CN102692471A - 一种检测乳腺癌淋巴结转移特征蛋白的质谱试剂 - Google Patents

Abstract

本发明建立了一种检测乳腺癌淋巴结转移的血清蛋白质谱模型，本发明发现了乳腺癌淋巴结转移的血清蛋白中具有51个特征蛋白，选取其中任意两个或两个以上蛋白，并用质谱分析，可检测乳腺癌淋巴结转移。本发明根据所述质谱模型，开发了用质谱方法检测血清中特异蛋白的试剂和试剂盒。

Description

一种检测乳腺癌淋巴结转移特征蛋白的质谱试剂

技术领域：

本发明涉及一种乳腺癌淋巴结转移蛋白的检测试剂，特别是用质谱检测乳腺癌淋巴结转移特征蛋白的试剂。

背景技术：

乳腺癌的发生是一个多基因突变导致抑癌基因失活、癌基因活化的过程。基因组学研究由于自身的限制难以完全阐明基因与蛋白质参与过程及其具体作用，而近年来蛋白质组学的发展为人们从整体上了解恶性肿瘤的发生、发展提供了较为理想的技术平台。目前临床上对恶性肿瘤预后评估主要依赖于临床表现、病理学及传统肿瘤标志(tumor marker)，但肿瘤早期复发或转移时常常无明显临床表现，而病理学证据很难得到且重复性差。乳腺癌在世界范围内其发病率都比较高，在美国每年的新发乳腺癌病人占女性各种恶性肿瘤的1/3。在我国乳腺癌发病率也已居女性各种恶性肿瘤前列。虽然对于乳腺癌的治疗已经取得了实质性的进展，预防和早期发现仍是降低乳腺癌死亡率的有效途径和提高患者成活率的关键。但目前的检测方法敏感性和特异性均较低，已成为乳腺癌早期检测的一个瓶颈。

乳腺癌的高发病率和高死亡率使得人们不断地寻求一种有效的早期检测方法，临床上仅以CA153一种蛋白作为血清学检测指标在敏感性和特异性上是远远不足的，而影象学检测一旦发现占位病变则已经不是很早期了。能够使疾病在发生的极早期就能够得已发现，并得到控制和治疗，进而大大提高治愈率或明显改善病人的预后和生活质量。近年来随着临床蛋白质组学的开展，使得乳腺癌的早期发现成为可能。

蛋白质的分离技术在蛋白质组学中应用分离技术有两个目的。第一、通过将蛋白质的混合物分离成单一蛋白质或蛋白质小组以简化复杂的蛋白质混合物；第二、通过标记的方法可以比较两个蛋白质的混合物样品中蛋白质的不同表现。其中主要的技术有双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)、高效液相层析(high-performanceliquid chromatography，HPLC)、毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)、亲和层析(affinity choromatography)、蛋白芯片(protein microarray)、磁性微球(magneticbeads，简称磁珠)和免疫组等。特别是蛋白芯片和磁珠两项新的蛋白指纹图谱技术克服了以往技术的缺点，具有高灵敏度、高通量、结果重复性好、可机械化操作和方法灵活等特点。待测样品来源广泛，不需作特殊前处理，可以直接点样检测，如血清、尿液及组织液等；检测快速，一般一例标本的检测时间仅需约5分钟，从标本制备到出结果全过程仅约1小时。蛋白芯片和磁珠两项新的蛋白指纹图谱技术有可能在体液中潜在生物标志(biomarker)检测方面创造革命性突破(许洋，蛋白质指纹图谱技术在实验诊断与临床医学中的研究进展，基础医学与临床，2007，27：134-142；Wang QT，et al.Constructionof a multiple myeloma diagnostic model by magnetic bead-based MALDI-TOF massspectrometry of serum and pattern recognition software.Anat Rec(Hoboken).2009：292：604-610)。二维电泳2-DE最先被用于临床蛋白组学研究，但其对疏水性、强酸性和强硷性蛋白的分辩率不够，而且不能检测低丰度蛋白，故实用价值受限。近来，蛋白芯片与质谱技术的结合，已被成功地用于肿瘤研究；但由于磁珠表面的结合面积远远大于蛋白芯片，从而磁珠的灵敏性比蛋白芯片更高(刘建栋等，血液蛋白质组与质谱仪检测流程标准化初探。基础医学与临床，2007，27：193-197)。磁珠具有优于二维电泳、蛋白芯片和其他质谱方法的特点，已被广泛地用于肿瘤等生物标志的筛查等研究(屠世良等，癌胚抗原阴性结直肠癌的检测和结直肠癌预后相关生物标志，基础医学与临床，2007；颜怀军等，应用蛋白质组学技术对脂肪肝患者血清标志物的筛选.世界华人消化杂志2008，16：3904-3909)。该技术具有操作简便、无需离心样品、可直接分析原始生物样本(如血清、尿液等)、样本用量小等特点，同时适合多样品平行检测和直接进行蛋白质全景式的搜索和分析，特别是对小分子量蛋白和低丰度蛋白具有较高的捕获效果，可以与其他蛋白质组学方法互补，目前已被广泛地用于肿瘤标志的筛查和临床检测，并均已获得很好的结果。但国内迄今尚无采用磁珠与液相色谱质谱联用仪(liquid chromatography massspectrometry，LC-MS)获得检测乳腺癌淋巴结转移血清特征蛋白的报道。液相色谱质谱联用仪的优势为测定蛋白的质荷比m/z的精确度要比激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)高，质荷比m/z误差＜0.001％。

