CN102676445B - 木霉菌剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了木霉菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）木霉菌种的种子培养；2）将步骤1）得到的木霉菌种子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液；3）将步骤2）得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，得到木霉液态发酵液；4）将步骤3）得到的木霉液态发酵液置于去淀粉马铃薯渣固体培养基中进行固态培养。本发明的有益效果为：1、本发明提供的技术方案采用易得且廉价的去淀粉马铃薯残渣生产木霉菌剂，解决了成本高、配方复杂等问题，同时解决了马铃薯渣造成的环境污染、以及不能充分回收利用的问题；2、本发明提供的技术方案产生木霉分生孢子的数量可以高达3.2×1012cfu/g底物，产孢量是现有技术的100倍，提高了产出率、更大程度的节约了成本。
Description
技术领域
本发明涉及微生物菌剂的制备方法，具体涉及木霉菌剂的制备方法。
背景技术
目前生产上常用的木霉菌剂多为分生孢子制剂，国外已有商品化的木霉制剂问世，如美国的Topshield(哈茨木霉T-22)和以色列的Trichodex(哈茨木霉T39)。国内也有少量的报道，如北京中美陆公司生产的木霉厚垣孢子制剂迈可键Ⅲ。
木霉菌剂的制备要经过一级种子培养、二级液体扩大培养、三级固体培养。自从木霉菌的生防效果得到广泛的认同以来，许多研究者就对其培养基质进行了大量的摸索。
(1)液体扩大培养
Jackson和whips等发现在丙氨酸一葡萄糖培养产生的菌丝干重比糖蜜一酵母粉培养生物量要高。Lewis和PaPavizas等研究发现糖蜜—玉米培养基在支持木霉生长和产孢方面优于蔗糖—硝酸盐培养基和葡萄糖—酒石酸培养基。目前国内在木霉液体培养以获得高的生物量方面文献比较少，仅有陈卫辉等木霉的浅层液体培养条件进行过初步研究，他们用虫草头孢废液添加几种中草药(青篙、黄芩、贯众和板蓝根)作为培养基，接种哈茨木霉的分生孢子进行培养，可获得1.67x108个孢子/皿，应用虫草头孢废液组合培养液培养哈茨产孢量比PD培养液、查氏培养液和理查德培养液都高。
(2)固体发酵
Lewis和Papaviazs等研究了木霉在各种固体培养基上产生孢子量的情况。以石英砂加松锯末、可可壳粉、咖啡壳粉、花生壳粉、玉米芯或麦麸皮等为原料，研究表明麦麸皮的效果最好，玉米粉和花生壳粉在刺激木霉产生孢子方面与麸皮的效果是相同的。朱辉等用城市垃圾加30%麦麸皮，接种量30%，8-10天得到孢子量109个/g。王永东等用麸皮、玉米粉3:1配比，蔗糖1.5%，蛋白胨1.5%，硝酸1.0%，磷酸二氢钾0.05%，缓冲盐NaH2P04-Na2HP04(0.50%-0.50%)接种量90%，温度22-25℃，9d产孢量达1.0x1010个/g。田连生（2006）等利用玉米秸秆制备木霉生物杀菌剂。张双玺（2008）等利用植物农药残渣生产绿色木霉( Trichoderma viride)菌制剂。武宽等(2007)利用甘蔗渣，麦麸，米糠组成的固体发酵培养基培养木霉，在相对湿度60-80%，温度25-28℃条件下，培养4-5天后，在12℃以下低温培养2-3天。固体发酵产物在40-50℃温度下干燥12-24小时，加入由硅藻土，麦麸，硫磺组成的促进剂。混合均匀，粉碎后过40目筛，即得木霉粉剂和粉粒剂。文献报道的作为生防剂的木霉菌生产方法所采用的培养基以粮食为主。另外有些文献报道的作为生防剂的木霉菌生产方法所采用的培养基以粮食为主。如中国专利(公开号:CN1554242A)中公开了一种木霉菌的生产方法，其培养基主要是颗粒直径在1-5毫米之间的小米、稻米、玉米、大麦、小麦或高梁。中国专利(公开号:CN1422946A)中公开了一种木霉菌的生产方法，其生产原料主要是大麦、鼓皮、筱麦等。杨合同利用玉米粉、麦麸等成分，采用液－固两相发酵技术生产木霉分生孢子取得成功。
固体发酵是生产木霉制剂中最为关键的技术之一。直接决定制剂的防病效果和制剂生产成本。而固体发酵中最重要的是培养基质的选择，选择适宜的培养基质可以简化操作、降低成本、保证制剂性能，同时可以利用残渣废料以减少环境污染。
张双玺,张兴在《利用植物农药残渣生产绿色木霉孢子的研究》中描述了以下制备方法：
1、加工原料：植物农药沙地柏残渣；
2、液体发酵：利用PDA培养基平板培养绿色木霉菌，待菌丝长满培养皿并变为绿色后，每皿加入10ml灭菌水，用接种环搅拌使孢子悬浮在水中，用移液管吸出悬浮液移入灭菌三角瓶中，孢子数量用血球计数板计数，然后用灭菌水将孢子浓度调整为 1×108/ml；
3、固体发酵：沙地柏残渣在75℃条件下用酒精提取4h，滤渣自然风干，麸皮在120℃烘干粉碎，鸡粪在150℃烘干粉碎，沙地柏：麦麸：鸡粪：硫酸铵比例为 12：4：3：1，准确称取5 g，121℃灭菌30 min，摇匀，接1×108/mL绿色木霉孢子悬浮液0.5ml，28℃培养箱培养，绿色木霉菌孢子培养的最佳时间为 8-12d，其产孢量达到7.4×109/g。
上述技术及培养基质有以下缺点
1、材料稀少：
该技术所用原料为植物农药沙地柏残渣，沙地柏产于我国新疆天山至阿尔泰山、宁夏、内蒙古、青海东北部、甘肃祁连山北坡、陕西榆林，海拔1100-2800m地带多石山地及沙丘上。北京、西安等地有引种。沙地柏常用于改善干旱、半干旱地区的环境和防止沙漠化进程，用于生物农药的提取报道较少。原材料难以获取，不适合大规模生产使用。
2、配方复杂：
该技术所用配方较为复杂，所用材料为沙地柏、麦麸、鸡粪、硫酸铵四种，操作繁琐。
3、产孢量低：
