CN102676585B

CN102676585B - 双组分系统基因dtrA和dtrB的用途与利用方法

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Publication number: CN102676585B
Application number: CN201210160266.3A
Authority: CN
Inventors: 陈明; 郝艳华; 张维; 王文涛; 赵鹏; 林敏�
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2012-05-14
Filing date: 2012-05-22
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2032-05-22
Also published as: CN102676585A

Abstract

本发明提供了一种双组分系统基因dtrA和dtrB的用途，用于提高菌株热敏感性和UV辐射抗性。还提供了一种双组分系统基因dtrA和dtrB的利用方法，包括克隆双组分系统基因dtrA和dtrB的步骤，双组分系统基因的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，进一步构建具有热敏感性和UV辐射抗性的ΔdtrA和ΔdtrB突变株；该双组分系统基因dtrA和dtrB的提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的功能可以被利用在发酵行业和生产抗UV辐射的化妆品行业，具有良好的应用前景。

Description

双组分系统基因dtrA和dtrB的用途与利用方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及耐辐射异常球菌R1中一对双组分系统基因dtrA和dtrB在提高菌株热敏感性和UV辐射抗性上的用途和利用方法。

背景技术

耐辐射异常球菌R1（Deinococcus radiodurans R1）具有超强的电离辐射、紫外线、DNA损伤试剂及干燥的抗性，备受各国科学家的关注和重视。如宋道军、余增亮的《耐辐射异常球菌抗辐射机理的研究新进展》中报道了各国在耐辐射异常球菌生理生化和遗传学特性、特殊的细胞膜结构、各种诱变因素所致的DNA损伤与其高效的修复机制方面的研究；基因组分析显示，耐辐射球菌R1中含有20种组氨酸激酶和26种反应调控蛋白，存在多个双组分系统，其中二号染色体上的dr_a0009（dtrA）和dr_a0010（dtrB）基因分别编码组氨酸激酶和反应调控蛋白，与枯草芽孢杆菌的同源性为40%以上。当外界或内部环境发生变化时，组氨酸激酶的传感器结构域能够感应环境的刺激并迅速二聚化，导致催化ATP依赖的特定的组氨酸残基自我磷酸化，然后反应调控蛋白催化组氨酸的磷酸基团转移到它自身的天门冬氨酸残基上，反应调控蛋白的磷酸化激活效应器结构域，从而与下游基因的启动子或与蛋白作用，产生调控应答反应。

细胞内有一系列的信号转导途径应对外界环境刺激，其中热激和UV辐射是一种重要的逆境胁迫。热激反应是细胞和有机体应对温度升高时的一种保守反应，能保护细胞和有机体免受热损伤，使得细胞恢复正常的生理活动，从而达到一个更高的耐热性水平。热激能迅速诱导一套基因的表达，同时使细胞膜的流动性发生变化。UV辐射能够产生嘧啶二聚体，造成的DNA损伤。

目前，耐辐射异常球菌R1（Deinococcus radiodurans R1）中dtrA（dr a0009，GeneID:1798204)基因和dtrB（dr a0010，Gene ID:1798154)基因对于热激反应和UV辐照的研究尚未见报道。而在发酵行业中，需要高温发酵杀死虫卵及一些有害细菌，可以提高发酵的质量，因此发酵行业对于热敏感菌株具有较大需求。紫外线（ultraviolet radiation,UV）对人体皮肤造成损伤已日益得到人们的重视，随之产生多种针对皮肤的防晒产品，在化妆品行业对抗UV辐射菌株的需求也与日俱增，因此利用基因工程研究基因在菌株热敏感性和UV辐射抗性中的应用是非常重要并具有经济价值的。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明提供了一种双组分系统基因dtrA和dtrB的用途，用于提高菌株热敏感性和UV辐射抗性。

双组分系统基因dtrA和dtrB的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，包括克隆双组分系统基因dtrA和dtrB的步骤，双组分系统基因的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，还包括构建具有热敏感性和UV辐射抗性的ΔdtrA和ΔdtrB突变株的步骤。

克隆双组分系统基因dtrA和dtrB的步骤包括设计dtrA和dtrB基因的PCR扩增特异性引物。从Deinococcus radiodurans基因组DNA中扩增出完整的dtrA和dtrB核苷酸序列。