发明内容：

本发明的目的是提供一种新的检测乳腺癌淋巴结转移的方法和试剂，通过建立检测乳腺癌淋巴结转移特征蛋白的优化质谱模型，提供用质谱法检测乳腺癌淋巴结转移特征蛋白的试剂。

本发明通过能与蛋白质结合的磁珠基质去捕获生物标志，并用有定量控制的质谱分析来检测乳腺癌淋巴结转移生物标志。

本发明建立了一种检测乳腺癌淋巴结转移的血清蛋白质谱模型，其特征在于：包括选自51个特征蛋白中任意两个或两个以上蛋白；所述特征蛋白质荷比m/z和临界峰值均值K分别为m/z＝5643，K≤5.84；m/z＝4651，K≤11.28；m/z＝2377，K＞6.19；m/z＝2240，K＞9.35；m/z误差＜0.001％，临界峰值均值K的变异系数CV＜5～10％。

从血清中筛选出51蛋白作为特征蛋白；选取上述51个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值K，建立了乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱模型。

上述质谱模型是采用以下步骤制备而得的：

1)4℃条件下2小时内收集乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者的血清两组血清标本，在-80℃低温冷冻备用；

2)采用WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠对所述两组血清标本的蛋白进行吸附；

3)用电喷雾电离已洗脱的血清蛋白后用液相色谱质谱联用仪对结合在表面的WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠上的两组血清蛋白进行读取，由此获得两组蛋白质谱图谱；

4)在每次实验数据收集前，用标准蛋白及质谱的标准化质控O型血清校正仪器，使蛋白质分子量误差＜0.001％和临界峰值均值K的变异系数CV＜5～10％，并精确地、定量地收集乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者优化的血清质谱图谱数据；

5)对所得数据进行统计学处理，根据乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者血清之间蛋白峰的差异，检测出2组血清蛋白质谱图谱之间有51个稳定的差异蛋白及其临界峰值；将所述51个差异蛋白作为乳腺癌淋巴结转移蛋白质谱模型的特征蛋白；

6)选取所述51个特征蛋白中任意两个或两个以上的蛋白，以各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值K构成用于检测乳腺癌淋巴结转移血清特征蛋白质谱模型；其中所述的特异蛋白质所述特征蛋白质荷比m/z和临界峰值均值K分别为m/z＝5643，K≤5.84；m/z＝4651，K≤11.28；m/z＝2377，K＞6.19；m/z＝2240，K＞9.35；m/z误差＜0.001％，临界峰值均值K的变异系数CV＜5～10％。

具体操作步骤如下：

1)4℃条件下2小时内收集经病理明确诊断的乳腺癌无淋巴结转移患者血清及经病理确定为乳腺癌有淋巴结转移的血清作为两组血清标本，进行-80℃低温冷冻备用；病人血清样本随后被分成两组：一组为训练集，另一组为盲测组；

2)采用阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠对所述乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者的两组血清标本的蛋白进行吸附；

3)用电喷雾电离已洗脱的生物标志后，用液相色谱质谱联用仪对结合在表面的WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠上的两组血清蛋白进行读取，设定最高检测分子量为30kDa，优化分子量范围1000～17000Da，最佳聚集中心9000Da，数据采集参数范围20～80，激光强度150～180，检测敏感度为7～8，收集总数为100次，由此获得两组蛋白质谱图谱；

