基乙酸乙酯(1.0当量)、吖丁啶(X=H)或3-羟基吖丁啶(X=OH)盐酸盐(1.1当量)和三乙胺(1.5当量)在80℃下加热6小时。将反应混合物浓缩并且使残余物在EtOAc(25mL)和DI水(25mL)之间分配。用EtOAc(2×30mL)萃取水相。使合并的有机萃取物干燥(Na2SO4)和浓缩，得到残余物，其通过硅胶层析法(对于X=H，4:1EtOAc/己烷；对于X=OH，16:1EtOAc/MeOH)纯化，得到期望的氰基乙酰胺。
氰基乙酸乙酯(550mg,4.86mmol)和吖丁啶盐酸盐(500mg)得到196.5mg(33%产率)的吖丁啶氰基乙酰胺。
氰基乙酸乙酯(469.4mg,4.15mmol)和3-羟基吖丁啶盐酸盐(500mg)得到89mg(15%产率)的吖丁啶氰基乙酰胺。
实施例81.氰基丙烯酰胺或杂芳基丙烯腈的合成
Figure BDA00001892012601261
合成氰基丙烯酰胺或杂芳基丙烯腈衍生物的一般程序：在环境温度下将4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛(1.0当量)、合适的氰基乙酰胺或杂芳基乙腈(1.2-1.5当量)和DBU(1.5-2.0当量)在THF或DMF(2mL)中搅拌1-3天。然后将反应混合物浓缩并通过制备型TLC或HPLC纯化，得到作为(E)-和(Z)-异构体的混合物的氰基丙烯酰胺或杂芳基丙烯腈。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-(吗啉-4-羰基)丙烯腈
产量：12.1mg(21%产率)。ESI-MS:447.7(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-(吡啶-4-基)丙烯腈
Figure BDA00001892012601271
产量：7.3mg(25%产率)。ESI-MS:411.7(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-N-叔丁基-2-氰基丙烯酰胺
产量：19.9mg(38%产率)。ESI-MS:433.2(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基-N-(2-(二甲基氨基)乙基)-N-甲基丙烯酰胺
Figure BDA00001892012601273
产量：9.8mg(29%)。ESI-MS:462.5(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基-N-(2-羟乙基)-N-甲基丙烯酰胺
Figure BDA00001892012601281
产量：2.3mg(5%)。ESI-MS:435.6(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基-N-(1,3-二羟基-2-甲基丙-2-基)丙烯酰胺
Figure BDA00001892012601282
产量：12.3mg(35%产率)。ESI-MS:464.5(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)丙烯腈
Figure BDA00001892012601283
产量：7.1mg(27%产率)。ESI-MS:401.5(MH+)。
2-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-1-氰基-N-异丙基乙烯磺酰胺
Figure BDA00001892012601291
产量：17.8mg(49%产率)。ESI-MS:455.5(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-N-(1-金刚烷基)-2-氰基丙烯酰胺
Figure BDA00001892012601292
产量：11.3mg(27%产率)。ESI-MS:511.6(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-(4-甲基噻唑-2-基)丙烯腈
Figure BDA00001892012601293
产量：12.7mg(48%产率)。ESI-MS:431.5(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-(1H-吡唑-1-基)丙烯腈
Figure BDA00001892012601301
产量：6.6mg(25%产率)。ESI-MS:400.3(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-(1H-1,2,3-三唑-1-基)丙烯腈
Figure BDA00001892012601302
产量：5.2mg(21%产率)。ESI-MS:401.5(MH+)。
烯丙基-2-(3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基丙烯酰氨基)-2-甲基丙酸酯
Figure BDA00001892012601303
产量：11.1mg(19%产率)。ESI-MS:503.6(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-(吡啶-3-基)丙烯腈
产量：21.3mg(62%产率)。ESI-MS:411.3(MH+)。
4-(2-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-1-氰基乙烯基)吡啶1-氧化物
产量：3.3mg(7%产率)。ESI-MS:427.7(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基-N′，N′-二甲基丙烯酰肼
Figure BDA00001892012601313