培养8-12d，其产孢量才达到7.4×109/g。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了培养基原材料容易获取、配方简单，产孢量高的木霉菌剂的制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：木霉菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1）木霉菌种的种子培养：所述木霉菌种为长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum Rifai）；将木霉种子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，培养温度为25-30℃，光照条件为光照8-16小时、黑暗8-16小时交替，培养时间为4天；
2）将步骤1）得到的木霉菌种子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为1×103cfu/ml-1×108cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节PH为4-7；
3）将步骤2）得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，发酵培养基质为去淀粉马铃薯渣培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：去淀粉马铃薯渣培养液为1:55-1:70培养条件为25℃-28℃，摇床培养140r/min-160r/min，连续培养5-7天，得到木霉液态发酵液；
4）将步骤3）得到的木霉液态发酵液置于去淀粉马铃薯渣固体培养基中进行固态培养，所述去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和蓬松剂，按质量比去淀粉马铃薯渣：蓬松剂为5：1，按质量比固体培养基: 发酵液为1:1-1:2，搅拌均匀，培养条件为25-30℃，静态培养8-10天，得到木霉菌剂，其中，产孢量为每克培养底物产出3.2×1012cfu单位木霉孢子。
上述的木霉菌剂的制备方法，所述步骤1）中，培养温度为27℃，光照条件为光照12小时、黑暗12小时交替。
上述的木霉菌剂的制备方法，所述步骤2）中，稀释浓度为1×106cfu/ml，调节PH为5。
上述的木霉菌剂的制备方法，所述步骤3）中，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：去淀粉马铃薯渣培养液为1:60；培养条件为25℃，摇床速度为150r/min，连续培养时间为6天。
上述的木霉菌剂的制备方法，所述步骤4）中，蓬松剂为珍珠岩、蛭石和/或麦麸的混合物。
上述的木霉菌剂的制备方法，所述步骤4）中的去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和蛭石和/或麦麸；所述去淀粉马铃薯渣的制备方法为将淀粉生产后的马铃薯残渣烘干后粉碎至20目得到的。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供的技术方案采用易得且廉价的去淀粉马铃薯残渣生产木霉菌剂，解决了成本高、配方复杂等问题，同时解决了马铃薯渣造成的环境污染、以及不能充分回收利用的问题；
2、本发明提供的技术方案产生木霉分生孢子的数量可以高达3.2×1012cfu/g底物，产孢量是现有技术的100倍，提高了产出率、更大程度的节约了成本。
具体实施方式
所用长枝木霉为保藏于accc（中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所）的菌株，保藏编号为31960。
实施例1：
木霉菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1）木霉菌种的种子培养：木霉菌种为长枝木霉；将木霉种子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，培养温度为25℃，光照条件为光照8小时、黑暗8小时交替，培养时间为4天；
2）将步骤1）得到的木霉菌种子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为1×103cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节PH为4；
3）将步骤2）得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，发酵培养基质为去淀粉马铃薯渣培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：去淀粉马铃薯渣培养液为1:55培养条件为25℃，摇床培养140r/min，连续培养5天，得到木霉液态发酵液；
4）将步骤3）得到的木霉液态发酵液置于去淀粉马铃薯渣固体培养基中进行固态培养，所述去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和珍珠岩，按质量比去淀粉马铃薯渣：珍珠岩为5：1，按质量比固体培养基: 发酵液为1:1，搅拌均匀，培养条件为25℃，静态培养8天，得到木霉菌剂，其中，产孢量为每克培养底物产出3.2×1012cfu单位木霉孢子。
步骤4）中的去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和蛭石和/或麦麸；所述去淀粉马铃薯渣的制备方法为将淀粉生产后的马铃薯残渣烘干后粉碎至20目得到的。
实施例2：
木霉菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1）木霉菌种的种子培养：木霉菌种为长枝木霉；将木霉种子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，培养温度为30℃，光照条件为光照16小时、黑暗16小时交替，培养时间为4天；
2）将步骤1）得到的木霉菌种子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为1×108cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节PH为7；
