CN102666584A - 封闭性抗dkk-1抗体及其用途 - Google Patents

封闭性抗dkk-1抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供结合Dkk-1的抗体及其片段，特别是结合Dkk-1的人源化抗体及其片段，甚至更特别是结合Dkk-1的完全人源化抗体及免疫功能片段。还提供与抗小鼠Dkk-1单克隆抗体竞争结合Dkk-1+细胞的抗体及其片段。还提供编码抗Dkk-1抗体或其片段的核酸，以及掺有这些核酸以重组表达抗Dkk-1抗体及其片段的表达载体及宿主细胞。还提供制备本发明抗体及其片段的方法。还提供骨合成代谢剂。还提供包含本发明的抗体或其片段的药用组合物。进一步提供治疗导致骨量流失的疾病、病状及病症(诸如骨病症)的方法。还提供治疗或预防骨量流失的方法，诱导骨量增加的方法，及诱导Wnt活性的方法。

Description

封闭性抗DKK-1抗体及其用途
本申请要求2009年5月12日提交的U.S.Provisional Application No.61/177,650以及2009年9月22日提交的U.S.Provisional Application No.61/244,638的权益，其在此以其整体援引加入本文。
技术领域
本发明涉及结合Dkk-1的抗体及其片段，特别是涉及结合Dkk-1的人源化的抗体及其片段，特别是涉及特异性结合Dkk-1(尤其是人Dkk-1)的完全人源化的抗体及片段。提供了编码抗Dkk-1抗体或其片段的核酸，以及掺入了这些核酸以用于重组表达抗Dkk-1抗体的表达载体及宿主细胞。也提供了骨合成代谢剂。也提供了包含本发明的抗体或其片段的药用组合物。还提供了治疗导致骨流失的疾病、病状及病症(诸如骨病症)的方法。也提供了治疗或预防骨量(bone mass)流失的方法、诱导骨量增加的方法以及诱导Wnt活性的方法。
背景技术
Wnt被分泌为糖蛋白，其结合及活化包括低密度受体相关蛋白(LRP5/6)及卷曲蛋白(frizzled protein)的受体复合物。Cadigan，K.M.及Y.I.Liu，(2005)Journal of Cell Science 119，395-402；Nusse，R.(2003)Development 130(22)：5297-305；及Pinson，K.I.(2000)Nature 2000407(6803)：535-8。
已有公开Wnt/LRP5调节骨量，以及Wnt信号途径的活化使得骨量增加。Boyden，L.M.等人，(2002)N Engl J Med 346：1513-1521；Little，R.D.等人，(2002)Am J Hum Genet 70：11-19；及Gong，Y.等人，(2001)Cell 107：513-523。Wnt信号受到拮抗剂的严密调节，其包括分泌的分子如Dickkopf 1(Dkk-1)。Tian，E.等人，(2003)N Engl J Med 349：2483-2494。据发现在人类中观察到的高骨量(HBM)表型是由于LRP5(G171V)中的单一点突变，其抑制Dkk-1结合LRP5的能力。Zhang，Y.等人，(2004)Mol Cell Biol.24(11)：4677-84。
Wnt信号在骨形成及骨生长中的关键作用使得Dkk-1成为可用于治疗以下疾病或病状的靶标，其中在所述疾病或病状中成骨细胞活性增加(骨量密度增加、骨形成增加而无相应的骨吸收的增加)将有利于患者，包括例如通过减少例如由于未经治疗的骨质疏松症而发生骨折的次数。WO2006/015373(US 2006/0127393)公开了治疗各种疾病(包括骨病症)的Dkk-1抗体。US 2008/0193449公开了抑制Dkk-1结合LRP5的特异于Dkk-1的抗体；包含这些抗体用于刺激骨生长的组合物；以及包含这些抗体用于治疗骨病症(诸如骨质疏松症)的组合物。
仍存在对于拮抗Dkk-1活性的新的合成代谢剂的需要，由此而增加成骨细胞活性以治疗其中骨形成增加将有利于患者的疾病、病状及病症(诸如骨质疏松症)。
发明概述
本发明涉及结合Dkk-1的抗体及其片段(例如抗原结合部分)，特别是涉及结合Dkk-1的人源化抗体及其片段，且更特别是涉及结合Dkk-1的完全人源化抗体及免疫功能片段。所述抗体及其片段对于Dkk-1抑制Wnt活性的能力进行拮抗。抗体及其免疫功能片段对于Dkk-1抑制骨中Wnt信号途径的能力进行拮抗，而伴有骨量的相应增加。抗体及其免疫功能片段包括具有天然存在的结构的抗体，以及具有抗原结合结构域的多肽(例如结构结构域抗体)。抗体及其免疫功能片段可用于治疗各种疾病、病状及病症，包括与骨量流失有关的那些，如骨质疏松症。抗体及其免疫功能片段还可用于治疗与继发性骨量流失有关的疾病、病状或病症，如由以下所引起或者伴有以下的骨量流失：例如用皮质类固醇、芳香酶抑制剂或噻唑烷硫酮(thiazolidinethiones，TZD)长期治疗；厌食症；或与性腺功能减退症或肾性骨营养不良有关的骨量流失。
所提供的一些抗体及其功能片段包括：
(a)一或多个选自以下组的轻链(LC)互补决定区(CDR)：
(i)与SEQ ID NO：22具有至少80％序列一致性的CDR1；
(ii)与SEQ ID NO：24具有至少80％序列一致性的CDR2；及
(iii)与SEQ ID NO：26具有至少80％序列一致性的CDR3；
(b)一或多个选自以下组的重链(HC)互补决定区(CDR)：
(i)与SEQ ID NO：30、49或50具有至少80％序列一致性的CDR1；
(ii)与SEQ ID NO：32或51具有至少80％序列一致性的CDR2；及
(iii)与SEQ ID NO：34或52具有至少80％序列一致性的CDR3；或
(c)(a)中的一或多个CDR及(b)中的一或多个CDR。
此类抗体及其免疫功能片段可特异性结合Dkk-1多肽。一些这些抗体及其免疫功能片段包括一、二、三、四、五或所有六个前述CDR。
还提供了所提供序列的保守性修饰。
进一步提供的抗体及其免疫功能片段的LC及HC与前述序列具有至少90％的序列一致性。
还提供具有LC的抗体及其免疫功能片段，其中所述LC的CDR1具有如SEQ ID NO：22所述的氨基酸序列、CDR2具有如SEQ ID NO：24所述的氨基酸序列、和/或CDR3具有如SEQ ID NO：26所述的氨基酸序列。
进一步提供的是具有HC的抗体及其免疫功能片段，其中所述HC的CDR1具有如SEQ ID NO：30、49或50所述的氨基酸序列、CDR2具有如SEQ ID NO：32或51所述的氨基酸序列、和/或CDR3具有如SEQ ID NO：34或52所述的氨基酸序列。
进一步提供的是具有LC和HC的抗体及其免疫功能片段，其中所述LC的CDR1具有如SEQ ID NO：22所述的氨基酸序列、CDR2具有如SEQID NO：24所述的氨基酸序列、和/或CDR3具有如SEQ ID NO：26所述的氨基酸序列，以及其中所述的HC的CDR1具有如SEQ ID NO：30、49或50所述的氨基酸序列、CDR2具有如SEQ ID NO：32或51所述的氨基酸序列和/或CDR3具有如SEQ ID NO：34或52所述的氨基酸序列。
进一步提供的是具有LC和HC的抗体及其免疫功能片段，其中所述LC的CDR1具有如SEQ ID NO：22所述的氨基酸序列、CDR2具有如SEQID NO：24所述的氨基酸序列且CDR3具有如SEQ ID NO：26所述的氨基酸序列，并且其中所述HC的CDR1具有如SEQ ID NO：30、49或50所述的氨基酸序列、CDR2具有如SEQ ID NO：32或51所述的氨基酸序列且CDR3具有如SEQ ID NO：34或52所述的氨基酸序列。
还提供包括以下的抗体及其免疫功能片段：(a)与如SEQ ID NO：20所述的序列具有至少80％序列一致性的LC可变区(VL)；(b)与如SEQ ID NO：28所述的序列具有至少80％序列一致性的HC可变区(VH)；或者(c)(a)的VL及(b)的VH。
还提供了结构类似但VL与如SEQ ID NO：20所述的序列具有至少90％序列一致性且VH与如SEQ ID NO：28所述的序列具有至少90％序列一致性的抗体及其免疫功能片段。
还提供了结构类似但VL与如SEQ ID NO：20所述的序列具有至少95％序列一致性且VH与如SEQ ID NO：28所述的序列具有至少95％序列一致性的抗体及其免疫功能片段。
还提供了包括具有如SEQ ID NO：20所述序列的VL及具有如SEQ IDNO：28所述序列的VH的抗体及其免疫功能片段。
所提供的一些抗体及其功能片段具有含以下或由以下所组成的LC：如SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：42所述的氨基酸序列；和/或含以下或由以下所组成的HC：如SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：40所述的氨基酸序列。
所提供的一些抗体及其功能片段具有由如SEQ ID NO：38或SEQ IDNO：42所述的氨基酸序列所组成的LC，及由如SEQ ID NO：36或SEQ IDNO：40所述的氨基酸序列所组成的HC。
进一步提供的是可与小鼠MabJC18竞争结合Dkk-1+细胞的抗体及其免疫功能片段。在实施方案中，本发明提供人源化抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合人类Dkk-1抗原，其中LC可变区的CDR(CDR1、CDR2及CDR3)及HC可变区的CDR(CDR1、CDR2及CDR3)具有以下氨基酸序列且其中该抗体或片段可与小鼠MabJC18竞争结合Dkk-1+细胞：LC：(i)CDR1(SEQ ID NO：22)、(ii)CDR2(SEQ ID NO：24)及(iii)CDR3(SEQID NO：26)；及HC：(i)CDR1(SEQ ID NO：30、49或50)、(ii)CDR2(SEQ IDNO：32或51)及(iii)CDR3(SEQ ID NO：34或52)。
本发明还提供人源化抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合人类Dkk-1抗原，其中LC可变区的互补决定区(CDR1、CDR2及CDR3)及HC可变区的互补决定区(CDR1、CDR2及CDR3)具有以下氨基酸序列：LC：(i)CDR1(SEQ ID NO：22)、(ii)CDR2(SEQ ID NO：24)及(iii)CDR3(SEQID NO：26)；及HC：(i)CDR1(SEQ ID NO：30、49或50)、(ii)CDR2(SEQ IDNO：32或51)及(iii)CDR3(SEQ ID NO：34或52)，其中LC的可变结构域构架含有人类IGKV3-11种系构架及IGKJ4区。
本发明还提供人源化抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合人类Dkk-1抗原，其中LC可变区的互补决定区(CDR1、CDR2及CDR3)及HC可变区的互补决定区(CDR1、CDR2及CDR3)具有以下氨基酸序列：LC：(i)CDR1(SEQ ID NO：22)、(ii)CDR2(SEQ ID NO：24)及(iii)CDR3(SEQID NO：26)；及HC：(i)CDR1(SEQ ID NO：30、49或50)、(ii)CDR2(SEQ IDNO：32或51)及(iii)CDR3(SEQ ID NO：34或52)，其中HC的可变结构域构架含有人类IGHV3-07种系构架(具有单一回复突变：R100变为T)及IGHJ6区。
本发明还提供人源化抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合人类Dkk-1抗原，其中LC可变区的互补决定区(CDR1、CDR2及CDR3)及HC可变区的互补决定区(CDR1、CDR2及CDR3)具有以下氨基酸序列：LC：(i)CDR1(SEQ ID NO：22)、(ii)CDR2(SEQ ID NO：24)及(iii)CDR3(SEQID NO：26)；及HC：(i)CDR1(SEQ ID NO：30、49或50)、(ii)CDR2(SEQ IDNO：32或51)及(iii)CDR3(SEQ ID NO：34或52)，其中LC的可变结构域构架含有人类IGKV3-11种系构架及IGKJ4区且HC的可变结构域构架含有人类IGHV3-07种系构架(具有单一回复突变：R100变为T)及IGHJ6区。
进一步提供的是包含本发明抗体的一或多个片段或区域的融合蛋白。在实施方案中，提供了包含如SEQ ID NO：20所述的LC可变区的至少10个相邻氨基酸和/或如SEQ ID NO：28所述的HC可变区的至少10个氨基酸的融合多肽。
在另一实施方案中，融合蛋白包含如SEQ ID NO：20所述的LC可变区和/或如SEQ ID NO：28所述的HC可变区。
在另一实施方案中，融合多肽包含以下的一或多个：
(a)选自以下组的轻链(LC)互补决定区(CDR)：
(i)与SEQ ID NO：22具有至少80％序列一致性的CDR1；
(ii)与SEQ ID NO：24具有至少80％序列一致性的CDR2；及
(iii)与SEQ ID NO：26具有至少80％序列一致性的CDR3；或
(b)一或多个选自以下组的重链(HC)互补决定区(CDR)：
(i)与SEQ ID NO：30、49或50具有至少80％序列一致性的CDR1；
(ii)与SEQ ID NO：32或51具有至少80％序列一致性的CDR2；及
(iii)与SEQ ID NO：34或52具有至少80％序列一致性的CDR3。
在另一实施方案中，融合蛋白包含HC CDR3(SEQ ID NO：34或52)及LC CDR3(SEQ ID NO：26)。
在另一实施方案中，融合蛋白包含一或多种本发明抗体，及其在天然分子中未附着的氨基酸序列，如异源序列或来自另一区域的同源序列。在实施方案中，异源序列为选自FLAG标签或6His标签的标签。
还提供了缀合至有助于与固体支撑物偶合的物质的抗体及其免疫功能片段。在实施方案中，抗体及其片段连接于有助于与固体支撑物偶合的物质。在实施方案中，固体支撑物为生物素或抗生物素蛋白。
还提供了连接于标记物质的抗体及其免疫功能片段。在实施方案中，标记物质为萤光分子或放射性分子。
所提供的各种抗体及其免疫功能片段可包括单一LC或HC，或单一可变轻链结构域和/或单一可变重链结构域。所提供的其他抗体及片段可包括两条LC和/或两条HC，其中在一些实施方案中，两条LC彼此相同；和/或其中在一些实施方案中，两条HC彼此相同。所提供的抗体可包括例如单克隆抗体、人类抗体、嵌合抗体或人源化抗体。所提供抗体的免疫功能片段可包括(但不限于)scFv、Fab、Fab′、(FAB′)2或结构结构域抗体。在实施方案中，抗体以约100pM或更低的Kd从Dkk-1多肽解离。
还提供各种编码抗体及其片段的核酸。一些核酸例如编码具有如SEQID NO：22、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26所列的氨基酸序列的LC CDR，从而所编码的CDR编码可特异性结合Dkk-1多肽的抗体或其免疫功能片段。一些核酸例如编码具有如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34所列的氨基酸序列的HC CDR，从而所编码的CDR编码可特异性结合Dkk-1多肽的抗体或其免疫功能片段。在一些实施方案中，核酸包含以下或由以下所组成：编码抗体或其免疫功能片段的VL和/或VH区域的序列，其中VL与SEQ ID NO：20所列的序列具有至少70％、80％、90％或95％序列一致性，且VH与SEQ ID NO：28所述序列具有至少70％、80％、90％或95％序列一致性。在一些实施方案中，核酸包括编码VL(其包含或者由SEQID NO：20所列的序列组成)的序列，和/或包括编码VH(其包含或者由SEQID NO：28所列的序列组成)的序列。在其他实施方案中，核酸包括编码具有前述序列特征的VL与VH两者的序列。
进一步提供的是编码以下任何的多核苷酸：(a)表4中所示的huMabJC18或其变体；(b)表4中所示抗体huMabJC18或其变体的片段或区域；(c)表4中所示抗体huMabJC18或其变体的轻链；(c)表4中所示抗体huMabJC18或其变体的重链；(d)一或多个来自表4中所示抗体huMabJC18或其变体的LC和/或HC的可变区；(e)表4中所示抗体huMabJC18或其变体的一或多个CDR(一、二、三、四、五或六个CDR)；(f)来自抗体huMabJC18的HC的CDR H3；(g)来自抗体huMabJC18的HC的CDR H1；(h)来自抗体huMabJC18的HC的CDR H2，其中氨基酸G57为G或W，和/或F58为F、L、G、Y、M或V，和/或Q59为Q、D、H、G、R或W；(i)来自抗体huMabJC18的HC的CDR H3，其中氨基酸T100为T或S，和/或氨基酸L102为L或Y，和/或氨基酸E103为E、R、Q、D或K；(j)来自抗体huMabJC18的LC的CDR L1，其中氨基酸E27为E、Q，和/或氨基酸D30为D或S，和/或氨基酸D31为D或S，和/或氨基酸F32为F或S，和/或氨基酸G33为G或Y，和/或氨基酸I34为I或L，和/或氨基酸S35为S或A，和/或氨基酸F36为F或W，和/或氨基酸I37为I或M；(k)来自抗体huMabJC18的LC的CDR L2，其中氨基酸G55为G或A，和/或氨基酸S56为S或T；(l)来自抗体huMabJC18的LC的CDR L3，其中氨基酸Q94为Q或H，和/或氨基酸L95为L、S、A或G，和/或氨基酸K96为K、I、L、W、M或S，和/或氨基酸E97为E或D，和/或氨基酸V98为V或L，和/或氨基酸P99为P或W，和/或氨基酸P100为P、S或G，和/或氨基酸T101为T、Y或L；(m)三个来自表4中所示抗体huMabJC18或其变体的LC的CDR；(n)三个来自表4中所示抗体huMabJC18或其变体的HC的CDR；(o)三个来自表4中所示抗体huMabJC18或其变体的LC的CDR，及三个来自表4中所示的抗体huMabJC18或其变体的HC的CDR；及(p)包含(b)至(p)中任一者的抗体。
还提供了与任何这些核酸序列互补的多核苷酸。多核苷酸可为单链(编码或反义)或双链，且可为DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括例如含有内含子且以一一对应的方式对应于DNA分子的HnRNA分子，及不含有内含子的mRNA分子。其他编码或非编码序列可能(但不一定)存在于所提供的多核苷酸内，且多核苷酸可能(但不一定)连接于其他分子和/或支撑材料。
提供了可包含天然序列(即编码抗体或其部分的内源序列)或可包含此序列的变体的多核苷酸。多核苷酸变体可含有一或多个取代、添加、缺失和/或插入，使得所编码的多肽的免疫反应性相对于天然免疫反应性分子并未减小。变体优选与编码天然抗体或其部分的多核苷酸序列展现至少约70％一致性，更优选至少约80％一致性，更优选至少约90％且最优选约95％一致性。
本发明还提供编码人源化抗体或其片段的氨基酸序列的DNA分子，其包含：
(a)一或多个选自以下组的LC CDR：
(i)与SEQ ID NO：22具有至少80％序列一致性的CDR1；
(ii)与SEQ ID NO：24具有至少80％序列一致性的CDR2；及
(iii)与SEQ ID NO：26具有至少80％序列一致性的CDR3；
(b)一或多个选自以下组的HC CDR：
(i)与SEQ ID NO：30、49或50具有至少80％序列一致性的CDR1；
(ii)与SEQ ID NO：32或51具有至少80％序列一致性的CDR2；及
(iii)与SEQ ID NO：34或52具有至少80％序列一致性的CDR3；或
(c)(a)中的一或多个CDR及(b)中的一或多个CDR，
其中LC的可变结构域构架含有人类IGKV3-11种系构架及IGKJ4区。
本发明还提供编码人源化抗体或其片段的氨基酸序列的DNA分子，其包含：
(a)一或多个选自以下组的LC CDR：
(i)与SEQ ID NO：22具有至少80％序列一致性的CDR1；
(ii)与SEQ ID NO：24具有至少80％序列一致性的CDR2；及
(iii)与SEQ ID NO：26具有至少80％序列一致性的CDR3；
(b)一或多个选自以下组的HC CDR：
(i)与SEQ ID NO：30、49或50具有至少80％序列一致性的CDR1；
(ii)与SEQ ID NO：32或51具有至少80％序列一致性的CDR2；及
(iii)与SEQ ID NO：34或52具有至少80％序列一致性的CDR3；或
(c)(a)中的一或多个CDR及(b)中的一或多个CDR，
其中HC的可变结构域构架含有人类IGHV3-07种系构架(具有单一回复突变：R100变为T)及IGHJ6区。
本发明还提供编码人源化抗体或其片段的氨基酸序列的DNA分子，其包含：
(a)一或多个选自以下组的LC CDR：
(i)与SEQ ID NO：22具有至少80％序列一致性的CDR1；
(ii)与SEQ ID NO：24具有至少80％序列一致性的CDR2；及
(iii)与SEQ ID NO：26具有至少80％序列一致性的CDR3；
(b)一或多个选自以下组的HC CDR：
(i)与SEQ ID NO：30、49或50具有至少80％序列一致性的CDR1；
(ii)与SEQ ID NO：32或51具有至少80％序列一致性的CDR2；及
(iii)与SEQ ID NO：34或52具有至少80％序列一致性的CDR3；或
(c)(a)中的一或多个CDR及(b)中的一或多个CDR，
其中LC的可变结构域构架含有人类IGKV3-11种系构架及IGKJ4区，且HC的可变结构域构架含有人类IGHV3-07种系构架(具有单一回复突变：R100变为T)及IGHJ6区。
本发明还提供编码人源化抗体或其片段的氨基酸序列的DNA分子，其包含：
(a)一或多个选自以下组的LC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：22)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：24)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：26)；
(b)一或多个选自以下组的HC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：30、49或50)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：32或51)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：34或52)；或
(c)(a)中的一或多个CDR及(b)中的一或多个CDR，
其中LC的可变结构域构架含有人类IGKV3-11种系构架及IGKJ4区，且HC的可变结构域构架含有人类IGHV3-07种系构架(具有单一回复突变：R100变为T)及IGHJ6区。
在DNA分子的一些实施方案中，LC CDR的核苷酸序列为如下：
CDR1：如SEQ ID NO：21所示
CDR2：如SEQ ID NO：23所示
CDR3：如SEQ ID NO：25所示。
在DNA分子的一些实施方案中，HC CDR的核苷酸序列为如下：
CDR1：如SEQ ID NO：29所示
CDR2：如SEQ ID NO：31所示
CDR3：如SEQ ID NO：33所示。
在DNA分子的一些实施方案中，LC可变区的核苷酸序列为如SEQ IDNO：19所示。
在DNA分子的一些实施方案中，HC可变区的核苷酸序列为如SEQ IDNO：27所示。
在DNA分子的一些实施方案中，LC的核苷酸序列为如SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：41所示。
在DNA分子的一些实施方案中，HC的核苷酸序列为如SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：39所示。
进一步提供的是载体，例如表达载体，其包含编码抗体或其片段的任何多核苷酸序列或DNA分子。
在实施方案中，提供编码人源化抗体或其片段的氨基酸序列的DNA分子，其包含：
(a)一或多个选自以下组的LC CDR：
(i)与SEQ ID NO：22具有至少80％序列一致性的CDR1；
(ii)与SEQ ID NO：24具有至少80％序列一致性的CDR2；及
(iii)与SEQ ID NO：26具有至少80％序列一致性的CDR3；
(b)一或多个选自以下组的HC CDR：
(i)与SEQ ID NO：30、49或50具有至少80％序列一致性的CDR1；
(ii)与SEQ ID NO：32或51具有至少80％序列一致性的CDR2；及
(iii)与SEQ ID NO：34或52具有至少80％序列一致性的CDR3；或
(c)(a)中的一或多个CDR及(b)中的一或多个CDR，
其中LC的可变结构域构架含有呈表达载体形式的人IGKV3-11种系构架及IGKJ4区。
在实施方案中，提供了编码人源化抗体或其片段的氨基酸序列的DNA分子，其包含：
(a)一或多个选自以下组的LC CDR：
(i)与SEQ ID NO：22具有至少80％序列一致性的CDR1；
(ii)与SEQ ID NO：24具有至少80％序列一致性的CDR2；及
(iii)与SEQ ID NO：26具有至少80％序列一致性的CDR3；
(b)一或多个选自以下组的HC CDR：
(i)与SEQ ID NO：30、49或50具有至少80％序列一致性的CDR1；
(ii)与SEQ ID NO：32或51具有至少80％序列一致性的CDR2；及
(iii)与SEQ ID NO：34或52具有至少80％序列一致性的CDR3；或
(c)(a)中的一或多个CDR及(b)中的一或多个CDR，
其中HC的可变结构域构架含有呈表达载体形式的人IGHV3-07种系构架(具有单一回复突变：R100变为T)及IGHJ6区。
在实施方案中，提供编码人源化抗体或其片段的氨基酸序列的DNA分子，其包含：
(a)一或多个选自以下组的LC CDR：
(i)与SEQ ID NO：22具有至少80％序列一致性的CDR1；
(ii)与SEQ ID NO：24具有至少80％序列一致性的CDR2；及
(iii)与SEQ ID NO：26具有至少80％序列一致性的CDR3；
(b)一或多个选自以下组的HC CDR：
(i)与SEQ ID NO：30、49或50具有至少80％序列一致性的CDR1；
(ii)与SEQ ID NO：32或51具有至少80％序列一致性的CDR2；及
(iii)与SEQ ID NO：34或52具有至少80％序列一致性的CDR3；或
(c)(a)中的一或多个CDR及(b)中的一或多个CDR，
其中LC的可变结构域构架含有人类IGKV3-11种系构架及IGKJ4区，且HC的可变结构域构架含有呈表达载体形式的人IGHV3-07种系构架(具有单一回复突变：R100变为T)及IGHJ6区。
在实施方案中，提供编码人源化抗体或其片段的氨基酸序列的DNA分子，其包含：
(a)一或多个选自以下组的LC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：22)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：24)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：26)；
(b)一或多个选自以下组的HC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：30、49或50)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：32或51)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：34或52)；或
(c)(a)中的一或多个CDR及(b)中的一或多个CDR，
其中LC的可变结构域构架含有人IGKV3-11种系构架及IGKJ4区域，且HC的可变结构域构架含有呈表达载体形式的人IGHV3-07种系构架(具有单一回复突变：R100变为T)及IGHJ6区。
还提供的是转化了本发明表达载体化的宿主。在实施方案中，提供以包含编码人源化抗体或其片段的氨基酸序列的DNA分子的表达载体所转化的宿主，该DNA分子包含：
(a)一或多个选自以下组的LC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：22)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：24)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：26)；
(b)一或多个选自以下组的HC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：30、49或50)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：32或51)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：34或52)；或
(c)(a)中的一或多个CDR及(b)中的一或多个CDR，
其中LC的可变结构域构架含有人IGKV3-11种系构架及IGKJ4区域，且HC的可变结构域构架含有人IGHV3-07种系构架(具有单一回复突变：R100变为T)及IGHJ6区。
还提供了宿主细胞，其包含编码人源化抗体或其片段的轻链及重链的重组表达系统，其中该抗体或片段特异性结合于人DKK-1抗原，且其中LC及HC的CDR具有以下氨基酸序列：
(a)一或多个选自以下组的LC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：22)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：24)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：26)；
(b)一或多个选自以下组的HC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：30、49或50)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：32或51)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：34或52)；或
(c)(a)中的一或多个CDR及(b)中的一或多个CDR。
进一步提供了制备人源化抗体或其片段的方法，其中所述抗体或片段特异性结合人类Dkk-1抗原，且其中LC及HC的CDR具有以下氨基酸序列：
(a)一或多个选自以下组的LC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：22)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：24)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：26)；
(b)一或多个选自以下组的HC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：30、49或50)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：32或51)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：34或52)；或
(c)(a)中的一或多个CDR及(b)中的一或多个CDR，
该方法包含提供由以下所转化的的宿主：(i)编码人源化抗体或其片段的轻链的第一表达载体，及编码人源化抗体或其片段的重链的第二表达载体，或(ii)编码人源化抗体或其片段的轻链与重链两者的单一表达载体；及将所述宿主维持于各个链被表达的条件下，及对通过组装如此表达的链所形成的人源化抗体或其片段进行分离。
进一步提供产生人源化抗体或其片段的方法，所述人源化抗体或其片段特异性结合人DKK-1抗原，且其中LC及HC的CDR具有以下氨基酸序列：
(a)一或多个选自以下组的LC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：22)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：24)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：26)；
(b)一或多个选自以下组的HC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：30、49或50)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：32或51)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：34或52)；或
(c)(a)中的一或多个CDR及(b)中的一或多个CDR，
该方法包含培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码该抗体或其片段的LC及HC的重组表达系统；及回收该抗体或其片段。
本发明提供人源化抗体或其片段，其包括培养含有编码人源化抗体或其片段的轻链及重链的重组表达系统的宿主细胞，其中该抗体或片段特异性结合人DKK-1抗原，且其中LC及HC的CDR具有以下氨基酸序列：
(a)一或多个选自以下组的LC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：22)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：24)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：26)；
(b)一或多个选自以下组的HC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：30、49或50)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：32或51)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：34或52)；或
(c)(a)中的一或多个CDR及(b)中的一或多个CDR，
且其中所述人源化抗体或其片段可与muMabJC18竞争结合人Dkk-1抗原。
也提供了药用组合物，其包含人源化抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合人类Dkk-1抗原，且其中LC及HC的CDR具有以下氨基酸序列：
(a)一或多个选自以下组的LC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：22)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：24)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：26)；
(b)一或多个选自以下组的HC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：30、49或50)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：32或51)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：34或52)；或
(c)(a)中的一或多个CDR及(b)中的一或多个CDR；
及药用可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
还提供药用组合物，其包含人源化抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合人Dkk-1抗原，且其中LC及HC的CDR具有以下氨基酸序列：
(a)一或多个选自以下组的LC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：22)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：24)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：26)；
(b)一或多个选自以下组的HC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：30、49或50)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：32或51)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：34或52)；或
(c)(a)中的一或多个CDR及(b)中的一或多个CDR，
其中所述人源化抗体或其片段可与muMabJC18竞争结合人DKK-1抗原；及药用可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
进一步提供了产生人源化抗体或其片段的方法，其包括培养含有编码人源化抗体或其片段的LC及HC的重组表达系统的宿主细胞，其中所述抗体或片段特异性结合人Dkk-1抗原，
且其中LC及HC的CDR具有以下氨基酸序列：
(a)一或多个选自以下组的LC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：22)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：24)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：26)；
(b)一或多个选自以下组的HC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO：30、49或50)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO：32或51)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO：34或52)；或
(c)(a)中的一或多个CDR及(b)中的一或多个CDR，
其中所述人源化抗体或其片段可与muMabJC18竞争结合人Dkk-1抗原；及回收该人源化抗体或其片段。
