CN102697814A - 一种治疗乙型肝炎的新药及其提取分离方法 - Google Patents
一种治疗乙型肝炎的新药及其提取分离方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明为“一种治疗乙型肝炎的新药及其提取分离方法”。涉及从高突足襞蛞蝓中,提取分离出一种能抑制HBV-DNA复制、并降低E抗元(HbeAg)表达的JK1。主要工艺:蛞蝓匀浆-50℃水浴锅内搅拌提取4小时--布袋离心--配成70%醇浓度浸出提取24小时-旋转蒸发回收乙醇--布袋离心弃渣-超滤膜脱水脱醇-真空冷冻干燥得JK1干粉---加入辅料制成胶囊剂、片剂。
Description
技术领域 生物技术
背景技术
乙型病毒性肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)是由HBV引起的一种常见传染病。HBV感染呈世界性分布是一个严重的公共卫生问题。全球约20亿人被证明有HBV感染,5%的世界人口现行慢性感染,其中3.5亿人为HBV慢性感染,每年约100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(HCC)。慢性乙型肝炎已成为世界上第10大致死疾病之一。我国属HBV感染中、高流行区,一般人群的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性检出率为9.09%,慢性乙型肝炎患者约3000万,每年有80~100万新生儿携带乙肝。乙型肝炎严重威胁人民的生命健康,且给家庭和社会造成巨大的经济损失,因此,对乙型肝炎治疗新药的研究迫在眉睫。
乙型肝炎的治疗目标是抑制或清除HBV,减轻肝内炎症活动,延缓或阻止肝损伤,防止发展至肝脏失代偿、肝硬化及肝癌,改善患者生存质量和延长生存时间。目前对慢性乙型肝炎患者的治疗多采取综合治疗方法,其中抗病毒治疗是重要的治疗措施之一。近年来,国内外学者已对慢性乙型肝炎的抗病毒治疗作了大量的研究,主要有细胞因子治疗、免疫调节治疗、核苷类似物治疗、联合治疗、中医中药治疗、导向治疗和基因治疗等。通过抑制HBV复制而直接阻断其自然病程的抗病毒疗法是慢性乙肝治疗的关键。但由于慢性HBV感染是病毒、肝细胞、机体免疫系统之间相互作用的动态过程,抗病毒治疗不仅与HBV基因异质性、HBVcccDNA的稳定性等病毒因素有关,更涉及到宿主的遗传素质及免疫状态等,因此临床抗病毒疗效远非理想,尤其是远期疗效。在抗HBV药物中,研究最为深入,疗效也较为确切的是α干扰素(IFN-α)和以拉米呋啶(3TC)为代表的核苷类药物。
干扰素,有抗病毒和激发免疫应答两方面的作用。干扰素使用效果个体差异大,对所有慢性乙型肝炎病人的完全应答率为30%~50%,完全应答的病人可能在3个月内使HBeAg、HBV-DNA转阴,且大多数结果稳定。但e抗原阴性慢性乙型肝炎患者对干扰素的反应性,比对e抗原阳性患者差,疗程至少1年才能获得较好疗效。干扰素开始用时普遍有发热反应,治疗期间多有疲乏,食欲略差,较重要的是近1/3的病人发生白细胞或血小板减少,偶可出现精神抑郁症状或诱导产生自身抗体和自身免疫性疾病,但是通用的剂量一般都能耐受,干扰素治疗期间激发免疫应答,ALT可能更高,肝炎症状可更明显,使较重的代偿性肝病失代偿,但是干扰素一般无耐药性突变。干扰素的适合治疗对象是慢性乙型肝炎,但干扰素不良反应较多,受到许多限制,如妊娠、精神病史、未经控制的自身免疫性疾病、失代偿性肝硬化、有症状的心脏病等都是绝对的禁忌症。
核苷类药物,目前在国内以拉米夫定为主。拉米呋啶(3TC)是一种人工合成的以左旋对映体构型存在的脱氧胞嘧啶类似物。拉米呋啶通过抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸聚合酶(HBV-DNAP)而抑制病毒的复制,起效快,对大部分患者有效,大约有10%的病人2周内血清病毒可下降至基础水平,但是这种抑制作用是可逆的,停药后易反弹,甚至病情加重。且随用药时间的延长发生耐药变异的比例增高,有研究显示:拉米呋啶治疗3年后,YMDD变异率可高达70%。拉米夫定最终抑制程度不及干扰素。另外,拉米呋啶对HBeAg的转阴率不及干扰素,且要坚持用药数年甚至更长的时间。,
其他核苷类似物,如阿德福韦(adefovir dipivoxil,ADV)、恩替卡韦(entecavir,ETV)、恩屈他滨(emtricitabine,ETC)等也能抑制HBV复制。但不良反应较多。如ADV是一种新的单磷酸腺苷类似物,对HBV野生株和YMDD变异株病毒有抑制作用,能使病人HBV-DNA水平迅速下降,但有明显的肾毒性,表现为肾小管酸中毒、轻度肾衰,停药后可恢复。ETV现已经完成III期临床研究,其安全性和耐受性与拉米呋啶相似,能抑制拉米呋啶耐药株的复制,但与拉米呋啶存在交叉耐药,发展前景似乎也不大。ETC疗效与拉米呋啶相似且耐受性好,但动物实验发现大剂量使用可能有致癌作用。