3）将步骤2）得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，发酵培养基质为去淀粉马铃薯渣培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：去淀粉马铃薯渣培养液为1:70培养条件为28℃，摇床培养160r/min，连续培养7天，得到木霉液态发酵液；
4）将步骤3）得到的木霉液态发酵液置于去淀粉马铃薯渣固体培养基中进行固态培养，所述去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和蛭石，按质量比去淀粉马铃薯渣：蛭石为5：1，按质量比固体培养基: 发酵液为1:2，搅拌均匀，培养条件为30℃，静态培养10天，得到木霉菌剂，其中，产孢量为每克培养底物产出3.2×1012cfu单位木霉孢子。
步骤4）中的去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和蛭石和/或麦麸；所述去淀粉马铃薯渣的制备方法为将淀粉生产后的马铃薯残渣烘干后粉碎至20目得到的。
实施例3：
木霉菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1）木霉菌种的种子培养：木霉菌种为长枝木霉；将木霉种子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，培养温度为27℃，光照条件为光照12小时、黑暗12小时交替，培养时间为4天；
2）将步骤1）得到的木霉菌种子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为1×106cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节PH为5；
3）将步骤2）得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，发酵培养基质为去淀粉马铃薯渣培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：去淀粉马铃薯渣培养液为1:60，培养条件为27℃，摇床培养150r/min，连续培养6天，得到木霉液态发酵液；
4）将步骤3）得到的木霉液态发酵液置于去淀粉马铃薯渣固体培养基中进行固态培养，所述去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和麦麸，按质量比去淀粉马铃薯渣：麦麸为5：1，按质量比固体培养基: 发酵液为1:1.5，搅拌均匀，培养条件为27℃，静态培养9天，得到木霉菌剂，其中，产孢量为每克培养底物产出3.2×1012cfu单位木霉孢子。
步骤4）中的去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和蛭石和/或麦麸；所述去淀粉马铃薯渣的制备方法为将淀粉生产后的马铃薯残渣烘干后粉碎至20目得到的。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.木霉菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）木霉菌种的种子培养：所述木霉菌种为长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum Rifai）；将木霉种子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，培养温度为25-30℃，光照条件为光照8-16小时、黑暗8-16小时交替，培养时间为4天；
2）将步骤1）得到的木霉菌种子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为1×103cfu/ml-1×108cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节pH为4-7；
3）将步骤2）得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，发酵培养基质为去淀粉马铃薯渣培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：去淀粉马铃薯渣培养液为1:55-1:70，培养条件为25℃-28℃，摇床培养140r/min-160r/min，连续培养5-7天，得到木霉液态发酵液；
4）将步骤3）得到的木霉液态发酵液置于去淀粉马铃薯渣固体培养基中进行固态培养，所述去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和蓬松剂，按质量比去淀粉马铃薯渣：蓬松剂为5：1，按质量比固体培养基:发酵液为1:1-1:2，搅拌均匀，培养条件为25-30℃，静态培养8-10天，得到木霉菌剂，其中，产孢量为每克培养底物产出3.2×1012cfu单位木霉孢子，所述蓬松剂为珍珠岩、蛭石和/或麦麸的混合物。
2.根据权利要求1所述的木霉菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中，培养温度为27℃，光照条件为光照12小时、黑暗12小时交替。
3.根据权利要求1所述的木霉菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中，稀释浓度为1×106cfu/ml，调节pH为5。
4.根据权利要求1所述的木霉菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：去淀粉马铃薯渣培养液为1:60；培养条件为25℃，摇床速度为150r/min，连续培养时间为6天。
5.根据权利要求1所述的木霉菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中的去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和蛭石和/或麦麸；所述去淀粉马铃薯渣的制备方法为将淀粉生产后的马铃薯残渣烘干后粉碎至20目得到的。
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