本发明也提供了治疗或预防骨量流失的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本发明的人源化抗体及其片段。在实施方案中，患者为患有转移至骨胳的癌症的患者。在实施方案中，患者为患有多发性骨髓瘤的患者。在实施方案中，患者为选自患有骨质疏松症、骨质减少(osteopenia)、佩吉特病(Paget′s Disease)、牙周炎、类风湿性关节炎及不活动所致的骨量流失的患者。在实施方案中，患者患有骨质疏松症。在实施方案中，患者患有雌激素缺乏症。
本发明还提供诱导骨量增加的方法，其包含向有需要的患者施用有效量的本发明的人源化抗体及其片段。在实施方案中，患者为患有转移至骨胳的癌症的患者。在实施方案中，患者为患有多发性骨髓瘤的患者。在实施方案中，患者为选自患有骨质疏松症、骨质减少、佩吉特病、牙周炎、类风湿性关节炎及不活动所致的骨量流失的患者。在实施方案中，患者患有骨质疏松症。在实施方案中，患者为骨移植接受者或患有骨折的患者。在实施方案中，患者患有由于如下所致的继发性骨量流失：使用皮质类固醇、芳香酶抑制剂或TZD长期治疗；厌食症；或由性腺功能减退症或肾性骨营养不良所引起。
本发明还提供诱导Wnt活性的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本发明的人源化抗体或其片段。
本发明也提供抗Dkk-1中和单克隆抗体及其免疫功能片段。在实施方案中，抗体或其片段以＜100pM的Kd结合人Dkk-1。在实施方案中，在基于功能细胞的测定中，抗体或其片段以＜100nM的IC50拮抗Dkk-1的作用。在实施方案中，在每月一次给药≤250mg之后，抗体或其片段具有预期会提高骨密度(BMD)量值的经预测的人类暴露情况。
还提供了对Dkk-1抑制Wnt活性的能力进行拮抗并由此使骨量增加的骨合成代谢物质，其适用于治疗其中此类骨形成增加将有利于患者的疾病、病状及病症，如骨质疏松症及导致继发性骨量流失的疾病、病状及病症(例如由用皮质类固醇、芳香酶抑制剂或TZD长期治疗；厌食症；或由性腺功能减退症或肾性骨营养不良所引起)。
本发明的抗体及其片段可与其他药用物质(特别是用于治疗或预防原发性及继发性骨量流失、骨质减少及如下文所述削弱骨强度的那些物质)组合施用。组合疗法可以任何适合的方式施用，如：(a)以单一药用组合物的形式，其包含本发明的人源化抗体或其片段、至少一种本文所述的另外的药用物质及药用可接受的赋形剂、稀释剂或载体；或(b)以两种分别的药用组合物的形式，其包含(i)第一组合物，其包含本发明的人源化抗体或其片段及药用可接受的赋形剂、稀释剂或载体，及(ii)第二组合物，其包含至少一种本文所述的另外的药用物质及药用可接受的赋形剂、稀释剂或载体。药用组合物可同时施用或依次并以任何适合的顺序施用。
进一步提供包含本发明所提供的抗体和/或其片段或包含本发明所提供的药用组合物的试剂盒。在实施方案中，所述试剂盒还包括涉及如何制备抗体或片段和/或如何施用抗体或片段的说明书。在另一实施方案中，将所述试剂盒用于诊断以确定患者是否能够通过抑制Wnt信号途径来增加骨量。
还提供在2009年2月18日在ATCC(依据布达佩斯条约的条款)进行的两个保藏。保藏了携带具有huMabJC18的HC可变区的质粒的大肠杆菌(E.coli)DH5α：宿主大肠杆菌DH5α中来自大肠杆菌的pCR2.1TOPO(UC25553，ATCC专利保藏编号PTA-9835)。保藏了携带具有huMabJC18的LC可变区的质粒的大肠杆菌DH5α：宿主大肠杆菌DH5α中来自大肠杆菌的pCR2.1TOPO(UC 25554，ATCC专利保藏编号PTA-9836)。对如此所保藏的质粒的公众可获得性的所有限制将在专利颁予后自本发明说明书不可撤销地消除。
Figure BPA00001497441300172
本发明的其他特征及优势将通过不应视为限制性的以下细节描述及实施例而显见。贯穿本说明书全文所引用的所有参考文献、Genbank条目、专利及公开专利申请的内容均以全文援引并入本文。
附图简述
图1A及1B展示在完整小鼠模型中抗小鼠Dkk-1单克隆抗体(JC18)的作用。在所有剂量下通过JC18处理，远端股骨的总BMD均显著提高(图1A)。60mg/kg剂量的JC18在小鼠中也显著提高骨形成的速率(图1B)。
图2展示在完整小鼠模型中Dkk-1单克隆抗体的小鼠嵌合体(小鼠嵌合体-嵌合人-小鼠抗体)的作用。相较于载剂(vehicle)，1至30mg/kg剂量的小鼠嵌合体提高总BMD。
图3展示JC18在OVX小鼠模型中预防由雌激素缺乏症所诱发的骨量流失。如所预期的那样，以载剂处理的小鼠在OVX后8周显示出由总BMD显著降低所表明的骨质减少。如在远端股骨处通过pQCT测量，相较于OVX小鼠的载剂处理，JC18剂量应答性地使总BMD提高7％至20％。在每周两次以15mg/kg JC18处理的小鼠中，总BMD不仅高于以载剂处理的OVX小鼠，而且维持在假对照水平，表明在此剂量及给药方案下，JC18完全预防OVX小鼠中骨质减少的发展。
图4展示JC18结合人同系物Dkk-1、Dkk-3及Dkk-4的特异性。JC18显示出与人Dkk-4的弱结合及不结合于人Dkk-3(至多5μg/ml)。
图5展示靶标介导的药物处置(Target Mediated Drug Disposition，TMDD)模型。
图6展示在以1、5、10及100μg/kg单次静脉内施用后大鼠中经V5-His标记的h-DKK-1的血清浓度图。0.001mg/kg样品，＞0.5小时的时间点；0.005mg/kg样品，＞1小时的时间点；及0.01mg/kg及0.1mg/kg样品，＞2小时的时间点低于测定法的可定量限度且不包括于曲线中。
图7展示向Sprague-Dawley大鼠每周静脉内施用huMabJC18后观察到及模型预测的游离/部分游离的huMabJC18浓度相对于时间的图。符号表示平均观察数据(±SD)且线表示由模型预测的情况。
图8A-E展示向Sprague-Dawley大鼠每周静脉内施用huMabJC18后观察到及模型预测的游离Dkk-1浓度相对于时间的图。符号表示平均观察数据(±SE)且线表示由模型预测的情况。将检测到的有抗huMabJC18抗体的样品从分析中移除。
图9A-B展示向食蟹猴(Cynomolgous Monkey)单次静脉内施用huMabJC 18后观察到及模型预测的游离/部分游离huMabJC 18浓度相对于时间的图。(A)雄性猴。(B)雌性猴。符号表示观察到的个别猴数据且线表示由模型预测的情况。
图10A-E展示向食蟹猴单次静脉内施用huMabJC18后观察到及模型预测的游离Dkk-1浓度相对于时间的图。符号表示观察数据且线表示由模型预测的情况。
图11展示在向Sprague-Dawley大鼠每周静脉内施用huMabJC18后在第一次给药后1.5周及2.5周的平均骨钙蛋白浓度(±SE)的图。*表示p＜0.05v.s.载剂
图12展示在每月一次皮下施用huMabJC18经6个月后人体内预测的游离Dkk-1浓度的图。测试三种不同剂量：0.003mg/kg，表示1/10的MABEL或无作用剂量；0.03mg/kg，表示MABEL；及3.57mg/kg，表示骨质疏松症的预测有效剂量。
图13展示在每月一次皮下施用huMabJC18经6个月后人体内预测的游离huMabJC18浓度的图。测试三种不同剂量：0.003mg/kg，表示1/10的MABEL或无作用剂量；0.03mg/kg，表示MABEL；及3.57mg/kg，表示骨质疏松症的预测有效剂量。展示生物分析测定的预期定量限度(Limit ofQuantitation，LOQ)表示低于预测MABEL的给药无用处。
图14展示基于(1)稳态平衡法(Duff，2006)及(2)机制性PK/PD(TMDD)建模，huMabJC18的受体占用计算v.s.预测的人类剂量的图
发明详述
本发明涉及分离的抗体及其片段(例如抗原结合部分)，特别是涉及特异性结合Dkk-1的人源化单克隆抗体及其片段。在一些实施方案中，本发明的抗体及其片段是源自特定重链及轻链种系序列和/或包含特定结构特征，如含特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供例如分离的抗体及其片段、产生这些抗体或其片段的方法、及含有所述抗体或其片段的药用组合物。本发明还涉及使用所述抗体及其片段来例如检测Dkk-1以及治疗各种导致骨量流失的疾病、病状或病症(诸如骨病症)的方法。还提供了治疗或预防骨量流失的方法、诱导骨量增加的方法及诱导Wnt活性的方法。
定义
除非在本文中另作定义，否则关于本发明所使用的科学及技术术语应具有本领域技术人员通常所了解的含义。此外，除非文中另有要求，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。一般而言，本文所用的关于细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质及核酸化学及杂交所使用的命名法及技术是本领域中熟知且常用的。除非另外说明，否则本发明的方法及技术一般按照本领域中熟知的常规方法以及本说明书中所引用及论述的各种一般性和比较特别的参考文献中所述的来进行。参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates(1992)，及Harlow及Lane Antibodies：A Laboratory Manual ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)，其援引加入本文中。如本领域中通常实现的那样或如本文所述，根据制造商说明书来进行酶反应及纯化技术。本文所用的关于分析化学、合成有机化学及医药及药物化学的术语及实验程序及技术是本领域中熟知及常用的。可使用标准技术来进行化学合成、化学分析、药物制备、配制及递送，以及治疗患者。
除非另外说明，否则本发明中所用的以下术语应理解为具有以下含义：
如本文中所用，“Dkk-1”包括例如鼠类及人类天然形式的Dkk-1。示例性Dkk-1蛋白及核苷酸序列在例如US 2006/0127393(WO 2006/015373)及US 2008/0193449中有公开。该术语还包括与这些天然蛋白具有免疫交叉反应性的这些天然序列的变体。这些蛋白质可抑制LRP5或LRP6与Wnt之间的相互作用。该术语还可以指天然或变体形式的Dkk-1中含有抗体可特异性结合的表位的片段。
术语“多核苷酸”或“核酸”意指单链或双链聚合物。构成多核苷酸的核苷酸可以是核糖核酸或脱氧核糖苷酸或任何类型的核苷酸经修饰的形式。所述修饰包括碱基修饰，如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修饰，诸如2′，3′-二脱氧核糖；及核苷酸间键修饰，诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoroaniladate)及磷酰胺酸(phosphoroamidate)。该术语包括单链和双链形式。
术语“寡核苷酸”意指包含200个或200个以下核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸长度为10至60个碱基。在其他实施方案中，寡核苷酸长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个核苷酸。寡核苷酸可例如用于构建突变基因的单链或双链寡核苷酸。本发明的寡核苷酸可为有义或反义寡核苷酸。本发明的寡核苷酸可包括用于检测测定的标记，包括放射性标记、萤光标记、半抗原或抗原标记。本发明的寡核苷酸可用作例如PCR引物、克隆引物或杂交探针。
“分离的核酸分子”意指基因组DNA或RNA、mRNA、cDNA或合成来源的DNA或RNA，或其一些组合，其不与在自然界中可发现所述分离的多核苷酸的全部或一部分多核苷酸相结合，或与在自然界中所不连接的多核苷酸相连接。为实现本发明的目的，应理解“包含特定核苷酸序列的核酸分子”并不涵盖完整染色体。“包含”指定的核酸序列的分离核酸分子除所指定的序列外还可以包括多达十个或甚至多达二十个其他蛋白质或其部分的编码序列；或者可以包括可操作地连接的调控序列，其控制所述核酸序列的编码区表达；和/或可包括载体序列。
除非另有规定，否则本文中论述的任何单链多核苷酸序列的左手端为5′端；双链多核苷酸序列的左手方向称作5′方向。初生态RNA转录物的5′至3′添加方向称作转录方向；在与RNA转录物具有相同序列的DNA链上且5′定位于RNA转录物的5′端的序列区域称作“上游序列”；在与RNA转录物具有相同序列的DNA链上且3′定位于RNA转录物的3′端的序列区域称作“下游序列”。
术语“控制序列”是指可影响其所连接的编码序列表达及处理的多核苷酸序列。这些控制序列的性质可视宿主生物体而定。在具体的实施方案中，原核生物的控制序列可包括启动子、核糖体结合位点及转录终止序列。例如，真核生物的控制序列可包括启动子，所述启动子包含用于转录因子的一或多个识别位点；转录增强子序列；及转录终止序列。本发明的“控制序列”可包括前导序列和/或融合配偶体序列。
术语“载体”意指用于将蛋白质编码信息转移至宿主细胞中的任何分子或实体(例如核酸、质粒、噬菌体或病毒)。
术语“表达载体”或“表达构建物”是指适宜于转化宿主细胞且含有引导和/或控制(联合宿主细胞)一或多个其可操作地连接的异源编码区表达的核酸序列的载体。表达构建物可包括(但不限于)这样的序列，所述序列影响或控制与其可操作地连接的编码区的转录、翻译，而若存在内含子则影响其RNA剪接。
如本文中所用，“可操作地连接”意指应用该术语的组分的关系允许其在适合条件下实现其固有功能。例如，载体中“可操作地连接”至蛋白质编码序列的控制序列以使得在与控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白质编码序列的表达的方式与其接合。
术语“宿主细胞”意指已经或能够经核酸序列转化且由此表达相关基因的细胞。该术语包括亲代细胞的后代(无论后代的形态或遗传构成是否与原始亲代细胞一致，只要相关基因存在即可)。
术语“转导”意指通常经由噬菌体使基因从一个细菌转移至另一个之中。“转导”也是指通过反转录病毒获取及转移真核细胞序列。
术语“转染”意指细胞吸收外来或外源DNA，且当外源DNA已引入细胞膜内时，该细胞已被“转染”。在本领域中熟知且于本文中公开了许多转染技术。例如参见Graham等人，1973，Virology 52：456；Sambrook等人，2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，同上文；Davis等人，1986，BasicMethods in Molecular Biology，Elsevier；及Chu等人，1981，Gene 13：197。这些技术可用于将一或多个外源DNA部分引入适合的宿主细胞中。
术语“转化”是指细胞遗传特征的改变，而当细胞已被修饰为含有新DNA或RNA时，则该细胞已被转化。例如，当细胞经由转染、转导或其他技术引入新遗传物质而自其天然状态经遗传修饰时，则该细胞已被转化。转染或转导之后，转化DNA可通过将实体整合至细胞的染色体内而与细胞DNA重组，或可短暂保持为游离元件而不复制，或可以质粒形式独立复制。当转化DNA随细胞分裂而复制时，细胞被视为已经“稳定转化”。
术语“多肽”或“蛋白质”意指具有天然蛋白的氨基酸序列的大分子，也即由天然存在及非重组细胞所产生，或由经遗传工程改造或重组的细胞所产生的蛋白质，且包含具有天然蛋白的氨基酸序列的分子，或具有对天然序列的一或多个氨基酸缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”及“蛋白质”特别涵盖抗Dkk-1抗体，或具有针对抗Dkk-1抗体的一或多个氨基酸缺失、添加和/或取代的序列。术语“多肽片段”是指相较于全长天然蛋白具有氨基端缺失、羧基端缺失和/或内部缺失的多肽。相较于天然蛋白，这些片段也可含有经修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段长约5至500个氨基酸。例如，片段长可为至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸。本发明的适用多肽片段包括抗体的免疫功能片段，包括结合结构域。在抗Dkk-1抗体的情况中，适用片段包括(但不限于)CDR区、重链或轻链的可变结构域、抗体链的一部分或仅其可变区(包括两个CDR)及其类似物。
在本文中提及的术语“分离的蛋白质”意指本发明的蛋白质(1)不含至少一些在正常情况下伴随可见的其他蛋白质，(2)基本上不含相同来源(例如相同物种)的其他蛋白质，(3)通过不同物种的细胞表达，(4)已与至少约50％的在自然界中与其结合的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其他物质分离，(5)与在自然界中不与其结合的多肽可操作地结合(通过共价或非共价相互作用)，或(6)不存在于自然界中。基因组DNA、cDNA、mRNA或其他RNA、具有合成来源者，或其任何组合可编码此分离的蛋白质。分离的蛋白质优选实质上不含其自然环境中可见的会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途的蛋白质或多肽或其他污染物。
多肽(例如抗体)的“变体”包含氨基酸序列相对于另一多肽序列已插入、缺失和/或取代一或多个氨基酸残基的氨基酸序列。本发明的变体包括融合蛋白。
多肽的“衍生物”为已经以一些不同于插入、缺失或取代变体的方式(例如通过结合于另一化学部分)而经化学修饰的多肽(例如抗体)。
如本领域技术人员应了解的那样，“免疫应答”包括(但不限于)辅助T细胞或细胞毒性T细胞反应的任何可检测的抗原特异性的或异源的活化、抗体产生、T细胞介导的过敏反应活化等。该术语涵盖例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞及由上述细胞或肝脏产生的可溶大分子(包括抗体、细胞激素及补体)致使自人体选择性损害、破坏或消除侵入病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或在自体免疫或病理学发炎的情况下，正常人类细胞或组织的作用。
“信号转导途径”是指在信号自细胞的一部分传递至细胞的另一部分中起作用的各种信号转导分子之间的生化关系。如本文中所用，短语“细胞表面受体”包括例如能够接收信号且使此信号传递穿过细胞质膜的分子及分子复合物。
“抗体”是能够通过至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等靶标的免疫球蛋白分子。如本文中所用，该术语不仅涵盖完整多克隆或单克隆抗体，而且还涵盖其片段(诸如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、单链(ScFv)及结构域抗体，包括鲨鱼及骆驼抗体)，及包含抗体部分的融合蛋白，及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰的构型。抗体包括任何类别的抗体，诸如IgG、IgA或IgM(或其子类)，且抗体不一定属于任何特定类别。视免疫球蛋白重链恒定结构域的抗体氨基酸序列而定，免疫球蛋白可归为不同类别。有五个主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且这些类别中的几类可进一步分成子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ及μ。不同类别免疫球蛋白的亚单元结构及三维构型是公知的。
本发明的抗体可仅来源于单一来源，或可为“嵌合”抗体，也即抗体的不同部分可来源于两种不同抗体。例如，CDR区可来源于大鼠或鼠类来源，而V区的构架区来源于不同动物来源，诸如人类。本发明的抗体或结合片段可通过重组DNA技术在杂交瘤中产生，或通过使完整抗体酶促或化学裂解而产生。除非另有说明，否则除包含两条全长重链及两条全长轻链的抗体外，术语“抗体”也包括其衍生物、变体、片段及突变所形成的蛋白质，其实例描述于下文中。
术语“轻链”包括具有足以赋予结合特异性的可变区序列的全长轻链及其片段。全长轻链包括可变区结构域VL及恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基端。本发明的轻链包括κ链及λ链。
术语“重链”包括具有足以赋予结合特异性的可变区序列的全长重链及其片段。全长重链包括可变区结构域VH及三个恒定区结构域CH1、CH2及CH3。VH结构域位于多肽的氨基端，且CH结构域位于羧基端，其中CH3最接近-COOH端。本发明的重链可为任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亚型)、IgA(包括IgA1及IgA2亚型)、IgM。VH及VL区可进一步再分为称为互补决定区(CDR)的高变区，穿插有称为构架区(FR)的较保守区域。各VH及VL由三个CDR及四个FR构成，其自氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链可变区及轻链可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体恒定区可介导免疫球蛋白结合宿主组织或包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)及经典补体系统的第一组分(C1q)的因子。在轻链及重链中，可变区与恒定区通过约12个或12个以上氨基酸的“J”区接合，其中重链也包括约10个或10个以上氨基酸的“D”区。一般参见Fundamental Immunology第7章(Paul，W.编，第2版.Raven Press，N.Y.(1989))。
如本文中所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)是指抗体中保留特异性结合抗原(例如α5β1)能力的一或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来执行。涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，即包含两个在铰链区通过二硫桥连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH及CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL及VH)由单独基因编码，但可使用重组法通过合成接头将其接合使其能够成为VL区与VH区配对形成单价分子的单一蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；例如参见Bird等人，(1988)Science242：423-426；及Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)。这些单链抗体也会被涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段可使用任何适合的技术(包括本领域技术人员已知的常规技术)而获得，且所述片段可通过与完整抗体相同的方式经筛选以便使用。
如本文中所用，“分离的抗体”意指这样的的抗体，其实质上不含具有不同抗原特异性的其他抗体(例如特异性结合Dkk-1的分离抗体实质上不含特异性结合除Dkk-1之外抗原的抗体)。然而，特异性结合Dkk-1的分离抗体可对其他抗原(诸如来自其他物种的Dkk-1分子)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可实质上不含其他细胞物质和/或化学物质。
如本文中所用，术语免疫球蛋白链的“免疫功能片段”(或简称“片段”)是指缺少至少一些在全长链中存在的氨基酸但能够特异性结合抗原的抗体轻链或重链的一部分。这些片段因其特异性结合靶标抗原且可与完整抗体竞争特异性结合特定表位而具有生物活性。在本发明的一方面，此片段将保留至少一个存在于全长轻链或重链中的CDR，且在一些实施方案中将包含单一重链和/或轻链或其部分。这些生物活性片段可通过重组DNA技术产生，或可通过使完整抗体酶促或化学裂解来产生。本发明的免疫功能免疫球蛋白片段包括(但不限于)Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、结构结构域抗体及单链抗体，且可来源于任何哺乳动物来源，包括(但不限于)人类、小鼠、大鼠、骆驼或兔。还涵盖本发明抗体的功能部分(例如一或多个CDR)可共价结合于第二蛋白或小分子产生针对体内特定靶标的治疗物质，从而具有双功能治疗特性，或具有延长的血清半衰期。
“Fab片段”包含一条轻链，及一条重链的CH1及可变区。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
“Fc”区含有两个包含抗体的CH1及CH2结构域的重链片段。两个重链片段是通过两个或两个以上二硫键且通过CH3结构域的疏水性相互作用而保持在一起。
“Fab′片段”含有一条轻链，及一条含有VH结构域及CH1结构域以及CH1与CH2结构域之间区域的重链的一部分，使得可在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”含有两条轻链及两条含有CH1与CH2结构域之间恒定区一部分的重链，使得两条重链之间形成链间二硫键。因此F(ab′)2片段由两个通过两条重链之间的二硫键保持在一起的Fab′片段所构成。
“Fv区”包含来自重链及轻链两者的可变区，但缺少恒定区。
“单链抗体”为重链可变区与轻链可变区已通过柔韧接头相连接形成单一多肽链，从而形成抗原结合区的Fv分子。单链抗体在例如WO 88/01649及美国专利第4,946,778号及第5,260,203号中有详细论述。
“结构结构域抗体”为仅含有重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或两个以上VH区经肽接头共价接合产生二价结构结构域抗体。二价结构结构域抗体的两个VH区可靶向相同或不同抗原。
“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同抗原特异性。然而，二价抗体可呈双特异性(参见下文)。
“多特异性抗体”为靶向一种以上抗原或表位的抗体。
“双特异性”、“双重特异性”或“双功能”抗体为具有两个不同抗原结合位点的杂合抗体。双特异性抗体是一种多特异性抗体，且可通过各种方法(包括(但不限于)杂交瘤融合或Fab′片段连接)产生。例如参见Songsivilai及Lachmann(1990)，Clin.Exp.Immunol.79：315-321；及Kostelny等人，(1992)，J.Immunol.148：1547-1553。双特异性抗体的两个结合位点将结合两个可位于相同或不同蛋白质靶标上的不同表位。
如本文中所用，“单克隆抗体”是指得自实质上同源的抗体群体的抗体，也即构成该群体的个别抗体除了可能以微量存在的天然的突变外为相同的。单克隆抗体针对单一抗原位点具有高度特异性。此外，与多克隆抗体制剂(其通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相反，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体得自实质上同源的抗体群的特征，且不应视为需要通过任何特定方法产生该抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可通过Kohler及Milstein(1975)Nature 256：495首先描述的杂交瘤法制得，或可通过诸如美国专利第4,816,567号中描述的重组DNA方法制得。单克隆抗体也可从使用例如McCafferty等人，(1990)Nature 348：552-554中所述的技术产生的噬菌体文库分离。
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体与另一物质或抗体的缀合物。
术语“人源化抗体”意指来源于另一哺乳动物物种(诸如小鼠)种系的CDR序列已移植于人类构架序列上的抗体。可在人类构架序列内进行额外构架区修饰。
如本文中所用，“人源化”抗体是指非人类(例如鼠类)抗体形式，其为含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链，或其片段(诸如抗体的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其他抗原结合子序列)。人源化抗体优选为人类免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基经具有所需特异性、亲和力及能力的来自非人类物种(供者抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基置换。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基经相应非人类残基置换。此外，人源化抗体可包含在接受者抗体或输入CDR或构架序列中均未见，但包括以使抗体效能进一步改进及优化的残基。一般而言，人源化抗体将包含实质上所有的至少一个及通常两个可变结构域，其中所有或实质上所有CDR区均对应于非人类免疫球蛋白的CDR区，且所有或实质上所有FR区均为人类免疫球蛋白共同序列的FR区。人源化抗体最优选还将包含免疫球蛋白恒定区或恒定结构域(Fc)的至少一部分，通常包含人类免疫球蛋白恒定区或恒定结构域的至少一部分。优选为Fc区如在WO 99/58572中所述经修饰的抗体。其他形式的人源化抗体具有一或多个相对于原始抗体经改变的CDR(CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2和/或CDR H3)。
如本文中所用，术语“人类抗体”或“完全人类抗体”会包括具有构架区及CDR区两者均来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，若抗体含有恒定区，则该恒定区也来源于人类种系免疫球蛋白序列。本发明的人类抗体或其抗原结合部分可包括不由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文中所用，术语“人类抗体”并不会包括来源于另一哺乳动物物种(诸如小鼠)种系的CDR序列已移植于人类构架序列上的抗体。
术语“人类单克隆抗体”或“完全人类单克隆抗体”是指显示单一结合特异性且具有构架区及CDR区两者均来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。在实施方案中，人类单克隆抗体是由包括得自具有包含人类重链转基因及轻链转基因的基因组的转基因非人类动物(例如转基因小鼠)的B细胞的杂交瘤产生，其中该B细胞融合于永生化细胞。
如本文中所用，术语“重组人类抗体”包括所有通过重组手段制备、表达、产生或分离的人类抗体，如(a)从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)或由此而制备的杂交瘤所分离的抗体(下文进一步描述)；(b)从经转化以表达人类抗体的宿主细胞，例如从转染瘤所分离的抗体；(c)从重组组合人类抗体文库分离的抗体；及(d)通过任何其他涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的手段制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人类抗体具有构架区及CDR区来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方案中，可对这些重组人类抗体进行体外诱变(或当使用人类Ig序列的转基因动物时进行体内体细胞诱变)且因此重组抗体的VH区及VL区的氨基酸序列为尽管来源于且有关于人类种系VH及VL序列但可能并非天然体内存在于人类抗体种系谱系中的序列。
如本文中所用，“同种型”或“类别”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG)。抗体的恒定结构域不涉及结合抗原，但显示各种效应功能。根据重链恒定区的氨基酸序列，特定人类抗体或免疫球蛋白可归于以下五个主要类别的免疫球蛋白之一：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。不同类别免疫球蛋白的结构及三维构型是公知的。在各种人类免疫球蛋白类别中，仅人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgM活化补体已知。已知人类IgG1及IgG3在人类中介导ADCC。
如本文中所用，“子类”是指重链恒定区基因的同种型内的进一步分类，诸如IgG同种型内的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4子类。
如本文中所用，术语“化合物”或“药用化合物”包括抗体、其抗原结合部分、免疫缀合物及双特异性分子。
短语“识别抗原的抗体”及“对抗原具特异性的抗体”与术语”特异性结合抗原的抗体”在本文中可互换使用。
术语“抗体依赖性细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的反应，其中非特异性细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性白血球、巨噬细胞等)对结合于靶细胞上的抗体进行识别并随后引起靶细胞溶解。这些介导ADCC的细胞毒性细胞一般表达Fc受体(FcR)。介导ADCC的初级细胞(NK细胞)表达Fc RIII，而单核细胞表达Fc RI、Fc RII、Fc RIII和/或Fc RIV。造血细胞上的FcR表达在Ravetch及Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92(1991)中有概述。为评估分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，诸如美国专利第5,500,362号或第5,821,337号中所述的测定。适用于这些测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)及自然杀伤(NK)细胞。或者另外，相关分子的ADCC活性可于体内，例如在动物模型(诸如Clynes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，95：652-656(1998)中所公开的)中加以评估。
使用术语“Fc受体”或”FcR”来描述结合抗体Fc区的受体，其中该Fc区包含铰链区及重链的CH2及CH3结构域。例如，FcR可为天然序列的人FcR。FcR可为结合IgG抗体的受体(γ受体)且包括Fc RI、Fc RII、Fc RIII及Fc RIV子类的受体，包括等位基因变体及这些受体的可变剪接形式。Fc RII受体包括Fc RIIA(“活化受体”)及Fc RIIB(“抑制受体”)，其不同之处主要在于胞浆结构域的类似氨基酸序列。活化受体Fc RIIA在其胞浆结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体Fc RIIB在其胞浆结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见Daeron，Annu.Rev.Immunol.，15：203-234(1997))。FcR在Ravetch及Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods，4：25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.，126：330-41(1995)中有评述。在本文中术语“FcR”涵盖包括有待将来鉴别的其他FcR。该术语也包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，Immunol.，117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.，24：249(1994))。免疫球蛋白Fc片段上的主要FcR结合位点存在于CH1结构域与CH2结构域之间的铰链区中。此铰链区与各种白血球上的FcR1-3相互作用且触发这些细胞攻击靶标(Wines等人，J.Immunol.，164：5313-5318(2000))。铰链区涵盖(但不限于)美国专利第6,165,476号中所述的序列。
术语“能够诱导抗体依赖性细胞毒性”是指如通过本领域技术人员已知的测定所测量的物质(如抗体)展现ADCC的能力。此活性的特征通常在于使Fc区与各种FcR结合。不受限于任何特定机制，本领域技术人员应认识到抗体展现ADCC的能力可例如借助于其子类(诸如IgG1或IgG3)、通过引入Fc区中的突变，或借助于抗体的Fc区中碳水化合物模式的修饰而实现。这些修饰在例如美国专利申请公开案第2007/0092521号中有描述。
术语“中和抗体”是指结合配体、防止配体结合其结合配偶体且中断否则会由配体结合于其结合配偶体引起的生物反应的抗体。在评估抗体或其免疫功能片段的结合及特异性中，当过量抗体使结合于配体的结合配偶体的量减少至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99％以上(如在体外竞争结合测定中所测量)时，抗体或片段将实质上抑制配体结合其结合配偶体。在Dkk-1抗体的情况中，中和抗体将减小Dkk-1结合LRP5或LRP6的能力，由此诱导Wnt活性可测量的提高。
术语“竞争”当在竞争同一表位的抗体的上下文中使用时意指通过测定法来确定抗体之间的竞争，其中所测试的抗体或免疫功能片段防止或抑制参考抗体特异性结合共同抗原(例如Dkk-1或其片段)。可使用众多类型的竞争结合测定，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(例如参见Stahli等人，(1983)Methods inEnzymology 9：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(例如参见Kirkland等人，(1986)J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(例如参见Harlow及Lane(1988)Antibodies，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(例如参见Morel等人，(1988)Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(例如参见Cheung等人，(1990)Virology 176：546-552)；及直接标记RIA(Moldenhauer等人，(1990)Scand.J.Immunol.32：77-82)。此测定通常涉及使用结合于带有这些未标记测试免疫球蛋白及标记的参考免疫球蛋白中任一者的固体表面或细胞的经纯化抗原。竞争性抑制是通过测定在测试免疫球蛋白存在下结合于固体表面或细胞的标记量来测量。存在的测试免疫球蛋白通常过量。由竞争测定鉴别的抗体(竞争抗体)包括与参考抗体结合相同表位的抗体，及结合足够接近由参考抗体所结合的表位的邻近表位以产生位阻的抗体。关于测定竞争结合的方法的其他细节在本文实例中提供。当存在的竞争抗体过量时，其通常将抑制参考抗体特异性结合于共同抗原达至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些情况中，结合被抑制达至少80％、85％、90％、95％、或97％或97％以上。
