CN102680629B - 安胃疡胶囊指纹图谱的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种甘草提取物胶囊，优选为安胃疡胶囊的指纹图谱建立方法。本发明所提供的采用高效液相色谱法检测甘草提取物胶囊中黄酮类化合物的含量，其中所述高效液相色谱的条件如下：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶填充相；流动相为体积比为22:78~75:25的乙腈和0.01~0.1%的三氟醋酸，进行梯度洗脱；流速为0.5~1.5mL/min；柱温为25~40℃；紫外检测波长为270nm。本发明提供的方法简便、稳定、精密度高、重现性好，能有效表征甘草提取物胶囊的质量，有利用于监控产品的质量。
Description
技术领域
本发明属于药物分析检测领域，涉及一种甘草提取物胶囊指纹图谱的建立方法。
背景技术
随着现代药物分析技术的发展，指纹图谱技术是当今国际公认的控制中药质量的质控模式，它在原药材的栽培、引种，中成药生产工艺的规范与优化，产品质量标准的制定等方面都提供全方位的质量保证。
近年来，国外对中草药产品的质量评价也在提倡指纹图谱。随着各种分析技术的创新和提高以及计算机应用技术的不断发展，世界各国对天然药物的了解和研究在不断深入，中药指纹图谱技术在国内外已成为一种发展趋势，其研究的方法和技术更趋成熟完善，成为国际公认的控制中药和天然药质量最有效的方法和手段。日本汉方药在20世纪80年代就采用高效液相指纹图谱控制质量。欧共体也将指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制，美国食品药品管理局（FDA）允许草药保健品申报资料时提供色谱指纹图，要求植物药在质量控制方面，必须制订指纹图谱的检测标准。世界卫生组织在1996年草药评价指导原则中也规定：如果草药的活性成分不明，可以提供色谱指纹图以证明产品质量的一致性。英国、印度、加拿大等国家在植物药的研究中，也对指纹图谱十分重视。在许多国家的药典中，色谱指纹图谱已成为主要的分离分析方法。目前，国外许多研究机构对中药指纹图谱的研究主要为建立指纹图谱与药效的相关性研究，是以中药理论和新药开发研究体系为主的模式。
在我国药典的中药部分，这一分析技术还未占主导地位。在医药科技“十五”计划中，重点提出解决中药材质量规范化问题。2000年，国家药品监督管理局颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，要求中药注射剂必须进行指纹图谱的研究，并建立其相关的标准。规范了中药指纹图谱的研究，从而促进了国内近几年来对指纹图谱的研究热潮。我国对中药指纹图谱的研究尚处于初级阶段，与发达国家相比有一定差距。目前主要为使用各种方法建立中药材及制剂的指纹图谱，以及对相应信息进行数字化处理，使其能够评价和控制中药材及制剂的质量。
影响中药及民族药发展的最重要原因之一是无法确定其有效成分的质与量，自从指纹图谱被发现应用到中药及民族药的质量控制这一领域，得到国家的大力支持与推广，国内许多大学及研究所都在开展这方面的工作，并获得了一定的成功，如银杏叶、板蓝根等。国内一些知名制药企业开始研究使用色谱技术提高中药材及其产品的质量控制标准，随着检测技术与仪器的发展经过十多年的努力，已有数个中药品种（针剂）的指纹图谱获得成功，但利用指纹图谱技术在中药固体制剂领域的产业化研究还没有普及，只有少数几家著名的有实力的制药企业取得几个中药产品的指纹图谱并应用于生产（白云山药业的板兰根颗粒）。
高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱具有分离效率高，分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点。不受样品挥发度和热稳定性的限制，样品中大多数成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测，是构建指纹图谱的主要方法之一。
安胃疡胶囊的内容物为甘草提取物，具有补中益气，解毒生肌，抑制胃液分泌，修复和保护胃粘膜的效果，适用于胃及十二指肠球部溃疡，对虚寒型和气滞型患者疗效较好，还可用于溃疡愈合后的维持治疗。目前的质量标准是检查安胃疡胶囊中几十种总黄酮类化合物的总含量，无法体现各种黄酮的特征，质量没有得到真正有效的控制，例如安胃疡胶囊现行的质量标准编号为WS3-002-(Z-002)-98-(Z)，其中规定其总黄酮含量测定的方法为重量法，由于重量法操作误差较大，受人为因素的影响较大，故重现性较差。