中药,近期新研发的成药(如肝复乐)和方剂不少,但尚乏能抑制HBV-DNA复制者,只能减轻肝内炎症活动,延缓肝损伤,防止发展至肝脏失代偿、肝硬化及肝癌,改善患者生存质量和延长生存时间。综上所述,权衡利蔽,目前仍然没有理想的抗乙肝新药,加强对新的抗HBV药物的研究已是当务之急。
近期,国内有人试图用蛞蝓多糖来治疗乙肝。刘群红、蔡霞等用蛞蝓多糖HepG2.2.15细胞做体外抗乙型肝炎病毒试验:以不同浓度的蛞蝓多糖和拉米夫定与HepG2.2.15细胞混合培养,通过MTT法检测药物的细胞毒性,9天后用ELISA法检测细胞培养液中的HBsAg和HBeAg分泌水平,用实时荧光定量PCR技术检测培养液中的HBV-DNA含量。结果:蛞蝓多糖在1mg·mL^-1浓度以下对细胞无毒性。蛞蝓多糖在所稀释的各浓度下,对HBsAg、HBeAg均有抑制作用,最大抑制率分别为56.2%和58.1%;HBsAg、HBeAg的治疗指数分别大于19.98%、22.78%。蛞蝓多糖可抑制HBV-DNA的复制(P<0.05)。揭示:蛞蝓多糖在体外具有显著抑制HBV的作用。蔡霞等还做了“蛞蝓多糖抗鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的作用”实验:采用先天感染DHBV的北京雏鸭为模型,随机分设0.9%氯化钠注射液模型对照组、拉米夫定组、蛞蝓多糖低、中、高3个剂量组,每组8只雏鸭均以20mg·kg-1·d-1灌胃给药10d.斑点杂交法观察用药前与用药后5d、10d及停药后5d血清中DHBV-DNA表达。结果:蛞蝓多糖不同剂量组对DHBV均有一定抑制作用.其中蛞蝓多糖的中、高剂量组于用药后第5天血清DHBV-DNA的吸光度A值为(0.66±0.14)、(0.73±0.26),第10天为(0.47±0.18)、(0.54±0.10),较0.9%氯化钠注射液对照组(1.61±0.54)、(1.20±0.51)明显降低,蛞蝓多糖的中、高剂量组对DHBV-DNA的抑制率于用药后第5天为24.14%、23.96%,第10天为45.98%、43.75%,与0.9%氯化钠注射液对照组相比明显提高。揭示蛞蝓多糖具有降低鸭血DHBV-DNA含量,抑制乙型肝炎病毒作用。
发明内容
本发明涉及从软体动物高突足襞蛞蝓(Vaginulus alte Ferussac)中,提取分离出一种能治疗乙型肝炎的新药,这种新药能有效的抑制HBV-DNA的复制,并降低E抗元的表达。本发明人在研究蛞蝓抗肺作用的同时,给15只HBV-DNA转基因感染的C57小鼠,用蛞蝓提取物两种不同部位“JK1”和“JK2”按400mg/kg.d灌胃,以拉米夫定作阳性对照,按40mg/kg.d灌胃给药15天验血、JK1组HBV-DNA考贝数有50%下降到正常(103)以下水平。而拉米夫定无变化;阴性对照组呈指数复制扩增。第30天血清学复查结果:JK1组HBV-DNA,100%下降到正常指标(103)以下。JK2和拉米夫定只有50%下降到正常水平;血清HbeAg(E抗元)定量(ng/ml)检测结果:对照组211.896±18.283;P为1。JK1 146.376±36.945;P=0.0256;JK2186.926±17.230,P=0.0940;拉米夫定组176.231±15.871,P=0.0430。证实蛞蝓有效提取部位JK1确有抑制HBV-DNA复制作用(与阴性对照组比较P<0.05),且比当今最好的治疗乙肝药拉米夫定还好。为蛞蝓研发成为治疗乙肝的新药,进一步提供了实验依据。
具体实施方式
【组分】单一高突足襞蛞蝓全虫提取分离成份;
【制备方法】将鲜蛞蝓或解冻蛞蝓反复匀浆一在50℃水浴锅搅拌提取4小时--过120目布袋离心--配成70%醇浓度浸出提取24小时-旋转蒸发回收乙醇-加入三氯乙酸调节PH=2--脱蛋白-搅拌60mim-120目布袋离心弃渣-过陶瓷超滤膜(200nm)脱水脱酸使PH值=6-7-真空冷冻干燥得蛞蝓有效部位JK1。加入相应辅料制成胶囊剂、片剂。工艺流程请见附图。“附图说明:附图是JK提取分离工艺流程。”
Claims (4)
1.该发明JK1是从高突足襞蛞蝓中提取分离出来的有效部位,其化学成份有待进一步研究。
2.该发明JK1是经蛞蝓匀浆、水提、醇沉、三氯乙酸脱蛋白,特别是经过200nm超滤膜和真空冷冻干燥等高新技术和工艺而制得的纯天然原创性新药原料。
3.该发明JK1对乙型肝炎病毒的脱氧核糖核酸(HBV-DNA)有明显的抑制作用,并可降低乙肝病毒E抗原(HbeAg)的表达。
4.该发明JK1有可能研发成为治疗乙型肝炎的一线新药。
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