术语“抗原”是指能够被选择性结合物质(诸如抗体)结合且另外能够用于动物中以产生可结合该抗原的抗体的分子或分子的一部分。抗原可具有一或多个能够与不同抗体相互作用的表位。
术语“表位”包括任何能够特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的决定簇。表位为抗原中经特异性靶向该抗原的抗体结合且当抗原为蛋白质时包括直接接触抗体的特异性氨基酸的区域。表位最常存在于蛋白质上，但在一些情况下可存在于其他种类的分子(诸如核酸)上。表位决定簇可包括化学活性表面分类的分子，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，且可具有特定三维结构特征和/或特定电荷特征。一般而言，对特定靶标抗原具有特异性的抗体将在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别靶标抗原上的表位。
如本文中所用，短语“特异性结合”意指化合物(例如蛋白质、核酸、抗体及其类似物)识别及结合特异性分子，但实质上不识别或结合样品中的其他分子。例如，识别及结合样品中同源配体(例如与其同源抗原Dkk-1结合的抗Dkk-1抗体)但实质上不识别或结合样品中其他分子的抗体或肽抑制剂。因此，在指定测定条件下，指定结合部分(例如抗体或其片段(例如其抗原结合部分))优先结合于特定靶标分子(例如Dkk-1)，且并不大量结合于测试样品中存在的其他组分。可使用各种测定形式来选择特异性结合相关分子的抗体。例如，固相ELISA免疫测定、免疫沉淀、BIAcore、FACS及蛋白印迹分析(Western blot analysis)为可用以鉴别与Dkk-1特异性反应的抗体的许多测定法中的几种。特异性或选择性反应通常为背景信号或干扰信号的至少两倍，且更通常大于背景的10倍，甚至更具体而言，当平衡解离常数(KD)≤1μM，例如≤100nM，且进一步例如≤10nM时，称抗体为“特异性结合”抗原。
当解离常数(Kd)优选为约100pM或100pM以下、约1×10-9或1×10-9以下，或1×10-8或1×10-8以下时，称本发明的抗体“特异性结合”其靶标抗原。
如本文中所用，术语“kon”意指特定抗体-抗原相互作用的结合速录，而如本文中所用，术语“koff”意指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文中所用，术语“KD”意指解离常数，其由koff与kon之比(也即koff/kon)获得且以摩尔浓度(M)的形式表述。抗体的KD值可使用在本领域中已确立的方法来测定。一种测定抗体KD的方法是通过使用表面等离子共振，其通常使用生物传感器系统，诸如系统。
术语IgG抗体的“高亲和力”一般是指抗体对靶标抗原的KD为1×10-7M或1×10-7M以下、5×10-8M或5×10-8M以下，或5×10-9M或5×10-9M以下。然而，对于其他抗体同种型，“高亲和力”结合可以不同。例如，对IgM同型的“高亲和力”结合是指抗体的KD为10-6M或10-6M以下、10-7M或10-7M以下，或10-8M或10-8M以下。
术语“一致性”是指如通过比对及比较序列所测定，两种或两种以上多肽分子或两种或两种以上核酸分子的序列之间的关系。“一致性百分比”意指在所比较分子的氨基酸或核苷酸之间一致残基的百分比且基于所比较的最小分子的大小来计算。对于这些计算，必须通过特定数学模型或计算机程序(也即“算法”)来处理比对中的间隙(若存在)。可用以计算所比对核酸或多肽的一致性的方法包括以下文献中所述的：Computational MolecularBiology，(Lesk，A.M.编)(1988)New York：Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects，(Smith，D.W.编)(1993)NewYork：Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，(Griffin，A.M.及Griffin，H.G.编)(1994)New Jersey：Humana Press；vonHeinje，G.(1987)Sequence Analysis in Molecular Biology，New York：Academic Press；Sequence Analysis Primer，(Gribskov，M.及Devereux，J.编)(1991)New York：M.Stockton Press；及Carillo等人，(1988)SIAM J.AppliedMath.48：1073。
计算一致性百分比时，以得到序列之间最大匹配的方式比对所比较的序列。用以测定一致性百分比的计算机程序为GCG程序包，其包括GAP(Devereux等人，(1984)Nucl Acid Res 12：387；Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，Wisc.)。使用计算机算法GAP来比对两种欲测测序列一致性百分比的多肽或多核苷酸。序列经比对以便实现其各自氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配范围(matched span)”，如依据算法所测定)。间隙开放罚分(gap opening penalty)(其经计算为平均对角线(averagediagonal)的3倍，其中“平均对角线”为所用比较矩阵对角线的平均值；“对角线”为通过特定比较矩阵赋予各完全氨基酸匹配的评分或数字)及间隙延长罚分(gap extension penalty)(其通常为间隙开放罚分的1/10)，以及诸如PAM 250或BLOSUM 62的比较矩阵与算法联合使用。在某些实施方案中，算法还使用标准比较矩阵(参见Dayhoff等人，(1978)Atlas of ProteinSequence and Structure 5：345-352，关于PAM 250比较矩阵；Henikoff等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919，关于BLOSUM 62比较矩阵)。
使用GAP程序测定多肽或核苷酸序列的一致性百分比的推荐参数如下：
算法：Needleman等人，(1970)J.Mol.Biol.48：443-453；
比较矩阵：BLOSUM 62，得自Henikoff等人，(1992)，同上文；
间隙罚分：12(但末端间隙无罚分)
间隙长度罚分：4
类似性的临限值：0。
比对两个氨基酸序列的某些比对方案仅可产生两个序列的短区域匹配，且此小比对区域可具有极高序列一致性，尽管该两种全长序列之间不存在显著关系。因此，所选比对方法(GAP程序)可视需要加以调整以产生跨越靶标多肽的至少50个相邻氨基酸的比对。
如本文中所用，“实质上纯”意指所述分子物质为存在的主要物质，也即以摩尔浓度计，其丰度大于同一混合物中的任何其他个别物质。在某些实施方案中，实质上纯的分子为目标物质占存在的全部大分子物质的至少50％(以摩尔浓度计)的组合物。在其他实施方案中，实质上纯的组合物将占组合物中所存在的全部大分子物质的至少80％、85％、90％、95％或99％。在其他实施方案中，将目标物质纯化至基本均质，其中通过常规检测方法在组合物中无法检测到污染物质，且因此组合物是由单一可检测大分子物质组成。
“氨基酸”包括其在本领域中的一般含义。二十种天然存在的氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology-A Synthesis，第2版，(E.S.Golub及D.R.Gren编)，Sinauer Associates：Sunderland，Mass.(1991)，该文献对任何目援引并入本文。二十种常见氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸(诸如α-，α-双取代氨基酸、N-烷基氨基酸)、及其他非常见氨基酸也可为本发明多肽的适合组分。非常见氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸，及其他类似氨基酸及亚氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽符号中，根据标准用法及惯例，左手方向为氨基端方向且右手方向为羧基端方向。
术语“骨质减少”是指患者的骨量流失相较于被视为具有正常骨密度(BMD)的标准患者为至少一个标准差。例如，测量可通过双能量X射线吸收测定术(Dual Energy X-ray Absorptiometry，DEXA)测定且将患者的BMD与年龄及性别匹配的标准比较(Z评分)。在测定骨质减少时，可获取一或多个骨胳的BMD量值。
术语“治疗有效量”是指经测定在哺乳动物中产生治疗反应的抗Dkk-1抗体量。这些治疗有效量可由本领域技术人员轻易地确定。
“糖型(Glycoform)”是指包含各种碳水化合物单元的键联的复杂寡糖结构。这些结构在例如Essentials of Glycobiology Varki等人编，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1999)中有描述，其也提供了标准糖生物学命名法的论述。这些糖型包括(但不限于)G2、G1、G0、G-1及G-2(例如参见WO 99/22764)。
“糖基化模式”经定义为碳水化合物单元共价连接至蛋白质(例如糖型)以及共价连接至糖型共价连接至蛋白质的肽主链的位点，更具体而言共价连接至免疫球蛋白的模式。
由不同细胞株或在转基因动物中表达的抗体相较于彼此可能具有不同糖型和/或糖基化模式。然而，不论这些抗体的糖基化如何，所有由本文提供的核酸分子编码，或包含本文提供的氨基酸序列的抗体均为本发明的一部分。
如本文中所用，术语“对象”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，诸如非人类灵长类动物、羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
如本文中所用，“治疗”意指降低患者所经受的疾病症状的频率。该术语包括施用本发明的化合物或物质以预防或延迟疾病症状、并发症或生化指标的发作；缓解症状或停止或抑制疾病、病状或病症进一步发展。治疗可为预防性(预防或延迟疾病发作，或预防其临床或亚临床症状的表现)或治疗性抑制或缓解疾病表现之后的症状。
在以下分段中进一步详细描述本发明的各种一般方面。
概述
本发明提供包含Dkk-1特异性抗体及免疫球蛋白抗原结合位点的新颖组合物。一些这些抗体及抗体片段可与来自若干哺乳动物来源的Dkk-1(包括大鼠、小鼠及人Dkk-1)交叉反应。一些抗体及片段对于来自一种物种的Dkk-1的亲和力高于对来自另一物种的Dkk-1的亲和力。本发明还提供新颖的中和抗体，其包括嵌合抗体、人源化抗体及人抗体，以及抗体及其免疫功能片段。还公开了编码抗体及片段的核酸，以及使用这些核酸表达所述抗体的方法。在另一方面，本发明涉及能够展现抗体抗原结合位点的免疫结合特性的分子(例如免疫功能片段及多肽)。
本文公开的抗体及免疫功能片段具有各种效用。一些抗体及片段例如适用于Dkk-1或其配体的特异性结合测定、亲和力纯化，且适用于筛选测定中以鉴别Dkk-1活性的其他拮抗剂。某些抗体可用以治疗与Dkk-1活性相关的各种疾病。因此一些抗体及片段可用于各种与骨胳有关的治疗，诸如提高BMD、合成新骨胳、治疗全身性骨量流失(例如骨侵蚀)、骨修复及治疗各种形式的关节炎。然而，所公开的某些抗体及片段可用于治疗各种与骨疾病无关的不同疾病。
抗体及片段
提供各种适用于调控Dkk-1活性的选择性结合物质。这些物质包括例如含有抗原结合结构域的抗体及其免疫功能片段(例如具有抗原结合区的单链抗体、结构域抗体、免疫粘附物及多肽)且特异性结合Dkk-1多肽(例如人类、大鼠和/或鼠类Dkk-1多肽)。一些物质如适用于抑制Dkk-1对LRP5和/或LRP6结合，并因此可用于刺激一或多种与Wnt信号传导相关的活性。
天然存在的抗体结构
所提供的一些结合物质具有通常与天然存在的抗体相关的结构。这些抗体的结构单元通常包含一或多个各自由两个相同多肽链对构成的四聚体，但一些哺乳动物物种也产生仅具有单一重链饿抗体。在典型抗体中，每对包括一条全长“轻”链(在某些实施方案中，约25kDa)及一条全长“重”链(在某些实施方案中，约50-70kDa)。各个免疫球蛋白链是由若干“免疫球蛋白域”构成，各“免疫球蛋白结构域”由约90至110个氨基酸组成且展现出特征的折叠模式。这些结构域为组成抗体多肽的基本单位。各链的氨基端部分通常包括负责抗原识别的可变结构域。羧基端部分在进化上比链的另一端更保守而称作“恒定区”或“C区”。人类轻链一般分类为κ及λ轻链，且这些链各含有一个可变结构域及一个恒定结构域。重链通常分类为μ、δ、γ、α或ε链，且据此将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有若干亚型，包括(但不限于)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM亚型包括IgM及IgM2。IgA亚型包括IgA1及IgA2。在人类中，IgA及IgD同种型含有四条重链及四条轻链；IgG及IgE同种型含有两条重链及两条轻链；且IgM同种型含有五条重链及五条轻链。重链C区通常包含一或多个可负责效应功能的结构域。重链恒定区结构域的数目视同种型而定。例如，IgG重链各含有三个C区结构域，称为CH1、CH2及CH3。所提供的抗体可具有任意的这些同种型及亚型。
在全长轻链及重链中，可变区及恒定区是通过约12个或12个以上氨基酸的“J”区接合，其中重链还包括约10个或10个以上氨基酸的“D”区。例如参见Fundamental Immunology，第2版，第7章(Paul，W编)(1989)NewYork：Raven Press(对所有目的以全文援引并入本文)。各轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。
免疫球蛋白链的可变区一般展现相同总体结构，包含相对保守性构架区(FR)由三个高变区(更通常称为“互补决定区”或CDR)接合。来自上述各重链/轻链对的两条链的CDR通常通过构架区比对以形成与靶标蛋白质(例如Dkk-1)上特定表位特异性结合的结构。天然存在的轻链及重链可变区自N端至C端通常均符合这些元件的以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。已设计编号系统以便对占据这些各结构域中位置的氨基酸指定编号。此编号系统系在Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest((1987及1991)美国国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health)，Bethesda，Md.)，或Chothia及Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，(1989)Nature 342：878-883中有定义。本发明提供的轻链各可与本发明提供的任何重链组合以形成抗体。在一些实施方案中，抗体含有两条相同轻链及两条相同重链。所提供的其他抗体为所提供的重链及轻链的组合形成的抗体的变体，且包含的轻链和/或重链各与这些链的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％一致性。在一些情况下，这些抗体包括至少一条重链及一条轻链，而在其他情况下，这些变体形式含有两条相同轻链及两条相同重链。
抗体的CDR
给定抗体的互补决定区(CDR)及构架区(FR)可使用下述系统鉴别：Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国健康与人类服务部(US Dept.of Health and Human Services)，PHS，NIH，NIH出版物第91-3242号(1991)。本文所公开的某些抗体包含一或多个与一或多个所提供的CDR的氨基酸序列一致或具有实质序列一致性的氨基酸序列。
所提供的抗体及片段可包括一、二、三、四、五或所有六个上述CDR。一些抗体具有表4中所列CDR的变体形式，其中一或多个(也即2、3、4、5或6个)CDR各与所提供的特异性CDR序列具有至少80％、85％、90％或95％序列一致性。
竞争抗体及片段
还提供与所实例的抗体或功能片段竞争特异性结合Dkk-1的抗体及其免疫功能片段。这些抗体及片段也可与实例抗体结合相同表位。预期与所试剂抗体或片段竞争或结合相同表位的抗体及片段显示类似功能特性。
单克隆抗体
所提供的抗体包括结合Dkk-1单克隆抗体。可使用本领域中已知的任何技术，例如通过使自完成免疫方案后的转基因动物收集的脾脏细胞永生化而产生单克隆抗体。脾脏细胞可使用本领域中已知的任何技术，例如使其与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤而永生化。用于产生杂交瘤的融合过程中的骨髓瘤细胞优选不产生抗体，具有高融合效率，且缺乏酶，致使其不能生长于某些仅支持所需融合细胞(杂交瘤)生长的选择性培养基中。适用于小鼠融合的细胞株的实例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7及S194/5XXO Bul；用于大鼠融合的细胞株的实例包括R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F及4B210。适用于细胞融合的其他细胞株为U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2及UC729-6。
在一些情况下中，杂交瘤细胞株如下制得：以Dkk-1免疫原对动物(例如具有人免疫球蛋白序列的转基因动物)免疫；从免疫的动物收集脾脏细胞；将收集的脾脏细胞与骨髓瘤细胞株融合，由此产生杂交瘤细胞；从杂交瘤细胞建立杂交瘤细胞株，及鉴别产生结合Dkk-1多肽的抗体的杂交瘤细胞株。本发明涵盖这些杂交瘤细胞株及其所产生的抗Dkk-1单克隆抗体。
可使用本领域中已知的任何技术纯化杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体。可进一步筛选杂交瘤或Mab以鉴别具有特定特性(诸如阻断Wnt诱导活性的能力)的Mab。在下文实例中提供这些筛选的实例。
嵌合及人源化抗体
还提供基于前述序列的嵌合及人源化抗体。适用作治疗物质的单克隆抗体可在使用前以多种方式修饰。一个实例为“嵌合”抗体，其为由不同抗体的蛋白区段构成的抗体，所述蛋白区段共价接合以产生功能免疫球蛋白轻链或重链或其免疫功能部分。一般而言，所述重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列一致或同源，而所述链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列一致或同源。关于与嵌合抗体的相关方法，参见例如美国专利第4,816,567号；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855(1985)。CDR移植描述于例如美国专利第6,180,370号、第5,693,762号、第5,693,761号、第5,585,089号及第5,530,101号。
一般而言，制造嵌合抗体的目标在于产生来自预定患者物种的氨基酸数目最大化的嵌合体。一个实例为“CDR移植”抗体，其中该抗体包含一或多个来自特定物种或属于特定抗体类别或子类的互补决定区(CDR)，而所述抗体链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列一致或同源。为用于人类，常将来自啮齿动物抗体的V区或所选CDR移植于人类抗体中，从而置换人类抗体天然存在的V区或CDR。
一种适用类型的嵌合抗体为“人源化”抗体。一般而言，人源化抗体由最初在非人类动物中产生的单克隆抗体产生。此单克隆抗体中的某些氨基酸残基(通常来自抗体的非抗原识别部分)被修饰为与相应同型的人类抗体中相应残基同源。人源化可例如使用各种方法，通过使啮齿动物可变区的至少一部分被人类抗体的相应区域取代来执行(例如参见美国专利第5,585,089号及第5,693,762号；Jones等人，(1986)Nature 321：522-25；Riechmann等人，(1988)Nature 332：323-27；Verhoeyen等人，(1988)Science239：1534-36)。在一些实施方案中，来自除人类外的物种的恒定区可与人类可变区一起使用以产生杂交抗体。
完全人类抗体
还提供完全人类抗体。可使用制备对给定抗原具有特异性的完全人类抗体而不使人类暴露于抗原(“完全人类抗体”)的方法。产生完全人类抗体的一种手段为小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人类免疫球蛋白(Ig)基因座引入内源性Ig基因已失活的小鼠中为一种在小鼠(可以任何所需抗原免疫的动物)中产生完全人类单克隆抗体(Mab)的手段。使用完全人类抗体可使有时因向人类施用小鼠或小鼠产生的Mab作为治疗物质所引起的免疫原性反应及过敏反应降至最低。
完全人类抗体可通过使能够在不产生内源免疫球蛋白的情况下产生人类抗体谱系的转基因动物(通常为小鼠)免疫来产生。用于此目的的抗原通常具有六个或六个以上相邻氨基酸，且视情况结合至载体，如半抗原。例如参见Jakobovits等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551-2555；Jakobovits等人，(1993)Nature 362：255-258；及Bruggermann等人，(1993)Year in Immunol.7：33。在此方法的实例中，转基因动物如下产生：使编码小鼠免疫球蛋白重链及轻链的内源性小鼠免疫球蛋白基因座失活，且插入含有编码人类重链及轻链蛋白质的基因座的人类基因组DNA的小鼠基因组大片段中。接着杂交育种经部分修饰的动物(其具有人类免疫球蛋白基因座的不完整互补序列)以获得具有所有所需免疫系统修饰的动物。当施用免疫原时，这些转基因动物产生对免疫原具有免疫特异性，但具有人类而非鼠类氨基酸序列(包括可变区)的抗体。关于这些方法的其他细节，参见例如WO 96/33735及WO 94/02602，其援引并入本文。关于制备人类抗体的转基因小鼠的其他方法描述于美国专利第5,545,807号；第6,713,610号；第6,673,986号；第6,162,963号；第5,545,807号；第6,300,129号；第6,255,458号；第5,877,397号；第5,874,299号及第5,545,806号；WO 91/10741及WO 90/04036，及EP 546073B1及EP 546073A1中。
本文中称作“HuMab”小鼠的上述转基因小鼠含有编码未重排人类免疫球蛋白重链(μ及γ)及κ轻链序列的人类免疫球蛋白基因小基因座，以及使内源性μ及k链基因座失活的靶向突变(Lonberg等人，(1994)Nature 368：856-859)。因此，小鼠展现小鼠IgM及k应答于免疫的表达降低，且所引入的人类重链及轻链转基因进行类别转换及体细胞突变以产生高亲和力人类IgG κ单克隆抗体(Lonberg等人，同上文；Lonberg及Huszar(1995)Intern.Rev.Immunol.，13：65-93；Harding及Lonberg(1995)Ann.N.Y Acad.Sci 764：536-546)。HuMab小鼠的制备详述于Taylor等人，(1992)Nucleic AcidsResearch，20：6287-6295；Chen等人，(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人，(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg等人，(1994)Nature 368：856-859；Lonberg(1994)Handbook ofExp.Pharmacology113：49-101；Taylor等人，(1994)International Immunology 6：579-591；Lonberg及Huszar(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93；Harding及Lonberg，1995，Ann.N.Y Acad.Sci.764：536-546；Fishwild等人，(1996)NatureBiotechnology 14：845-851；前述参考文献对所有目的以全文援引并入本文。还参见美国专利第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,789,650号；第5,877,397号；第5,661,016号；第5,814,318号；第5,874,299号；及第5,770,429号；以及美国专利第5,545,807号；及WO 93/1227；WO 92/22646；及WO 92/03918。用于在这些转基因小鼠中产生人类抗体的技术还在WO 98/24893，及Mendez等人，(1997)NatureGenetics 15：146-156中公开，其援引并入本文。例如，HCo7及HCo12转基因小鼠品系可用于产生人类抗Dkk-1抗体。
使用杂交瘤技术，可从转基因小鼠(诸如上述转基因小鼠)产生并选择具有所需特异性的抗原特异性人类MAb。可使用适合载体及宿主细胞克隆并表达这些抗体，或可从自所培养的杂交瘤细胞收集抗体。
完全人类抗体还可来源自噬菌体展示文库(如于Hoogenboom等人，(1991)J.Mol.Biol.227：381；及Marks等人，(1991)J.Mol.Biol.222：581所公开)。噬菌体展示技术是通过在丝状噬菌体表面上展示抗体谱系及随后依据噬菌体与所选抗原的结合来选择噬菌体而模拟免疫选择。一种此技术描述于WO 99/10494中(以援引并入本文)，其描述使用此方法分离针对MPL受体及msk受体的高亲和力及功能促效性抗体。
双特异性或双功能抗体
所提供的抗体还包括双特异性及双功能抗体，此类抗体如上所述包括一或多个CDR或一或多个可变区。双特异性或双功能抗体在一些情况下为具有两个不同重链/轻链对及两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可由各种方法(包括(但不限于)杂交瘤融合或Fab′片段连接)产生。例如参见Songsivilai及Lachmann(1990)Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，(1992)J.Immunol.148：1547-1553。
各种其他形式
所提供的一些抗体或免疫功能片段为上述抗体及片段的变体形式。天然存在的氨基酸可基于共同侧链特性分类：[0149]1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；[0150]2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；[0151]3)酸性：Asp、Glu；[0152]4)碱性：His、Lys、Arg；[0153]5)影响链取向的残基：Gly、Pro；及[0154]6)芳香气族：Trp、Tyr、Phe。保守氨基酸取代可包括一种这些类别的成员换为同类别中的另一成员。保守氨基酸取代可涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而非通过在生物系统中合成而并入。这些包括肽模拟物及其他逆向或反向形式的氨基酸部分。非保守取代可包括将一种上述类别的成员交换为另一类别的成员。这些经取代的残基可引入与人类抗体同源的抗体区域中或该分子的非同源区域中。
产生这些变化时，根据某些实施方案，可考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。蛋白质的亲水情况如下计算：赋予各氨基酸一个数值(“亲水指数”)且接着沿肽链反复求这些值的平均值。各氨基酸己基于其疏水性及电荷特征赋予亲水指数。其为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；及精氨酸(-4.5)。
亲水情况对赋予蛋白质相互作用生物功能的重要性在本领域中已周知(例如参见Kyte等人，1982，J.Mol.Biol.157：105-131)。已知某些氨基酸可经具有类似亲水指数或评数的其他氨基酸取代且仍保留类似生物活性。在基于亲水指数进行变化时，在某些实施方案中，包括取代亲水指数在.+-.2内的氨基酸。在本发明的一些方面，包括那些在.+-.1内者，且在本发明的其他方面，包括那些在.+-.0.5内的。
在本领域中也已知，可基于亲水性有效进行相似氨基酸的取代，特别在由此产生的生物功能蛋白或肽要用于免疫实施方案的情况下，如在本发明情况下更是如此。在一些实施方案中，蛋白质的最大局部平均亲水性(如取决于其相邻氨基酸的亲水性)与其免疫原性及抗原结合或免疫原性(也即与蛋白质的生物特性)相关。
已赋予这些氨基酸残基以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)及色氨酸(-3.4)。在基于类似亲水性值进行变化时，在一些实施方案中，包括取代亲水性值在.+-.2内的氨基酸，在其他实施方案中，包括取代亲水性值在.+-.1内的氨基酸，且在其他实施方案中，包括取代亲水性值在.+-.0.5内的氨基酸。在一些情况下，还可基于亲水性从氨基酸初级序列鉴别表位。这些区域也称“表位核心区”。
本领域技术人员将能够使用熟知技术测定如本文所述的多肽的适合变体。本领域技术人员可鉴别分子中可经变化的适合区域，且通过靶向相信对活性不重要的区域而不会破坏活性。本领域技术人员也将能够鉴别分子中在类似多肽中保守残基及部分。在其他实施方案中，甚至可使对生物活性或对结构重要的区域进行保守性氨基酸取代而不破坏生物活性或对多肽结构无不利影响。
另外，本领域技术人员可回顾鉴别类似多肽中对活性或结构重要的残基的结构功能研究。鉴于此比较，可预测蛋白质中与类似蛋白质中对活性或结构重要的氨基酸残基对应的氨基酸残基的重要性。对于这些经预测重要的氨基酸残基，本领域技术人员可选择化学上类似的氨基酸取代。
本领域技术人员还可分析类似多肽的3维结构及与类似多肽的该结构相关的氨基酸序列。鉴于此信息，本领域技术人员可关于三维结构预测抗体的氨基酸残基比对。本领域技术人员可选择不使经预测位于蛋白质表面上的氨基酸残基产生根本变化，因为这些残基可能涉及与其他分子的重要相互作用。此外，本领域技术人员可产生在各所需氨基酸残基处含有单一氨基酸取代的测试变体。接着可使用测定来对Dkk-1中和活性筛选这些变体，(参见下文实例)从而产生关于哪个氨基酸可经变化及哪个氨基酸必须不变的信息。换言之，基于自这些常规实验所收集的信息，本领域技术人员可轻易地测定应避免进一步取代(单独或与其他突变组合)的氨基酸位置。
许多科学出版物已专注于预测二级结构。参见Moult(1996)Curr.Op.inBiotech.7：422-427；Chou等人，(1974)Biochemistry 13：222-245；Chou等人，(1974)Biochemistry 113：211-222；Chou等人，(1978)Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.47：45-148；Chou等人，(1979)Ann.Rev.Biochem.47：251-276；及Chou等人，(1979)Biophys.J.26：367-384。此外，目前可利用计算机程序协助预测二级结构。一种预测二级结构的方法基于同源模型。例如，序列一致性大于30％或类似性大于40％的两种多肽或蛋白质常具有相似拓扑结构。蛋白质结构数据库(PDB)的最新发展已提供增强的二级结构可预测性，包括多肽结构或蛋白质结构内的潜在折叠数目。参见Holm等人，(1999)Nucl.Acid.Res.27：244-247。已提出(Brenner等人，(1997)Curr.Op.Struct.Biol.7：369-376)，指定多肽或蛋白质中存在有限数目的折叠且一旦解出结构的临界值，则结构预测将变得大为精确。
预测二级结构的其他方法包括“穿线法(threading)”(Jones(1997)Curr.Opin.Struct.Biol.7：377-87；Sippl等人，(1996)Structure 4：15-19)、“概况分析法”(Bowie等人，(1991)Science 253：164-170；Gribskov等人，(1990)Meth.Enzym.183：146-159；Gribskov等人，(1987)Proc.Nat.Acad.Sci.84：4355-4358)，及“进化关联法(evolutionary linkage)”(参见Holm(1999)，同上文；及Brenner(1997)，同上文)。
在本发明的一些实施方案中，氨基酸取代应：(1)降低蛋白易分解性，(2)降低易氧化性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变配体或抗原结合亲和力，和/或(4)赋予或改变这些多肽的其他物理化学或功能特性。例如，可在天然存在的序列中进行单个或多个氨基酸取代(在某些实施方案中，保守性氨基酸取代)。可在抗体中位于形成分子间接点的结构域外的该部分中进行取代。在这些实施方案中，可使用不实质上改变亲本序列结构特征的保守性氨基酸取代(例如不破坏为亲本或天然抗体特征的二级结构的一或多个置换氨基酸)。本领域认可的多肽二级及三级结构实例描述于Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton编)，(1984)W.H.New York：Freeman and Company；Introduction to Protein Structure(Branden及Tooze编)，(1991)New York：Garland Publishing；及Thornton等人，(1991)Nature 354：105中。
本发明还涵盖本发明抗体的糖基化变体，其中相较于亲本多肽的氨基酸序列，糖基化位点的数目和/或类型已改变。在某些实施方案中，抗体蛋白质变体包含比天然抗体多或少的数目的N连接糖基化位点。N连接糖基化位点特征在于序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定为X的氨基酸残基可为除脯氨酸外的任何氨基酸残基。产生此序列的氨基酸残基取代为添加N连接碳水化合物链提供潜在新位点。或者，消除或改变此序列的取代将防止添加天然多肽中存在的N连接碳水化合物链。例如，可通过缺失Asn或通过用不同氨基酸取代Asn来减少糖基化。在其他实施方案中，产生一或多个新N连接位点。抗体通常在Fc区中具有N连接糖基化位点。
其他优选抗体变体包括半胱氨酸变体，其中亲本或天然氨基酸序列中的一或多个半胱氨酸残基缺失或经另一氨基酸(例如丝氨酸)取代。半胱氨酸变体为适用的，尤其当抗体必须再折叠为生物活性构象时更是如此。半胱氨酸变体可具有少于天然抗体的半胱氨酸残基，且通常为偶数以使不成对半胱氨酸所引起的相互作用降至最低。
所公开的重链及轻链、可变区结构域及CDR可用以制备含有可特异性结合Dkk-1多肽的抗原结合区的多肽。例如，可将表4中所列的一或多个CDR以共价或非共价方式并入分子(例如多肽)中以制得免疫黏附物。免疫黏附物可并有CDR作为较大多肽链的一部分，可使CDR共价连接于另一多肽链，或可以非共价方式并有CDR。CDR使免疫粘附物能够特异性结合特定相关抗原(例如Dkk-1多肽或其表位)。
还提供基于本文所述的可变区结构域及CDR的模拟物(例如“肽模拟物”)。这些类似物可为肽、非肽，或肽与非肽区的组合。Fauchere，(1986)Adv.Drug Res.15：29；Veber及Freidinger，(1985)TINS第392页；及Evans等人，(1987)J.Med.Chem.30：1229，所述文献援引并入本文。可使用结构上类似于治疗适用肽的肽模拟物来产生类似治疗或预防作用。这些化合物通常借助于计算机分子建模来开发。一般而言，本发明的肽模拟物为结构上类似于呈现所需生物活性(在本文中诸如特异结合Dkk-1的能力)的抗体的蛋白质，但一或多个肽键视情况通过本领域中熟知的方法置换为以下的键：-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式及反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-及-CH2SO-。共同序列的一或多个氨基酸经相同类型的D-氨基酸系统性取代(例如D-赖氨酸置换L-赖氨酸)可在本发明的某些实施方案中用于产生较稳定的蛋白质。另外，可通过本领域中已知的方法(Rizo及Gierasch，(1992)Ann.Rev.Biochem.61：387，援引并入本文)，例如通过添加能够形成使肽环化的分子内二硫桥的内部半胱氨酸残基来产生包含共同序列或实质上一致共同序列变体的限制性肽。
还提供本文所述抗体及免疫功能片段的衍生物。衍生的抗体或片段可包含赋予抗体或片段所需特性(诸如在特定用途中半衰期延长)的任何分子或物质。所衍生的抗体可包含例如可检测(或标记)部分(例如放射性分子、比色分子、抗原分子或酶促分子)、可检测珠(诸如磁性或电致密(例如金)珠)、或结合于另一分子的分子(例如生物素或抗生蛋白链菌素(streptavidin))、治疗或诊断部分(例如放射性部分、细胞毒性部分或药用活性部分)、或提高抗体对于特定用途(例如施用对象，诸如人类对象，或其他体内或体外用途)的适用性的分子。可用以衍生抗体的分子的实例包括白蛋白(例如人血清白蛋白)及聚乙二醇(PEG)。可使用本领域中熟知的技术制备抗体的白蛋白连接衍生物及聚乙二醇化衍生物。在实施方案中，抗体结合或以其他方式连接转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)或TTR变体。TTR或TTR变体可经例如选自以下组的化学物质化学修饰：聚葡萄糖、聚(n-乙烯基吡咯啶酮)、聚乙二醇、聚丙二醇同聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇及聚乙烯醇。