发明内容
本发明利用HPLC-TOF-MS技术，用不同的色谱方法指认若干个黄酮单体化合物，找出其具有特征的指纹特性，建立了安胃疡胶囊中黄酮类成分的高效液相色谱特征图谱。获得这类化合物的色谱条件，建立指纹档案，使这类化合物的质量得以真正控制，为安胃疡胶囊质量标准的提高提供技术支撑，也为其产品的可控可靠提供依据。
因此，本发明的目的是，提供一种甘草提取物胶囊，例如安胃疡胶囊的指纹图谱建立方法。
本发明的另一个目的是，提供一种甘草提取物胶囊，例如安胃疡胶囊的检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
一方面，本发明提供一种甘草提取物胶囊，优选为安胃疡胶囊的指纹图谱建立方法，所述方法包括采用高效液相色谱法检测甘草提取物胶囊，优选为安胃疡胶囊中黄酮类化合物的含量，其中所述高效液相色谱的条件如下：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充相；流动相为体积比为22:78~75:25的乙腈和0.01~0.1%（体积比）的三氟醋酸水溶液进行梯度洗脱；流速为0.5~1.5 mL/min；柱温为25~40℃；紫外检测波长为270nm；理论塔板数按查尔酮A峰计算，应不低于3000。
优选地，所述方法还包括通过以下方法制备对照品溶液：取甘草查尔酮A对照品，加入70%（体积比）乙醇水溶液制成每1ml含0.8mg的溶液，作为对照品溶液。
优选地，所述方法还包括通过以下方法制备供试品溶液：取甘草提取物胶囊内容物0.1g，置25ml量瓶中，加70%（体积比）乙醇水溶液20ml，超声提取5分钟，取出，放冷，以70%乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，用0.2μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
在一个优选的实施方案中，本发明提供的方法包括如下步骤：
（1）对照品溶液的制备：取甘草查尔酮A对照品，加入70%（体积比）乙醇水溶液制成每1ml含0.8mg的溶液，作为对照品溶液；
（2）供试品溶液的制备：取甘草提取物胶囊内容物0.1g，置25ml量瓶中，加70%（体积比）乙醇水溶液20ml，超声提取5分钟，取出，放冷，以70%（体积比）乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，用0.2μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；以及
（3）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定，得到指纹图谱：
色谱柱：Agela Venusil MP 5μm C18-100Å 4.6×250mm；
流动相：体积比为22:78~75:25的乙腈和0.01%（体积比）的三氟醋酸水溶液，进行梯度洗脱；
流速：1.0 mL/min；
柱温：30 ℃；
紫外检测波长：270 nm。
优选地，所述梯度洗脱程序按如下体积比设置进行：
0分钟时，流动相为22%的乙腈和78%的0.01%（体积比）的三氟醋酸水溶液；
10分钟时，流动相为25%的乙腈和75%的0.01%（体积比）的三氟醋酸水溶液；
15分钟时，流动相为30%的乙腈和70%的0.01%（体积比）的三氟醋酸水溶液；
25分钟时，流动相为35%的乙腈和65%的0.01%（体积比）的三氟醋酸水溶液；
40分钟时，流动相为45%的乙腈和55%的0.01%（体积比）的三氟醋酸水溶液；
80分钟时，流动相为60%的乙腈和40%的0.01%（体积比）的三氟醋酸水溶液；
90分钟时，流动相为75%的乙腈和25%的0.01%（体积比）的三氟醋酸水溶液；
100分钟时，流动相为75%的乙腈和25%的0.01%（体积比）的三氟醋酸水溶液。
优选地，所述建立的指纹图谱中包括7个特征峰，且所述各特征峰的相对保留时间分别为：0.52±0.05（峰1）、0.65±0.05（峰2）、0.80±0.05（峰3）、0.93±0.05（峰4）、1.00±0.05（S峰）、1.07±0.05（峰6）、1.15±0.05（峰7）。
另一方面，本发明提供一种检测甘草提取物，例如安胃疡胶囊中黄酮类化合物的方法，所述方法采用上述方法建立的指纹图谱来检测甘草提取物，例如安胃疡胶囊中的黄酮类化合物。