产量：6.1mg(18%产率)。ESI-MS:420.5(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基-N-甲氧基丙烯酰胺
Figure BDA00001892012601321
产量：19mg(49%产率)。ESI-MS:407.4(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基-N，N-二甲基丙烯酰胺
由N,N-二甲基氰基乙酰胺制备(Basheer,A.;Yamataka,H.;Ammal,S.C.;Rappoport,Z.J.Org.Chem.2007,72,5297-5312)。
产量：33.8mg(24%,E:Z=1.7:1)。ESI-MS:405.2(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基-N-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)丙烯酰胺
由2-氰基-N-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)乙酰胺制备(Santilli,A.A.;Osdene,T.S.J.Org.Chem.1964,29,2066-2068)。
Figure BDA00001892012601323
产量：17.2mg(39%)，ESI-MS:449.2(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基-N，N-二乙基丙烯酰胺
由N,N-二乙基氰基乙酰胺制备(Wang,K.;Nguyen,K.;Huang,Y.;
Figure BDA00001892012601331
A.J.Comb.Chem.2009,11,920-927)。
Figure BDA00001892012601332
产量：9.2mg(8%)，ESI-MS:433.2(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-(吡咯烷-1-羰基)丙烯腈
由N-(2-氰基乙酰基)吡咯烷制备(Wang,K.;Nguyen,K.;Huang,Y.;
Figure BDA00001892012601333
A.J.Comb.Chem.2009,11,920-927)。
Figure BDA00001892012601334
产量：1.6mg(3%)，ESI-MS:431.2(MH+)
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-(吖丁啶-1-羰基)丙烯腈
Figure BDA00001892012601341
产量：16.5mg(32%)，ESI-MS:417.2(MH+)
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-(3-羟基吖丁啶-1-羰基)丙烯腈
Figure BDA00001892012601342
产量：20.1mg(38%)，ESI-MS:433.2(MH+)
(E)-3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-(4-甲基哌嗪-1-羰基)丙烯腈
由N-(2-氰基乙酰基)-N’-甲基哌嗪制备(Proenca,F.;Costa,M.GreenChem.2008,10,995-998)。
产量：15.7mg(25%),ESI-MS:460.2(MH+)
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基-N-环丙基丙烯酰胺
向在已预冷却至0-5℃的THF(2.2mL)中4-叔丁基氧基羰基氨基-7-(3-叔丁基二甲基甲硅烷氧基丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛(101mg,0.1925mmol)和N-环丙基氰基乙酰胺3(47.8mg,2.0当量)的溶液中加入DBU(58μL,2.0当量)。使反应混合物加温至环境温度并且搅拌1小时，然后维持在-20℃下12小时。将反应混合物浓缩，并且通过硅胶层析法(2:1己烷/EtOAc)纯化，得到53.2mg(E:Z=2:1,44%产率)的作为黄色油的中间体保护的氰基丙烯酰胺。将该油溶解在CH2Cl2(3mL)并且加入TFA(1.5mL)。在20-25℃下16小时后，将反应混合物浓缩并且将残余物再溶解在THF(6mL)中，并加入1M水性HCl(2mL)。将反应混合物维持在环境温度下8小时，然后用饱和水性NaHCO3(20mL)和盐水(30mL)猝灭，并且用EtOAc(3x 50mL)萃取。使合并的EtOAc萃取物干燥(MgSO4)和浓缩，并且通过制备型TLC(3:1甲苯/IPA，0.5cm板，2次洗脱)将所得的油纯化，得到作为黄色油的氰基丙烯酰胺(26mg，在2步74%产率)。ESI-MS:417.1(MH+)。
1-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2,2-二氟乙酮
Figure BDA00001892012601361
向在CH2Cl2(2mL)中对应的二叔丁氧羰基氨基叔丁基二甲基甲硅烷氧基二氟甲基酮(39.0mg,57.8μmol)的溶液中加入TFA(2mL)。使反应混合物维持在环境温度下17小时，然后浓缩以及将残余物再溶解在THF(3mL)中。加入HCl(1M,1mL)并且将反应混合物在环境温度下搅拌12小时，然后用饱和水性碳酸氢钠(5mL)猝灭，并且用EtOAc(3×10mL)萃取。使合并的有机萃取物干燥(Na2SO4)和浓缩，得到白色固体，其在MeCN(10mL)中调成浆料。将悬浮液过滤，并且将滤液浓缩，得到作为白色固体的二氟甲基酮(6.9mg,33%产率,2步)。ESI-MS:361.3(MH+)。