其他衍生物包括抗Dkk-1抗体或其片段与其他蛋白质或多肽诸如通过表达重组融合蛋白的共价或聚集性结合物，所述重组融合蛋白包含异源多肽与抗Dkk-1抗体多肽的N端或C端的融合。例如，经结合肽可为异源信号(或前导)多肽，例如酵母α因子前导多肽；或肽，诸如表位标签。含抗Dkk-1抗体的融合蛋白可包含为有助于纯化或鉴别抗Dkk-1抗体所添加的肽(例如聚His)。如Hopp等人，BioTechnology 6：1204(1988)及美国专利第5,011,912号中所述抗Dkk-1抗体多肽也可连接于FLAG肽。FLAG肽具高度抗原性且提供特异性单克隆抗体(Mab)可逆性结合的表位，使得能够快速测定及易于纯化所表达的重组蛋白。适用于制备融合蛋白(其中FLAG肽融合于既定多肽)的试剂可购得(Sigma，St.Louis，Mo.)。
含有一或多种抗Dkk-1抗体多肽的寡聚物可用作Dkk-1拮抗剂。寡聚物可呈共价连接或非共价连接的二聚物、三聚物或较高寡聚物形式。涵盖包含两种或两种以上抗Dkk-1抗体多肽的寡聚物以供使用，其中一个实例为同二聚物。其他寡聚物包括杂二聚物、同三聚物、杂三聚物、同四聚物、杂四聚物等。
一个实施方案涉及包含经由肽部分之间共价或非共价相互作用融合于抗Dkk-1抗体多肽而接合的多个抗Dkk-1抗体多肽的寡聚物。这些肽可为肽接头(间隔体)，或具有促进寡聚化的特性的肽。如下文较详细描述，亮氨酸拉链及来源于抗体的某些多肽属于可促进与其连接的抗Dkk-1抗体多肽寡聚化的肽。
在具体的实施方案中，寡聚物包含二至四种抗Dkk-1抗体多肽。寡聚物的抗Dkk-1抗体部分可呈上述任何形式，例如变体或片段。寡聚物优选包含具有Dkk-1结合活性的抗Dkk-1抗体多肽。
在实施方案中，使用来源于免疫球蛋白的多肽制备寡聚物。包含某些异源多肽融合于来源于抗体的多肽的各部分(包括Fc域)的融合蛋白的制备已描述于例如Ashkenazi等人，(1991)PNAS USA 88：10535；Byrn等人，(1990)Nature 344：677；及Hollenbaugh等人，(1992)“Construction of ImmunoglobulinFusion Proteins”，Current Protocols in Immunology，增刊4，第10.19.1-10.19.11页。
本发明的一个实施方案设计包含两个通过使抗Dkk-1抗体的Dkk-1结合片段融合于抗体的Fc区所产生的融合蛋白的二聚体。二聚体可如下制得：例如将编码融合蛋白的基因融合物插入适当表达载体中，在经重组表达载体转化的宿主细胞中表达基因融合物，且允许所表达的融合蛋白组装更为类似的抗体分子，随后在Fc部分之间形成链间二硫键以产生二聚体。
如本文中所用，术语“Fc多肽”包括来源于抗体Fc区的多肽的天然及突变蛋白形式。还包括含有促进二聚化的铰链区的这些多肽的截短形式。包含Fc部分的融合蛋白(及由此形成的寡聚物)提供易于在蛋白质A或蛋白质G管柱上通过亲和力层析纯化的优势。
PCT申请WO 93/10151及美国专利第5,426,048号及第5,262,522号中所述的一种适合Fc多肽为一种单链多肽，其自人类IgG1抗体的Fc区的N端铰链区延伸至天然C端。另一适用的Fc多肽为美国专利第5,457,035号，及Baum等人，(1994)，EMBO J.13：3992-4001中所述的Fc突变蛋白。此突变蛋白的氨基酸序列与WO 93/10151中所呈现的天然Fc序列的氨基酸序列一致，但氨基酸19己自Leu变为Ala，氨基酸20己自Leu变为Glu，且氨基酸22己自Gly变为Ala。突变蛋白对Fc受体展现出低亲和力。
在其他实施方案中，诸如本文所公开的抗Dkk-1抗体的重链和/或轻链的可变部分可由经一种抗体重链和/或轻链的可变部分取代。
或者，寡聚物为包含多种抗Dkk-1抗体多肽、有或无肽接头(间隔肽)的融合蛋白。适合的肽接头如美国专利4,751,180及4,935,233所述。
另一种制备寡聚抗Dkk-1抗体衍生物的方法涉及使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链结构域为促进存在其的蛋白质寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初在若干DNA结合蛋白中被鉴别(Landschulz等人，(1988)Science 240：1759)，且此后于各种不同蛋白质中发现。已知亮氨酸拉链包括天然存在的肽及其二聚或三聚衍生物。适于产生可溶性寡聚蛋白质的亮氨酸拉链域的实例于WO94/10308中描述，且来源于肺表面活性剂蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链描述于Hoppe等人，(1994)FEBS Letters 344：191中，其援引并入本文。使用经修饰的亮氨酸拉链，允许与其融合的异源蛋白质稳定三聚化见Fanslow等人，(1994)Semin.Immunol.6：267-78中。在一种方法中，包含抗Dkk-1抗体片段或衍生物融合于亮氨酸拉链肽的重组融合蛋白是适合的宿主细胞中表达，并从培养物上清液中回收形成可溶寡聚抗Dkk-1抗体片段或衍生物。
核酸
还提供编码本发明抗体的一或两条链、或其片段、衍生物、突变形成的蛋白质或变体的核酸；足以用作杂交探针的多核苷酸；用于鉴别、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的PCR引物或测序引物；抑制多核苷酸表达的反义核酸；及前述各物的互补序列。核酸可为任何长度。其长度可为例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000或5,000个以上核苷酸，和/或可包含一或多个额外序列(例如调控序列)，和/或为较大核酸(例如载体)的一部分。核酸可为单链或双链且可包含RNA和/或DNA核苷酸，及其人工变体(例如肽核酸)。还提供编码包括这些肽的融合蛋白的核酸。
编码抗体多肽(例如重链或轻链、仅可变结构域，或全长)的DNA可与已用Dkk-1或其免疫原性片段免疫的小鼠的B细胞分离。可通过诸如聚合酶链反应(PCR)的常规程序分离DNA。噬菌体展示为已知技术的另一实例，由此可制备抗体衍生物。在一方法中，作为相关抗体组分的多肽在任何适合的重组表达系统中表达，且允许所表达的多肽组装以形成抗体分子。
提供编码抗体及免疫功能片段的轻链及重链、可变区及CDR的示例性核酸。由于遗传密码子的简并性，因此各多肽序列也由除所列者外的大量其他核酸序列编码。本发明提供编码本发明各抗体的各简并核苷酸序列。
本发明进一步提供与其他核酸在特定杂交条件下杂交的核酸。本领域中熟知将核酸杂交的方法。例如参见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley及Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。已知中等严格杂交条件的实例使用含有5倍氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的预洗溶液；约50％甲酰胺、6倍SSC的杂交缓冲液；且杂交温度为55℃(或其他类似杂交溶液，诸如含有约50％甲酰胺的杂交溶液，杂交温度为42℃)，及洗涤条件为60℃、0.5倍SSC、0.1％SDS。已知的严格杂交条件的实例为在6倍SSC中、在45℃下杂交，随后在68℃下、在0.1倍SSC、0.2％SDS中洗涤一或多次。此外，本领域技术人员可调节杂交和/或洗涤条件以提高或降低杂交严格度，使得包含彼此至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致的核苷酸序列的核酸通常保持彼此杂交。
影响杂交条件选择的基本参数及设计适合条件的指南阐述于以下文献中：例如Sambrook，Fritsch，及Maniatis(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，第9章及第11章；及Current Protocols in Molecular Biology(1995)Ausubel等人编，John Wiley&Sons，Inc.，章节2.10及6.3-6.4，且可由一般本领域技术人员基于例如DNA的长度和/或碱基组成而轻易地测定。
可通过突变将变化引入核酸中，由此使得其所编码的多肽(例如本发明的抗体或抗体衍生物)的氨基酸序列产生变化。可使用本领域中已知的任何技术来引入突变。在实施方案中，使用例如定点诱变方案来改变一或多个特定氨基酸残基。在另一实施方案中，使用例如随机诱变方案来改变一或多个随机选择的残基。无论以何方式产生变化，均可针对所需特性表达并筛选突变体多肽。
可将突变引入核酸中而不显著改变其所编码的多肽的生物活性。例如，可使核苷酸取代在非必需氨基酸残基处引起氨基酸取代。或者，可将一或多个突变引入核酸中，从而选择性改变其所编码多肽的生物活性。例如，突变可定量或定性地改变生物活性。定量改变的实例包括提高、降低或消除活性。定性改变的实例包括改变抗体的抗原特异性。
在另一方面，本发明提供适用作检测本发明核酸序列的引物或杂交探针的核酸分子。本发明的核酸分子可仅包含核酸序列中编码本发明全长多肽的一部分，例如可用作探针或引物的片段或编码本发明多肽的活性部分(例如Dkk-1结合部分)的片段。
基于本发明核酸序列的探针可用以检测核酸或类似核酸，例如编码本发明多肽的转录物。探针可包含标记基团，例如放射性同位素、萤光化合物、酶或酶辅助因子。这些探针可用以鉴别表达多肽的细胞。
在另一方面，本发明提供载体，其包含编码本发明的多肽或其一部分(例如含有一或多个CDR或一或多个可变区结构域的片段)的核酸。载体的实例包括(但不限于)质粒、病毒载体、非游离型哺乳动物载体及表达载体，例如重组表达载体。本发明的重组表达载体可以适于在宿主细胞中表达核酸的形式包含本发明的核酸。重组表达载体包括一或多个基于要用于表达的宿主细胞所选择的调控序列，其可操作地连接至要表达的核酸序列。调控序列包括在许多类型宿主细胞中引导核苷酸序列组成性表达的调控序列(例如SV40早期基因增强子、Rous肉瘤病毒启动子及细胞巨大病毒启动子)；仅在某些宿主细胞中引导核苷酸序列表达的调控序列(例如组织特异性调控序列，参见Voss等人，(1986)Trends Biochem.Sci.11：287，Maniatis等人，(1987)Science 236：1237，其以全文援引并入本文)；及引导核苷酸序列回应于特定处理或条件而诱导性表达的调控序列(例如哺乳动物细胞中的金属硫蛋白启动子，及原核与真核系统中的tet反应性启动子和/或链霉素(streptomycin)反应性启动子(参见上文))。本领域技术人员应了解，表达载体的设计可视如欲转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质表达量等因素而定。可将本发明的表达载体引入宿主细胞中以由此产生由如本文所述的核酸编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽。
在另一方面，本发明提供已引入本发明重组表达载体的宿主细胞。宿主细胞可为任何原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母、昆虫、或哺乳动物细胞(例如CHO细胞))。可经由常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。对于哺乳动物细胞的稳定转染，视所用表达载体及转染技术而定，已知仅一小部分细胞可将外源DNA整合至其基因组中。为鉴别及选择这些整合物(integrant)，一般将编码可选标志(例如实现对抗生素的抗性)的基因连同相关基因一起引入宿主细胞中。优选可选标志包括赋予抗药性的标志，诸如G418、潮霉素(hygromycin)及甲胺喋呤(methotrexate)。经所引入的核酸稳定转染的细胞可通过药物选择(例如已并有可选标志基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)以及其他方法来鉴别。
抗体的制备
所提供的非人类抗体可例如来源于产生抗体的任何动物，诸如小鼠、大鼠、兔、山羊、驴或非人类灵长类动物(诸如猴(例如食蟹猴或恒河猴)或猿(例如黑猩猩))。非人类抗体可用于例如体外细胞培养及基于细胞培养的应用中，或对抗体的免疫反应不发生或可忽略、可预防、不成问题或合乎需要的任何其他应用中。在本发明某些实施方案中，可通过用全长Dkk-l或用Dkk-1的羧基端部分进行免疫来产生抗体。抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体，或可在宿主细胞中通过表达重组DNA来合成。
完全人类抗体可如上所述通过免疫含有人类免疫球蛋白基因座的转基因动物或通过选择表达人类抗体谱系的噬菌体展示文库来制备。
本发明的单克隆抗体(Mab)可通过各种技术产生，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler及Milstein，(1975)Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。或者，可采用产生单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。一种适用于制备杂交瘤的动物系统为鼠类系统，其为已完全建立的程序。在本领域中已知免疫方案及分离用于融合的经免疫脾细胞的技术。对于这些程序，将来自经免疫小鼠的B细胞与适合的永生化融合配偶体(诸如鼠类骨髓瘤细胞株)融合。此外，必要时，可将大鼠或其他哺乳动物免疫以代替小鼠，且可使来自这些动物的B细胞与鼠类骨髓瘤细胞株融合以形成杂交瘤。或者，可使用来自除小鼠之外来源的骨髓瘤细胞株。制备杂交瘤的融合程序也是熟知的。
所提供的单链抗体可通过将重链与轻链可变结构域(Fv区)片段经由氨基酸桥(短肽接头)连接，产生单一多肽链来形成。这些单链Fv(scFv)可通过融合编码两个可变结构域多肽(VL及VH)的DNA之间编码肽接头的DNA来制备。视两个可变结构域之间柔韧接头的长度而定，所得多肽可自身折叠以形成抗原结合单体，或其可形成多聚体(例如二聚体、三聚体或四聚体)(Kortt等人，(1997)Prot.Eng.10：423；Kortt等人，(2001)Biomol.Eng.18：95-108)。通过组合包含不同VL及VH的多肽，可形成结合不同表位的多聚scFv(Kriangkum等人，(2001)Biomol.Eng.18：31-40)。为产生单链抗体所开发的技术包括以下文献中所述的：美国专利第4,946,778号；Bird(1988)Science 242：423；Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879；Ward等人，(1989)Nature 334：544，de Graaf等人，(2002)Methods Mol Biol.178：379-87。
本文提供的属于一个子类的抗体可使用子类转换法转变为不同子类的抗体。因此，例如，IgG抗体可来源于IgM抗体，且反之亦然。这些技术使得制备的新颖抗体，其不仅具有给定抗体(亲本抗体)的抗原结合特性，而且还展现不同于亲本抗体的生物特性的抗体同种型或子类相关的生物特性。可采用重组DNA技术。这些过程中可采用编码特定抗体多肽的经克隆DNA，例如编码所需同种型抗体的恒定结构域的DNA。例如参见Lantto等人，(2002)Methods Mol.Biol.178：303-16。
此外，还已知产生具有不同特性(也即针对其所结合的抗原的亲和力不同)的抗体的技术。一种此技术称作链改组，其包括在丝状噬菌体表面上展示免疫球蛋白可变结构域基因谱系，通常称作噬菌体展示。如Marks等人，(1992)BioTechnology，10：779所述，链改组已用于制备针对半抗原2-苯基噁唑-5-酮的高亲和力抗体。
可对表1中所述的重链及轻链进行保守性修饰(及对编码核酸进行相应修饰)以产生具有功能特征及生物化学特征的抗Dkk-1抗体。实现这些修饰的方法已描述于上文中。
可以各种方式进一步修饰本发明的抗体及其功能片段。例如，若其要用于治疗目的，则其可与聚乙二醇结合(聚乙二醇化)以延长血清半衰期或增强蛋白质传递。或者，本发明抗体或其片段的V区可与不同抗体分子的Fc区融合。用于此目的的Fc区可经修饰以使其不结合补体，从而在将融合蛋白用作治疗剂时降低诱导患者细胞溶解的可能性。另外，本发明抗体或其功能片段可与人类血清白蛋白结合以增强抗体或其片段的血清半衰期。本发明抗体或其片段的另一适用融合配偶体为转甲状腺素蛋白(TTR)。TTR具有形成四聚体的能力，因此抗体-TTR融合蛋白可形成多价抗体，从而可提高其结合亲和力。
或者，本文所述抗体及片段的功能特征和/或生物化学特征的实质性修饰可如下实现：在重链及轻链的氨基酸序列中产生对以下作用显著不同的取代：维持(a)取代区中分子主链的结构，例如呈折叠或螺旋构形，(b)分子在靶标位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的庞大性(bulkiness)。“保守氨基酸取代”可包括天然氨基酸残基经对该位置处氨基酸残基的极性或电荷具有极少或无影响的非天然残基取代。此外，如先前已关于丙氨酸扫描诱变所述，多肽中的任何天然残基也均可经丙氨酸取代。
本发明抗体的氨基酸取代(不论保守还是非保守)可由本领域技术人员通过应用常规技术来实施。氨基酸取代可用于鉴别本文所提供抗体的重要残基，或提高或降低这些抗体对人类Dkk-1的亲和力或改变本文所述的其他抗Dkk-1抗体的结合亲和力。
抗Dkk-1抗体的表达
抗Dkk-1抗体及免疫功能片段可通过许多常规技术来制备。例如，可通过重组表达系统，使用本领域中已知的任何技术产生抗Dkk-1抗体。例如参见Monoclonal Antibodies，Hybridomas：A New Dimension in BiologicalAnalyses，Kennet等人(编)，Plenum Press，New York(1980)；及Antibodies：ALaboratory Manual，Harlow及Lane(编)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)。
本发明的抗体可在杂交瘤细胞株或除杂交瘤之外的细胞株中表达。可使用编码抗体的表达构建物来转化哺乳动物、昆虫或微生物宿主细胞。可使用将多核苷酸引入宿主细胞中的任何已知方法进行转化，所述已知方法包括例如将多核苷酸封装于病毒或噬菌体中并通过本领域中已知的转染程序使用构建物来转导宿主细胞，如美国专利第4,399,216号；第4,912,040号；第4,740,461号及第4,959,455号所例示。所用的最佳转化过程将视所转化的宿主细胞类型而定。将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法在本领域中熟知且包括(但不限于)葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺(polybrene)介导的转染、天然质粒融合、电穿孔、囊封多核苷酸于脂质体中、混合核酸与带正电的脂质、及将DNA直接微注射于核中。
本发明的重组表达构建物通常包含编码多肽的核酸分子，该多肽包含以下的一或多者：重链恒定区；重链可变区；轻链恒定区；轻链可变区；抗Dkk-1抗体的轻链或重链的一或多个CDR。使用标准接合技术将这些核酸序列插入适当表达载体中。通常选择在所用特定宿主细胞中具功能性的载体(也即载体与宿主细胞的机制相容，可发生许可基因扩增和/或表达)。在一些实施方案中，所用载体采用使用报导蛋白(诸如二氢叶酸还原酶)的蛋白质片段互补测定(例如参见美国专利第6,270,964号，其原因并入本文)。适合表达载体可购自例如Invitrogen Life Technologies或BD Biosciences(前身为“Clontech”)。克隆及表达本发明抗体及片段的其他适用载体包括Bianchi及McGrew，Biotech Biotechnol Bioeng 84(4)：439-44(2003)(其援引并入本文)中所述的载体。其他适合表达载体在例如Methods Enzymol，第185卷(D.V.Goeddel编)(1990)New York：Academic Press中有论述。
用于任何宿主细胞中的表达载体通常含有用于质粒或病毒维持及克隆及表达外源核苷酸序列的序列。这些序列统称“侧接序列(flankingsequence)”，通常包括一或多个以下可操作地连接的核苷酸序列：启动子、一或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供者及受者剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码待表达多肽的核酸的多接头区域、及可选标记元件。
载体视情况可含有“标签”编码序列，也即位于编码序列的5′或3′端的寡核苷酸分子、编码聚His(诸如6His)的寡核苷酸序列、或存在用于其市售抗体的另外的“标签”，诸如HA(来自流感病毒的血球凝集素)或myc。该标签通常在表达后融合于抗体蛋白质，且可充当自宿主细胞亲和力纯化抗体的工具。亲和力纯化可例如通过柱层析，使用针对标签的抗体作为亲和基质来实现。视情况可随后通过各种手段(诸如使用供裂解用的某些肽酶)从经纯化的抗体多肽移除标签。
表达载体中的侧接序列可为同源(也即来自与宿主细胞相同的物种和/或品系)、异源(也即来自除宿主细胞物种或品系之外的物种)、杂交(也即来自一种以上来源的侧接序列的组合)、合成或天然的。因此，侧接序列的来源可为任何原核或真核生物体、任何脊椎动物或无脊椎动物生物体，或任何植物，其限制条件为侧接序列在宿主细胞机构中具功能性且可由宿主细胞机构活化。
适用于本发明的载体的侧接序列可通过本领域中熟知的若干方法中任一者获得。本文中适用的侧接序列通常已预先通过定位和/或通过限制性内切酶消化加以鉴别，且因此可使用适当限制性内切酶自适当组织来源分离。在一些情况下，侧接序列的全核苷酸序列可能已知。在本文中，侧接序列可使用本文所述的核酸合成或克隆方法合成。
当已知侧接序列的全部或仅一部分时，其可使用PCR和/或通过用来自相同物种或另一物种的适合寡核苷酸和/或侧接序列片段筛选基因组文库来获得。当侧接序列未知时，可自可含有例如编码序列或甚至另一个或多个基因的一大段DNA中分离含有侧接序列的DNA片段。分离可如下实现：限制性内切酶消化以产生适当DNA片段，随后使用琼脂糖凝胶纯化(
Figure BPA00001497441300532
柱层析(Chatsworth，Calif.))分离；或通过本领域技术人员已知的其他方法实现分离。实现此目的的适合酶的选择为本领域技术人员显而易见。
复制起点通常为原核表达载体(尤其为市场上可购的原核表达载体)的一部分，且起点有助于载体在宿主细胞中扩增。若所选载体不含有复制起点，则可基于已知序列进行化学合成，并接合至载体中。例如，来自质粒pBR322(New England Biolabs，Beverly，Mass)的复制起点适于大多数革兰氏阴性(gram-negative)菌，且各种起点(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、或诸如HPV或BPV的乳头状瘤病毒)适于在哺乳动物细胞中克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要哺乳动物复制起点(例如通常仅使用SV40起点，因为其含有早期启动子)。
本发明的表达及克隆载体通常将含有由宿主生物体识别且可操作地连接于编码抗Dkk-1抗体或其免疫功能片段的核酸的启动子。启动子为位于结构基因起始密码子上游(也即5′)(一般在约100bp至1000bp内)、控制结构基因转录的未转录序列。启动子常规分为两类之一：诱导性启动子及组成性启动子。诱导性启动子应答于培养条件的某些变化(诸如有或无营养素存在或温度变化)引发在其控制下DNA转录量增加。另一方面，组成性启动子引发连续产生基因产物；也即对基因表达极少或无实验控制。由各种潜在宿主细胞识别的大量启动子是已知的。适合的启动子如下可操作地连接至编码抗Dkk-1抗体的DNA：通过限制酶消化从源DNA移除启动子，或通过聚合酶链反应扩增启动子，及将所需启动子序列插入载体中。
在本领域中还熟知适用于酵母宿主的启动子。酵母增强子宜与酵母启动子一起使用。适用于哺乳动物宿主细胞的启动子熟知且包括(但不限于)得自病毒基因组的启动子，此类病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽类肉瘤病毒、细胞巨大病毒、反转录病毒、B型肝炎病毒且最优选为猴病毒40(SV40)。其他适合哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克启动子及肌动蛋白启动子。
适用于实施本发明的重组表达载体的特定启动子包括(但不限于)：SV40早期启动子区(Bemoist及Chambon(1981)Nature 290：304-10)；CMV启动子；Rous肉瘤病毒的3′长末端重复序列中所含的启动子(Yamamoto等人，(1980)Cell 22：787-97)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-45)；金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等人，(1982)Nature 296：39-42)；原核表达载体，诸如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75：3727-31)；或tac启动子(DeBoer等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)。也可使用展现组织特异性且已用于转基因动物中的以下动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中具活性的I型弹性蛋白酶基因控制区(Swift等人，(1984)Cell 38：63946；Ornitz等人，(1986)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399409；MacDonald，1987，Hepatology 7：425-515)；在胰腺β细胞中具活性的胰岛素基因控制区(Hanahan(1985)Nature 315：115-22)；在睾丸、乳房、淋巴及肥大细胞中具活性的小鼠乳腺瘤病毒控制区(Leder等人，(1986)Cell45：485-95)；在肝中具活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等人，(1987)Genesand Devel.1：268-76)；在肝中具活性的α-胎儿蛋白基因控制区(Krumlauf等人，(1985)Mol.Cell.Biol.5：1639-48；Hammer等人，(1987)Science 235：53-58)；在肝中具活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人，(1987)Genes and Devel.1：161-71)；在骨髓细胞中具活性的β-血球蛋白基因控制区(Mogram等人，1985，Nature 315：338-40；Kollias等人，(1986)Cell 46：89-94)；在脑寡树突神经胶质细胞中具活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等人，(1987)Cell 48：703-12)；在骨胳肌中具活性的肌凝蛋白轻链-2基因控制区(Sani(1985)Nature 314：283-86)；在丘脑下部具活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等人，(1986)Science 234：1372-78)；及最特别是在淋巴细胞中具活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人，(1984)Cell 38：647-58；Adames等人，(1985)Nature 318：533-38；Alexander等人，(1987)Mol.Cell Biol.7：1436-44)。
可将增强子序列插入载体中以增强编码本发明的抗Dkk-1抗体或其免疫功能片段的核酸在高等真核细胞中的转录。增强子为DNA的顺式作用元件，长度通常为约10-300bp，其作用于启动子以增强转录。增强子的取向及位置相对独立。已发现其位于转录单元的5′及3′。已知可从哺乳动物基因获得的若干增强子序列(例如血球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎儿蛋白及胰岛素)。也可使用来自病毒的增强子序列。SV40增强子、细胞巨大病毒早期启动子增强子、多瘤增强子及腺病毒增强子为活化真核启动子的示例性增强元件。尽管增强子可剪接于载体中核酸分子的位置5′或3′处，但其通常位于启动子的5′位点。
在表达载体中，转录终止序列通常位于多肽编码区的末端的3′处且用以终止转录。用于在原核细胞中表达的转录终止序列通常为富G-C片段，随后为多T序列。尽管该序列易于从文库克隆或甚至可作为载体的一部分在市场上购得，但其也可使用核酸合成方法(诸如本文所述的方法)轻易地合成。
可选标记基因元件编码对选择性培养基中生长的宿主细胞的存活及生长必需的蛋白质。表达载体中所用的典型选择标记基因编码符合以下的蛋白质：(a)赋予原核宿主细胞对抗生素或其他毒素(例如氨苄西林(ampicillin)、四环素(tetracycline)或卡那霉素(kanamycin))的抗性；(b)补充细胞的营养缺陷；或(c)供应从复合培养基不可得的关键营养素。可选标记的实例包括抗卡那霉素基因、抗氨苄西林基因及抗四环素基因。也可使用抗细菌新霉素基因在原核与真核宿主细胞中选择。
可使用其他选择基因扩增将表达的基因。扩增为不能以单拷贝形式以足够高量表达以允许细胞在某些选择条件下存活及生长的基因在连续代重组细胞的染色体内连续复制(reiterated in tandem)的过程。哺乳动物细胞的适合的可扩增可选标记的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)及无启动子胸苷激酶。在使用这些标记时，将哺乳动物细胞转化体置于选择压力下，其中仅转化体借助于载体中存在的选择基因而单独经调适以存活。通过在连续提高选择剂于培养基中的浓度的条件下培养所转化的细胞来施加选择压力，由此仅允许已扩增选择基因的那些细胞存活。在这些情形中，与选择基因相邻的DNA(诸如编码本发明抗体的DNA)与选择基因共扩增。因此，从所扩增的DNA合成更多量的抗Dkk-1多肽。
核糖体结合位点通常为mRNA的翻译起始所必需且特征在于Shine-Dalgarno序列(原核细胞)或Kozak序列(真核细胞)。该元件通常位于启动子的3′处及待表达的多肽编码序列的5′处。
在一些情况下，例如当需要在真核宿主细胞表达系统中糖基化时，可操作各种前序列以改善糖基化或产量。例如，可改变特定信号肽的肽酶裂解位点，或添加也可影响糖基化的前导序列(pro-sequence)。最终蛋白质产物可在-1位置(相对于成熟蛋白质的第一氨基酸)具有一或多个可能尚未完全移除的易于表达的额外氨基酸。例如，最终蛋白质产物可具有一或两个可见于肽酶裂解位点的氨基酸残基连接于氨基端。或者，若酶在成熟多肽内的此区域切割，则使用一些酶裂解位点可能产生略微截短但具活性形式的所需多肽。
当市售表达载体缺乏一些如上所述的所需侧接序列时，可通过将这些序列个别地接合于载体中来修饰该载体。在已视需要选择载体及修饰之后，将编码抗Dkk-1抗体或其免疫功能片段的核酸分子插入载体的适当位点。
将含有编码本发明抗体或其免疫功能片段的序列的完整载体插入适合宿主细胞中以进行扩增和/或多肽表达。可通过熟知方法实现抗Dkk-1抗体其免疫功能片段的表达载体转化至所选宿主细胞中，所述熟知方法包括诸如转染、感染、氯化钙、电穿孔、微注射、脂质体转染、DEAE-葡聚糖方法或其他已知技术的方法。所选方法将部分地随要使用的宿主细胞的类型而变化。这些方法及其他适合的方法为本领域技术人员所熟知。
经转化的宿主细胞当在适当条件下培养时合成抗Dkk-1抗体或其功能片段，其可随后从培养基(若宿主细胞将其分泌至培养基中)或直接从产生其的宿主细胞(若其未分泌)收集。适当宿主细胞的选择将视各种因素而定，诸如所需表达量、实现活性所需或必需的多肽修饰(诸如糖基化或磷酸化)、及易折叠为生物活性分子。
可作为宿主用于表达的哺乳动物细胞株在本领域中熟知且包括(但不限于)许多可得自美国菌种保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)的永生化细胞株，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞(HeLacell)、幼仓鼠肾脏(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如Hep G2)及许多其他细胞株。在某些实施方案中，可通过测试各种细胞株以确定具有最高表达量且产生具有组成性Dkk-1结合特性的抗体细胞株来选择表达特定DNA构建物的最优选细胞株。
药用组合物
在另一方面，本发明提供一种组合物，例如药用组合物，其含有与药用可接受的载体一起配制的一种本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分或其组合。这些组合物可包括一种本发明的抗体或免疫缀合物或双特异性分子，或其组合(例如两种或两种以上的不同者)。例如，本发明的药用组合物可包含结合靶抗原上不同表位或具有互补活性的抗体(或免疫缀合物或双特异性分子)的组合。
本发明的药用组合物也可以组合疗法(也即与其他物质组合)的形式施用。例如，组合疗法可包括本发明的抗Dkk-1抗体与至少一种其他消炎剂或免疫抑制剂的组合。下文在关于本发明的抗体的用途的章节中更详细描述可用于组合疗法的治疗剂的实例。
如本文中所用，“药用可接受的载体”包括任何及所有生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂、及类似物。载体通常适于静脉内、肌肉内、皮下、非经肠、脊椎或表皮施用(例如通过注射或输注)。视给药途径而定，可将活性化合物(也即抗体、其抗原结合部分、免疫缀合物或双特异性分子)包被于材料中以保护化合物免受酸及可使化合物失活的其他自然条件的作用。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以中性形式(包括两性离子形式)或以带正电或带负电物质的形式存在。在一些情况下，可使抗体与反荷离子复合以形成药用可接受的盐。因此，本发明医药化合物可包括一或多种药用可接受的盐。
“药用可接受的盐”是指保留亲本化合物(例如抗体)的所需生物活性且不赋予不期望的毒性作用的盐(例如参见Berge，S.M.等人，(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。例如，术语“药用可接受的盐”包括含有一或多种抗体及一或多种反荷离子的复合物，其中反荷离子来源于药用可接受的无机及有机酸及碱。
这些盐的实例包括酸加成盐及碱加成盐。酸加成盐包括衍生自诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸及其类似物的无毒性无机酸，以及衍生自诸如脂族单羧酸及二羧酸、苯基取代烷酸、羟基烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸及其类似物的无毒性有机酸的酸加成盐。碱加成盐包括衍生自诸如钠、钾、镁、钙及其类似物的碱土金属，以及衍生自诸如N，N′-二苯甲基乙二胺、N-甲基还原葡糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因(procaine)及其类似物的无毒性有机胺的碱加成盐。
此外，药用可接受的无机碱包括金属离子。金属离子包括(但不限于)适当碱金属盐、碱土金属盐及其他生理学可接受的金属离子。衍生自无机碱的盐包括铝盐、铵盐、钙盐、钴盐、镍盐、钼盐、钒盐、锰盐、铬盐、硒盐、锡盐、铜盐、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、锰盐、亚锰盐、钾盐、铷盐、钠盐及锌盐，且呈其常见价。
本发明的抗体的药用可接受酸加成盐可由以下酸制备：其包括(但不限于)甲酸、乙酸、乙酰胺基苯甲酸、己二酸、抗坏血酸、硼酸、丙酸、苯甲酸、樟脑酸、碳酸、环己胺磺酸、去氢胆酸、丙二酸、依地酸(edetic)、乙基硫酸、芬地柞酸(fendizoic)、偏磷酸、丁二酸、乙醇酸、葡萄糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、鞣酸、柠檬酸、硝酸、抗坏血酸、葡糖醛酸、顺丁烯二酸、叶酸、反丁烯二酸、丙酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、赖氨酸、异柠檬酸、三氟乙酸、双羟萘酸、丙酸、邻胺基苯甲酸、甲磺酸、乳清酸、草酸、酮基丁二酸、油酸、硬脂酸、水杨酸、胺基水杨酸、硅酸盐、对羟基苯甲酸、烟碱酸、苯基乙酸、杏仁酸、恩波酸(embonic)、磺酸、甲烷磺酸、磷酸、磷酸、乙烷磺酸、乙烷二磺酸、铵、苯磺酸、泛酸、萘磺酸、甲苯磺酸、2-羟基乙烷磺酸、对胺基苯磺酸、硫酸、硝酸、亚硝酸、硫酸单甲酯、环己基胺基磺酸、β-羟基丁酸、甘氨酸、甘胺酰甘氨酸、谷氨酸、二甲胂酸盐、二胺基己酸、樟脑磺酸、葡萄糖酸、硫氰酸、酮戊二酸、5-磷酸吡哆醛、氯苯氧基乙酸、十一酸、N-乙酰基-L-天冬氨酸、半乳糖二酸及半乳糖醛酸。