4)在每次实验数据收集前，用标准蛋白及质谱的标准化质控O型血清校正仪器，用2746±1Da、5909±1Da、6634±1Da标准峰为质谱内标定性(分子量)质控标准，使m/z误差＜0.001％，从而获得的精确的蛋白质谱图谱；

5)定量性质谱调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da等强度调至50％信号强度的最大值，使临界峰值均值K的变异系数CV＜5～10％，并收集精确的质谱图谱数据；

6)对所得数据进行Mann-Whitney U检验统计学处理，根据乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者血清之间蛋白峰值的差异(认定P值小于0.05时具有统计学意义)，检测出2组血清蛋白指纹质谱图谱之间有51个稳定的差异蛋白，见表1：

表1乳腺癌淋巴结转移和对照组的51个差异峰

m/z表示质荷比；

P由乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移组的对照产生；

标志着‘▲’的峰被选为乳腺癌淋巴结转移检验模型的标记峰；

图1在训练数据组的决定树分类图表：母节点(Node1)，子节点(Node2-4)，和终节点(Terminal Node 1-5)；N及W代表对照组、病人的数量。在母节点和子节点下面的数目M是代表蛋白峰的质荷比。比如，在母节点的M5643_49代表质荷比5643.49。如当Node1中m/z＝5643，K≤5.84时，Node 2中m/z＝4651，K≤11.28时提示乳腺癌淋巴结转移；当Node3m/z＝2377，K＞6.19；当Node4 m/z＝2240，K＞9.35时提示乳腺癌淋巴结转移。按决定树分类图表的原则，将特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值K：m/z＝5643，K≤5.84；m/z＝4651，K≤11.28；m/z＝2377，K＞6.19；m/z＝2240，K＞9.35输入计算机用软件运算后，可产生代表性质谱模型的提示结果。本发明可用于计算机软件产品中新的应用，如开发新软件产品。

将上述51个差异蛋白作为乳腺癌淋巴结转移质谱检验模型的特征蛋白；

由于多个特征蛋白组合起来才可将乳腺癌无淋巴结转移与乳腺癌有淋巴结转移等完全分开，故选取上述51个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值K，建立了乳腺癌无淋巴结转移与乳腺癌有淋巴结转移两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱模型(图1-2)，所说的特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值K分别为m/z＝5643，K≤5.84；m/z＝4651，K≤11.28；m/z＝2377，K＞6.19；m/z＝2240，K＞9.35(表2)。

利用该质谱模型，只要将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值K与本发明质谱模型逐一进行对比分析，就可用于乳腺癌淋巴结转移检验。

表2乳腺癌无淋巴结转移与乳腺癌有淋巴结转移的蛋白峰谱统计

利用该质谱模型(图1、表2)，将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值K与本发明的质谱模型逐一进行对比分析，经临床试用及双盲测试，其鉴别30例乳腺癌有淋巴结转移与35例乳腺癌无淋巴结转移组的敏感性为90.00％，特异性为97.14％：对全盲测试组(30例乳腺癌有淋巴结转移和35例乳腺癌无淋巴结转移)分析，从30例有淋巴结转移标本中正确的区分出了27例(90.00％)，在35例无淋巴结转移的对照组中正确的区分出了34例(97.14％)(表3)。

表3乳腺癌淋巴结转移检测模型的预测结果

利用C8及C18疏水基质磁珠的实验结果与上述WCX阴离子基质磁珠的实验结果一致。

本发明根据上述质谱模型，还提供了一种用质谱方法检测生物样品中特异蛋白的试剂，其特征在于：含有能与特异蛋白质结合的磁珠基质，所述磁珠是可吸附样品中蛋白质WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠。

所述特异蛋白是乳腺癌淋巴结转移中的蛋白。

本发明的试剂的使用方法如下：

1)取样：4～6℃条件下收集待测者的血清标本，在-80℃低温冷冻备用；

2)用本试剂中的磁珠对血清标本的蛋白进行吸附及用标准的质谱前处理(细见实施例1)；

3)用电喷雾电离已洗脱的血清蛋白后，用液相色谱质谱联用仪对结合在磁珠上的血清蛋白进行读取，获得蛋白质谱图谱；

4)与特征蛋白质谱模型进行对比

选取蛋白质谱模型中51个特征蛋白中任意两个或两个以上的蛋白，对比各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值K。