3-(4-氨基-7-(3-羟丙基)-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氰基-N-异丙基丙酰胺
Figure BDA00001892012601362
向在MeOH(1.8mL)中对应的氰基丙烯酰胺(31.7mg,75.8μmol)的溶液中加入冰AcOH(0.2mL)，随后加入氰基硼氢化钠(14.3mg,227μmol,3.0当量)。将反应混合物在环境温度下搅拌24小时，然后浓缩并且通过制备型HPLC(在H2O中0.1%TFA：在MeCN中0.1%TFA，在20分钟内95:5至20:80v/v的梯度)纯化残余物，得到作为无色油的期望的酰胺(9.8mg,24%产率)。ESI-MS:421.5(MH+)。
实施例82.可逆性硫醇加成至亲电子、腈-取代的烯烃的测定
Figure BDA00001892012601371
通过在40mL D2O中溶解NaCl(400mg)、KCl(10mg)、Na2DPO4(30.7mg)和KD2PO4(9.7mg)制备氘化的磷酸盐缓冲盐水(PBS-d)。用NaOD(在D2O中溶液)和在D2O中DCl将溶液的pH调整至7.4。
向在0.75mL的DMSO-d6中氰基丙烯酸酯A(5.1mg,27.3μmol)的溶液中加入在PBS-d(0.25mL)中的400mM 2-巯基乙醇(BME)的溶液。通过1HNMR的反应混合物的分析表明向硫醇加合物B的>95%转化。
通过对于氰基丙烯酸酯A在8.30ppm下和对于硫醚B在4.52ppm下的鉴定峰的积分可容易地测定起始氰基丙烯酸酯与加合物的比率。
氰基丙烯酸酯A:1H NMR(400MHz,3:1v/v DMSO-d6:PBS-d):δ8.30(s,1H),7.91(m,2H),7.60-7.49(m,3H),3.78(s,3H)。
BME的加入导致形成具有以下谐振的加合物B(非对映体的大约61:39混合物)：1H NMR(400MHz,3:1v/v DMSO-d6:PBS-d):7.41(m,1H),7.35-7.28(m,4H),4.52(s,1H),3.64(s,3H,主要非对映体),3.56(s,3H,次要非对映体),3.46(t,J=6.3Hz,2H,主要非对映体，与对于过量的BME的信号重叠),3.38(t,J=6.7Hz,2H,次要非对映体),2.58-2.40(m,2H,与对于过量的BME的信号重叠)。如通过以下实验证实的，发现硫醇加合物的形成为可逆的：
向在0.75mL的DMSO-d6中氰基丙烯酸酯A(17.1mg,91.4μmol)的溶液中加入在PBS-d(0.25mL)中400mM BME的溶液。通过1H NMR的反应混合物分析表明硫醇加合物B与起始氰基丙烯酸酯A的比率为85:15。然后通过将100μL的反应混合物加入900μL的3:1v/vDMSO-d6:氘化的PBS中稀释反应混合物10倍。通过1H NMR的溶液分析表明硫醇加合物B与起始氰基丙烯酸酯A的比率为53:47；氰基丙烯酸酯A与硫醇加合物B的比率通过对于氰基丙烯酸酯A在8.30ppm和对于硫醚B在4.52ppm的鉴定峰的积分来测定(图9)。
实施例83.通过UV/可见光光谱法的硫醇可逆性测定
Figure BDA00001892012601381
可在20℃下使用Spectramax M5(Molecular Devices,SunnyvaleCA)UV-VIS分光光度计在250-500nm的范围内对UV-活性亲电体与BME的可逆性反应进行分光光度表征。通过混合等体积的以上示出的N-异丙基氰基丙烯酰胺(在PBS中400μM溶液，pH 7.4)与2-巯基乙醇的溶液(在PBS中100mM BME溶液，pH 7.4蚓引发平衡反应。
通过监测氰基丙烯酰胺在400nm下的吸光度峰来分光光度地分析(Costar清洁平底96-孔板，对于各反应100μL/孔)溶液C(在pH 7.4下在PBS中200μM氰基丙烯酰胺，对照)和D(在pH 7.4下在PBS中200μM氰基丙烯酰胺和50mM BME)。该峰的消失(溶液D，图2)表明与BME的反应。然后通过将10μL等分试样与90μL的PBS(pH 7.4)或在PBS(pH 7.4)中50mMBME混合将溶液D稀释10倍。将溶液C也在PBS(pH 7.4)中稀释10倍，并且用作吸光度信号的参照。溶液D稀释至PBS导致氰基丙烯酰胺在400nm下的吸光度的快速恢复(在数秒内)，表明BME-氰基丙烯酰胺加合物的快速逆转。这些数据与上述NMR测定一致。对于吸收在大于300nm波长的光的亲电体(例如，氰基丙烯酰胺)，分光光度测定比NMR更方便并且在高通量形式(96-孔板)中更易于实施。
提供以上实施例以说明本发明，而非限制其范围。本发明的其它变型对于本领域普通技术人员将是显而易见的，并且涵盖在所附的权利要求中。本文所引用的所有出版物、数据库、Genbank序列、专利和专利申请均在此通过引用并入。
Figure IDA00001892013100011

Claims (46)

1.抑制蛋白激酶的方法，所述方法包括使所述蛋白激酶与有效量的可逆性激酶抑制剂接触和使所述可逆性激酶抑制剂可逆地结合到活性位点半胱氨酸残基，从而抑制所述蛋白激酶，
其中所述可逆性激酶抑制剂具有式I的结构：
Figure FDA00001892012500011
其中
R1是取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、或者取代的或未取代的杂芳基；
L1是键、-C(O)-、-C(O)N(L3R2)-、-C(O)O-、-S(O)n-、-O-、-N(L3R2)-、-P(O)(OL3R2)O-、-SO2N(L3R2)-、-P(O)(NL3R2)N-、取代的或未取代的亚烷基、取代的或未取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基、或者取代的或未取代的亚杂芳基；