可见，本发明人研究用不同的色谱方法找出其具有特征的指纹特性，获得这类化合物的色谱条件，建立指纹档案，使这类化合物的质量得以真正控制，为安胃疡胶囊质量标准的提高提供技术支撑。具体地，通过文件检索和方法学论证，摸索色谱条件（峰种类、峰面积、保留时间），比较种类与含量，利用高效液相法建立适用于安胃疡胶囊的指纹图谱，提高安胃疡及其制剂的质量标准，使产品质量可控可靠；根据指纹图谱，选择利用原料，提高产品收率，增加经济效益。
本发明提供的方法简便、稳定、精密度高、重现性好，能有效表征甘草提取物胶囊（例如安胃疡胶囊）的质量，有利用于监控产品的质量。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1A为实施例2中样品峰指认图谱；
图1B为实施例2中对照品峰叠加图谱；
图2为本发明提供的安胃疡胶囊的指纹图谱；
图3为实施例4中精密度考察的色谱结果图；
图4为实施例4中稳定性考察的色谱结果图；
图5为实施例4中重复性考察的色谱结果图。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
以下各实施例中所使用的对照品来源如下：
甘草苷，购自中国药品生物制品检定所，批号：111610-200604；甘草酸铵，购自中国药品生物制品检定所，批号：111731-200614；甘草查耳酮A，购自上海同田生化技术有限公司，批号：10091421。
以下各实施例中所使用的供试品可购自新疆全安药业有限公司，其制备方法如下：取经提取甘草浸膏或甘草酸粉后的甘草渣，用93%以上的乙醇水溶液提取两遍，每遍1小时，合并提取液浓缩至稠膏状，加2.0%的碳酸钠溶液溶解，沉淀24小时，取上清液用10.0%的盐酸中和至PH值2-3，过滤，沉淀物用纯化水洗涤至pH值6，沉淀物经40-50℃干燥后，即得甘草提取物。取甘草提取物，用5%的淀粉浆制粒，干燥，整粒，总混，填充胶囊，铝塑包装，装盒，即得甘草提取物胶囊。
以下各实施例中所使用的色谱仪为美国Agilent 1100系列（G1322A在线真空脱气机，G1311A四元梯度泵，G1313A自动进样器，G1316A柱温箱，G1315B二极管阵列检测器）。
实施例1 供试品溶液的制备
本实施例从以下几方面对供试品溶液的制备方法进行了考察。
1、提取溶剂
以水、30%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液、70%乙醇水溶液、无水乙醇为提取溶剂，采用超声提取方法，对同一批供试品进行了提取溶剂考察。
结果表明（图未示出），水及30%乙醇水溶液提取率过低，且40min后色谱峰成分几乎未提取出来，50%乙醇水溶液与70%乙醇水溶液提取效果相当，无水乙醇提取率低于50%乙醇水溶液及70%乙醇水溶液，因此选用与药典中含量测定方法相同的70%乙醇水溶液作为供试品提取溶剂。
2、供试品取样量
分别精密称取安胃疡胶囊内容物0.02g、0.05g、0.1g、0.2g置25ml量瓶中，以70%乙醇水溶液为溶剂，超声提取30分钟，制备供试品。
结果表明，取样量0.02~0.05g，图谱（未示出）中较多色谱峰响应值相应较低，而取样0.1、0.2g各色谱锋成分在图谱中均能明显显示，考虑色谱柱的保护，选则0.1g作为供试品取样量。
3、提取时间考察
在取样量考察时，发现胶囊内容物较易溶解，因此考察提取时间时分别考察了超声时间15、30、45分钟的提取效果，并同时使用人工振摇的方法制备了一份供试品。
结果发现，四种方法几乎无差异，但振摇提取需大力振摇才能使样品全部溶解，比较费力，因此又考察了超声5分钟助溶的方法，对比图谱（未示出），亦无差异，因此选择易操作的超声5分钟助溶的方法制备供试品。
实施例2 色谱条件与系统适用性试验考察
本实施例从以下各方面对安胃疡胶囊指纹图谱的色谱条件和与系统适用性进行了试验考察。
1、指纹图谱检测方法的选择
文献调研表明，甘草渣中成分主要以黄酮类成分为主，此类成分均有较好的紫外吸收，因此选用HPLC-UV检测法进行指纹图谱研究。
2、指纹图谱检测波长的选择
文献研究表明，甘草渣中主要含有黄酮类成分，其中多为查耳酮、二氢黄酮、异黄酮等，且甘草原药材中尚含有甘草皂苷类成分，其紫外吸波长特征各不相同，有文献报道使用波长梯度；采用二极管阵列检测器对样品进行全波长检测，根据收集的三维图谱（图未示出），并同时收集245 nm、270 nm、276nm（甘草苷最大吸收）、330nm、360 nm波长处的图谱（图未示出）。