构建具有热敏感性和UV辐射抗性的ΔdtrA和ΔdtrB突变株的步骤包括：

1)．用SacII酶和EcoRV酶将分别连接在载体上的dtrA基因和dtrB基因从中间切开；

2)．插入两端加了同一酶切位点的卡那抗性盒，测序验证克隆基因；

3)．通过PCR将插入卡那抗性盒的目的片段扩增出来；

4)．将插入卡那抗性盒的DNA片段通过同源重组的方法直接转化到耐辐射异常球菌R1中。

优选的是，所述连接dtrA和dtrB基因的载体为T载体。

进一步优选的是，所述连接dtrA基因的载体为pMD19T载体。

进一步优选的是，所述连接dtrB基因的载体为pGEM-T Easy载体。

具体将DNA片段转化到耐辐射异常球菌R1中的步骤如下：

1）挑取耐辐射异常球菌R1单菌落于TGY液体培养基中，30℃培养至对数期；

2）按1:100转接至新鲜的TGY液体培养基中，30℃培养至对数期（OD₆₀₀≈0.4）；

3）取2mL菌液6000×g离心2min，去上清，用200μL含30mM CaCl₂的TGY液体培养基重悬菌体，30℃水浴80min；

4）吸50μL上述菌悬液于一新的EP管中，加入10μL冰上放置的DNA片段，振荡混匀后，30℃水浴90min；

5）加800μL新鲜TGY液体培养基混匀，于30℃摇床中培养4h；

6）取100μL培养好的菌液涂布于不含抗生素的TGY固体培养基上，30℃培养约2d；

7）挑取单菌落，提取其基因组，用验证引物进行PCR验证，获得ΔdtrA和ΔdtrB突变株。

对该突变株进行一系列生理生化分析，实验结果显示，本发明所述的dtrA基因和dtrB基因突变后，导致在高温（42℃）下生长时两突变株较野生型R1敏感，同时突变株的UV辐射抗性增强。该双组分系统基因dtrA和dtrB的提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的功能可以被利用在发酵行业，将该双组分系统基因的突变ΔdtrA和ΔdtrB作为发酵用菌株，可提高菌株耐高温的能力，提高高温细菌的分解代谢能力，缩短发酵时间，提高生产能力，减少染菌的机会，提高发酵的产量和质量；将该双组分系统基因dtrA和dtrB应用到生产抗UV辐射的化妆品行业，可利用转化了该系统基因的菌株生产的可吸收紫外光辐射的代谢产物生产抗紫外线辐射化妆品，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是含有D.radiodurans R1中dtrA基因序列的PCR产物验证电泳图谱；

图2是含有D.radiodurans R1中dtrB基因序列的PCR产物验证电泳图谱；

图3是野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB生长到对数期后，经30℃正常温度处理3h后的生长情况的照片，图中：

a为野生型R1；

b为ΔdtrA突变株；

c为ΔdtrB突变株；

图4是野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB生长到对数期后，经42℃高温热激处理3h后的生长情况的照片，图中：

a为野生型R1；

b为ΔdtrA突变株；

c为ΔdtrB突变株；

图5是野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB在42℃高温处理下的生长曲线，其中：

a为野生型R1；

b为ΔdtrA突变株；

c为ΔdtrB突变株；

图6是UV辐照前野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB的生长情况的照片，图中：

a为野生型R1；

b为ΔdtrA突变株；

c为ΔdtrB突变株；

图7是UV辐照处理7min后野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB的生长情况的照片，图中：

a为野生型R1；

b为ΔdtrA突变株；

c为ΔdtrB突变株；

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解为这些实施例仅用于举例说明本发明的方法，而不用于限制本发明的范围。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。

实施例1dtrA和dtrB核苷酸序列SEQ ID NO:1的克隆

根据已公布的Deinococcus radioduransR1菌株的基因组序列，设计dtrA和dtrB基因的PCR扩增特异性引物。从Deinococcus radiodurans基因组DNA中扩增出完整的dtrA和dtrB核苷酸序列：

dtrA-Up 5’CGCCACGAACACGGTCAG 3’

dtrA-Down 5’CACTCAGCGGCACGAAGG 3’

dtrB-up： 5’CACCGGCCTGAACTCCAT 3’

dtrB-down： 5’TCGCACCGTTCCTACACC 3’