L2是键、-C(O)-、-C(O)N(L3AR2A)-、-C(O)O-、-S(O)t-、-O-、-N(L3AR2A)-、-P(O)(OL3AR2A)O-、-SO2N(L3AR2A)-、-P(O)(NL3AR2A)N-、取代的或未取代的亚烷基、取代的或未取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基、或者取代的或未取代的亚杂芳基；
n和t独立地是0、1或2；
L3和L3A独立地是键、取代的或未取代的亚烷基、取代的或未取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基、或者取代的或未取代的亚杂芳基，其中w是0、1或2；
R2和R2A独立地是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、或者取代的或未取代的杂芳基；
E是吸电子基团；
其中当所述蛋白激酶未变性、部分变性或完全变性时，所述可逆性激酶抑制剂从所述蛋白激酶可测量地离解；和
其中如果L1是键并且R1是(3-(4-氨基-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙-1-醇)-6-基，那么-L2-E不是-C(O)NH2。
2.根据权利要求1的方法，其中所述可逆性激酶抑制剂具有下式：
Figure FDA00001892012500021
其中
W是-C(O)-或-S(O)2-；
z是0或1；
X是O或N，其中如果X是O，那么z是0；
R3和R4独立地是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、或者取代的或未取代的杂芳基，其中R3和R4任选地与X结合在一起以形成取代的或未取代的杂环烷基或者取代的或未取代的杂芳基；
L1、L4和L5独立地是键、取代的或未取代的亚烷基、取代的或未取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基、或者取代的或未取代的亚杂芳基；和
其中如果L1是键并且R1是(3-(4-氨基-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙-1-醇)-6-基，那么R3和R4中至少一个不是氢。
3.根据权利要求1的方法，其中所述可逆性激酶抑制剂具有下式：
Figure FDA00001892012500022
其中
环A是取代的或未取代的杂芳基。
4.根据权利要求3的方法，其中所述环A是五元的R31-取代的或未取代的杂芳基或者六元的R31-取代的或未取代的杂芳基，
R31是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R33-取代的或未取代的烷基、R33-取代的或未取代的杂烷基、R33-取代的或未取代的环烷基、R33-取代的或未取代的杂环烷基、R33-取代的或未取代的芳基、或者R33-取代的或未取代的杂芳基；
R33独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R34-取代的或未取代的烷基、R34-取代的或未取代的杂烷基、R34-取代的或未取代的环烷基、R34-取代的或未取代的杂环烷基、R34-取代的或未取代的芳基、或者R34-取代的或未取代的杂芳基；
R34独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R35-取代的或未取代的烷基、R35-取代的或未取代的杂烷基、R35-取代的或未取代的环烷基、R35-取代的或未取代的杂环烷基、R35-取代的或未取代的芳基、或者R35-取代的或未取代的杂芳基；和
R35独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、或者未取代的杂芳基。
5.根据权利要求3的方法，其中所述可逆性激酶抑制剂具有下式：
其中
环A是取代的或未取代的杂芳基。
6.根据权利要求3的方法，其中环A是R31-取代的或未取代的呋喃基、R31-取代的或未取代的噻吩基、R31-取代的或未取代的吡咯基、R31-取代的或未取代的咪唑基、R31-取代的或未取代的吡唑基、R31-取代的或未取代的噁唑基、R31-取代的或未取代的异噁唑基、R31-取代的或未取代的噻唑基、R31-取代的或未取代的异噻唑基、R31-取代的或未取代的三唑基、R31-取代的或未取代的噁二唑基、R31-取代的或未取代的吡啶基、R31-取代的或未取代的嘧啶基、R31-取代的或未取代的哒嗪基、R31-取代的或未取代的吡咯啉基、R31-取代的或未取代的吡嗪基、R31-取代的或未取代的四唑基、R31-取代的或未取代的呋喃基、R31-取代的或未取代的二氢噻吩并吡唑基、R31-取代的或未取代的硫茚基、R31-取代的或未取代的咔唑基、R31-取代的或未取代的苯并噻吩基、R31-取代的或未取代的苯并呋喃基、R31-取代的或未取代的吲哚基、R31-取代的或未取代的喹啉基、R31-取代的或未取代的苯并三唑基、R31-取代的或未取代的苯并噻唑基、R31-取代的或未取代的苯并噁唑基、R31-取代的或未取代的苯并咪唑基、R31-取代的或未取代的异喹啉基、R31-取代的或未取代的异吲哚基、R31-取代的或未取代的吖啶基、R31-取代的或未取代的苯并异噁唑基(benzoisazolyl)，
R31是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R33-取代的或未取代的烷基、R33-取代的或未取代的杂烷基、R33-取代的或未取代的环烷基、R33-取代的或未取代的杂环烷基、R33-取代的或未取代的芳基、或者R33-取代的或未取代的杂芳基；
R33独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R34-取代的或未取代的烷基、R34-取代的或未取代的杂烷基、R34-取代的或未取代的环烷基、R34-取代的或未取代的杂环烷基、R34-取代的或未取代的芳基、或者R34-取代的或未取代的杂芳基；