综合考察，甘草渣在270 nm波长处的信息量最大且色谱峰峰高相当，因此最后确定270 nm为甘草渣指纹图谱的检测波长。
3、指纹图谱对照品峰指认
研究过程中，对安胃疡胶囊样品进行了HPLC-MS分析，通过HPLC-MS数据，并结文献报道及对照品指认（对照品叠加图谱见图1B），确定安胃疡胶囊样品中含有甘草苷、甘草酸、芒柄花素及甘草查儿酮A成分及各成分对应的色谱峰，具体参见图1A。
4、色谱柱考察
分别考察了Agela、Agilent、GRACE及Kromasil四种色谱柱。
结果表明，四种色谱柱的检测图谱各不相同，对色谱峰的分离各有特色（图未示出）。相对比较，在同样条件下，Agela色谱柱对样品各色谱峰的分离度最佳，大部分色谱峰能达到基本分离，因此选用AgelaVenusil MP 5μm C18-100Å 4.6×250mm色谱柱进行甘草渣指纹图谱的测定。
5、流动相洗脱系统考察
实验初期，在摸索指纹图谱色谱条件时曾参考文献分别考察了乙腈-0.4%冰醋酸水、乙腈-0.1%磷酸水系统，对比结果，磷酸水对色谱峰的分离效果优于冰醋酸水；后又比较了乙腈-0.01%三氟醋酸水系统，结果发现磷酸水和三氟醋酸水系统对大部分色谱峰的分离效果相当，只有个别色谱峰略有差异，综合各色谱峰的分离效果（图未示出），确定使用乙腈-0.01%三氟醋酸水作为指纹图谱色谱洗脱系统，进行后续色谱条件摸索。
6、柱流速的考察
照HPLC色谱条件，分别考察了不同的柱流速（1.1 ml/min，1.0 ml/min，0.9 ml/min）。
结果表明，柱流速各成分分离效果的影响不明显，仅个别色谱峰1.0ml/min的流速分离效果较好（图未示出），因此选用柱流速为1.0ml/min。
7、柱温考察
照HPLC色谱条件，分别考察了3种柱温（25℃、30℃、35℃）。
结果表明，柱温各色谱峰成分分离效果的影响不明显，略有差异（图未示出）,30℃时50~60min的色谱峰分离效果微佳，因此选用柱温为30℃。
8、指纹图谱色谱条件2倍色谱峰采集时间考察
供试品溶液进样后，记录200min的色谱图，考察是否出峰完全（图未示出）。
结果表明，在此色谱条件下，100分钟以后未检出色谱峰。
9、流动相空白考察
在HPLC色谱条件下，不进样单运行程序考察100分钟的色谱图，未检测到任何色谱峰（图未示出），结果表明流动相空白对指纹图谱检测无影响。
10、空白溶剂影响的考察
在HPLC色谱条件下记录空白溶剂（70%乙醇水溶液）100分钟的色谱图，未检测到任何色谱峰（图未示出），结果表明空白溶剂对指纹图谱检测无影响。
11、辅料影响考察
取辅料（淀粉）适量，以70%乙醇水溶液超声提取制备供试品，照安胃疡胶囊特征图谱条件检测（图未示出）。结果表明，辅料对安胃疡胶囊特征图谱检测无干扰。
实施例3 安胃疡胶囊中甘草黄酮类物质的检测
1.色谱柱：型号为Agela Venusil MP 5μm C18-100Å 4.6×250mm；
2.流动相：以乙腈为流动相A，以0.01%三氟醋酸（TFA）溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；
3.流速：1.0mL/分钟；
4.检测波长：270nm；
5.柱温30℃；
6.对照品溶液的制备：取甘草查尔酮A对照品适量，加70%乙醇水溶液制成每1ml含0.8mg的溶液，即得。
7.供试品溶液的制备：称取安胃疡胶囊内容物0.1g，置25ml量瓶中，加70%乙醇水溶液20ml，超声提取5分钟，取出，放冷，以70%乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，用0.2μm微孔滤膜滤过，即得。
8.测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录100分钟的色谱图。
实施例4 方法学考察
1、精密度考察
制备供试品溶液，参照实施例3的方法，连续进样6次，测定特征图谱，叠加图见图3，利用指纹图谱软件评价相似度，结果表明，仪器精密度良好。
2、稳定性考察
制备供试品溶液，参照实施例3的方法，分别在接近0、3.5、7、11、15、24小时进样，测定特征图谱，叠加图见图4，采用指纹图谱软件计算其相似度，结果表明，24小时内测定，供试品溶液稳定。
3、重复性考察
平行制备6份供试品溶液，参照实施例3的方法测定特征图谱，特征图谱叠加图见图5，利用指纹图谱软件计算其相似度，结果表明，方法重复性良好。