本发明用所述的试剂开发了检测试剂盒，按盒中说明书的操作方法可用于检测乳腺癌淋巴结转移。

所述试剂盒中含有通常检测蛋白质常规的其它试剂和设备，如U9处理液(9mol/L尿素，2％CHAPS，1％DTT，50mmol/L Tris-CL，pH9.0)、WCX磁珠(弱阴离子表面，羧酸基团)、C8及C18(疏水基团)磁珠、磁珠结合缓冲液(50mmol/L NaAc，pH 4.0～4.3)、ElutionBuffer、SPA(Sinapinic Acid)饱和溶液。这些试剂和设备，本领域普通技术人员均熟知。如试剂盒，还含有可用质谱仪进行分析的阳性对照与阴性对照，标准化质控O型血清等。

本发明的特点及效果：

本发明与其他乳腺癌淋巴结转移的检测方法比较，具有以下优点：

第一、本发明采用乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者具有差异的多个特征蛋白组合起来进行对乳腺癌淋巴结转移血清的检测，提供的质谱模型是乳腺癌淋巴结转移早期检测和筛查的新方法和新途径，并为进一步发现新的乳腺癌淋巴结转移生物标志提供了基础；

第二、与以往的血清学检测方法比较具有较高的敏感性和特异性，是一种在蛋白组学水平上的检测，对乳腺癌淋巴结转移的早期检测提供了新标准；

第三、本发明由于磁珠表面的结合面积远远大于蛋白芯片，从而磁珠的灵敏性比蛋白芯片更高而具有了更高的灵敏度，从而优化了质谱模型；

第四、本发明首创采用了定量性质谱调控，变异系数CV＜5～10％，使磁珠的临界峰值均值K比蛋白芯片更可靠及精确；

第五、本发明采用了更高精确度的质谱仪，使m/z误差＜0.001％，从而获得的精确的蛋白质谱图谱；

第六、本发明质谱模型的构建方法设计精确及合理可行，为降低我国乳腺癌淋巴结转移的病死率、提高乳腺癌淋巴结转移的临床治愈提供了一种新的筛查和复发的评估方法。

附图说明

图1在训练数据组的决定树分类图表：母节点(Node1)，子节点(Node2-4)，和终节点(Terminal Node 1-5)；N及W代表对照组、病人的数量。在母节点和子节点下面的数目M是代表蛋白峰的质荷比。比如，在母节点的M5643_49代表质荷比5643.49。如当Node1中m/z＝5643，K≤5.84时，Node 2中m/z＝4651，K≤11.28时提示乳腺癌淋巴结转移；当Node3m/z＝2377，K＞6.19；当Node4m/z＝2240，K＞9.35时提示乳腺癌淋巴结转移。按决定树分类图表的原则，将特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值K：m/z＝5643，K≤5.84；m/z＝4651，K≤11.28；m/z＝2377，K＞6.19；m/z＝2240，K＞9.35输入计算机用软件运算后，可产生代表性质谱模型的提示结果。本发明可用于计算机软件产品中新的应用，如开发新软件产品。

图2乳腺癌淋巴结转移代表性的质谱峰：在图2的4张图中，有4个蛋白标记物，质荷比m/z为4651、5643、2240、2377；其中每张图的上部三个小图是代表乳腺癌无淋巴结转移的校准图；下部三个小图是代表乳腺癌有淋巴结转移的校准图。横轴代表特异蛋白峰的m/z，纵轴代表特异蛋白的峰值相对强度。

具体实施方式

本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。实施例中实验材料来源如下：

阴离子的WCX磁珠(赛尔WCX)、C8及C18的疏水基质磁珠(赛尔

C8及C18)、Elution Buffer(赛尔

EB)和标准化质控O型血清(赛尔标血O)购买于湖州赛尔迪生物医药科技有限公司；

9mol/L尿素，2％CHAPS，i％DTT，50mmol/L Tris-CL；100mmol/L NaAc；SPA(SinapinicAcid)饱和溶液；标准蛋白购买于美国Sigma公司。

实施例1乳腺癌无淋巴结转移与乳腺癌有淋巴结转移患者的区分及质谱的试剂盒制备

(1)实验方法

此研究中应用的所有连续的47个乳腺癌无淋巴结转移与54个乳腺癌有淋巴结转移患者的病人。他们的平均年龄是55岁(从47岁到81岁)。这些病人的血样是从血清收集的。101例非乳腺癌的对照血清样本，来自于健康志愿者。