R34独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R35-取代的或未取代的烷基、R35-取代的或未取代的杂烷基、R35-取代的或未取代的环烷基、R35-取代的或未取代的杂环烷基、R35-取代的或未取代的芳基、或者R35-取代的或未取代的杂芳基；和
R35独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、或者未取代的杂芳基。
7.根据权利要求1的方法，其中
R1是R7-取代的或未取代的烷基、R7-取代的或未取代的杂烷基、R7-取代的或未取代的环烷基、R7-取代的或未取代的杂环烷基、R7-取代的或未取代的芳基、或者R7-取代的或未取代的杂芳基；
R7独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R8-取代的或未取代的烷基、R8-取代的或未取代的杂烷基、R8-取代的或未取代的环烷基、R8-取代的或未取代的杂环烷基、R8-取代的或未取代的芳基、R8-取代的或未取代的杂芳基、或者-L6-R7A；
L6是-O-、-C(O)-、-C(O)NH-、-S(O)m-或者-S(O)mNH-；
m是0、1或2；
R7A是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R8-取代的或未取代的烷基、R8-取代的或未取代的杂烷基、R8-取代的或未取代的环烷基、R8-取代的或未取代的杂环烷基、R8-取代的或未取代的芳基、R8-取代的或未取代的杂芳基；
R8独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R9-取代的或未取代的烷基、R9-取代的或未取代的杂烷基、R9-取代的或未取代的环烷基、R9-取代的或未取代的杂环烷基、R9-取代的或未取代的芳基、或者R9-取代的或未取代的杂芳基；
R9独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R10-取代的或未取代的烷基、R10-取代的或未取代的杂烷基、R10-取代的或未取代的环烷基、R10-取代的或未取代的杂环烷基、R10-取代的或未取代的芳基、或者R10-取代的或未取代的杂芳基；和
R10独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、或者未取代的杂芳基。
8.根据权利要求1的方法，其中
L1是键、R11-取代的或未取代的亚烷基、R11-取代的或未取代的亚杂烷基、R11-取代的或未取代的亚环烷基、R11-取代的或未取代的亚杂环烷基、R11-取代的或未取代的亚芳基、或者R11-取代的或未取代的亚杂芳基；
R11独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R12-取代的或未取代的烷基、R12-取代的或未取代的杂烷基、R12-取代的或未取代的环烷基、R12-取代的或未取代的杂环烷基、R12-取代的或未取代的芳基、或者R12-取代的或未取代的杂芳基；
R12独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R13-取代的或未取代的烷基、R13-取代的或未取代的杂烷基、R13-取代的或未取代的环烷基、R13-取代的或未取代的杂环烷基、R13-取代的或未取代的芳基、或者R13-取代的或未取代的杂芳基；
R13独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R14-取代的或未取代的烷基、R14-取代的或未取代的杂烷基、R14-取代的或未取代的环烷基、R14-取代的或未取代的杂环烷基、R14-取代的或未取代的芳基、或者R14-取代的或未取代的杂芳基；和
R14独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、或者未取代的杂芳基。
9.根据权利要求1的方法，其中
R2是氢、R15-取代的或未取代的烷基、R15-取代的或未取代的杂烷基、R15-取代的或未取代的环烷基、R15-取代的或未取代的杂环烷基、R15-取代的或未取代的芳基、或者R15-取代的或未取代的杂芳基；
R15独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R16-取代的或未取代的烷基、R16-取代的或未取代的杂烷基、R16-取代的或未取代的环烷基、R16-取代的或未取代的杂环烷基、R16-取代的或未取代的芳基、R16-取代的或未取代的杂芳基、或者-L7-R15A；
L7是-O-、-C(O)-、-C(O)NH-、-S(O)y-或者-S(O)yNH-；
y是0、1或2；
R15A是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R16-取代的或未取代的烷基、R16-取代的或未取代的杂烷基、R16-取代的或未取代的环烷基、R16-取代的或未取代的杂环烷基、R16-取代的或未取代的芳基、R16-取代的或未取代的杂芳基；
R16独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R17-取代的或未取代的烷基、R17-取代的或未取代的杂烷基、R17-取代的或未取代的环烷基、R17-取代的或未取代的杂环烷基、R17-取代的或未取代的芳基、或者R17-取代的或未取代的杂芳基；
R17独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R18-取代的或未取代的烷基、R18-取代的或未取代的杂烷基、R18-取代的或未取代的环烷基、R18-取代的或未取代的杂环烷基、R18-取代的或未取代的芳基、或者R18-取代的或未取代的杂芳基；和
R18独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、或者未取代的杂芳基。