药用可接受的有机碱包括三甲胺、二乙胺、N，N′-二苯甲基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二苯甲基胺、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基还原葡糖胺)、普鲁卡因、环胺、四级铵阳离子、精氨酸、甜菜碱、咖啡碱、克立咪唑(clemizole)、2-乙胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、2-二甲胺基乙醇、乙烷二胺、丁胺、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、乙基还原葡糖胺、还原葡糖胺、葡糖胺、组氨酸、海卓胺(hydrabamine)、咪唑、异丙胺、甲基还原葡糖胺、吗啉、哌嗪、吡啶、吡哆醇、钕、哌啶、多元胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可豆碱、三乙胺、三丙胺、三乙醇胺、缓血酸胺、甲胺、牛磺酸、胆酸盐、6-胺基-2-甲基-2-庚醇、2-胺基-2-甲基-1，3-丙二醇、2-胺基-2-甲基-1-丙醇、脂族单羧酸及二羧酸、苯基取代烷酸、羟基烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸、锶、三(羟基甲基)甲基甘氨酸(tricine)、肼、苯基环己胺、2-(N-吗啉基)乙烷磺酸、双(2-羟基乙基)胺基-参(羟基甲基)甲烷、N-(2-乙酰胺基)-2-胺基乙烷磺酸、1，4-哌嗪二乙烷磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙烷磺酸、1，3-双[参(羟基甲基)甲胺基]丙烷、4-吗啉丙烷磺酸、4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸、2-[(2-羟基-1，1-双(羟基甲基)乙基)胺基]乙烷磺酸、N，N-双(2-羟基乙基)-2-胺基乙烷磺酸、4-(N-吗啉基)丁烷磺酸、3-(N，N-双[2-羟基乙基]胺基)-2-羟基丙烷磺酸、2-羟基-3-[参(羟基甲基)甲胺基]-1-丙烷磺酸、4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙烷磺酸)、二水合哌嗪-1，4-双(2-羟基丙烷磺酸)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪丙烷磺酸、N，N-双(2-羟基乙基)甘氨酸、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(4-丁烷磺酸)、N-[参(羟基甲基)甲基]-3-胺基丙烷磺酸、N-参(羟基甲基)甲基-4-胺基丁烷磺酸、N-(1，1-二甲基-2-羟基乙基)-3-胺基-2-羟基丙烷磺酸、2-(环己基胺基)乙烷磺酸、3-(环己基胺基)-2-羟基-1-丙烷磺酸、3-(环己基胺基)-1-丙烷磺酸、N-(2-乙酰胺基)亚胺二乙酸、4-(环己基胺基)-1-丁烷磺酸、N-[参(羟基甲基)甲基]甘氨酸、2-胺基-2-(羟基甲基)-1，3-丙二醇、及胺基丁三醇(trometamol)。
本发明的药用组合物还可包括药用可接受的抗氧化剂。药用可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠及其类似物；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血基棕榈酸酯、丁基化羟基甲氧苯(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚及其类似物；及(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其类似物。
可用于本发明的药用组合物中的适合的水性及非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其类似物)及其适合的混合物、诸如橄榄油的植物油，及诸如油酸乙酯的可注射有机酯。适当流动性可例如通过使用诸如卵磷脂的包衣物质；在分散液的情况下通过维持所需颗粒大小；及通过使用表面活性剂来维持。
这些组合物也可含有佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂及分散剂。可通过上述杀菌程序与通过包括各种抗细菌剂及抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及其类似物)来确保防止微生物存在。在组合物中还可适宜地包括等渗剂，诸如糖、氯化钠及其类似物。另外，可通过包括延迟吸收的物质，诸如单硬脂酸铝及明胶来实现可注射药物形式的延长的吸收。
药用可接受的载体包括无菌水性溶液或分散液，及供临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。用于医药活性物质的这些介质及物质的使用在本领域中是公知的。除非任何常规介质或物质与活性化合物不相容，否则包括将其用于本发明俄药用组合物中。还可在组合物中并入补充性活性化合物。
治疗组合物通常必须为无菌且在制造及储存条件下稳定。可将组合物配制为溶液、微乳液、脂质体，或其他适于高药物浓度的有序结构。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇，及液态聚乙二醇及其类似物)及其适合的混合物的溶剂或分散介质。适当流动性可例如通过使用诸如卵磷脂的包衣；在分散液情况下通过维持所需颗粒大小；及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可通过在组合物中包括延迟吸收的物质(例如单硬脂酸盐及明胶)来实现可注射组合物的延长的吸收。
可通过将所需量的活性化合物并入含一种上述成分或其组合的适当溶剂中，视需要随后进行杀菌微滤来制备无菌可注射溶液。一般而言，通过将活性化合物并入含有基本分散介质及来自上述各成分的其他所需成分的无菌载剂中来制备分散液。在制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，制备方法包括(但不限于)真空干燥及冷冻干燥(冻干)，其由先前经无菌过滤的溶液产生活性成分加任何额外所需成分的粉末。
可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分量将视所治疗的对象及特定给药模式而变。可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分量一般将为产生治疗作用的组合物量。一般而言，以100％计，此量将在约0.01％至约99％的活性成分、优选约0.1％至约70％、最优选约1％至约30％的活性成分与药用可接受的载体组合的范围内。
调整给药方案以提供最佳所需反应(例如治疗反应)。例如，可施用单次剂量(single bolus)；可随时间施用若干分次剂量；或可如治疗情况的紧急程度所指示按比例降低或提高剂量。围了易于给药及剂量均一性，特别适宜将非经肠组合物配制成单位剂型。如本文所用，单位剂型是指适合作为单位剂量用于待治疗对象的实体上的离散单位；各单位含有经计算产生所需治疗作用的预定量的活性化合物与所需医药载体组合。本发明的单位剂型的规格受以下因素支配且直接视这些因素而定：(a)活性化合物的独特特征及欲实现的特定治疗作用；及(b)在本领域中为处理对象的敏感性而混配此活性化合物的固有局限性。
对于施用所述抗体而言，剂量在每公斤宿主体重约0.0001至100毫克，更通常0.01至5毫克的范围内。例如，剂量可为每公斤体重0.3毫克、每公斤体重1毫克、每公斤体重3毫克、每公斤体重5毫克或每公斤体重10毫克，或在每公斤体重1毫克至10毫克的范围内。示例性治疗方案要求每周给药一次、每两周给药一次、每三周给药一次、每四周给药一次、每月给药一次、每3个月给药一次或每3至6个月给药一次。本发明的抗Dkk-1抗体或其抗原结合部分的给药方案包括例如经由皮下施用每公斤体重1毫克或每公斤体重3毫克，其中使用一种下述给药方案施用抗体：(i)每四周施用六剂，接着每三个月；(ii)每三周；(iii)每公斤体重3毫克一次，随后每三周每公斤体重1毫克。
在一些实施方案中，同时施用具有不同结合特异性的两种或两种以上抗体或其片段，在该情况下所施用的各抗体剂量在指定范围内。抗体通常分多次施用。单次剂量之间的时间间隔可为例如每周、每月、每三个月或每年。时间间隔也可无规律，如由测量患者体内靶标抗原的抗体的血液含量所指示。在一些方法中，调整剂量以实现血浆抗体浓度约1至1000μg/ml，而在一些方法中约25至300μg/ml。
或者，抗体可以缓释型配制物施用，在该情况下需要的给药频率较低。剂量及频率视患者体内抗体的半衰期而变化。一般而言，人类抗体显示最长半衰期，其次为人源化抗体、嵌合抗体，及非人类抗体。给药剂量及频率可视治疗为预防性或治疗性而变化。在预防性应用中，以相对低频率的时间间隔施用相对较低的剂量历经长时间。一些患者在其余生继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对较短时间间隔施用相对较高剂量直至疾病进展减缓或终止，优选直至患者显示疾病症状部分或完全改善。此后，可向该患者施以预防性疗法。
本发明的药用组合物中活性成分的实际剂量浓度可变化，以便获得有效实现针对特定患者、组合物及给药模式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分量。所选剂量浓度将视多种药物动力学因素而定，此类因素包括所用的本发明的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性；给药途径；给药时间；所用特定化合物的排泄速率；治疗持续期间；与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料；所治疗患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况及先前病史；及在医学技术中所熟知的类似因素。
“治疗有效剂量”的本发明抗Dkk-1抗体优选使得疾病症状严重度降低，无疾病症状期的频率及持续时间增加，或预防由疾病病痛所致的损伤或残疾。本领域技术人员将能够基于诸如个体体型、个体症状的严重度及所选特定组合物或给药途径的因素来决定这些量。
可使用诸如靶标介导药物处置(TMDD)PK/PD模型的方法计算抗Dkk-1抗体的剂量。可使用这些模型计算抗体浓度反应关系。可使用PK/PD模型来评价抗体非靶标介导消除、抗体转换及复合物形成及消除。可使用TMDD模型将使用动物模型(例如大鼠或猴)测定的数据翻译为人类数据以预测有效剂量。可使用MABEL模型测定表达及转换率。可使用PK/PD模型以基于Kd值来计算受体占用。为测定受体占用，考虑靶标和/或抗体-靶标复合物动力学的转换率。可使用PK/PD模型预测临床研究的安全性及效率。
可经由一或多种给药途径，使用在本领域中已知的各种方法中一或多种来施用本发明的组合物。如本领域技术人员应了解，给药途径和/或模式将视所需结果而变。本发明的抗体或其抗原结合部分的施用途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊椎或其他非经肠给药途径，例如通过注射或输注。如本文中所用，短语“非经肠施用”意指除肠及局部施用外，通常通过注射的给药模式，且包括(但不限于)静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蜘蛛膜下、脊椎内、硬膜外及胸骨内注射及输注。
或者，本发明的抗体或其抗原结合部分可经由非经肠途径来施用，此类非经肠途径诸如局部、表皮或粘膜给药途径，例如鼻内、经口、经阴道、经直肠、舌下或局部。
活性化合物可与保护化合物避免快速释放的载体(诸如控制释放配制物，包括植入物、经皮贴片及微囊递送系统)一起制备。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。制备这些配制物的许多方法已获专利或一般为本领域技术人员所熟知。例如参见Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems，J.R.Robinson编，Marcel Dekker，Inc.，New York(1978)。
可用本领域中已知的医学装置施用治疗组合物。例如，本发明的治疗组合物可用无针皮下注射装置施用，该装置诸如美国专利第5,399,163号；第5,383,851号；第5,312,335号；第5,064,413号；第4,941,880号；第4,790,824号；或第4,596,556号中所公开的装置。适用于本发明的熟知植入物及模组(module)的实例包括：美国专利第4,487,603号，其公开以控制速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利第4,486,194号，其公开经由皮肤施用药物的治疗装置；美国专利第4,447,233号，其公开以精确输注速率传递药物的药物输注泵；美国专利第4,447,224号，其公开用于连续药物递送的可变流动速率可植入输注装置；美国专利第4,439,196号，其公开具有多腔隔室的渗透药物传递系统；及美国专利第4,475,196号，其公开渗透药物传递系统。本领域技术人员已知许多其他这些植入物、传递系统及模组。
在一些实施方案中，可配制本发明的抗体或其片段以确保适当的体内分布。例如，血脑障壁(BBB)排除许多高度亲水性化合物。为确保本发明的治疗化合物穿过BBB(必要时)，可将其配制的例如脂质体中。关于制造脂质体的方法，例如参见美国专利第4,522,811号；第5,374,548号；及第5,399,331号。脂质体可包含一或多个部分，其经选择性输送至特定细胞或器官中，从而增强靶向药物递送(例如参见V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示例性靶向部分包括叶酸盐或生物素(例如参见Low等人的美国专利第5,416,016号)；甘露糖(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等人，(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等人，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白质A受体(Briscoe等人，(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等人，(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
如本文所提供，可施用所提供的药用组合物用于预防性和/或治疗性处理。“有效量”一般是指实现所需作用足够但无毒性量的活性成分(也即抗Dkk-1抗体或其免疫功能片段)的量，该所需作用为降低或消除症状严重度和/或频率，和/或改善或补救损害。“治疗有效量”是指足以治疗疾病病况或症状，或预防、阻碍、延缓或逆转疾病或任何其他不期望的症状的进展的量。“预防有效量”是指有效预防、阻碍或延缓疾病病况或症状发作的量。
一般抗体或片段的毒性及治疗功效可根据标准医药程序在细胞培养物和/或实验动物中测定，包括例如测定LD50(对50％群体致死的剂量)及ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比为治疗指数且其可表示为比率LD50/ED50。优选展现大治疗指数的组合物。
得自细胞培养和/或动物研究的数据可用于确定用于人类的剂量范围。活性成分的剂量通常处于包括ED50、具有极少毒性或无毒性的循环浓度范围内。剂量可视所用剂型及所用给药途径而在此范围内变化。
如在本文中所提及，欲以治疗或预防方式采用的包含抗Dkk-1抗体或其免疫功能片段的药用组合物的有效量将视例如治疗情形及目标而定。根据某些实施方案，本领域技术人员将了解治疗的适当剂量浓度因此将部分地视所传递的分子、正使用抗Dkk-1抗体所针对的适应症、给药途径，及患者的体型(体重、体表或器官尺寸)和/或病状(年龄及一般健康状况)而变。临床医师可滴定剂量且改变给药途径以获得最佳治疗作用。
给药频率将视配制物中抗Dkk-1抗体或其免疫功能片段的药物动力学参数而定。例如，临床医师将施用组合物直至达到实现所需作用的剂量为止。组合物因此可以单次剂量或随时间以两次或两次以上剂量(其可能含有或可能不含有相同量的所需分子)施用，或以连续输注方式经由植入装置或导管施用。治疗可为随时间连续或为间歇式。适当剂量的进一步改进由本领域技术人员常规进行且在其常规执行的任务的范围内。适当剂量可经由使用适当剂量反应数据来确定。
为治疗特征在于Dkk-1异常或过量表达的医学病症，可以足以诱导至少一个反映病症严重度的指标持续改善的量及时间向患者施用包含本发明抗Dkk-1抗体或其免疫功能片段的组合物。若患者相隔至少一至七天或在一些情况下一至六周至少两次展现改善，则改善被视为“持续”。适当时间间隔将在某种程度上视所治疗的疾病病状而定；其在测定确定改善是否持续的适当时间间隔的熟练医师的技能范围内。改善程度基于征兆或症状，且还可采用给予患者的问卷，诸如生活品质问卷来测定。
可评估反映患者疾病程度的各种指标以便确定治疗的量及时间是否充分。通过在施用第一剂抗体之前检查患者来确定所选指标的基线值。优选在施用第一剂的约60天内进行基线检查。若施用抗体以治疗急性症状，诸如治疗骨折，则在发生损伤后实际可能最短时间内施用第一剂。
通过施用本发明的抗Dkk-1抗体或其免疫功能片段来诱导改善直至患者显现所选指标超过基线的改善为止。在治疗慢性病状时，通过重复施用此药物历时至少一个月或一个月以上(例如历时一、二或三个月或三个月以上)的时段或无限期来获得此改善程度。一至六周的时段，或甚至单次剂量通常足以治疗急性病状。对于损伤或急性病状，单次剂量可能足够。
尽管患者疾病程度在治疗后根据一或多个指标可能表现获改善，但治疗可能以相同量或以降低的剂量或频率无限期继续。在治疗已减少或中止后，若症状重现，则该治疗稍后可以初始量继续。
抗Dkk-1抗体的示例效用
检测及筛选
本发明的抗Dkk-1抗体及其免疫功能片段可用以检测生物样品中的Dkk-1。这些用途允许鉴别产生蛋白质的细胞或组织，或充当检测Dkk-1产生过度或产生不足的病理学病状的诊断剂。
所提供的抗体及片段也可用于筛选结合Dkk-1的分子的方法中。例如可使用各种竞争筛选法。在一些方法中，使抗Dkk-1抗体所结合的Dkk-1分子或其片段与本文所公开的抗体或片段以及另一分子(也即候选分子)接触。抗体或片段与Dkk-1之间结合减少指示分子结合Dkk-1。可使用各种方法(例如ELISA)检测抗体或片段的结合。检测抗Dkk-1抗体或片段与Dkk-1之间的结合可通过以可检测方式标记抗体而简化。在一些方法中，进一步分析在初始筛选中展现结合的分子以测定其是否抑制Dkk-1活性(例如分子是否活化Wnt信号传导)。
治疗骨胳相关病症
在其他方面，所提供的某些抗体及免疫功能片段可用以治疗患有各种不同疾病的患者，此类疾病包括例如对Dkk-1活性抑制有反应的疾病。这些抗体及片段也可用以治疗对诱导Wnt信号传导有反应的疾病。除非另有说明，否则如本文中所用，术语“患者”包括人类及动物对象。这些疾病的实例包括(但不限于)各种疾病，涉及骨胳病症，包括低骨量病状、全身性骨量流失、骨形成受抑制及骨侵蚀。一些抗体及片段也可用于骨修复。
在一些实施方案中，抗体或片段具有刺激成骨细胞活性及增加骨密度或骨量的治疗用途。这些抗体及片段因此适用于治疗患有各种医学病症(包括过度骨量流失)的患者或甚至在可能不一定存在过度破骨细胞活性之处也需要形成新骨的患者。阻断Dkk-1活性使得成骨细胞经由Wnt蛋白质传输的信号传导而活化。过度破骨细胞活性与许多骨质减少的病症相关，此类病症可用所提供的抗体及免疫功能片段治疗，包括骨质减少、骨质疏松症、牙周炎、佩吉特病、不活动所致的骨量流失、溶解性骨转移及关节炎(包括类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎)、僵直性脊椎炎及其他涉及骨侵蚀的病状。
还可治疗各种其他低骨量病状，包括各种形式的骨质疏松症，其包括(但不限于)糖皮质激素诱发的骨质疏松症、移植后诱发的骨质疏松症、与化学疗法相关的骨质疏松症(也即，化学疗法诱导的骨质疏松症)、不活动诱发的骨质疏松症、机械减负(mechanical unloading)所致的骨质疏松症，及与抗惊厥剂使用相关的骨质疏松症。可用一些抗体或片段治疗的其他骨疾病包括与肾衰竭相关的骨疾病及与营养、肠胃和/或肝相关的骨疾病。
还可治疗不同形式的关节炎，实例包括骨关节炎及类风湿性关节炎。此类抗体及片段还可用以治疗与关节炎(例如类风湿性关节炎)相关的全身性骨量流失。在治疗关节炎时，患者可受益于病灶周围(perilesional)或病灶内注射本发明的抗体或其片段。例如，此类抗体或其片段可与发炎关节相邻注射或直接注射于发炎关节中，从而刺激该部位受损骨胳的修复。
已知一些癌症提高破骨细胞活性且诱导骨吸收，诸如乳腺癌及前列腺癌。出现于骨髓中的多发性骨髓瘤也与骨量流失相关，其部分可能由以下引起：血浆细胞的Dkk-1表达增加，其接着抑制附近成骨细胞的骨胳建造活性。通过施用本发明的抗体或其免疫功能片段来降低Dkk-1活性可使得成骨细胞活性提高，从而抵销过度破骨细胞活性，由此在患者中降低上述病症的严重度、减少骨侵蚀及诱导新骨形成。使用某些抗Dkk-1特异性抗体或免疫功能片段治疗可诱导患有骨质减少病症的患者骨密度显著提高。
以本文所述的抗体或免疫功能片段抑制Dkk-1也可用于各种骨修复应用中。例如，某些抗体及片段可适用于延缓与人造关节相关的磨损碎片骨量溶解、加速骨折修复及增强骨移植物并入移植其的周围活骨中。
如本文所公开，抗Dkk-1抗体或其免疫功能片段可单独施用或与其他治疗剂组合施用，例如与癌症治疗剂、与抑制破骨细胞活性的物质或与增强成骨细胞活性的其他物质组合施用。例如，可向进行放射疗法或化学疗法的癌症患者施用本发明抗体。与本发明抗体组合使用的化学治疗剂可包括蒽环霉素(anthracycline)、紫杉醇(taxol)、他莫昔芬(tamoxifene)、多柔比星(doxorubicin)、5-氟尿嘧啶、奥赛力铂(oxaloplatin)、
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([(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-1-氧代-3-苯基-2-[(吡嗪基羰基)胺基]丙基]胺基]丁基]硼酸)和/或用于治疗癌症的其他小分子药物。乳腺癌患者将受益于相伴施用芳香酶抑制剂与包含化学疗剂及抗Dkk-1抗体或其免疫功能片段的组合治疗。
抗Dkk-1抗体及其免疫功能片段可单独用于治疗导致骨量流失的上述病状，或与治疗有效量的包括(但不限于)以下骨生长促进(合成代谢)剂或骨抗再吸收剂组合使用：表示为BMP-1至BMP-12的骨型态发生因子(bonemorphogenic factor)；转化生长因子-β及TGF-β家族成员；成纤维细胞生长因子FGF-1至FGF-10；白介素-1抑制剂(包括IL-1ra，IL-1的抗体及IL-1受体的抗体)；TNFα抑制剂(包括依那西普(etanercept)、阿达木单抗(Adalibumab)及英利昔单抗(infliximab))；RANK配体抑制剂(包括可溶RANK，特异性结合RANK或RANK配体的护骨素及拮抗抗体)、副甲状腺素、E系列前列腺素、双磷酸盐及骨增强矿物，诸如氟化物及钙。可与本发明抗体及其功能片段组合使用的合成代谢剂包括副甲状腺素及类胰岛素生长因子(IGF)，其中后一物质优选与IGF结合蛋白复合。WO 89/11540中描述适于此组合治疗的IL-1受体拮抗剂且WO 98/01555中描述适合的可溶TNF受体-1。示例性RANK配体拮抗剂于例如WO 03/086289、WO03/002713、美国专利第6,740,511号及第6,479,635号中公开。所有上述专利及专利申请均援引并入本文。
另外，抗Dkk-1抗体可与结合肿瘤细胞并对肿瘤生长诱导细胞毒性和/或细胞抑制效应的抗体组合施用于患者。这些抗体的实例包括结合存在于肿瘤细胞上的细胞表面蛋白Her2、CDC20、CDC33、粘蛋白样糖蛋白及表皮生长因子受体(EGFR)并诱导对呈现这些蛋白的肿瘤细胞的细胞抑制和/或细胞毒性效应的抗体。该抗体的实例包括治疗乳腺癌的HERCEPTIN及治疗非霍奇金淋巴瘤的
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，且还包括基于抗体的药物，如
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及
Figure BPA00001497441300683
另外，组合疗法可包括选择性诱导肿瘤细胞凋亡的多肽(如TNF相关多肽TRAIL)作为癌症治疗剂。
本发明的抗体或其免疫功能片段可与用于相同病状的其他治疗及治疗剂相伴施用。如本文中所用，“相伴施用”涵盖同时或依次施用的治疗。抗Dkk-1抗体或其免疫功能片段可以预防方式施用以预防或减轻早期癌症(第I期或第II期)所致的骨量流失发作，或可经施用以改善转移至骨胳造成的现有骨量流失病状。
本发明的抗Dkk-1抗体可用于预防和/或治疗骨胳中肿瘤细胞的生长。因为肿瘤细胞刺激破骨细胞再吸收内部骨基质，所以转移至骨胳的癌症可轻易地扩散。用抗Dkk-1抗体或其免疫功能片段治疗通过刺激成骨细胞活性提高而有助于维持这些转移部位的骨密度。可能转移至骨胳的任何癌症均可在转移发生之前或之后用施用抗Dkk-1抗体来预防或治疗。
多发性骨髓瘤是可用抗Dkk-1抗体或其抗原结合片段来预防和/或治疗的一类癌症的实例。患病的患者通常由于骨胳局部区域中破骨细胞活化提高而展现骨量流失。骨髓瘤细胞直接或间接产生RANK配体，即活化破骨细胞从而使得骨髓间隙中包埋的骨髓瘤细胞周围的骨胳溶解的蛋白质。与骨髓瘤细胞相邻的正常破骨细胞又产生IL-6，使得骨髓瘤细胞生长及增殖。另外，多发性骨髓瘤细胞产生Dkk-1，由此在此疾病中抑制成骨细胞活性且进一步促进骨胳再吸收活性。用抗Dkk-1抗体或其免疫功能片段治疗动物将激发成骨细胞活性，由此使得肿瘤部位的骨量增加。此治疗可使骨痛降低，且可通过预防再吸收活性(其释放肿瘤细胞所用的骨营养素)来阻断进一步转移至骨胳。在治疗此疾病时，抗Dkk-1抗体或其免疫功能片段可与针对RANK配体的拮抗抗体或针对IL-6的抗体相伴施用。
治疗其他病症
除与骨胳病症有关的前述用途外，所提供的某些抗体及免疫功能片段可用于治疗其他疾病。Dkk-1在这些各种疾病中的作用部分地由其在各种不同组织中的表达支持。此类抗体及片段例如可用于治疗需要促进干细胞再生的疾病。这些疾病包括(但不限于)糖尿病、慢性心脏衰竭及各种肌肉疾病(例如由例如不活动或卧床休息所致的不用性萎缩)；衰老性脆弱(老年人少肌症)；肌肉营养不良；与癌症、AIDS或发炎相关的恶病质；肾衰竭/尿毒症的蛋白质-能量营养不良症，及肥胖症的肌肉萎缩)。也可治疗各种发炎疾病，包括例如克罗恩氏病(Crohn′s disease)、结肠炎及发炎性肠病。此类抗体及片段还可用于治疗各种神经疾病(例如阿兹海默氏症(Alzheimer′sDisease)、帕金森氏症(Parkinson′s disease)及亨丁顿氏病(Huntington′sdisease))。还可用某些抗体及片段治疗眼疾(例如黄斑退化及各种视网膜病)。还可用一些抗体治疗不同肾病(例如末期肾病、慢性肾病、丝球体肾炎、肾小管间质肾炎及IgA肾病变)。另外，还可治疗各种肺病(例如慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化及囊肿性纤维化)及各种皮肤病症，包括真皮及表皮疾病。可治疗的皮肤病症的实例包括受损肠上皮(例如化学疗法诱导的损害)，及需要刺激肠上皮生长及存活的其他疾病。
试剂盒
还提供包括如本文所述抗体或免疫功能片段或药用组合物的试剂盒。一些试剂盒包括所述抗体、片段或组合物于容器(例如小瓶或安瓿)中，且还可包括将抗体或片段用于上文所公开的各种检测、筛选及治疗应用的说明书。抗体、片段或组合物可为各种形式，包括例如为溶液的一部分的形式或呈固体(例如冻干粉末)形式。说明书可包括如何在适当流体中制备(例如溶解或再悬浮)抗体或片段和/或如何施用抗体或片段以便治疗上述疾病(例如骨病症，诸如低骨量、全身性骨量流失、骨形成受抑制及骨侵蚀；干细胞再生；发炎疾病；神经疾病；眼疾；肾病及皮肤病)的描述。
此类试剂盒还可包括各种其他组分，诸如缓冲剂、盐、错合金属离子及上文在关于药用组合物的章节中所述的其他物质。这些组分可与抗体或片段一起包括或可在单独的容器中。试剂盒也可包括与抗体或片段一起施用的其他治疗剂。这些物质的实例包括(但不限于)治疗癌症的物质、骨促进剂及结合肿瘤细胞的抗体，及上述其他物质。
抗Dkk-1抗体的进一步具体描述
对Fcγ部分的修饰
在重组人源化抗体中，可修饰Fcγ部分以避免与Fcγ受体及补体免疫系统相互作用。此类修饰由剑桥大学病理学系的Mike Clark博士所设计，且制备这些抗体的技术如在1999年11月18日公开的WO 99/58572中描述。例如，若将抗体用于治疗人类，则可将恒定区工程改造为更类似于人类恒定区以避免免疫反应。参见例如美国专利第5,997,867号及5,866,692号。
对huMabJC18的修饰
huMabJC18为完全人源化抗Dkk-1单克隆抗体。本发明涵盖对huMabJC18的修饰，包括不会显著影响其特性的功能等效抗体及活性和/或亲和力增强或降低的变体。例如，如本领域技术人员应了解，huMabJC18的氨基酸序列可突变以获得对Dkk-1具有所需结合亲和力的抗体。多肽修饰在本领域中为常规实践且在本文中无需详细描述。实施例中示例多肽修饰。经修饰多肽的实例包括：具有氨基酸残基保守性取代、一或多种不会显著不利地改变功能活性的氨基酸缺失或添加的多肽，或使用化学类似物。
氨基酸序列插入包括：长度在一个残基至含有一百个或一百个以上残基的多肽范围内的氨基端和/或羧基端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体或融合于表位标签的抗体。抗体分子的其他插入变体包括酶或多肽与抗体的N端或C端的融合物，其延长抗体的血清半衰期。
取代变体在经移除的抗体分子中具有至少一个氨基酸残基及在其位置插入不同残基。最受关注的供取代诱变的位点包括高变区，但还涵盖构架(FR)变化。表1中所示的保守性取代是在“保守性取代”标题下。若这些取代引起生物活性改变，则可引入在表1中命名为“示例性取代”，或如下文关于氨基酸类别进一步描述生物更实质变化且筛选产物。
表1：氨基酸取代
抗体生物特性的实质改变是通过选择对以下的作用显著不同的取代而实现：维持(a)取代区中多肽主链的结构，例如呈折叠或螺旋构形，(b)靶标位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链体积。基于常见侧链特性将天然存在的残基分组：
(1)非极性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)不带电极性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性(带负电荷)：Asp、Glu；
(4)碱性(带正电荷)：Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；及
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe、His。
通过将一种这些类别的成员换为另一类别进行非保守性取代。
维持抗体适当构象中不涉及的任何半胱氨酸残基均也可经取代，一般经丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性且防止异常交联。相反地，可向抗体中添加半胱氨酸键以改善其稳定性，尤其当抗体为如Fv片段的抗体片段时更是如此。
氨基酸修饰可介于改变或修饰一或多个氨基酸至完全重新设计一个区域，如可变区。可变区的变化可改变结合亲和力和/或特异性。在一些实施方案中，在CDR结构域内产生不超过一至五个保守氨基酸取代。在其他实施方案中，在CDR结构域内产生不超过一至三个保守氨基酸取代。在其他实施方案中，CDR结构域为CDR H3和/或CDR L3。
huMabJC18的糖基化
修饰还包括糖基化及非糖基化多肽，以及具有其他翻译后修饰的多肽，此类翻译后修饰诸如用不同糖来糖基化、乙酰化及磷酸化。抗体在其恒定区中保守位置经糖基化(例如参见Jefferis及Lund(1997)Chem.Immunol.65：111-128；Wright及Morrison(1997)TibTECH 15：26-32)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白质功能(例如参见Boyd等人，(1996)Mol.Immunol.32：1311-1318；Wittwe及Howard(1990)Biochem.29：4175-4180)及糖蛋白的部分之间的分子内相互作用，其可影响糖蛋白的构象及所呈现的三维表面(Hefferis及Lund，同上文；Wyss及Wagner(1996)Current Opin.Biotech.7：409-416)。寡糖还可用以基于特定识别结构使给定糖蛋白靶向某些分子。也有报导抗体的糖基化影响抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。具体而言，报导具有四环素调控的β(1，4)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTIII)(催化形成平分GlcNAc的糖基转移酶)的表达的CHO细胞具有获改善的ADCC活性(例如参见Umana等人，(1999)Nature Biotech.17：176-180)。
抗体的糖基化通常为N连接或O连接。N连接是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸、及天冬酰胺-X-半胱氨酸(其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸)为碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中存在任何这些三肽序列均会产生潜在糖基化位点。O连接糖基化是指糖N-乙酰基半乳胺糖、半乳糖或木糖之一连接至羟基氨基酸，最通常连接至丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
向抗体中添加糖基化位点宜通过改变氨基酸序列使得其含有一或多种上述三肽序列来实现(对于N连接糖基化位点)。该改变还可通过对初始抗体的序列进行一或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加或取代来进行(对于O连接糖基化位点)。
还可改变抗体的糖基化模式而不改变基本核苷酸序列。糖基化在很大程度上视用于表达抗体的宿主细胞而定。由于用于表达作为潜在治疗剂的重组糖蛋白(例如抗体)的细胞类型极少为天然细胞，因此可预期抗体的糖基化模式改变(例如参见Hse等人，(1997)J.Biol.Chem.272：9062-9070)。
除宿主细胞的选择外，在抗体的重组产生期间影响糖基化的因素还包括生长模式、培养基配制物、培养物密度、氧合作用、pH值、纯化流程及类似因素。已提出各种方法来改变特定宿主生物体中实现的糖基化模式，包括引入或过度表达某些在寡糖产生中所涉及的酶(例如参见美国专利第5,047,335号；第5,510,261号及第5.278,299号)。可例如使用内切糖苷酶H(Endo H)从糖蛋白酶促移除糖基化或某些类型的糖基化。另外，重组宿主细胞可经遗传工程改造，使得在某些类型的多糖加工中具有缺陷。这些及类似技术在本领域中熟知。
偶合技术
如上文所述，其他修饰方法包括使用在本领域中已知的偶合技术，其包括(但不限于)酶促手段、氧化取代及螯合。可使用修饰例如连接标记以便免疫测定。经修饰的huMabJC18多肽可使用在本领域中已确立的方法制得且可使用在本领域中已知的标准测定来筛选，其中一些描述于下文及实施例中。本领域技术人员应了解制造及筛选这些修饰的任何适合方法。
经修饰的恒定区
在本发明的一些实施方案中，抗体包含经修饰的恒定区，诸如免疫惰性或部分惰性的恒定区，例如不触发补体介导溶解、不刺激抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)，或不活化微神经胶质细胞；或在任何一或多个以下各项中的活性降低(相较于未经修饰的抗体)：触发补体介导溶解、刺激抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)，或活化微神经胶质细胞。恒定区的不同修饰可用以实现最佳程度和/或组合的效应功能。例如参见Morgan等人，Immunology 86：319-324(1995)；Lund等人，J.Immunology 157：4963-9157：4963-4969(1996)；Idusogie等人，J.Immunology 164：4178-4184(2000)；Tao等人，J.Immunology 143：2595-2601(1989)；及Jefferis等人，Immunological Reviews 163：59-76(1998)。在实施方案中，恒定区如在以下文献中所述经修饰：Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624；PCT申请第PCT/GB99/01441号；和/或英国专利申请第9809951.8号。
在实施方案中，抗体包含人类重链IgG2a恒定区，该恒定区包含以下突变：A330P331至S330S331(参考野生型IgG2a序列的氨基酸编号)。Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624。在另一实施方案中，恒定区经去糖基化(aglycosylated)。在另一实施方案中，通过使恒定区中的糖基化氨基酸残基突变使恒定区去糖基化。例如，N-糖基化位点N297可突变为A、Q、K或H。例如参见Tao等人，J.Immunology 143：2595-2601(1989)；及Jefferis等人，Immunological Reviews 163：59-76(1998)。在实施方案中，将恒定区酶促去糖基化(诸如通过酶PNGase来移除碳水化合物)。
效应结构域
其他抗体修饰包括如例如1999年11月18日公开的WO 99/58572中所述修饰的抗体。除针对靶标分子的结合结构域外，这些抗体还包含具有与人类免疫球蛋白重链的恒定结构域的全部或部分实质上同源的氨基酸序列的效应结构域。这些抗体能够结合靶标分子，而不触发靶标的显著补体依赖性溶解或细胞介导破坏。在一些实施方案中，效应结构域能够特异性结合FcRn和/或FcγRIIb。这些通常基于源自两个或两个以上人类免疫球蛋白重链CH2域的嵌合结构域。以此方式修饰的抗体尤其适用于慢性抗体疗法以避免常规抗体疗法的发炎及其他不利反应。
亲和力成熟
在实施方案中，抗体为亲和力成熟抗体。例如，亲和力成熟抗体可通过在本领域中已知的程序产生(例如Marks等人，1992，Bio/Technology，10：779-783；Barbas等人，(1994)Proc Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813；Schier等人，(1995)Gene，169：147-155；Yelton等人，(1995)J.Immunol.，155：1994-2004；Jackson等人，(1995)J.Immunol.，154(7)：3310-9；Hawkins等人，(1992)J.Mol.Biol.，226：889-896)。