PCR反应条件为95℃、5min，[95℃ 30sec，57℃ 30sec，72℃ 90sec]30个循环，72℃延伸10min，PCR产物过柱纯化，dtrA克隆于pMD19T载体上，dtrB克隆于pGEM-T Easy载体上。

实施例2构建ΔdtrA和ΔdtrB突变株

dtrA基因含有一个SacII酶切位点，dtrB基因含有一个EcoRV酶切位点，分别用SacII酶和EcoRV酶将连在pMD19T载体和pGEM-T Easy载体上的dtrA基因和dtrB基因从中间切开，插入两端加了同一酶切位点的卡那抗性盒，测序验证克隆基因正确；通过PCR将插入卡那抗性盒的目的片段扩增出来；将插入卡那抗性盒的DNA片段通过同源重组的方法直接转化到耐辐射异常球菌R1中，提取其基因组，用验证引物扩增目的片段并电泳，验证图谱见图1和图2。

具体转化方法如下：

5）加800μL新鲜TGY液体培养基混匀，于30℃摇床中培养4h；

实施例3野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB的热激反应实验

1、实验方法

将野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB活化后，按1%的接菌量分别接种于不含任何抗生素的TGY液体培养基（R1）和含8μg/mL卡那霉素的TGY液体培养基（ΔdtrA和ΔdtrB）中，30℃振荡培养10h，培养至对数期（OD₆₀₀≈0.8），用于热激处理。

1）各取20mL野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB的菌液，6000×g离心10min，收集菌体，菌体分别用10mM的pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤2次，重悬于20mL磷酸缓冲液中，30℃正常培养3h，各取1mL于1.5mL EP管中，用无菌的去离子水倍比稀释（10^-1到10^-5），分别取10μL稀释至10^-1到10^-5的野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB菌液，滴加在不含任何抗生素的TGY固体培养基上，观察野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB的生长情况。

2）各取20mL野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB的菌液，6000×g离心10min，收集菌体，菌体分别用10mM的pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤2次，重悬于20mL磷酸缓冲液中，42℃热激培养3h，各取1mL于1.5mL EP管中，用无菌的去离子水倍比稀释（10^-1到10^-5），分别取10μL稀释至10^-1到10^-5的野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB菌液，滴加在不含任何抗生素的TGY固体培养基上，观察野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB的生长情况。

2、实验结果

1）已培养至对数期的野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB在30℃正常培养3h后，菌株均能正常生长，生长状况一致，没有差异（见图3，表1）。

2）已培养至对数期的野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB在42℃高温热激3h后，野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB的生长表现出明显的差异（见图4，表1）。

表1野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB在42℃热激条件下的生长情况

3、结论

上述实验表明，dtrA和dtrB基因突变后，在42℃高温热激条件下突变株的生长较野生型R1敏感。

实施例4野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB在42℃下的生长曲线测定

1、实验方法

将野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB活化后，转接到液体TGY培养基中，初始浓度均调到OD₆₀₀≈0.2，42℃振荡培养，每隔一定时间取样品测其OD₆₀₀值，将所得数据绘制成生长曲线。

2、实验结果

野生型R1在42℃生长时，最大OD₆₀₀值能达到3.5，而突变株ΔdtrA和ΔdtrB在42℃下OD₆₀₀值分别至1.5和2.2左右时就停止生长（见图5）。

3、结论

上述实验表明在高温（42℃）条件下，与野生型R1相比，突变株ΔdtrA和ΔdtrB的生长显著下降，表现为热敏感。

实施例5UV辐射抗性的实验

1、实验方法

1）活化野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB，按1%的接菌量分别接种于不含任何抗生素的TGY液体培养基（R1）和含8μg/mL卡那霉素的TGY液体培养基（ΔdtrA和ΔdtrB）中，30℃振荡培养16h，培养至对数期，备用于UV辐照实验。