10.根据权利要求2的方法，其中
R4是氢、R23A-取代的或未取代的烷基、R23A-取代的或未取代的杂烷基、R23A-取代的或未取代的环烷基、R23A-取代的或未取代的杂环烷基、R23A-取代的或未取代的芳基、或者R23A-取代的或未取代的杂芳基，在一些实施方案中，R4和R4A不是氢；
R23A是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R24A-取代的或未取代的烷基、R24A-取代的或未取代的杂烷基、R24A-取代的或未取代的环烷基、R24A-取代的或未取代的杂环烷基、R24A-取代的或未取代的芳基、R24A-取代的或未取代的杂芳基、或者-L7A-R24B；
L7A独立地是-O-、-C(O)-、-C(O)NH-、-S(O)y′-或者-S(O)y′NH-；
y'是0、1或2；
R24B独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R24A-取代的或未取代的烷基、R24A-取代的或未取代的杂烷基、R24A-取代的或未取代的环烷基、R24A-取代的或未取代的杂环烷基、R24A-取代的或未取代的芳基、R24A-取代的或未取代的杂芳基；
R24A独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R25A-取代的或未取代的烷基、R25A-取代的或未取代的杂烷基、R25A-取代的或未取代的环烷基、R25A-取代的或未取代的杂环烷基、R25A-取代的或未取代的芳基、或者R25A-取代的或未取代的杂芳基；
R25A独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R26A-取代的或未取代的烷基、R26A-取代的或未取代的杂烷基、R26A-取代的或未取代的环烷基、R26A-取代的或未取代的杂环烷基、R26A-取代的或未取代的芳基、或者R26A-取代的或未取代的杂芳基；
R26A独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、或者未取代的杂芳基。
11.根据权利要求1的方法，其中
L2是键、R19-取代的或未取代的亚烷基、R19-取代的或未取代的亚杂烷基、R19-取代的或未取代的亚环烷基、R19-取代的或未取代的亚杂环烷基、R19-取代的或未取代的亚芳基、或者R19-取代的或未取代的亚杂芳基；
R19独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R20-取代的或未取代的烷基、R20-取代的或未取代的杂烷基、R20-取代的或未取代的环烷基、R20-取代的或未取代的杂环烷基、R20-取代的或未取代的芳基、或者R20-取代的或未取代的杂芳基；
R20独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R21-取代的或未取代的烷基、R21-取代的或未取代的杂烷基、R21-取代的或未取代的环烷基、R21-取代的或未取代的杂环烷基、R21-取代的或未取代的芳基、或者R21-取代的或未取代的杂芳基；
R21独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R22-取代的或未取代的烷基、R22-取代的或未取代的杂烷基、R22-取代的或未取代的环烷基、R22-取代的或未取代的杂环烷基、R22-取代的或未取代的芳基、或者R22-取代的或未取代的杂芳基；和
R22独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、或者未取代的杂芳基。
12.根据权利要求2的方法，其中
L5是键、R19-取代的或未取代的亚烷基、R19-取代的或未取代的亚杂烷基、R19-取代的或未取代的亚环烷基、R19-取代的或未取代的亚杂环烷基、R19-取代的或未取代的亚芳基、或者R19-取代的或未取代的亚杂芳基；
R19独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R20-取代的或未取代的烷基、R20-取代的或未取代的杂烷基、R20-取代的或未取代的环烷基、R20-取代的或未取代的杂环烷基、R20-取代的或未取代的芳基、或者R20-取代的或未取代的杂芳基；
R20独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R21-取代的或未取代的烷基、R21-取代的或未取代的杂烷基、R21-取代的或未取代的环烷基、R21-取代的或未取代的杂环烷基、R21-取代的或未取代的芳基、或者R21-取代的或未取代的杂芳基；
R21独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R22-取代的或未取代的烷基、R22-取代的或未取代的杂烷基、R22-取代的或未取代的环烷基、R22-取代的或未取代的杂环烷基、R22-取代的或未取代的芳基、或者R22-取代的或未取代的杂芳基；以及
R22独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、或者未取代的杂芳基。
13.根据权利要求2的方法，其中
R3是氢、R23-取代的或未取代的烷基、R23-取代的或未取代的杂烷基、R23-取代的或未取代的环烷基、R23-取代的或未取代的杂环烷基、R23-取代的或未取代的芳基、或者R23-取代的或未取代的杂芳基；
R23独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R24-取代的或未取代的烷基、R24-取代的或未取代的杂烷基、R24-取代的或未取代的环烷基、R24-取代的或未取代的杂环烷基、R24-取代的或未取代的芳基、R24-取代的或未取代的杂芳基、或者-L8-R23A'；