文库扫描诱变
以下方法可用于调整抗体亲和力及表征CDR。表征抗体的CDR和/或改变(诸如改善)多肽(诸如抗体)的结合亲和力的一种方式称为“文库扫描诱变”。一般而言，文库扫描诱变如下运作。使用技术上认可的方法将CDR中的一或多个氨基酸位置用两个或两个以上(诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸置换。此产生纯系的小文库(在一些实施方案中，为每个经分析的氨基酸位置一个)，各自具有两个或两个以上成员的复合(若在每个位置处两个或两个以上氨基酸经取代)。一般而言，该文库还包括包含天然(未经取代)氨基酸的纯系。针对与靶标多肽(或其他结合靶标)的结合亲和力筛选来自各文库的少量纯系，例如约20-80个纯系(视文库的复杂性而定)，且鉴别结合增加、相同、减少或无结合的候选物。
确定结合亲和力
确定结合亲和力的方法在本领域中熟知。可使用BIAcore或ProteOn表面等离子共振分析测定结合亲和力，该分析检测约2倍或2倍以上的结合亲和力差异。当起始抗体以相对高亲和力(例如约10nM或10nM以下的KD)结合时，这些类型的分析尤其适用。在本文实施例中描述使用BIAcore或ProteOn表面等离子共振的筛选。
可使用Kinexa Biocensor、闪烁邻近测定(scintillation proximity assay)、ELISA、ORIGEN免疫测定(IGEN)、萤光猝灭、萤光转移和/或酵母展示来确定结合亲和力。还可使用适合的生物测定来筛选结合亲和力。
在一些实施方案中，使用技术上认可的诱变方法(其中一些描述于本文中)，CDR中的每个氨基酸位置经所有20个天然氨基酸置换(在一些实施方案中每次一个)。此产生纯系的小文库(在一些实施方案中，每个经分析的氨基酸位置一个)，其各自具有20个成员的复合(若在每个位置所有20个氨基酸均经取代)。
在一些实施方案中，待筛选的文库在两个或两个以上位置包含取代，其可在同一CDR中或在两个或两个以上CDR中。因此，文库可包含在一个CDR中两个或两个以上位置的取代。文库可在两个或两个以上CDR中两个或两个以上位置包含取代。文库可在3、4、5个或5个以上位置包含取代，此类位置可见于二、三、四、五或六个CDR中。可使用低冗余密码子来制备取代。例如参见Balint等人，(1993)Gene 137(1)：109-18的表2。
CDR可为CDRH3和/或CDRL3。CDR可为CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和/或CDRH3中一或多个。CDR可为Kabat CDR、ChothiaCDR或延伸CDR。
可将结合改善的候选物测序，由此鉴别产生获改善亲和力(也称为“获改善”取代)的CDR取代突变体。也可将结合的候选物测序，由此鉴别保持结合的CDR取代。
可进行多轮筛选。例如，结合获改善的候选物(各自在一或多个CDR的一或多个位置包含氨基酸取代)也适用于设计第二文库，该第二文库在各获改善CDR位置(即CDR中取代突变体显示获改善结合的氨基酸位置)含有至少初始及经取代氨基酸。下文进一步讨论此文库制备、及筛选或选择。
就具有获改善的结合、相同结合、减少的结合或无结合的纯系频率还提供关于各氨基酸位置对抗体-抗原复合物稳定性的重要性的信息而言，文库扫描诱变还提供表征CDR的手段。例如，若CDR的位置当变为所有20个氨基酸时均保持结合，则将该位置鉴别为不可能为抗原结合所需的位置。相反，若CDR的位置在仅小百分比取代下保持结合，则将该位置鉴别为对CDR功能重要的位置。因此，文库扫描诱变方法产生关于CDR中可变为许多不同氨基酸(包括所有20个氨基酸)的位置及CDR中不可变或只能改变少数氨基酸的位置的信息。
亲和力获改善的候选物可在第二文库中组合，其在该位置包括获改善氨基酸、初始氨基酸，且可在该位置进一步包括额外取代(视所需文库复杂性而定)，或允许使用所需筛选方法或选择方法。另外必要时相邻氨基酸位置可经随机化为至少两种或两种以上氨基酸。相邻氨基酸的随机化可允许突变CDR中具有额外构象灵活性，其又可允许或有助于引入较大数目的改善性突变。文库还可在第一轮筛选中不显示亲和力获改善的位置包含取代。
使用在本领域中已知的任何方法，包括使用BIAcore表面等离子共振分析筛选，及使用本领域中已知用于选择的任何方法(包括噬菌体展示、酵母展示及核糖体展示)筛选或选择第二文库中结合亲和力获改善和/或改变的文库成员。
融合蛋白
如上文所述，本发明还涵盖含本发明抗体(诸如huMabJC18)或多肽的一或多个片段或区域的融合蛋白。可通过本领域中已知的方法，例如以合成或重组方式产生huMabJC18融合多肽。本发明的huMabJC18融合蛋白通常使用本文所述的重组方法，通过制备及表达编码其的多核苷酸而制得，但其也可通过本领域中已知的其他手段(包括例如化学合成)来制备。
缀合
如上文所述，本发明还提供组合物，其包含huMabJC18抗体或多肽与有助于缀合至固体支撑物(诸如生物素或抗生物素蛋白)的物质的结合物(例如连接物)。为简单起见，一般将参考huMabJC18或抗体，应了解这些方法适用于本文所述的任何Dkk-1结合实施方案。缀合一般是指如本文所述连接这些组分。可以许多方式实现连接(其一般为至少出于给药目的，将这些组分以紧密缔合形式固定)。例如，当物质与抗体各具有能够与另一者反应的取代基时，则其之间可能发生直接反应。例如，诸如氨基或硫氢基的亲核基团一方面可能与诸如酐或酸卤化物的含羰基基团反应，或另一方面与含有良好脱离基(例如卤基)的烷基反应。
标记物质
如上文所述，本发明的抗体或多肽可连接于任何适合的标记物质(或者称为“标记”)，如萤光分子、放射性分子或在本领域中已知的任何其他标记。标记在本领域中为已知，其一般提供(直接或间接)信号。
组合物
如上文所述，本发明还提供组合物(包括药用组合物)及试剂盒，其包含例如huMabJC18，或如本发明阐明的本文所述任何或所有抗体和/或多肽。
多核苷酸、载体(例如表达载体)及宿主细胞
如上文用所提供的若干特定实施方案所示，本发明还提供编码本发明抗体及多肽(包括含图1中所示轻链及重链可变区的多肽序列的抗体)的经分离多核苷酸，及包含多核苷酸的载体及宿主细胞。
在另一方面，本发明提供编码任何本文所述抗体(包括抗体片段)及多肽的多核苷酸。如本领域技术人员应了解，所提供的多核苷酸可通过在本领域中已知的程序来制得。
在另一方面，本发明提供含任何本发明多核苷酸的组合物(包括上文及下文较详细描述的药用组合物)。在实施方案中，组合物包含表达载体，该表达载体包含编码如本文所述huMabJC18的多核苷酸。在实施方案中，组合物包含表达载体，该表达载体含编码任何本文所述抗体或多肽的多核苷酸。在又一实施方案中，组合物含SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：28所示的任何一或两个多核苷酸。本文还描述多核苷酸组合物的表达载体及施用。
在另一方面，本发明提供制造任何本文所述多核苷酸的方法。
本发明还涵盖与任何这些序列互补的多核苷酸。多核苷酸可为单链(编码或反义)或双链，且可为DNA(基因组、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子包括含有内含子且一一对应于DNA分子的HnRNA分子，及不含有内含子的mRNA分子。其他编码或非编码序列可(但非必需)存在于本发明的多核苷酸内，且多核苷酸可(但非必需)连接至其他分子和/或载体材料。
多核苷酸可包含天然序列(也即编码抗体或其部分的内源性序列)或可包含此序列的变体。多核苷酸变体含有一或多个取代、添加、缺失和/或插入，使得编码多肽的免疫反应性相对于天然免疫反应性分子不减小。一般可如本文所述评估对经编码多肽的免疫反应性的影响。变体优选与编码天然抗体或其部分的多核苷酸序列呈至少约70％一致性，更优选至少约80％一致性及最优选至少约90％一致性。
若当下述为达最大对应进行比对时，两个序列中的核苷酸或氨基酸的序列相同，则将两个多核苷酸或多肽序列称为“一致”。通常通过在比较窗上比较序列以鉴别及比较具有序列相似性的局部区域来进行两个序列之间的比较。如本文中所用，“比较窗”是指至少约20个(通常30至约75个，或40至约50个)相邻位置的区段，其中可将序列与具有相同数目的相邻位置的参考序列在该两个序列最佳比对之后相比较。
供比较的序列的最佳比对可使用生物信息软件Lasergene套件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)中的Megalign程序，使用系统默认参数来进行。此程序实施以下参考文献中所述的若干比对方案：Dayhoff，M.O.(1978)A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distantrelationships；Dayhoff，M.O.(编)Atlas of Protein Sequence and Structure，National Biomedical Research Foundation，Washington DC，第5卷，增刊3，第345-358页；Hein J.(1990)Unified Approach to Alignment and Phylogenes，第626-645页，Methods in Enzymology第183卷，Academic Press，Inc.，SanDiego，CA；Higgins，D.G.及Sharp，P.M.(1989)CABIOS 5：151-153；Myers，E.W.及Muller W.(1988)CABIOS 4：11-17；Robinson，E.D.，1971，Comb.Theor.11：105；Santou，N.，Nes，M.(1987)Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath，P.H.A.及Sokal，R.R.(1973)Numerical Taxonomy the Principles and Practice ofNumerical Taxonomy，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.及Lipman，D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730。
优选通过在具有至少20个位置的比较窗上比较两个最佳比对序列来测定“序列一致性百分比”，其中对于两个序列最佳比对而言，相较于参考序列(其不包含添加或缺失)，比较窗中多核苷酸或多肽序列的部分可包含20％或20％以下，通常5％至15％，或10％至12％的添加或缺失(也即间隙)。如下计算该百分比：测定在两个序列中均存在的一致核酸碱基或氨基酸残基的位置数得到匹配位置数，用匹配位置数除以参考序列中位置总数(也即窗尺寸)且将结果乘以100得到序列一致性百分比。
变体也可(或替代性地)与天然基因或其部分或补体实质上同源。这些多核苷酸变体能够在中等严格条件下与天然存在的编码天然抗体的DNA序列(或互补序列)杂交。
适合的“中等严格条件”包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗；在50℃-65℃、5×SSC下杂交过夜；随后在65℃下洗涤两次历时20分钟，每次用2×、0.5×及0.2×SSC(含有0.1％SDS)。
如本文中所用，“高严格条件”或“高严格性条件”为如下条件：(1)采用低离子强度及高温来洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交期间采用变性剂，诸如甲酰胺，例如含0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯啶酮的50％(v/v)甲酰胺/含750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)，42℃；或(3)在42℃下采用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×登哈特溶液(Denhardt′s solution)、超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS及10％硫酸葡聚糖，洗涤为在42℃下于0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中及在55℃下50％甲酰胺，随后为由在55℃下含有EDTA的0.1×SSC组成的高严格性洗涤。本领域技术人员应认识到如何视需要调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度及其类似因素的所需因素。
本领域技术人员应了解由于遗传密码子的简并性，因此存在许多编码如本文所述的多肽的核苷酸序列。一些这些多核苷酸与任何天然基因的核苷酸序列均具有最小同源性。然而，本发明特别涵盖因密码子使用差异而不同的多核苷酸。此外，包含本文中所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明的范畴内。等位基因为内源性基因，其因一或多个突变，诸如核苷酸的缺失、添加和/或取代而改变。所得mRNA及蛋白质可能(但不一定)具有改变的结构或功能。可使用标准技术(诸如杂交、扩增和/或数据库序列比较)鉴别等位基因。
可使用化学合成、重组方法或PCR获得本发明的多核苷酸。化学多核苷酸合成的方法在本领域中熟知且无需在本文中详述。本领域技术人员可使用本文提供的序列及商业DNA合成器以产生所需DNA序列。
对于使用重组方法制备多核苷酸，如本文进一步论述，可将包含所需序列的多核苷酸插入适合载体中，且该载体又可引入至适合宿主细胞中以便复制及扩增。可通过在本领域中已知的任何手段将多核苷酸插入宿主细胞中。通过直接吸收、内吞作用、转染、F-匹配或电穿孔引入外源多核苷酸来转化细胞。引入后，外源多核苷酸可以未整合载体(诸如质粒)形式维持在细胞内或整合于宿主细胞基因组中。如此扩增的多核苷酸可通过本领域中熟知的方法与宿主细胞分离。例如参见Sambrook等人，(1989)。
或者，PCR使DNA序列复制。PCR技术在本领域中熟知且描述于美国专利第4,683,195号；第4,800,159号；第4,754,065号；及第4,683,202号，以及PCR：The Polymerase Chain Reaction，Mullis等人编，BirkauswerPress，Boston(1994)中。
可通过使用在适当载体中的分离DNA且将其插入适合宿主细胞中来获得RNA。当细胞复制且DNA转录至RNA中时，则可使用本领域技术人员所熟知的方法(例如Sambrook等人，(1989)所阐述)分离RNA。
适合克隆载体可根据标准技术来构建，或可选自大量在本领域中可得的克隆载体。尽管所选克隆载体可根据要使用的宿主细胞而变化，但适用克隆载体一般将具有自我复制能力，可具有特定限制性内切酶的单一靶标，和/或可携有可用于选择含有载体的纯系的标志的基因。适合实例包括质粒及细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA、及穿梭载体(诸如pSA3及pAT28)。这些及许多其他克隆载体可得自供应商，诸如BioRad、Stratagene及Invitrogen。
表达载体一般为含有本发明多核苷酸的可复制多核苷酸构建物。意味表达载体必须在宿主细胞中作为游离基因体，或作为染色体DNA的主要部分可复制。适合表达载体包括(但不限于)例如质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒)、粘粒，及WO 87/04462中公开的表达载体。载体组分一般可包括(但不限于)以下的一或多种：信号序列；复制起点；一或多个标志基因；适合转录控制元件(诸如启动子、增强子及终止子)。为了表达(也即翻译)，通常还需要一或多个翻译控制元件，诸如核糖体结合位点、翻译起始位点及终止密码子。
可通过许多适当手段中任意者，包括电穿孔、采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质进行转染；微粒轰击；脂质体转染；及感染(例如其中载体为诸如牛痘病毒的感染物)将含有相关多核苷酸的载体引入宿主细胞中。引入载体或多核苷酸的选择通常宿主细胞的特征而定。
本发明还提供包含任何本文所述的多核苷酸的宿主细胞。任何能够过度表达异源DNA的宿主细胞均可用于分离编码相关抗体、多肽或蛋白质的基因的目的。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括(但不限于)COS、Hela细胞及CHO细胞。还参见例如WO 87/04462。适合的非哺乳动物宿主细胞包括原核细胞(诸如大肠杆菌或枯草杆菌(B.subtillis))及酵母(诸如酿酒酵母(S.cerevisae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)或乳酸克鲁维氏酵母(K.lactis))。宿主细胞的cDNA表达量优选为宿主细胞中相应相关内源性抗体或蛋白质(若存在)的约5倍、更优选10倍、甚至更优选20倍。通过例如免疫测定或FACS实现特异性结合A1-40的宿主细胞的筛选。可鉴别过度表达相关抗体或蛋白质的细胞。
以下实施例进一步说明本发明，而不应被视为进一步限制。贯穿本发明全文所引用的所有图、表及所有参考文献、专利及公开专利申请的内容均以全文引用的方式明确并入本文中。
实施方案
实施例1：muMabJC18的产生
制备
A.免疫原
使用Pierce Imject Immunogen EDC试剂盒，用mcKLH(目录号77622)使得自R&D systems的重组人类Dkk-1(rhuDkk-1)(目录号1096-DK/CF，对应于C端与10X His标签融合的人类Dkk-1的aas2-266)结合至KLH。KLH结合蛋白通过Genovac GmbH制备且用作产生次纯系JC9H3(JC18)的融合的免疫原。
SEQ ID NO：1人类Dkk1-(10His)aa序列
(呈粗斜体字体氨基酸表示经纯化蛋白质的实际N端)
MALGAAGATRVFVAMVAAALGGHPLLGVSA
Figure BPA00001497441300821
LNSVLNSNAIKNLPPPLG
GAAGHPGSAVSAAPGILYPGGN KYQTI DNYQPYPCAEDEECGTDEYCA
SPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICVSSDQNH
FRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRT TLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSD
CASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEG
LSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRHHHHHHHHHH
SEQ ID NO：2人类Dkk1-(10His)nt序列
(核苷酸序列，其中呈粗斜体字体的核苷酸仅为当R&D不提供序列信息时对序列的评估)
ATGGCTCTGGGCGCAGCGGGAGCTACCCGGGTCTTTGTCGCGATGG
TAGCGGCGGCTCTCGGCGGCCACCCTCTGCTGGGAGTGAGCGCCA
CCTTGAACTCGGTTCTCAATTCCAACGCTATCAAGAACCTGCCCCCA
CCGCTGGGCGGCGCTGCGGGGCACCCAGGCTCTGCAGTCAGCGCC
GCGCCGGGAATCCTGTACCCGGGCGGGAATAAGTACCAGACCATTG
ACAACTACCAGCCGTACCCGTGCGCAGAGGACGAGGAGTGCGGCAC
TGATGAGTACTGCGCTAGTCCCACCCGCGGAGGGGACGCAGGCGT
GCAAATCTGTCTCGCCTGCAGGAAGCGCCGAAAACGCTGCATGCGT
CACGCTATGTGCTGCCCCGGGAATTACTGCAAAAATGGAATATGTGT
GTCTTCTGATCAAAATCATTTCCGAGGAGAAATTGAGGAAACCATCAC
TGAAAGCTTTGGTAATGATCATAGCACCTTGGATGGGTATTCCAGAA
GAACCACCTTGTCTTCAAAAATGTATCACACCAAAGGACAAGAAGGTT
CTGTTTGTCTCCGGTCATCAGACTGTGCCTCAGGATTGTGTTGTGCT
AGACACTTCTGGTCCAAGATCTGTAAACCTGTCCTGAAAGAAGGTCA
AGTGTGTACCAAGCATAGGAGAAAAGGCTCTCATGGACTAGAAATAT
TCCAGCGTTGTTACTGTGGAGAAGGTCTGTCTTGCCGGATACAGAAA
GATCACCATCAAGCCAGTAATTCTTCTAGGCTTCACACTTGTCAGAGA
CAC
B.免疫及杂交瘤产生
以50微克/剂/小鼠的KLH结合rhuDkk-1蛋白使Balb/c小鼠腹膜内免疫。重复此剂量3次历经4周时段。在融合前2天及1天，使小鼠接受50μg蛋白质的最终免疫加强(final boost)。将脾脏淋巴细胞与非分泌型sp2/0骨髓瘤细胞株融合且进行HAT选择，如先前所述(Galfre及Milstein，MethodsEnzymol 733-46(1981))。回收分泌Dkk1特异性IgG的杂交瘤，次克隆且使用下述测定来检测。
Dkk-1特异性(ELISA测定)
A.检测
使用以下基于ELISA的方法检测Dkk-1特异性抗体。将rhuDkk-1蛋白(R&D systems目录号1096DK/CF)于涂布缓冲液(Sigma碳酸盐/碳酸氢盐涂布缓冲液(pH 9.6)，目录号C-3041，根据制造商说明书构成)稀释至1μg/ml。向Nunc Maxisorp 96孔盘中每孔添加100μl Dkk-1，且在4℃下培育过夜。在室温下，以250微升/孔的洗涤缓冲液(含0.05％(v/v)Tween-20(Sigma目录号P2287)、无Ca/Mg++的dPBS(Sigma目录号D8537))洗涤各孔4次，接着以200微升/孔的阻断缓冲液(含1％PVA(Sigma目录号363170)(重量/体积)的dPBS(Sigma目录号D8537))阻断2小时。接着通过快速倾析移除阻断缓冲液。通过连续2倍连续稀释于阻断缓冲液中来稀释抗体且以每孔100μl涂覆于各盘。在室温下培育各盘1小时且接着如上所述进行洗涤。
通过添加对抗体物质具有特异性的二抗来测定测试抗体与Dkk的结合。当测试鼠类抗体时，使用100微升/孔的HRP结合山羊抗小鼠IgG(H&L)，其以1比4000稀释于阻断缓冲液(Jackson ImmunoResearch目录号115-035-146)中。当测试人源化抗体时，使用100微升/孔的HRP结合山羊抗人类IgG F(ab′)2，其以1比4000稀释于阻断缓冲液(JacksonImmunoResearch目录号109-035-097)中。在室温下培育此类盘30分钟，接着如上所述洗涤2次。每孔添加100μl新鲜制备的底物(KPL ABTS过氧化酶底物，2组分，目录号50-62-00，根据制造商说明书制备)，且使其显色。显色后，测量在405nm及490nm下的盘吸光率。以在两种波长下吸光率之差的形式呈现吸光率值。JC18显示结合于rhuDkk-1，达5μg/ml。
B.结合于其他人类Dkk同系物的特异性
使用上述ELISA方案，但还以重组人类Dkk3(R&D systems目录号1118-DK/CF)及Dkk4(R&D systems目录号1269-DK/CF)涂布各盘来评估JC18结合于其他人类Dkk蛋白的能力。JC18显示与人类Dkk-4的弱结合且不结合于人类Dkk-3，达5μg/ml。
表2
  JC 18(ng/ml)   人类DKK-1(OD)   人类DKK-3(OD)   人类DKK-4(OD)
  5000   2.07215   0.0289   0.5088
  1250   2.06405   0.0244   0.3366
  31   1.934   0.0226   0.24585
  8   1.42005   0.02255   0.14735
  2   0.7559   0.02065   0.07895
  0.5   0.2986   0.02325   0.0431
  0.125   0.11785   0.02265   0.0325
  0.03   0.0593   0.02345   0.02715
C.物种交叉反应性
使用上述ELISA方案，但也以重组大鼠Dkk-1(R&D systems目录号4010-DK/CF)、小鼠Dkk-1(R&D systems目录号1765-DK/CF)、小鼠Dkk-2(R&D systems目录号2435-DK/CF)及小鼠Dkk-4(R&D systems目录号3105-DK/CF)涂布各盘来评估JC18结合于其他物种Dkk蛋白的能力。JC18显示：(1)与小鼠及大鼠Dkk-1的结合类似于与人类Dkk-1的结合，达5μg/ml；(2)不结合于小鼠Dkk-2，达5μg/ml；及(3)与小鼠Dkk-4的弱结合，达5μg/ml。
克隆及测序
使用QIAshredder离心柱使一百万个杂交瘤细胞均质化且根据来自QIAGEN的RNAeasy Mini试剂盒提取全部RNA。使用来自Invitrogen的SuperScript III RT试剂盒合成cDNA。使用来自Novagen的小鼠IgG引物组(IgG-Primer Sets)(其由用于克隆小鼠IgG重链基因及小鼠κ或λ轻链的简并引物组成)克隆Dkk-1抗体的可变区。PCR循环条件如下：在94℃下历时2分钟，1个循环；在94℃下历时30秒，五个循环，在44℃下历时30秒及在68℃下历时60秒；随后在94℃下历时30秒，25个循环；在54℃下历时30秒及在68℃下历时60秒。将所得PCR产物克隆于来自Invitrogen的Topo-TA克隆载体中且加以测序。通过对所克隆抗体序列及自腹水产生的初始抗体进行质谱(MS)分析进行直接比较来确认所克隆的抗体序列。
下文提供JC18野生型(小鼠)单克隆抗体的可变区的轻链及重链的核苷酸序列及预测氨基酸序列。
SEQ ID NO：3JC18轻链可变区nt序列
GACATTGTGTTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGG
CAGAGGGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTGATGACTT
TGGCTTAGTTTTATGAACTGGTTCCAACAGAAACCAGGACAGCCACC
CAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAAGCAGGGATCCGGGGTCCCTG
CCAGGTTTAGGGGCAGTGGGTCTGGGTCAGACTTCAGCCTCACCATC
CATCCTGTGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGT
AAGGAGGTTCCTCCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAA
AA
SEQ ID NO：4JC18轻链可变区aa序列
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDDFGISFMNWFQQKPGQPPK
LLIYAASKQGSGVPARFRGSGSGSDFSLTIHPVEEDDTAMYFCQQSKEV
PPTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：5JC18轻链可变区CDR1nt序列
AGA GCC AGC GAA AGT GTT GAT GAC TTT GGC ATT AGT TTT ATG
AAC
SEQ ID NO：6JC18轻链可变区CDR1aa序列
RASESVDDFGISFMN
SEQ ID NO：7JC18轻链可变区CDR2nt序列
GCT GCA TCC AAG CAG GGA TCC
SEQ ID NO：8JC18轻链可变区CDR2aa序列
AASKQGS
SEQ ID NO：9JC18轻链可变区CDR3nt序列
CAG CAA AGT AAG GAG GTT CCT CCC ACG
SEQ ID NO：10JC18轻链可变区CDR3aa序列
QQSKEVPPT
SEQ ID NO：11JC18重链可变区nt序列
GAAGTGAAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAG
GGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAATT
ATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTG
GGTCGCATCCATTAGTGGTGGTGGTGACACCTACTATCCAGACAGTG
TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGTCAGGAACATCCTC
TACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTA
CTGTGCAACATCCCTTGAGAACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAG
GAACCTCAATCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO：12JC18重链可变区aa序列
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWV
ASISGGGDTYYPDSVKGRFTISRDNVRNILYLQMSSLRSEDTAMYYGATS
LENYAMDYWGQGTSITVSS
SEQ ID NO：13JC18重链可变区CDR1nt序列
AAT TAT GCC ATG TCT
SEQ ID NO：14JC18重链可变区CDR1aa序列
NYAMS
SEQ ID NO：15JC18重链可变区CDR2nt序列
TCC ATT AGT GGT GGT GGT GAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG
AAG GGC
SEQ ID NO：16JC18重链可变区CDR2aa序列
SISGGGDTYYPDSVKG
SEQ ID NO：17JC18重链可变区CDR3nt序列
TCC CTT GAG AAC TAT GCT ATG GAC TAC
SEQ ID NO：18JC18重链可变区CDR3AA序列
SLENYAMDY
实施例2：产生及测试经由muMabJC18突变获得的人源化抗Dkk-1单克降 抗体(huMabJC18)
人源化抗体及其变体的结合亲和力测定
此实例中所用的一般方法：
A.纯系表征中所用的表达载体
抗体Fab片段的表达是在类似于以下文献中所述者的IPTG诱导性lacZ启动子控制下进行：Barbas(2001)Phage display：a laboratory manual，ColdSpring Harbor，NY，Cold Spring Harbor Laboratory Press pg.2.10.VectorpComb3X，然而修饰包括添加及表达以下额外结构域：IgG2a人类免疫球蛋白的人类κ轻链恒定结构域及CHI恒定结构域。Igγ-2链C区，蛋白质保藏编号P01859；免疫球蛋白κ轻链(智人)，蛋白质保藏编号CAA09181
Figure BPA00001497441300862
B.小规模Fab制备
如下进行96孔盘中Fab的小规模表达。以用Fab文库转化的大肠杆菌为起始物，挑选群落以接种母盘(琼脂LB+安比西林(50μg/ml)+2％葡萄糖)与运作盘(2毫升/孔，96孔/盘，含有1.5mL LB+安比西林(50μg/ml)+2％葡萄糖)。使两个盘均在30℃下生长8-12小时。在4℃下储存母盘，且在5000rpm下集结运作盘的细胞，且用1mL LB+安比西林(50μg/ml)+1mM IPTG再悬浮以诱导Fab表达。
在30℃下表达5小时的时间后通过离心收集细胞，接着再悬浮于500μL缓冲液HBS-EP(100mM HEPES缓冲液(pH 7.4)，150mM NaCl，0.005％P20)中。通过一个冷冻(-80℃)接着解冻(37℃)的循环来实现HBS-EP再悬浮细胞的溶解。在5000rpm下离心细胞溶胞物30分钟以使细胞碎片与含有Fab的上清液分离。使用96孔Multiscreen HTS滤板(Millipore，目录号MSFBN6B50)过滤上清液。接着将上清液注入BIAcore等离子共振装置中以获得各Fab的亲和力信息。自母盘恢复出表达Fab的纯系以将DNA测序且用于如下所述的大规模Fab制造及详细表征。
C.大规模Fab制备
为获得详细动力学参数，使Fab表达且从大培养物纯化。以5mL来自所选Fab表达大肠杆菌纯系的过夜培养物接种含有200mL LB+安比西林(50μg/ml)+2％葡萄糖的锥形瓶。在30℃下培育纯系直至实现1.0的OD550nm为止，且接着通过以200ml LB+安比西林(50μg/ml)+1mM IPTG置换培养基加以诱导。在30℃下表达5小时的时间后，通过离心使细胞集结，接着再悬浮于10mL PBS(pH 8)中。通过两个冷冻/解冻(分别在-80℃及37℃)循环实现细胞溶解。
将细胞溶胞物的上清液载入以PBS(pH 8)平衡的Ni-NTA超流琼脂糖(Qiagen，Valencia.CA)柱上，接着以5管柱体积的PBS(pH 8)洗涤。以PBS(pH8)+300mM咪唑使个别Fab洗脱于不同部分中。将含有Fab的部分汇集且于PBS中透析，接着通过ELISA定量，随后进行亲和力表征。
D.全抗体制备
为表达全抗体，将重链及轻链可变区克隆于哺乳动物表达载体中且使用脂质转染胺转染至HEK 293细胞中以便短暂表达。
使用标准方法，用蛋白质A纯化抗体。
BIAcore测定：
通过使用配备有CM5感测器晶片(BIAcore AB，Uppsala，Swede)的BlAcore3000TM表面等离子共振(SPR)系统(BIAcore Inc.，Piscataway，NJ)测定huMabJC18对人类、小鼠或大鼠Dkk1的亲和力。为进行huMabJC18-人类Dkk1相互作用分析，通过huMabJC18与三个流槽(Fc2、Fc3及Fc4)的胺偶合产生反应表面。根据供应商说明书以N-乙基-N′-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化CM5晶片。将huMabJC18IgG稀释于10mM乙酸钠(pH 4.0)中且以30μg/ml的浓度注射至活化的晶片上。
使用穿过个别晶片通道的可变流动时间，实现一系列抗体密度：200-800反应单位(RU)。接着用山羊Fab2抗人类Fc(Cappel 55053)使IgG及参考表面饱和以防止Dkk-1非特异性结合于晶片表面。接着以乙醇胺阻断晶片。在25℃下，用由HBS-EP(0.01M HEPES(pH 7.4)、0.15NaCl、3mMEDTA、0.005％表面活性剂P20)+2mg/ml BSA+2mg/ml CM聚葡萄糖构成的BIAcore运作缓冲液执行测定。以100μL/min注射以30.9nM经纯化人类Dkk1(R&D Systems)蛋白起始的五成员三倍连续稀释液历时1.5分钟，且监测解离历时8小时。通过使用BIAevaluation程序将数据拟合至1∶1朗缪尔(Langmuir)结合模型(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L.Petersson，B.(1994).Methods Enzymology 6.99-110)而同时获得动力学结合速录(kon)及解离速率(koff)。以koff/kon形式计算平衡解离常数(KD)值。
为进行huMabJC18与小鼠或大鼠Dkk-1的相互作用分析，通过预固定于CM5晶片表面的山羊Fab2抗人类Fc将低含量huMabJC18(通常100-400个反应单位)捕捉于个别流槽上。不含有人源化抗体的山羊Fab2抗人类Fc饱和流槽充当参考通道。分别使用70.1nM或30.2nM作为三倍连续稀释的上限浓度，在晶片上滴定小鼠或大鼠Dkk-1(R&D Systems)。在100μL/min下监测缔合期及解离期分别历时90秒及30分钟。所有实验的捕捉表面均用两次30秒的0.75mM H3PO4脉冲来再生，但人类Dkk-1实验中所用的胺偶合huMabJC 18表面除外(其不再生)。
双参考(double-reference)结合反应且使用BiaEvaluation v.4.0软体全拟合至简单模型。由动力学速率常数的商(KD＝koff/kon)推断亲和力。
对于测定huMabJC18变体对人类Dkk1的结合及解离速率的筛选测定，使用BIAcore或ProteOn XPR36(BioRad，Inc.)系统。对于BIAcore测定，根据供应商说明书将生物素标记的人类Dkk1捕捉于SA(抗生蛋白链菌素)BIAcore晶片上。将生物素标记的人类Dkk-1蛋白稀释于HBS-EP中，且以5μg/mL的浓度注射至晶片上。选择穿过个别晶片通道的流动时间以实现约500-600反应单位(RU)的抗原密度。使用HBS-EP缓冲液作为运作缓冲液。在高温(37℃)下以30μl/min注射经过滤的重组大肠杆菌细胞溶胞物历时1分钟，允许有1至5分钟解离期。以8mM NaOH+8％乙醇使表面再生。在实验开始时及又在测定结束时注射阳性对照物Fab(纯系24)两次以评估再现性。
对于ProteOn测定，注射连续稀释倍数凭经验测定的生物素标记的人类Dkk-1历时1分钟以在ProteOn NLC Neutravidin感测器晶片的五个通道上产生不同程度的固定(150-3000RU)。保持第六通道未经改变充当参考表面。在高温(37℃)下以20μl/min注射含重组Fab的经过滤大肠杆菌溶菌液历时50秒。运作缓冲液是由PBS+1mg/ml BSA+0.005％Tween-20组成。ProteOn经构型使得各注射液在五个Dkk-1通道各者以及参考通道上方流动，且可同时注射六个Fab样品。监测Fab自Dkk-1表面的解离历时20分钟。注射8％EtOH、8mM NaOH 30秒来再生晶片表面。将纯系24Fab用作对照物。不同配体通道之间各纯系在缔合期间的结合量，及解离速率极其一致。
huMabJC18及其变体对Dkk1的结合亲和力