实施例5 特征图谱共有模式的建立
参照实施例3的方法，检测了2008年（3批）、2009年（14批）和2010年（3批）生产的安胃疡胶囊。使用药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统，2004A版》软件，利用20批安胃疡胶囊特征图谱生成共有模式图，具体描述如下：
1、特征图谱标注：结合二十批安胃疡胶囊特征图谱特性，共标注共有色谱峰7个，如图2；图谱中标注的甘草苷成分色谱峰在20批胶囊样品中仅2009年产的批号为20090201~20090901共10批明显有检出，其他均痕量检出甚至未检出，因此甘草苷成分定义为非共有峰，2号峰为含有芒柄花素成分的肩峰。
2、特征图谱相似度计算：20批安胃疡胶囊共同计算相似度，结果见表1。结果表明，20批安胃疡胶囊与共有模式的相似度在0.909~0.992之间，平均值达到0.976，综合分析，20批样品均一、稳定，表明该产品生产工艺稳定。
表1 20批安胃疡胶囊相似度结果
3、安胃疡胶囊特征图谱各特征峰相对保留时间计算
利用20批安胃疡胶囊特征图谱各色谱峰保留时间数据，以甘草查尔酮A为参照峰S，计算其他6个特征峰与S峰的相对保留时间，得出20批数据的均值制定相对保留时间标准；结果得到各色谱峰与参照峰相对保留时间如下：0.52（峰1）、0.65（峰2）、0.80（峰3）、0.93（峰4）、1.00(峰S）、1.07（峰6）、1.15（峰7）。考虑色谱柱及检测仪器间误差，暂定检查限度为规定值的±5%之内。
Claims (4)
1.一种安胃疡胶囊指纹图谱的建立方法，所述方法包括采用高效液相色谱法检测安胃疡胶囊中黄酮类化合物的含量，所述方法包括如下步骤：
（1）对照品溶液的制备：取甘草查尔酮A对照品，加入70%乙醇水溶液制成每1ml含0.8mg的溶液，作为对照品溶液；
（2）供试品溶液的制备：取甘草提取物胶囊内容物0.1g，置25ml量瓶中，加70%乙醇水溶液20ml，超声提取5分钟，取出，放冷，以70%乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，用0.2μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；以及
（3）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定，记录100分钟的色谱图，得到指纹图谱：
色谱柱：Agela Venusil MP
5μm 4.6×250mm；
流动相：体积比为22:78～75:25的乙腈和0.01%（体积比）的三氟醋酸水溶液，进行梯度洗脱；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
紫外检测波长：270nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序按如下体积比设置进行：
0分钟时，流动相为22%的乙腈和78%的0.01%（体积比）的三氟醋酸水溶液；
10分钟时，流动相为25%的乙腈和75%的0.01%（体积比）的三氟醋酸水溶液；
15分钟时，流动相为30%的乙腈和70%的0.01%（体积比）的三氟醋酸水溶液；
25分钟时，流动相为35%的乙腈和65%的0.01%（体积比）的三氟醋酸水溶液；
40分钟时，流动相为45%的乙腈和55%的0.01%（体积比）的三氟醋酸水溶液；
80分钟时，流动相为60%的乙腈和40%的0.01%（体积比）的三氟醋酸 水溶液；
90分钟时，流动相为75%的乙腈和25%的0.01%（体积比）的三氟醋酸水溶液；
100分钟时，流动相为75%的乙腈和25%的0.01%（体积比）的三氟醋酸水溶液。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其特征在于，所述建立的指纹图谱中包括7个特征峰，且所述特征峰的相对保留时间分别为：
峰1：0.52±0.05；峰2：0.65±0.05；峰3：0.80±0.05；峰4：0.93±0.05；S峰：1.00±0.05；峰6：1.07±0.05；峰7：1.15±0.05。
4.一种检测安胃疡胶囊中黄酮类化合物的方法，所述方法采用权利要求1至3中任一项所述方法建立的指纹图谱来检测安胃疡胶囊中的黄酮类化合物。
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