L8是-O-、-C(O)-、-C(O)NH-、-S(O)p-或者-S(O)pNH-；
p是0、1或2；
R23A'是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R24-取代的或未取代的烷基、R24-取代的或未取代的杂烷基、R24-取代的或未取代的环烷基、R24-取代的或未取代的杂环烷基、R24-取代的或未取代的芳基、R24-取代的或未取代的杂芳基；
R24独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R25-取代的或未取代的烷基、R25-取代的或未取代的杂烷基、R25-取代的或未取代的环烷基、R25-取代的或未取代的杂环烷基、R25-取代的或未取代的芳基、或者R25-取代的或未取代的杂芳基；
R25独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R26-取代的或未取代的烷基、R26-取代的或未取代的杂烷基、R26-取代的或未取代的环烷基、R26-取代的或未取代的杂环烷基、R26-取代的或未取代的芳基、或者R26-取代的或未取代的杂芳基；和
R26独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、或者未取代的杂芳基。
14.根据权利要求1的方法，其中
L3是键、R27-取代的或未取代的亚烷基、R27-取代的或未取代的亚杂烷基、R27-取代的或未取代的亚环烷基、R27-取代的或未取代的亚杂环烷基、R27-取代的或未取代的亚芳基、或者R27-取代的或未取代的亚杂芳基；
R27独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R28-取代的或未取代的烷基、R28-取代的或未取代的杂烷基、R28-取代的或未取代的环烷基、R28-取代的或未取代的杂环烷基、R28-取代的或未取代的芳基、或者R28-取代的或未取代的杂芳基；
R28独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R29-取代的或未取代的烷基、R29-取代的或未取代的杂烷基、R29-取代的或未取代的环烷基、R29-取代的或未取代的杂环烷基、R29-取代的或未取代的芳基、或者R29-取代的或未取代的杂芳基；
R29独立地是氢、卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、R30-取代的或未取代的烷基、R30-取代的或未取代的杂烷基、R30-取代的或未取代的环烷基、R30-取代的或未取代的杂环烷基、R30-取代的或未取代的芳基、或者R30-取代的或未取代的杂芳基；和
R30独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CF3、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、或者未取代的杂芳基。
15.根据权利要求2的方法，
其中
R1是R7-取代的或未取代的杂环烷基、R7-取代的或未取代的芳基、或者R7-取代的或未取代的杂芳基；
L1、L4和L5独立地是键；
R7独立地是-NH2、R8-取代的或未取代的烷基、R8-取代的或未取代的芳基、R8-取代的或未取代的杂芳基、或者-L4-R7A；
L4是-C(O)-；
R7A独立地是R8-取代的或未取代的烷基、R8-取代的或未取代的芳基、R8-取代的或未取代的杂芳基；
R8独立地是-OH或者R9-取代的或未取代的烷基；
R4是氢或者R15-取代的或未取代的烷基；
R3是氢或者R23-取代的或未取代的烷基；或者
R3和R4任选地与X结合在一起以形成4-7元的杂环烷基。
16.根据权利要求15的方法，其中R8独立地是-OH或者未取代的烷基。
17.根据权利要求15的方法，其中X是N。
18.根据权利要求15的方法，其中X是O。
19.根据权利要求18的方法，其中R4是R15-取代的或未取代的烷基。
20.根据权利要求9的方法，
其中
R1是R7-取代的苯基、R7-取代的6元杂环烷基、R7-取代的或未取代的6,5稠环杂芳基、或者R7-取代的或未取代的5,6稠环杂芳基；
R7独立地是卤素、-CN、-OH、-NH2、-COOH、R8-取代的或未取代的烷基、R8-取代的或未取代的杂烷基、R8-取代的或未取代的环烷基、R8-取代的或未取代的杂环烷基、R8-取代的或未取代的芳基、或者R8-取代的或未取代的杂芳基、或者-L6-R7A；
R7A独立地是R8-取代的或未取代的环烷基、R8-取代的或未取代的杂环烷基、R8-取代的或未取代的芳基、或者R8-取代的或未取代的杂芳基；
L6是-O-、-C(O)-、-C(O)NH-、-S(O)m-或者-S(O)mNH-；
R8独立地是-OH或者R9-取代的或未取代的烷基；和
m是0、1或2。
21.根据权利要求20的方法，
其中
R7是R8-取代的或未取代的杂芳基、或者-L6-R7A；
L6是-C(O)-；和
R7A是R8-取代的或未取代的杂芳基。
22.根据权利要求1至21中一项的方法，其中所述可逆性激酶抑制剂以小于100nM的抑制常数抑制所述蛋白激酶。
23.根据权利要求1或22中任一项的方法，其中所述蛋白激酶是Rsk、Nek、Mekk1、MSK1或者Plk。
24.在需要治疗的受试者中治疗与激酶活性相关的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的具有式(I)的结构的化合物：
Figure FDA00001892012500121
其中
R1是取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、或者取代的或未取代的杂芳基；
L1和L2独立地是键、-C(O)N(L3R2)-、-C(O)O-、-S(O)n-、-O-、-S-、-N(L3R2)-、取代的或未取代的亚烷基、取代的或未取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基、或者取代的或未取代的亚杂芳基；