磁珠操作步骤

血清样品处理：从-80℃冰箱中取出血清，于4℃，10000rpm离心5min。取10μL血清样品，加20μL U9处理液(9mol/L尿素，2％CHAPS，1％DTT，50mmol/L Tris-CL，pH9.0)，充分混匀，冰浴振荡30min后取出，加入360μL结合缓冲液(100mmol/L NaAc，pH4.0)，立即混匀。所有样本在分析前仅被冻溶一次(刘建栋等，血液蛋白质组与质谱仪检测流程标准化初探。基础医学与临床，2007，27：193-197)。病人和血清样本随后被分成两组：一组为训练集，另一组为盲测组。

磁珠上样及洗脱：将处理好的样品100μL加至已装好WCX磁珠(弱阴离子表面，羧酸基团，捕获正电荷基团蛋白)的PCR管中，置磁性处理器上孵育30min，除去液体。加100μL磁珠结合缓冲液(50mmol/L NaAc，pH 4.0～4.3)至已装好WCX磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育2分钟，除去液体，重复上述操作2次。加10μL Elution Buffer 2min，洗脱标本至上清液。取5μL上清液移至另一个PCR管中，加入5μLSPA饱和溶液充分混匀，取1μL混合溶液加样到液相色谱质谱联用仪(液相色谱质谱联用仪的英文缩写为LC-MS)的电喷雾器中，电离已洗脱的生物标志。

数据收集

用液相色谱质谱联用仪进行蛋白质谱分析。在读取数据前，用加有标准蛋白质(外标)来校正质谱仪，使分子量误差＜0.01％。本研究中阅读仪的主要参数设定为，最高检测分子量为30kDa，优化分子量范围1000～17000Da，最佳聚集中心9000Da，数据采集参数范围20～80，收集总数为100次。软件中设定读片程序，以读取数据。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至50％质谱信号强度的最大值。用2746±1Da、5909±1Da、6634±1Da标准峰为质谱内标定性(分子量)质控标准，使m/z误差＜0.001％，从而获得的精确的蛋白质谱图谱。

统计学分析

应用软件分析处理所有峰谱，形成蛋白质谱图谱。所有的图谱都进行了标准化，统一到它们自己全部的离子总数(峰面积的总和)。将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至40～50％信号强度的最大值，并且用最显著的峰进行了校正，而后又进行了“减少基线”，定义蛋白峰(s/n＞5，最小的峰强度＞1.6)。分析所有1～30kDa之间的蛋白峰，并且仔细检查了每个相应的峰，计算出峰的平均值K，标准误差(SD)和变异系数(CV)。用Mann-Whitney U检验比较配对样本的蛋白峰，计算P值。

乳腺癌淋巴结转移检测多肽蛋白筛选

用Mann-Whitney U检验比较配对样本的蛋白峰，变异系数CV＜5～10％；初步分析筛选出P＜0.05的乳腺癌淋巴结转移患者与对照组有51个差异多肽蛋白，不同峰的m/z及特征蛋白的表达变化见表4：

表4乳腺癌淋巴结转移和对照组的51个差异峰

m/z表示质荷比；

P由乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移组的对照而产生；

标志着‘▲’的峰被选为乳腺癌淋巴结转移检验模型的标记峰；

图1在训练数据组的决定树分类图表：母节点(Node1)，子节点(Node2-4)，和终节点(Terminal Node 1-5)；N及W代表对照组、病人的数量。在母节点和子节点下面的数目M是代表蛋白峰的质荷比。比如，在母节点的M5643_49代表质荷比5643.49。如当Node1中m/z＝5643，K≤5.84时，Node2中m/z＝4651，K≤11.28时提示乳腺癌淋巴结转移；当Node3m/z＝2377，K＞6.19；当Node4m/z＝2240，K＞9.35时提示乳腺癌淋巴结转移。按决定树分类图表的原则，将特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值K：m/z＝5643，K≤5.84；m/z＝4651，K≤11.28；m/z＝2377，K＞6.19；m/z＝2240，K＞9.35输入计算机用软件运算后，可产生代表性质谱模型的提示结果。本发明可用于计算机软件产品中新的应用，如开发新软件产品。