2）各取20mL野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB的菌液，6000×g离心10min，收集菌体，菌体分别用10mM的pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤2次，重悬于20mL磷酸缓冲液中；分别将悬液置于直径为9cm灭菌的培养皿中，并置于UV辐射装置中，室温下进行UV辐照（254nm，16μw/cm²）处理，辐照过程中，将培养皿置于电动旋转的平台上，转速为35转/分，确保UV光均匀照射于菌液上。分别在UV辐照3min，5min，7min，9min，12min各取不同样品，用无菌去离子水进行倍比稀释（10^-1到10^-5）后，分别取10μL样品滴加在不含任何抗生素的TGY固体培养基上，观察野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB的生长情况。

2、实验结果

UV辐照处理前，野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB的生长状况无明显差别（见图6）；UV辐照5min后，野生型R1稀释到10^-3基本停止生长，而突变株ΔdtrA和ΔdtrB仍能正常生长；UV辐照7min后，野生型R1停止生长，突变株ΔdtrA和ΔdtrB稀释到仍能正常生长（见图7）。

表2野生型R1和突变株ΔdtrA和ΔdtrB在UV辐照下的生长

3、结论

dtrA和dtrB基因的突变导致突变株的UV辐射抗性明显高于野生型R1。

需要说明的是，按照本发明的双组分系统基因dtrA和dtrB的用途的技术方案范畴包括了上述各部分之间的任意组合。

尽管以上内容具体地参考优选实施例来示出并描述了本发明，但本领域的技术人员可以理解，可以作出形式和细节上的各种改变而不脱离所附权利要求书中所述的本发明的范围。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，均仍属于本发明技术方案的范围。

Claims

1.一种双组分系统基因dtrA和dtrB的用途，其特征在于：用于提高菌株热敏感性和UV辐射抗性；所述双组分系统基因dtrA和dtrB的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

2.一种利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，包括克隆双组分系统基因dtrA和dtrB的步骤，双组分系统基因的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，其特征在于：还包括构建具有热敏感性和UV辐射抗性的ΔdtrA和ΔdtrB突变株的步骤。

3.根据权利要求2所述的利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，其特征在于：克隆双组分系统基因dtrA和dtrB的步骤包括设计dtrA和dtrB基因的PCR扩增特异性引物。

4.根据权利要求3所述的利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，其特征在于：克隆双组分系统基因dtrA和dtrB的步骤包括从Deinococcus radiodurans 基因组DNA中扩增出完整的dtrA和dtrB核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，其特征在于：构建具有热敏感性和UV辐射抗性的ΔdtrA和ΔdtrB突变株的步骤包括：

1）．用SacII酶和EcoRV酶将分别连接在载体上的dtrA基因和dtrB基因从中间切开；

2）．插入两端加了同一酶切位点的卡那抗性盒，测序验证克隆基因；

3）．通过PCR将插入卡那抗性盒的目的片段扩增出来；

4）．将插入卡那抗性盒的DNA片段通过同源重组的方法直接转化到耐辐射异常球菌R1中。

6.如权利要求5所述的利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，其特征在于：所述连接dtrA和dtrB基因的载体为T载体。

7.如权利要求6所述的利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，其特征在于：所述连接dtrA基因的载体为pMD19T 载体。

8.如权利要求7所述的利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，其特征在于：所述连接dtrB基因的载体为pGEM-T Easy载体。

9.如权利要求5至8中任一项所述的利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，其特征在于：具体将DNA片段转化到耐辐射异常球菌R1中的转化方法如下：

2）按1 : 100转接至新鲜的TGY液体培养基中，30℃培养至对数期，OD₆₀₀≈0.4；

3）取2 mL菌液6000×g离心2 min，去上清，用200 μL含30 mM CaCl₂的

TGY液体培养基重悬菌体，30℃水浴80 min；

4）吸50 μL上述菌悬液于一新的EP管中，加入10 μL冰上放置的DNA片

段，振荡混匀后，30℃水浴90 min；

5）加800 μL新鲜TGY液体培养基混匀，于30℃摇床中培养4 h；

6）取100 μL培养好的菌液涂布于不含抗生素的TGY固体培养基上，30℃培养约2 d；

7）挑取单菌落，提取其基因组，用验证引物进行PCR验证，获得ΔdtrA和ΔdtrB突变株。

10.通过权利要求9的利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法构建的突变菌株。