L3独立地是键、取代的或未取代的亚烷基、取代的或未取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基、或者取代的或未取代的亚杂芳基；
R2独立地是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、或者取代的或未取代的杂芳基；
E是吸电子基团；
其中如果L1是键并且R1是(3-(4-氨基-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙-1-醇)-6-基，那么R2和R3中至少一个不是氢。
25.根据权利要求24的方法，其中所述疾病或病症是癌症、自身免疫性疾病、HIV感染或者炎症。
26.具有下式的化合物：
Figure FDA00001892012500122
其中
W是-C(O)-或-S(O)2-；
z是0或1；
X是O或N，其中如果X是O，那么z是0；
R1是取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、或者取代的或未取代的杂芳基；
R3和R4独立地是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、或者取代的或未取代的杂芳基，其中R3和R4任选地与X结合在一起以形成取代的或未取代的杂环烷基或者取代的或未取代的杂芳基；
L1、L4和L5独立地是键、取代的或未取代的亚烷基、取代的或未取代的亚杂烷基、取代的或未取代的亚环烷基、取代的或未取代的亚杂环烷基、取代的或未取代的亚芳基、或者取代的或未取代的亚杂芳基；和
其中如果L1是键并且R1是(3-(4-氨基-5-对甲苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙-1-醇)-6-基，那么R3和R4中至少一个不是氢。
27.根据权利要求26的化合物，其中X是N。
28.根据权利要求27的化合物，其中
R1是R7-取代的苯基；
R7是R8-取代的或未取代的杂芳基、或者-L6-R7A，其中L6是-C(O)-，和R7A是R8-取代的或未取代的杂芳基。
29.根据权利要求28的化合物，其中R3和R4是氢。
30.根据权利要求28的化合物，其中R7是R8-取代的或未取代的嘌呤基、R8-取代的或未取代的嘧啶基、R8-取代的或未取代的咪唑基、R8-取代的或未取代的1H-吡咯并[2,3-b]吡啶基、R8-取代的或未取代的嘧啶基、R8-取代的或未取代的1H-吲唑基、或者R8-取代的或未取代的7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基。
31.根据权利要求28的化合物，其中
R7是-L4-R7A；和
R7A是R8-取代的或未取代的1H-吡咯并[2,3-b]吡啶基。
32.根据权利要求27的化合物，其中
R1是R7-取代的6元杂环烷基；和
R7是R8-取代的或未取代的杂芳基。
33.根据权利要求32的化合物，其中
R1是R7-取代的哌啶；和
R7是R8-取代的或未取代的嘌呤基、R8-取代的或未取代的嘧啶基、R8-取代的或未取代的咪唑基、R8-取代的或未取代的1H-吡咯并[2,3-b]吡啶基、R8-取代的或未取代的嘧啶基、R8-取代的或未取代的1H-吲唑基、或者R8-取代的或未取代的7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基。
34.根据权利要求33的化合物，其中R3和R4是氢。
35.根据权利要求27的化合物，其中
R1是R7-取代的或未取代的6,5稠环杂芳基或者R7-取代的或未取代的5,6稠环杂芳基；
R7独立地是-NH2、R8-取代的或未取代的烷基、R8-取代的或未取代的芳基；和
R8独立地是-OH或者未取代的烷基。
36.根据权利要求35的化合物，其中R1是R7-取代的或未取代的吲唑基或者R7-取代的或未取代的7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基。
37.根据权利要求36的化合物，其中R3和R4是氢。
38.根据权利要求36的化合物，
其中
R3是未取代的烷基；和
R4是氢。
39.根据权利要求36的化合物，
其中
R3是苯基甲基；和
R4是氢。
40.根据权利要求36的化合物，其中R3和R4与N结合以形成R23-取代的或未取代的吡咯烷基。
41.根据权利要求26的化合物，其中X是O。
42.根据权利要求41的化合物，其中
R1是R7-取代的或未取代的6,5稠环杂芳基或者R7-取代的或未取代的5,6稠环杂芳基；
R7独立地是-NH2、R8-取代的或未取代的烷基、R8-取代的或未取代的芳基；和
R8独立地是-OH或者未取代的烷基；和
R3是未取代的烷基。
43.根据权利要求42的化合物，
其中
R1是R7-取代的7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基；和
R7是-NH2、R8-取代的或未取代的烷基、或者R8-取代的或未取代的苯基。
44.具有下式的化合物：
Figure FDA00001892012500151
其中
所述环A是取代的或未取代的杂芳基。
45.根据权利要求26的化合物，具有以下结构：
Figure FDA00001892012500152
Figure FDA00001892012500161
Figure FDA00001892012500171
Figure FDA00001892012500181
Figure FDA00001892012500191
46.根据权利要求44的化合物，具有以下结构：
Figure FDA00001892012500192
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