将上述51个差异蛋自作为乳腺癌淋巴结转移质谱检验模型的特征蛋白；

实施例2临床试用及双盲测试

由于多个特征蛋白组合起来才可将乳腺癌无淋巴结转移与乳腺癌有淋巴结转移等完全分开，故选取上述51个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值K，建立了乳腺癌无淋巴结转移与乳腺癌有淋巴结转移两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱模型(图1-2)，所说的特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值K分别为m/z＝5643，K≤5.84；m/z＝4651，K≤11.28；m/z＝2377，K＞6.19；m/z＝2240，K＞9.35(表5)。

利用该质谱模型，只要将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值K与本发明质谱模型逐一进行对比分析，就可用于乳腺癌淋巴结转移检验。

表5乳腺癌无淋巴结转移与乳腺癌有淋巴结转移的蛋白峰谱统计

利用该质谱模型(图1、表5)，将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值K与本发明的质谱模型逐一进行对比分析，经临床试用及双盲测试，其鉴别30例乳腺癌有淋巴结转移与35例乳腺癌无淋巴结转移组的敏感性为90.00％，特异性为97.14％；对全盲测试组(30例乳腺癌有淋巴结转移和35例乳腺癌无淋巴结转移)分析，从30例有淋巴结转移标本中正确的区分出了27例(90.00％)，在35例无淋巴结转移的对照组中正确的区分出了34例(97.14％)(表6)。

表6乳腺癌淋巴结转移检测模型的预测结果

利用C8及C18疏水基质磁珠的实验结果与上述WCX阴离子基质磁珠的实验结果一致。

本发明可以应用到已经脱离人体的体液中的乳腺癌淋巴结转移生物标志组合的检测方法或试剂盒，为一种新的非侵入性的体外质谱检测方法。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.一种用液相色谱质谱联用仪的方法检测人体血清样品中特异蛋白的试剂，其特征在于：特异蛋白是乳腺癌淋巴结转移的蛋白，含有能与特异蛋白质结合的磁珠基质，所述磁珠是可吸附样品中蛋白质的WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠。

2.一种检测试剂盒，其特征在于：含有试剂盒操作方法的说明书；

含有阳性对照与阴性对照，所述对照可用液相色谱质谱联用仪进行分析；

将待检样品中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值K与所述选自51个特征蛋白中任意两个或两个以上蛋白逐一进行对比分析，所述特征蛋白质荷比m/z和临界峰值均值K分别为m/z＝5643，K≤5.84；m/z＝4651，K≤11.28；m/z＝2377，K＞6.19；m/z＝2240，K＞9.35；质荷比m/z误差＜0.001％，临界峰值均值K的变异系数CV＜5～10％。

3.人体血清样品中特异蛋白的试剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)4℃条件下2小时内收集乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者的两组血清样品，在-80℃低温冷冻备用；

2)采用WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠对所述两组血清样品的蛋白进行吸附；

3)用液相色谱质谱联用仪对结合在表面的WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠上的两组血清蛋白进行读取，由此获得两组蛋白质谱图谱；

4)在每次实验数据收集前，用标准蛋白及质谱的标准化质控O型血清样品校正仪器，使质荷比m/z误差＜0.001％和临界峰值均值K的变异系数CV＜5～10％，并精确地、定量地收集乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者优化的血清质谱图谱数据；

5)对所得数据进行统计学处理，根据乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者两组血清样品之间蛋白峰的差异，检测出两组血清蛋白质谱图谱之间有51个稳定的差异蛋白及其临界峰值；

6)将待检样品中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值K与所述选自51个特征蛋白中任意两个或两个以上蛋白逐一进行对比分析，所述特征蛋白质荷比m/z和临界峰值均值K分别为m/z＝5643，K≤5.84；m/z＝4651，K≤11.28；m/z＝2377，K＞6.19；m/z＝2240，K＞9.35；质荷比m/z误差＜0.001％，临界峰值均值K的变异系数CV＜5～10％。

4.权利要求3所述的人体血清样品中特异蛋白的试剂的制备方法，其特征在于：将待检样品中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值K与所述选自51个特征蛋白中任意两个或两个以上蛋白逐一进行对比分析。

5.权利要求4所述的人体血清样品中特异蛋白的试剂的制备方法，其特征在于：所述待检样品中相应蛋白是质荷比为5643、4651、2377、2240的特征蛋白。

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