huMabJC18的氨基酸序列如SEQ ID NO：40(HC可变区)及SEQ ID NO：42(LC可变区)所述。使用如上所述的BIAcore测定的huMabJC18IgG对Dkk-1的结合亲和力于下表3中展示。
表3：huMabJC18IgG对来自人类、小鼠及大鼠的Dkk1的结合亲和力
  Dkk-1物种   kon(1/Ms)   koff(1/s)   T1/2(h)   KD(nM)
  人类   ＞1.3×106＊   ＜2.0×10-6^   ＞96.27   ＜0.002
  小鼠   ＞1.3×106＊   ＜3.9×10-5^   ＞4.94   ＜0.03
  大鼠   ＞1.3×106＊   2.1×10-4   0.92   ＜0.1
*结合速录过快以致不能测量
^解离速率过慢以致不能测量
KD＝koff/kon
T1/2(s)＝ln2/koff(1/s)
huMabJC18变体的CDR的氨基酸序列于下表4中展示。表4中所示的所有氨基酸取代均相对于huMabJC18的序列来描述。huMabJC18及其变体的hDkk-1结合亲和力还于表4中展示。
表4：如在37℃下通过BIAcore或Proteon分析所测定的huMabJC18及其变体的氨基酸序列及动力学数据
Figure BPA00001497441300901
Figure BPA00001497441300911
Figure BPA00001497441300921
Figure BPA00001497441300931
Figure BPA00001497441300941
Figure BPA00001497441300951
在表4中，#表示在该位置的间隙；n.d.，未测定。
CDR为延伸CDR，其包括Kabat与Chothia定义，但CDR H1为Kabat定义。将氨基酸残基依次编号(参见SEQ ID NO：28关于H2及H3行中残基的编号，及SEQ ID NO：20关于L1、L2及L3行中残基的编号)。所有纯系均具有构架且CDR H1序列与huMabJC18一致。KD＝koff/kon。以筛选模式测定所有koff值，但加下划线者是通过整体分析流经捕捉于BIAcore晶片或ProteOn表面上的IgG的hDkk-1浓度系列来获得。因此加下划线的KD值通过测量kon而以实验方式测定。其他KD值为基于1×106(1/Ms)的kon评估值的理论值。因为所有经分析的纯系的结合速录均极快且因此扩散受限(＞1×106，且过快以致不能精确测量)，所以亲和力极可能甚至高于所示值。
huMabJC18与Dkk同系物的相互作用
针对结合于其他可得Dkk同系物(包括人类Dkk-3、人类Dkk-4、小鼠Dkk-2及小鼠Dkk-4(R&D Systems))来分析HuMabJC18。结果于表5中概述。
表5：huMabJC18与Dkk同系物的相互作用
 Dkk同系物   kon(1/Ms)   koff(1/s) T1/2(小时)   KD(nM)
 hDkk-3   -   - -   不结合
 hDkk-4   1.50×104   1.72×10-4 1.12   11
 mDkk-2   1.80×104   1.69×10-4 1.14   9
 mDkk-4   ＞1.3×106*   ＜3.9×10-5^ ＞4.94   ＜0.03
*结合速录过快以致不能测量
^解离速率过慢以致不能测量
如上所述使用山羊Fab2抗人类Fc作为预固定捕捉试剂进行对huMabJC18与Dkk-1同系物的相互作用分析。在五倍连续稀释中，分别使用76.3nM、88.8nM或32.3nM作为上限浓度，在晶片上滴定人类Dkk-4、小鼠Dkk-2或小鼠Dkk-4。人类Dkk-3显示无特异性结合反应。
JC18Dkk-1结合抗体
如在25℃下通过BIAcore分析所测定的小鼠抗体JC18与人类、小鼠或大鼠Dkk1(R&D System)的结合亲和力于下表6中展示。对于此测定，使多株抗小鼠IgG与BIAcore晶片胺偶合。抗Dkk-1抗体JC18为6.53μg/mL，且在5μl/min下经捕捉1分钟。以50-100μl/min注射人类、小鼠或大鼠Dkk-1的五倍连续稀释液(R&D Systems；0.4-250nM)历时1分钟。监测解离历时3-5分钟。用两次30秒的100mM H3PO4脉冲使晶片再生。
表6：如在25℃下由BIAcore测定，小鼠抗体JC18结合于人类、小鼠
或大鼠Dkk-1的动力学数据。
 Dkk-1物种   Kon(1/Ms)   Koff(1/s)   Kd(nM)
 人类   3.18×106   2.07×10-4   0.65
 小鼠   1.74×106   2.54×10-3   1.5
 大鼠   3.8×106   2.75×10-3   0.72
huMabJC18的序列
SEQ ID NO：19huMabJC18轻链可变区nt序列
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTG
GCGAGCGGGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACG
ACTTCGGCATCAGCTTCATCAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAG
GCCCCCAGACTGCTCATCTACGCCGGCAGCAAGCAGGGCAGCGGC
ATCCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCC
TGACCATCTCCAGCCTCGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGC
CAGCAGCTGAAAGAGGTGCCCCCCACCTTCGGCGGTGGGACCAAG
GTGGAAATCAAA
SEQ ID NO：20huMabJC18轻链可变区aa序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDDFGISFINWYQQKPGQAPRL
LIYAGSKQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQLKEVPP
TFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：21huMabJC18轻链可变区CDR1nt序列
CGGGCCAGCGAGAGCGTGGACGACTTCGGCATCAGCTTCATCAAC
SEQ ID NO：22huMabJC18轻链可变区CDR1aa序列
RASESVDDFGISFIN
SEQ ID NO：23huMabJC18轻链可变区CDR2nt序列
GCCGGCAGCAAGCAGGGCAGC
SEQ ID NO：24huMabJC18轻链可变区CDR2aa序列
AGSKQGS
SEQ ID NO：25huMabJC18轻链可变区CDR3nt序列
CAGCAGCTGAAAGAGGTGCCCCCCACC
SEQ ID NO：26huMabJC18轻链可变区CDR3aa序列
QQLKEVPPT
SEQ ID NO：27huMabJC18重链可变区nt序列
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGC
GGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCA
GCTACGCCATCAGCTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGG
AATGGGTGGCCAGCGTGAGCGGCACCGGCCTGGGCTTCCAGACCTA
CTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAAC
GCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGG
ACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCTCCCTGGAAAACTACGCCTTC
GACTACTGGGGCCAGGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO：28huMabJC18重链可变区aa序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAISWVRQAPGKGLEWV
ASVSGTGLGFQTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY
CATSLENYAFDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：29huMabJC18重链可变区CDR1nt序列
AGCAGCTACGCCATCAGC
SEQ ID NO：30huMabJC18重链可变区CDR1aa序列
SSYAIS
SEQ ID NO：49huMabJC18重链可变区CDR1aa序列(Kabat)
SYAIS
SEQ ID NO：50huMabJC18重链可变区CDR1aa序列(Chothia)
GFTFSSY
SEQ ID NO：31huMabJC18重链可变区CDR2nt序列
AGCGTGAGCGGCACCGGCCTGGGCTTCCAGACCTACTACCCCGACA
GCGTGAAGGGC
SEQ ID NO：32huMabJC18重链可变区CDR2aa序列
SVSGTGLGFQTYYPDSVKG
SEQ ID NO：51huMabJC18重链可变区CDR2aa序列(Chothia)
SVSGTGLGFQTY
SEQ ID NO：33huMabJC18重链可变区CDR3nt序列
TCCCTGGAAAACTACGCCTTCGACTAC
SEQ ID NO：34huMabJC18重链可变区CDR3aa序列
TSLENYAFDY
SEQ ID NO：52huMabJC18重链可变区CDR3aa序列(短)
SLENYAFDY
有前导序列的SEQ ID NO：35huMabJC18重链nt序列
Figure BPA00001497441300981
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTG
CAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTC
ACCTTCAGCAGCTACGCCATCAGCTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCA
AGGGCCTGGAATGGGTGGCCAGCGTGAGCGGCACCGGCCTGGGCT
TCCAGACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAG
CCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTG
CGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCTCCCTGGAAA
ACTACGCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCACGGTCACCGTCTC
CTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGC
TCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCA
AGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGC
TCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA
GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTT
CGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAAC
ACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGCTGTGTCGAGTGCC
CACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTC
CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG
TCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCA
GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACA
AAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCG
TCCTCACCGTCGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAA
GTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCATCCTCCATCGAGAAAACCA
TCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCT
GCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACC
TGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGG
AGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCAT
GCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGG
ACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAT
GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGT
CTCCGGGTAAA
有前导序列的SEQ ID NO：36huMabJC18重链aa序列(*Δa突变(A329S、P330S)以粗斜体展示)
Figure BPA00001497441300991
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF
SSYAISWVRQAPGKGLEWVASVSGTGLGFQTYYPDSVKGRFTISRDNA
KNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATSLENYAFDYWGQGTTVTVSSASTKG
PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP
AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC
VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEV
QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLNGKEYK
CKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
糖基化位点：HC、N296。
有前导序列的SEQ ID NO：37huMabJC18轻链nt序列
Figure BPA00001497441300992
Figure BPA00001497441300993
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCT
GAGCCTGAGCCCTGGCGAGCGGGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCAG
CGAGAGCGTGGACGACTTCGGCATCAGCTTCATCAACTGGTATCAGC
AGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTCATCTACGCCGGCAGCAA
GCAGGGCAGCGGCATCCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGG
CACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTCGAACCCGAGGACTTCG
CCGTGTACTACTGCCAGCAGCTGAAAGAGGTGCCCCCCACCTTCGG
CGGTGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCT
GTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGC
CTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAG
TACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGA
GAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGC
AGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTA
CGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAG
AGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
有前导序列的SEQ ID NO：38huMabJC18κ轻链aa序列
Figure BPA00001497441301001
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESV
DDFGIS FINWYQQKPGQAPRLLIYAGSKQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTI
SSLEPEDFAVYYCQQLKEVPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL
KSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY
SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
huMabJC18的同型：IgG2(Δa)*、κ
huMabJC18的异型：G2(n-)、Km3
无前导序列的SEQ ID NO：39huMabJC18重链nt序列
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGC
GGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCA
GCTACGCCATCAGCTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGG
AATGGGTGGCCAGCGTGAGCGGCACCGGCCTGGGCTTCCAGACCTA
CTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAAC
GCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGG
ACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCTCCCTGGAAAACTACGCCTTC
GACTACTGGGGCCAGGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCA
CCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCAC
CTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTC
CCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCG
GCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC
CTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGA
CCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGA
CAAGACAGTTGAGCGCAAATGCTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCA
GCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACC
CAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTG
GTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT
ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGA
GGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTC
GTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCT
CCAACAAAGGCCTCCCATCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACC
AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCC
GGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAA
AGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCG
ACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG
TGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT
GCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
无前导序列的SEQ ID NO：40huMabJC18重链aa序列(*Δa突变(A329S、P330S)以粗斜体展示)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAISWVRQAPGKGLEWV
ASVSGTGLGFQTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY
CATSLENYAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALG
CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSN
FGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFP
PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR
EEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP
Figure BPA00001497441301011
IEKTISKTKG
QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN
NYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSPGK
糖基化位点：HC、N296。
无前导序列的SEQ ID NO：41huMabJC18轻链nt序列
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTG
GCGAGCGGGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACG
ACTTCGGCATCAGCTTCATCAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAG
GCCCCCAGACTGCTCATCTACGCCGGCAGCAAGCAGGGCAGCGGC
ATCCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCC
TGACCATCTCCAGCCTCGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGC
CAGCAGCTGAAAGAGGTGCCCCCCACCTTCGGCGGTGGGACCAAG
GTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCC
GCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCC
TGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTG
GATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGC
AGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCT
GAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCA
CCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGG
AGAGTGT
无前导序列的SEQ ID NO：42huMabJC18κ轻链aa序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDDFGISFINWYQQKPGQAPRL
LIYAGSKQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQLKEVPP
TFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKV
QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC
EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
实施例3：huMabJC18的体外功能活性：在基于细胞的功能测定中测定JC18 在Wnt活性中的作用
选择含有在具有TCF结合位点的TK启动子控制下的萤光素酶报导基因的稳定U2OS细胞株(U2OS TF)用于基于细胞的功能测定。当以Wnt3a条件培养基处理细胞时，经由Wnt信号传导路径活化启动子。此活化由Dkk-1拮抗。Wnt信号传导的Dkk-1介导抑制又可通过添加Dkk-1中和mAb来逆转。
具体而言，JC18为以高亲和力结合于小鼠及人类Dkk-1的单克隆抗体。在U2OS TOPFlash细胞中检验其逆转Dkk-1抑制Wnt 3a信号传导的能力。U2OS细胞得自ATCC且以TOPFlash质粒(Upstate)、TCF-萤光素酶报导构建物稳定转染。将细胞在37℃、5％CO2下维持于补充有10％胎牛血清、1％Pen Strep及2mM谷氨酰胺的McCoys 5A培养基中。将U2OS TOPFlash细胞以每平方公分31,250个细胞的密度接种于常规生长培养基中，且培育过夜。以含0.25μg/ml rhDkk-1蛋白或载剂(PBS、Gibco)及不同浓度的Dkk-1mAb的Optimem(Gibco)处理细胞。在过夜培育之后，以报导基因溶解缓冲液(Promega)溶解细胞且使用萤光素酶试剂(Promega)定量萤光素酶表现。
HuMabJC18，即完全人源化抗Dkk-1mAb在功能测定中以1.3nM的IC50显示良好功效(表7)。
表7：在基于细胞的功能测定中，Dkk-1抗体的IC50值
  抗体   IC50
  huMabJC18   1.3nM
实施例4：体内评价muMabJC18及小鼠嵌合体的骨胳功效
使用雌性成年C57BL/6小鼠评价测试Dkk-1抗体的体内骨胳作用。在24℃下，以12小时光/12小时暗循环来圈养动物，且允许其自由获取水及商业膳食(Purina laboratory Rodent Chow 5001，Purina-Mills，St.Louis，MO)。根据Pfizer动物管理许可方案来进行实验，且根据实验动物管理及使用ILAR(实验动物研究院(Institute of Laboratory Animal Research))指南来供养动物。以载剂或抗体通过每周一或两次经口管饲历时数周来处理小鼠。在研究结束时，对小鼠施以安乐死且收集血清以便测量游离抗体及游离Dkk-1含量。另外，收集骨胳样品以便通过周边定量计算机断层摄影术(pQCT)、微CT及组织形态测定法(histomorphometry)来评估骨量及骨形成的变化。
由pQCT(Stratec XCT Research M；Norland Medical Systems，FortAtkison，WI，USA)用5.40版软体扫描右股骨。在远端附近2.5mm处(距生长板(疏松骨富集部位)～1.5mm)取各远端股骨(distal femur)干骺端的1mm厚的横截面，且在远端附近8mm处(皮质骨富集部位)取各股骨骨干的1mm厚的横截面，体元尺寸为0.10mm。测定全部骨胳、骨小梁且皮质骨的以体积计含骨量、密度及面积。
由微CT机(Micro-CT40，Scanco Medical，Auenring 6-8，Bassersdorf，Switzerland)，用3.1版软体扫描右股骨。在远端附近2.3至3.1mm处(距生长板～1.3至2.1mm)取远端股骨干骺端横截面(总共50片，厚度各自为16μm，总厚度＝0.8mm)以便测定骨小梁体积。
处理左股骨以便对疏松骨进行组织形态评估(histomorphometricassessment)。简言之，使左股骨在梯度浓度的乙醇中脱水且未脱钙便包埋于甲基丙烯酸甲酯中。使用Reichert-Jung Polycut S切片机(Leica Corp.，Heidelberg，Germany)将远端股骨的纵向切面切为4μm及10μm厚。以经改善的马森三色染色(modified Masson′s Trichrome stain)将4μm切片染色且10μm切片保持不染色。所有组织形态测量均使用影像分析系统(Osteomeasure，Inc.，Altanta，GA)在远端股骨干骺端的疏松骨组织中、在生长板-骨骺接合点附近0.375mm与0.875mm之间的区域中进行。以4μm厚经染色切片以骨组织面积的百分比测量疏松骨体积及以全部疏松骨周长的百分比测量破骨细胞表面。计算小梁数目、厚度及间隔。在10μm厚的未染色切片中获得基于萤光染料的骨形成指数，包括含双萤光染料标记的疏松骨表面(矿化表面)的百分比、矿物质沈积率、骨形成速率(骨表面及组织体积指示物)。
完整小鼠模型中的研究方案及结果
A.抗小鼠Dkk-1单克隆抗体(JC18)在完整小鼠模型中的作用
对雌性成年C57BL/6小鼠每周一次经口给予载剂或小鼠IgG1或JC18(10、30及60mg/kg)历时6周。在尸体解剖时自各小鼠收集右股骨与左股骨。使用pQCT分析右股骨且使用组织形态测量法分析左股骨。远端股骨的总BMD在所有剂量的JC18处理下均显著提高(图1A)。JC18在小鼠中在60mg/kg剂量下也显著提高骨形成速率(图1B)。
B.Dkk-1单克隆抗体的小鼠嵌合体(小鼠嵌合体-嵌合人类-小鼠抗体)在完整小鼠模型中的作用
以0、0.001、0.01、0.1、1、3、10及30mg/kg小鼠嵌合体每周处理4个月的完整雌性C57BL/6小鼠历时6周。以5mg/kg小鼠嵌合体每周处理一组小鼠两次历时6周。使用pQCT分析各动物的右远端股骨。如图2中所示，相较于载剂处理，小鼠嵌合体在1至30mg/kg的剂量下提高总BMD。
SEQ ID NO：43嵌合抗体(hu-mu)：嵌合huMabJC 18Lvar-小鼠κaa序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDDFGISFINWYQQKPGQAPRL
LIYAGSKQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQLKEVPP
TFGGGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINV
KWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTC
EATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO：44嵌合抗体(hu-mu)：嵌合huMabJC18Hvar-小鼠IgG1恒定aa序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAISWVRQAPGKGLEWV
ASVSGTGLGFQTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY
CATSLENYAFDYWGQGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTL
GCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSST
WPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKP
KDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQF
NSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAP
QVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQ
PIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSH
SPGK
SEQ ID NO：45嵌合抗体(hu-mu)：huMabJC18Lvar nt序列
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTG
GCGAGCGGGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACG
ACTTCGGCATCAGCTTCATCAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAG
GCCCCCAGACTGCTCATCTACGCCGGCAGCAAGCAGGGCAGCGGC
ATCCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCC
TGACCATCTCCAGCCTCGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGC
CAGCAGCTGAAAGAGGTGCCCCCCACCTTCGGCGGTGGGACCAAG
GTGGAAATCAAA
SEQ ID NO：46嵌合抗体(hu-mu)：小鼠κnt序列
GCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACGATCCAGTGAGCA
GTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTA
CCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGAC
AAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGC
ACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGA
ACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCGACTCACAAGACATCAACTT
CACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG
SEQ ID NO：47嵌合抗体(hu-mu)：huMabJC18Hvar nt序列
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGC
GGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCA
GCTACGCCATCAGCTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGG
AATGGGTGGCCAGCGTGAGCGGCACCGGCCTGGGCTTCCAGACCTA
CTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAAC
GCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGG
ACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCTCCCTGGAAAACTACGCCTTC
GACTACTGGGGCCAGGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO：48嵌合抗体(hu-mu)：小鼠IgG1CH1-CH2-CH3nt序列
GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGC
TGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGC
TATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTC
CAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTACA
CTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGA
GACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTG
GACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATG
TACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAA
GGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGG
TAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTA
GATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGC
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C.卵巢切除的小鼠模型
对雌性成年C57BL/6小鼠进行假手术或卵巢切除(OVX)手术以便评价测试Dkk-1抗体在模拟停经后骨量流失的雌激素缺乏情况中的骨胳作用。在24℃下，以12小时光/12小时暗循环来圈养动物，且允许其自由获取水及商业膳食(Purina laboratory Rodent Chow 5001，Purina-Mills，St.Louis，MO)。根据Pfizer动物管理许可方案来进行实验，且根据实验动物管理及使用ILAR(实验动物研究院)指南来供养动物。以载剂或抗体通过每周一或两次经口管饲历时数周来处理小鼠。在研究结束时，对小鼠施以安乐死且收集骨头样品以便通过周边定量计算机断层摄影术(pQCT)、微CT及组织形态测定法评估骨量变化。这些测量的方法已于先前章节中描述。
研究方案及结果
在OVX小鼠模型中，抗小鼠Dkk-1单克隆抗体(JC18)预防雌激素缺乏所诱导的骨量流失。
对4个月大的雌性C57BL/6小鼠进行假手术或卵巢切除(OVX)手术且手术次日开始以载剂或JC18(0.3、1、3、10及30mg/g，每周)或JC18(15mg/kg，每周两次)处理8周。如所预期，经载剂处理的小鼠在OVX后8周如由总BMD显著降低所证明展现骨质减少(图3)。如由pQCT在远端股骨处所测量，相较于对OVX小鼠的载剂处理，JC18剂量回应地使总BMD提高7％至20％。在每周两次用15mg/kg JC18处理的小鼠中，总BMD不仅高于以载剂处理的OVX小鼠，而且也维持在假控制级，表明在此剂量及给药方案下，JC18完全预防OVX小鼠骨质减少的发展(图3)。
实施例5：huMabJC18在完整大鼠模型中提高骨量
使成年雌性大鼠每周一次接受静脉内施用0、0.1、1、10或100mg/kghuMabJC18历时6周。在处理后2周，在以1、10及100mg/kg huMabJC18处理的大鼠中，血清骨钙蛋白(骨形成生物标志)分别提高30％、26％及25％，且其与处理后4周的对照值无差别。血清CTX(骨吸收标志)在处理之后不显示一致变化。血清生物标志的这些变化支持huMabJC18对骨胳的合成代谢作用。在以10mg/kg及100mg/kg剂量的huMabJC18处理的大鼠中，远端股骨BMD及股骨干BMC(骨矿物质含量(bone mineral content))分别显著提高11％及16％或7％及8％，表明这些动物疏松骨及皮质骨量增加。
实例6：了解与靶向可溶抗原Dkk-1(Wnt信号传导路径的拮抗剂)的单克降 抗体疗法有关的系统动力学的方法：应用机制性临床前药物动力学/药效学 (PK/PD)模型选择人类首次使用(FIH)IgG2抗体的起始剂量。
骨质疏松症为特征在于低骨密度的骨疾病，其使得骨胳易碎且随后引起骨折。大多数骨质疏松症药物疗法(包括双磷酸盐、抑钙素、HRT及选择性雌激素受体调节剂(SERM))通过降低骨吸收来预防骨量流失。使患有骨质疏松症的患者的骨量恢复为医学需要未实现的领域。
Dkk-1结合于LRP5/6受体及Kremen-1/2辅受体促进受体复合物内化，使得Wnt信号衰减(Diarra等人，(2007)Nat Med 13：156-163)。
关于Wnt路径在维持骨量中的重要作用的遗传证据来自对Wnt受体LRP5中活化与失活突变的鉴别。LRP5失活使得骨量降低且引起体染色体隐性基因病症：人类的骨质疏松症假神经胶质瘤(OPPG)症候群(Gong等人，(2001)Cell 107：513-523)及LRP5剔除小鼠的类似表型(Holmen等人，(2004)J Bone Miner Res 19：2033-2040)。
具有HBM的个体的骨折风险显著降低。
预期中和Dkk-1抗体因由成骨细胞的骨形成增加而增加骨量，且因此预防骨量疏松性骨折。HuMabJC18为用于治疗骨质疏松症以及其他病症的人源化原型抗Dkk-1单克隆抗体。其以高亲和力(Kd＜100pM)体外结合人类、小鼠、大鼠及食蟹猴Dkk-1。其增加完整小鼠的骨量且使卵巢切除的小鼠(停经后骨量流失的模型)的骨质减少骨胳恢复骨量(Li等人，2009；准备中的手稿)。
尽管大量抗体处于开发中，但仅有少数使用临床前数据来预测抗体的临床药物动力学或有效剂量的报导公开(Lobo等人，(2004)J Pharm Sci93：2645-2668；Agoram，(2009)Br J Clin Pharmacol 67：153-160)。当预期线性PK时，异速生长动力模型常用于抗体药物动力学(PK)的种间类推(interspecies scaling)(Wang等人，(2008)Clin Pharmacol Ther 84：548-558)。然而，不同于小分子，抗体与其靶标的相互作用常影响抗体的PK。药物动力学(PK)与药效学(PD)紧密关联且了解PK/PD需要关于抗体、靶标及抗体-靶标相互作用的知识。最高值来自使PK与PD反应关联以预测既定剂量后的药物暴露及作用(Agoram等人，(2007)Drug Discov Today 12：1018-1024)。机构性PK/PD模型化因此提供预测抗体的人类PK及临床上有效剂量的合理及有效手段。
在此研究中，在大鼠与猴中同时表征抗体huMabJC18靶标(Dkk-1)使能够深刻了解反应的药物动力学及药效学。其伴随关于以下的知识：用于在临床中机构性预测PK/PD的健康个体相对于患病个体中的靶标含量、靶标转换率及抗体-靶标缔合/解离速率。
研究目的在于比较及对比通过以下计算获得的抗Dkk-1IgG2抗体(huMabJC18)的预测临床起始剂量：(1)毒物学物种中无不利作用量(NOAEL)，(2)使用经典达夫方程序(Duff equation)，最小的预期生物作用量(MABEL)，及(3)使用靶标介导药物处置(TMDD)模型的MABEL。
使用大鼠及猴中的临床前安全性研究来测定NOAEL。将100倍安全因数应用于NOAEL以产生推荐的起始剂量。使用经典达夫方程序来计算受体占用率且MABEL定义为产生10％受体占用的剂量。在大鼠及猴研究中使用TMDD模型拟合游离Dkk-1及抗体随时间变化的浓度。将模型外推至人类且MABEL估计为得到Dkk-1降低10％的剂量。
测试物质
在Genovac(Germany)通过以全长重组人类Dkk-1蛋白(R&D Systems，Minneapolis，MN)使Balb/C小鼠免疫来制得单株抗Dkk-1抗体。使用文库扫描诱变策略(Pons等人，2009；准备中的手稿)使单一小鼠IgG1/κ同型抗体(JC18)人源化及亲和力成熟。相较于亲本小鼠抗体，人源化抗体(huMabJC18)对于人类与小鼠Dkk-1均展现＞100倍的亲和力提高。
内部(in-house)克隆及表达Dkk-1动力学研究中所用的HDkk-1-V5-6His(人类)及rDkk-1-TEV-V5-6His(大鼠)，且通过TOPFLASH测定定性为功能性(Ai等人，2005)。
BIAcore实验
使用配备有CM5感测器晶片的BIAcore 3000TM系统(BIAcore AB，Uppsala，Sweden)来分析huMabJC18与人类或小鼠或大鼠或食蟹猴Dkk-1的间的相互作用。在相互作用分析期间监测缔合期及解离期。双参考结合反应且使用BiaEvaluation v.4.0软体全拟合至简单模型。由动力学速率常数之商(Kd＝koff/kon)推断亲和力。
动物研究
所有动物研究根据实验动物管理及使用委员会(IACUC)批准的动物管理及使用方案进行。
大鼠中的Dkk-1动力学研究
以静脉内单次剂量形式向雄性Sprague-Dawley(Sprague Dawley)大鼠(n＝3只/剂)施用1、5、10及100μg/kg的hDkk-1-V5-6His。在给药前，及在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8及24小时收集系列血液样品。以静脉内单次剂量形式向雄性Sprague-Dawley大鼠(n＝3只/剂)施用100μg/kg rDkk-1-TEV-V5-6His。在给药前，及在给药后0.083、0.17、0.33、0.5、1、2、4及6小时收集系列血液样品(300μl)。通过离心获得血清且储存在-20℃下直至分析。
大鼠中的药物动力学/药效学研究
在雌性Sprague-Dawley大鼠(n＝40，在研究持续的过程中体重为250-350g，Charles River Laboratories，Wilmington，MA)中进行实验。每周一次通过静脉内途径向雌性Sprague-Dawley大鼠(n＝8只/剂)施用0.1、1、10及100mg/kg的HuMabJC18历时连续六周。向一组大鼠(n＝8)施用载剂对照物(20mM组氨酸(pH 6.5)，含140mM NaCl)。
在给药前，及在第一次给药后1、3、8、24、48、72、168、240、336、408、504、576、672、744、840、912及1008小时自各治疗组收集系列血液样品。通过离心获得血清且储存在-20℃下直至分析Dkk-1及huMabJC18浓度。
大鼠中的骨密度测定
为评估抗Dkk-1mAb治疗对骨量的作用，由周边定量计算机断层摄影术(pQCT，Stratec XCT Research M，Norland Medical Systems，Fort Atkinson，WI)用5.40版软体扫描切离的右股骨。在远端附近2.5mm处(疏松骨富集部位)扫描各远端股骨干骺端的1mm厚的横截面，体元尺寸为0.10mm。以体积计的总骨密度(BMD)如先前所述(Ke等人，2001年)来测定。
食蟹猴中的药物动力学/药效学研究
遵照美国动物福利法案(U.S.Animal Welfare Act)，及实验动物管理及使用指南(实验动物研究院，1996)中规定的条件进行此研究的动物管理及实验程序。
在此研究中使用2至5岁大、重量在3.2kg与5.2kg之间的五只雄性及五只雌性食蟹猴(食蟹食蟹猴(Macaca fascicularis))(Charles River Primates，BioResearch Facility，Houston，Texas)。将动物(n＝1只/性别/组)归入5组。以单次剂量形式通过缓慢静脉内注射向4组(1只雄性猴及1只雌性猴)施用0.1、1、10或100mg/kg剂量的HuMabJC18。以相同方式向其余组施用载剂对照物。
在治疗前，及在给药后0.1、0.5、1、3、8、24、48、72、168、240、336、408、504、576及672小时经由股骨静脉穿刺自各治疗组收集全血样品(～2ml)。通过离心自全血分离血清，之后在-80℃下储存样品直至分析。稍后分析样品的Dkk-1及huMabJC18浓度。
游离Dkk-1测定
根据制造商说明书验证Assay Designs(Ann Arbor，Michigan)人类Dkk-1ELISA系统(目录号900-151)以测量人类血清中的总Dkk-1，但具有以下微小改变：使用R&D Systems(Minneapolis，MN)重组人类Dkk-1(目录号1096-dk-10/cf)作为测定标准物。
为测定大鼠及猴血清中的游离Dkk-1(未结合于治疗抗体)，使用抗Dkk-1抗体捕捉未结合的血清Dkk-1，且根据试剂盒说明书使用来自AssayDesigns人类Dkk-1ELISA系统(目录号900-151)的试剂进行其余步骤，但具有以下改变：分别使用R&D Systems(Minneapolis，MN)重组大鼠Dkk-1(目录号4010-dk-10/cf)及人类Dkk-1(目录号1096-dk-10/cf)作为大鼠及猴测定的测定标准物。
来自健康个体及患病个体的人类血清样品购自BioreclamationInc.(Nassau，NY)。
V5标记的Dkk-1测定
通过ELISA方法测定V5标记的Dkk-1的血清浓度。将样品于PBS缓冲液(含有3％BSA及0.05％Tween-20)中稀释至1/4至1/40的最终最小所需稀释度(MRD)范围，用以减小背景且使浓度能够处于线性测定范围内(测定盘上～0.195-25ng/ml)。将hDkk-1-V5-6His或rDkk-1-TEV-V5-6His校正及品质控制标准物稀释于与样品相同的基质组合物中。在4℃下以50μl 2μg/ml抗V5抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)过夜涂布96孔免疫吸附测定盘(Nalgene Nunc，Rochester，NY)，接着以含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗涤，接着用含有3％BSA及0.05％Tween-20的PBS缓冲液阻断。将经稀释样品及标准物添加至盘(50微升/孔)中且在震荡下在室温下培育1小时。接着以两个洗涤循环洗涤此类盘，随后与辣根过氧化酶结合的抗Dkk-1二次抗体(来自Assay Designs试剂盒，Ann Arbor，MI)一起培育1小时。在洗涤后，通过以3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)受质(KPL，Gaithersburg，MD)进行呈色反应约10分钟使盘显色，接着用2M H2SO4终止。在450nm的波长下测定吸光率OD读数之后，减去背景空白基质OD值(减去650nm)。在SoftMax Pro 4.8中使用V5标记的Dkk-1校正标准物，使用4参数拟合，以均匀加权来构建标准曲线。据此标准曲线插入V5标记的Dkk-1于未知样品中的血清浓度。
骨钙蛋白测定
通过使用大鼠-MIDTM骨钙蛋白ELISA试剂盒(Rat-MIDTMOsteocalcin ELISA Kit)(Nordic Bioscience Diagnostics A/S，Herlev，Denmark)测量血清骨钙蛋白浓度。
大鼠PK/PD样品的游离/部分游离huMabJC18抗体测定
通过电致化学发光(ECL)方法，使用Meso Scale Discovery(MSD)系统(Gaithersburg，MD)来测定huMabJC18的血清浓度。将样品于含有1％BSA的PBS缓冲液中稀释至1/2至1/150的最终最小所需稀释度(MRD)，随后额外10-4000倍稀释以减小背景干扰且处于线性测定范围内(测定盘上～5-1300ng/ml)。将HuMabJC18校正及品质控制标准物稀释于与样品相同的基质组合物中。在4℃下以5μg/ml hDkk-1-V5-6His(内部产生)过夜涂布96孔MSD高结合盘(目录号L11XB-3)。在倒置该盘以移除涂料之后，以含1％BSA的PBS阻断各盘。将经稀释样品及标准物添加至盘(25微升/孔)中且在震荡下在室温下培育2小时。接着以三个洗涤循环用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗涤各盘，随后与MSD标记钌(ruthinylated)的山羊抗人类IgG抗体(目录号R32AJ-1)一起培育1小时。在洗涤后，将含表面活性剂的MSD读取缓冲液T(4x)(目录号R92TC-1)添加至各孔中，且立即在MSD Sector成像器6000上读取。自样品值减去背景空白基质值。在MSDDiscovery Workbench 3.0版软体中使用抗Dkk-1人源化抗体校正标准物，使用4参数拟合，以1/y2加权来构建标准曲线。据此标准曲线插入抗Dkk-1人源化抗体于未知样品中的血清浓度。
猴样品的游离/部分游离huMabJC18抗体测定
通过ELISA方法测定huMabJC18的血清浓度。将样品于PBS缓冲液(含有3％BSA及0.05％Tween-20)中稀释至1/4至1/100的最终最小所需稀释度(MRD)，接着额外10-500倍稀释以减小背景干扰且处于线性测定范围内(测定盘上约8-100ng/ml)。将HuMabJC18校正及品质控制标准物稀释于与样品相同的基质组合物中。在4℃下以1.5μg/ml hDkk-1-V5-6His(内部产生)过夜涂布96孔免疫吸附测定盘，且接着在以含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗涤的后以PBS(含有3％BSA及0.05％Tween-20)阻断。将经稀释样品及标准物添加至盘(100微升/孔)中且在震荡下在室温下培育1小时。接着以三个洗涤循环洗涤此类盘，随后与生物素标记的小鼠抗人类IgG2(Invitrogen，Carlsbad，CA)一起培育1小时，之后添加辣根过氧化酶结合的抗生蛋白链菌素(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，且将盘再培育30分钟。在洗涤后，通过以3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)受质进行呈色反应～10分钟使盘显色，接着用2M H2SO4终止。在450nm的波长下测定吸光率OD读数之后，减去背景空白基质OD值(减去650nm)。在SoftMaxPro 4.8中使用抗Dkk-1人源化抗体校正标准物，使用4参数拟合，以均匀加权来构建标准曲线。据此标准曲线插入抗Dkk-1人源化抗体于未知样品中的血清浓度。
抗药物抗体(ADA)测定
以桥联配体结合测定(LBA)，使用Meso Scale Discovery(MSD)平台(Gaithersburg，MD)测量大鼠及猴中针对huMabJC 18的抗药物抗体(ADA)的存在。将以测定稀释剂(3％BSA，0.05％Tween 20，PBS)1∶10稀释的血清样品(25μl)添加至涂有含1μg/ml huMabJC18的pH 9.6碳酸盐缓冲液的96孔MSD高结合盘中。在室温下培育1小时之后，将盘洗涤且将25μl标记钌的huMabJC18以1μg/ml添加至各孔中，且在室温下再培育1小时。将盘洗涤且在添加150μl MSD读取缓冲液(2×)之后，在MSD Sector成像器6000上读取盘。
非房室模型药物动力学分析
使用WinNonLin企业版计算机软体5.2版(Pharsight Corp.，Cary，NC)进行药物动力学分析。通过对数血浆浓度时间概况的线性回归来测定终末阶段速率常数(kel)。由0.693/kel计算终末消除半衰期(t1/2)。Cmax、Tmax及Cmin值直接得自所记录的数据。使用线性梯形法则计算血清-浓度时间曲线下面积(AUC0-tlast)且使用Kel外推至无限(AUC0-inf.)。使用关系剂量/AUC0-inf计算清除率(CL)。使用关系CL/kel计算分布容积(Vc)。Cave经计算为AUC(第1给药时 间间隔)/第1给药时间间隔的tlast。
在大鼠的Dkk-1动力学研究中，针对h-Dkk-1提出的消除半衰期值为在5、10及100μg/kg剂量下测定的半衰期值的平均值。可得的数据点不足以计算在1μg/kg剂量下的消除半衰期值。对于r-Dkk-1，由在100μg/kg(所施用的唯一剂量)下对3只大鼠的未处理合并分析(
Figure BPA00001497441301131
pool analysis)来计算消除半衰期。
药物动力学/药效学分析
进行个别大鼠及猴抗体浓度相对于时间数据的初步非房室分析(Jusko，1992)，其公开抗体的非线性药物动力学。使用机构性靶标介导药物处置模型(Mager及Jusko，2001)描述大鼠及猴中huMabJC18的PK/PD概况(图5)。简言之，TMDD模型假定抗体(huMabJC18)对靶标(Dkk-1)的可饱和高亲和力结合造成可观察的非线性药物动力学特性。中心室中的抗体(体积V1)结合于(速率常数，kon)游离Dkk-1以形成抗体-Dkk-1受体复合物。复合物在形成后可解离(速率常数，koff)或抗体-Dkk-1复合物可消除(速率常数kel，复合物)。未结合的抗体也可以一级速率(kel)直接自中心室消除。扩展该模型以解释非特异性组织部位的抗体分布，其由速率常数k12及k21描述。
以以下微分方程组的形式实施模型：
Figure BPA00001497441301132
Figure BPA00001497441301133
Figure BPA00001497441301134
Figure BPA00001497441301135
Figure BPA00001497441301137
Figure BPA00001497441301138
其中CmAb血清等于huMabJC18的游离浓度，Kd＝koff/kon且
[mAb總]＝CmAb血清+C複合物且[T arg et總]＝C標靶+C複合物。
以在DOS外壳中、在Windows XP下运作的V版NONMEM软体，利用6.6版Compaq Visual Fortran来求微分方程系统的数值解。将ADVAN 8TOL＝3用于此刚性问题(stiff problem)。用t＝0时单位剂量及通过设置F3(游离Dkk-1)为t＝0时估计的游离Dkk-1浓度初始化游离Dkk-1室。使用四级多项式模型表征载剂猴中Dkk-1反应的可变性：
Y＝A*TIME^4-B*TIME^3+C*TIME^2-D*TIME+DKK0，其中A、B、C及D为自载剂数据测定的常数且在模型中固定，且Dkk0等于给药前(t＝0小时)Dkk-1的浓度。此是在NONMEM中的$ERROR区块中实施，其具有药物的相加效应。
使用简单的余弦函数表征载剂大鼠中Dkk-1反应的可变性：F＝基线+振幅*Cos((时间-峰值时间)*(2*π/24))(Chakraborty等人，(1999)JPharmacokinet Biopharm 27：23-43)，其具有药物的相乘效应。
由以下评估配适度(goodness-of-fit)：NONMEM中$COV次常式提供的参数估计值及参数相关矩阵的精密度、目测加权剩余针对时间及预测浓度的随机散布，以及目测所预测的个别个体相对于实际浓度-时间曲线在任一时点系统偏误的缺乏。
使用TMDD模型在Berkeley-Madonna(8.3.9版，University of California，Berkeley，CA)中进行骨质疏松症患者的Dkk-1及huMabJC18浓度的模拟。人类模拟中所用的参数展示于表14中。经由异速生长原则，使用以下形式的简单动力模型，自大鼠及猴类推人类PK、靶标及复参数：Y＝aBWb，其中Y为相关参数，BW为体重，a为异速生长系数且b为异速生长指数。为类推半衰期，假设b等于0.25，对于消除及吸收速率常数(kel及kel)，假设b等于-0.25，且对于分布容积，假设b等于1(Wang等人，2008)。
来源于此三种方法的预测临床起始剂量的估计值相差5个数量级以上。最高起始剂量来源于NOAEL计算(1mg/kg)。最低起始剂量来源于采用达夫方程序的MABEL计算(0.00003mg/kg)。来源于采用TMDD模型的MABEL计算的起始剂量处于此范围之中值附近(0.03mg/kg)。
BIAcore数据
表8中展示使用BIAcore表面结合技术测定，huMabJC18相对于人类、小鼠、大鼠及猴Dkk-1的体外Dkk-1结合动力学的概述。HuMabJC18以高亲和力(Kd分别＜2pM、＜30pM及＜100pM)结合人类、小鼠及大鼠Dkk-1。在大多数情况下，结合速录(kon)过快且解离速率(koff)过慢以致BIAcore仪器不能精确测量。HuMabJC18也结合于食蟹猴Dkk-1，但由于Dkk-1样品的杂质，因此无法测定Kd。
表8：huMabJC18的体外Dkk-1结合动力学
Figure BPA00001497441301151
a结合速录过快以致不能精确测量
b解离速率过慢以致不能精确测量
c由于质量输送限制及不纯样品，因此不可测定结合速录
d未测定
停经前、停经后、骨质减少及骨量疏松女性中的Dkk-1表达
表9中展示来自停经前(n＝50)、停经后(n＝50)、骨质减少(n＝50)及骨量疏松(n＝50)女性的血清样品中的Dkk-1浓度。在所测试的样品集中，停经前与停经后女性之间不存在显著的Dkk-1浓度差异，表明年龄不影响Dkk-1浓度。停经前女性的Dkk-1含量(平均2.2ng/ml)相较于来自骨质减少女性的样品(T评分-2.2，平均Dkk-1为9.0ng/ml)及骨量疏松女性的样品(T评分-3.0，平均Dkk-1为10.5ng/ml)之间存在显著差异(p＜0.01)。将这些值包括于PK/PD模型中以预测huMabJC18在骨量疏松女性中的有效剂量。
表9：停经前、停经后、骨质减少及骨量疏松雌性个体中的Dkk-1浓度
Figure BPA00001497441301152
a正常T评分＞-1.0，骨质减少定义为T评分＜-1.0且＞-2.5，骨质疏松症定义T评分为-2.5或-2.5以下。
大鼠中的Dkk-1靶标动力学：
通过静脉内快速施用，将V5-His标记的人类(h-)Dkk-1及大鼠(r-)Dkk-1以1、5、10及100μg/kg(h-Dkk-1)或100μg/kg(r-Dkk-1)施用雄性Sprague-Dawley大鼠。在所测试的剂量范围中h-Dkk-1动力学为线性的。h-Dkk-1的平均消除半衰期为22.3±6.4分钟(图6)且r-Dkk-1的平均消除半衰期为34分钟。
大鼠药物动力学及药效学
图7中展示在每周向雌性Sprague-Dawley大鼠静脉内施用之后，平均游离/部分游离huMabJC18浓度相对于时间的概况。表10中展示非房室药物动力学参数。huMabJC18的药物动力学在剂量范围中为非线性的，在直达10mg/kg的剂量下，AUC超比例(supra-proportional)增大。此表明相较于较高剂量(10mg/kg及100mg/kg)，在较低剂量(0.1mg/kg及1mg/kg)下清除速率较高。在稍后的时间点，一些大鼠中的血清huMabJC18浓度低于预期或低于测定的定量限制。使用定性抗药物抗体(ADA)测定来证实这些样品中的大鼠抗huMabJC18抗体，且从分析及曲线移除来自该大鼠的数据。
表10：在静脉内施用huMabJC18a之后，Sprague-Dawley大鼠中游离/部分游离huMabJC18浓度的非房室药物动力学参数
Figure BPA00001497441301161
a以平均值±标准差形式报导的值
bTmax＝每只大鼠1小时，但100mg/kg组的Tmax＝一只大鼠3小时
cCave＝AUC(第1给药时间间隔)/第1给药时间间隔的tlast(由于稀疏取样，因此并非对于研究的全部持续时间)。
dCmin＝第1给药时间间隔(0-168小时)。
在图8A-8E中将同一研究中的平均游离Dkk-1浓度绘曲线。游离Dkk-1浓度在向大鼠施用huMabJC18之后迅速降低。除最低剂量外，在所有剂量下游离Dkk-1浓度在研究持续时间中均保持受抑制。
食蟹猴药物动力学及药效学
将食蟹猴中个别游离/部分游离血清huMabJC18浓度相对于时间的概况展示于图9A及9B中，且将食蟹猴中huMabJC18的非房室药物动力学参数展示于表11中。huMabJC18的药物动力学在所测试的剂量范围内为非线性的，在较低剂量下观察到较高清除速率及较短半衰期值。在该剂量范围内，huMabJC18在食蟹猴中的半衰期在1-13天的范围内。
表11：在单次静脉内给药(n＝1只/性别/剂量组)之后，食蟹猴中游离/部分游离huMabJC18浓度的平均非房室药物动力学参数
Figure BPA00001497441301171
an＝1，由于A U C(0-inf)＞120％A U C(0-tlast)。
b因自不同时间间隔计算而报导的个别t1/2值。
给药后在1mg/kg组中在约14天及在10mg/kg组中一只猴中在约21天暴露损失可能归因于形成抗huMabJC18抗体，且自分析及曲线中移除这些数据。然而，此不可使用定性ADA测定来证实。
同一研究中食蟹猴中游离Dkk-1的平均血清浓度于图10A-10E中展示。游离Dkk-1浓度在给予huMabJC18之后迅速降低。Dkk-1抑制的持续时间为剂量依赖性且在较低剂量下恢复至基线。在最高剂量下，Dkk-1在整个给药时间间隔中保持受抑制。
PK/PD模型化
使用机构性TMDD模型(Mager及Jusko，2001)同时拟合在猴与大鼠中随时间变化的游离huMabJC18及游离Dkk-1的浓度(图5)。选择此模型，因为其解释抗体非靶标特异性消除、靶标合成及转换，及复合物形成及消除。将大鼠中huMabJC18及Dkk-1的所观察到的PK/PD概况相对于所预测的PK/PD概况展示于图7及图8A-E中，且将猴中此类概况展示于图9A-B及图10A-E中。来自大鼠及猴的TMDD模型的参数估计值展示于表12中。
表12：猴及大鼠中经估计的PK/PD参数
Figure BPA00001497441301172
a以t1/2＝0.693/kel形式计算的二次参数
bkon及koff为在先前的运作中测定，其中$COV无法在NONMEM中获得。在最终运作中，将kon及koff估计值固定于这些值且获得$COV。c以Kd＝Koff/Kon形式计算的二次参数
来自大鼠及猴中PK/PD模型的分布容积(V1)及半衰期的估计值与大鼠及猴中IgG2抗体的药物动力学一致(Peppard及Orlans，1980；Hinton等人，2004)。大鼠体内效能的估计值(Kd＝34.8pM)与大鼠中体外获得之值(Kd＜100pM，参见上文BIAcore数据)一致。自Dkk-1kel测定的Dkk-1半衰期估计值(猴中26分钟及大鼠中11分钟)类似于自V5-his标记的h-Dkk-1及r-Dkk-1转换研究估计之值(分别22.3分钟及34分钟，参见上文靶标动力学章节)。复合物的半衰期(自复合物Kel估计)为介于抗体huMabJC18与靶标Dkk-1的估计半衰期之间的中间值。
大鼠中的骨生物标志：
除靶标Dkk-1之外，还在大鼠研究中定量其他生物标志，包括骨钙蛋白(已确立的骨形成生物标志)及骨密度(BMD)(经验证骨质疏松症生物标志)(例如参见Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of MineralMetabolism(Rosen CJ编)第152-163页及第174-179页，American Society forBone and Mineral Research，Washington D.C)。在大鼠研究中第一次给药后1.5及2.5周骨钙蛋白浓度相对于剂量的曲线展示于图11中。在1毫克/公斤/周剂量组中在第一次给药后2.5周及在10及100毫克/公斤/周剂量组中在给药后1.5周，骨钙蛋白浓度存在统计学上显著(p＜0.05)提高。
如表13中所示，相较于载剂对照组，在以10及100毫克/公斤/周huMabJC18处理的大鼠中，总骨密度分别显著提高11％及16％。
表13：在以huMabJC18a处理六周的雌性大鼠的远端股骨的总骨密度(BMD)变化
Figure BPA00001497441301191
a数据以平均值±SE的形式表述。
*：相对于载剂p＜0.05；**：相对于载剂p＜0.01。
通过静脉内注射以不同剂量的huMabJC18每周处理雌性大鼠历时6周。在研究结束时测量BMD。
人类PKPD模拟
使用基于机制的PK/PD(TMDD)模型(图5)模拟huMabJC18在人类体内的PK/PD且预测治疗骨质疏松症以及其他病症的有效剂量。将IgG2抗体PK参数(非靶标介导)的文献报导值与得自猴及大鼠PK/PD模型化(表14)的Dkk-1靶标动力学及huMabJC18-Dkk-1复合物动力学的知识组合以获得关于人类PK/PD模拟的信息。
表14：人类PK/PD模拟中所用的参数估计值
Figure BPA00001497441301192
OVX小鼠疾病模型中的先前实验表明骨密度统计学上显著提高需要Dkk-1降低50％(数据未图示)。在给药时间间隔中使Dkk-1降低＞50％的huMabJC18的预测有效剂量为每月一次给予3.57mg/kg。由于关于内源性Dkk-1的动力学及对此参数的Dkk-1抑制(及因此剂量)的高敏感性的不确定性，因此与其相关的预计剂量(projected dose)具有不确定性。预测得到最小预期生物作用(MABEL)的剂量为0.03mg/kg。预测此剂量使Dkk-1含量短暂降低＜20％，接着恢复至基线。预测0.003mg/kg(MABEL的1/10)的剂量无作用。Dkk-1浓度的这些人类模拟展示于图12中且应在临床中的剂量设置中具有高价值。
预测在涵盖MABEL(0.03mg/kg)及预测的有效剂量(3.57mg/kg)的剂量范围中huMabJC18具有非线性药物动力学。这归因于TMDD且展示于图13中。
靶标了解
小鼠中的数据表明Dkk-1为骨重塑的主调控剂(Diarra等人，(2007)NatMed 13：156-163)且疾病病况(卵巢切除，OVX)小鼠中的Dkk-1基线含量为健康小鼠(内部数据)的约5倍。也已显示Dkk-1含量在患有骨胳病变的多发性骨髓瘤患者的骨髓血浆及末梢血液中提高(Tian等人，2003)。敏感性分析显示预测人类剂量的抗Dkk-1单克隆抗体(huMabJC18)对Dkk-1基线含量高度敏感。基线Dkk-1含量越高，降低Dkk-1所需的抗体浓度越大。靶标的基线含量常自先前临床测量已知，然而缺乏此关于Dkk-1的信息促使建立健康个体与患者群体(骨质减少及骨量疏松患者)中人类Dkk-1含量的参考范围，其可用于在临床发展的不同阶段进行提供更多信息的剂量预测。分析显示在骨质减少及骨量疏松女性(T评分＜-1)中的Dkk-1含量高于健康女性。
靶标配体的转换率可自数分钟至数天不同，其可对有效剂量及甚至靶标受干扰以达临床益处的潜力具有显著影响。一些配体具有跨物种的类似动力学，但对于其他配体，转换并非可预测的先验(a priori)。Meno-Tetang等人(Meno-Tetang及Lowe(2005)Basic Clin Pharmacol Toxicol 96：182-192)显示IgE转换率在小鼠中5至8小时至人类中2.7天的范围内，其显著影响抗IgE抗体的人类作用的预测。对于Dkk-1，敏感性分析证实预测剂量的抗Dkk-1单克隆抗体(huMabJC18)对Dkk-1半衰期敏感，其中靶标转换率越高，需要的抗体的摩尔浓度过量越高。自文献无法获得关于Dkk-1转换率的信息，且因此实验使用静脉内给予大鼠的V5-his标记的人类及大鼠Dkk-1内部完成。这些实验表明Dkk-1具有高转换率(对于h-Dkk-1半衰期为22.3分钟且对于r-Dkk-1半衰期为34分钟)且人类与大鼠形式的Dkk-1在大鼠体内具有类似转换率。稍后通过使用PK/PD模型化来估算给予huMabJC18的大鼠及猴体内Dkk-1半衰期来证实Dkk-1的快速转换率。
大鼠及猴中huMabJC18的PK/PD了解
在大鼠及猴研究中，huMabJC18展现非线性药物动力学，其中在较低剂量下获得较高清除率及较短消除半衰期值。此表明靶标介导药物处置(TMDD)，其中抗体与其药理学靶标的相互作用影响较低剂量下的处置(Tabrizi等人，(2006)Drug Discov Today 11：81-88.；Wang等人，(2008)ClinPharmacol Ther 84：548-558)。因为靶标的有限表达，所以此路径在较高剂量下为饱和。在靶标介导路径饱和后，典型IgG FcRn分解代谢清除机制起主要作用，其给予抗体其特征性长半衰期。对于针对细胞膜上表达的蛋白质的单克隆抗体TMDD较为常见，其中受体介导的内吞作用使得药物消除。然而，还可关于可溶靶标观察TMDD：奥马佐单抗(omalizumab)及狄诺塞麦(denosumab)为可溶靶标的抗体(分别为IgE，及NFκB的受体活化剂)，其展现非线性消除动力学(Hayashi等人，2007；Marathe等人，2008)。
由描述全身性药物浓度的PK模型(用作描述PD的强制函数)组成的经验PK/PD模型因为不解释PK与PD的相依性所以常不适于表征TMDD。Mager等人(Mager及Jusko(2001)J Pharmacokinet Pharmacodyn 28：507-532)提出描述药物PK、靶标动力学及其相互作用的单一模型。此模型解释药物分子的特异性及非特异性分布及消除以及提供解释靶标动力学的灵活性。在同时分析PK及PD的其他情况下，使用此模型来提供剂量、暴露及反应之间的直接联系(Meno-Tetang及Lowe(2005)Basic Clin Pharmacol Toxicol96：182-192)；Ng等人，(2006)Pharm Res 23：95-103.；Wu等人，(2006)J PharmSci 95：1258-1268)。在此情况下，使用TMDD模型同时拟合在以若干剂量静脉内施用huMabJC18之后大鼠及猴体内抗体huMabJC18及靶标Dkk-1浓度。该模型得到huMabJC18的非靶标介导药物动力学的估计值，其与各物种中典型IgG2药物动力学相当一致(Peppard及Orlans(1980)Immunology40：683-686；Hinton等人，(2004)J Biol Chem 279：6213-6216)。因此，大鼠中消除半衰期为2.5天且猴中消除半衰期为13.6天。分布容积约等于猴中血浆容量(0.052L/kg)，但高于大鼠中血浆容量(0.147L/kg)。
据PK/PD模型化，靶标Dkk-1的消除半衰期经估计在大鼠中为11分钟及在猴中为26分钟。此与在大鼠中测量的V5-his标记的h-Dkk1的消除半衰期(半衰期＝25分钟)呈相同数量级。huMabJC18-Dkk-1复合物的半衰期估计为介于huMabJC18半衰期与Dkk-1半衰期之间的中间值，其可能反映靶标介导清除机制。然而，靶标结合于抗体有可能干扰抗体结合于FcRn，且正内部完成研究以检验此假设。
在大鼠中，除靶标生物标志Dkk-1减少外，也观察到骨形成的生物标志(骨钙蛋白及骨密度)增加。此数据对使用huMabJC18来治疗骨胳病症(诸如骨质疏松症)给予进一步支持。
预测人类有效剂量及计算MABEL
对于单克隆抗体，正普遍认识到基于PK/PD模型化来合理选择安全的人类首次使用剂量为必需的(例如参见Publications policy and guidance：Department of Health-Publications的英国政府网站)。新参数，最小预期生物作用量(MABEL)涉及基于PK/PD模型化方法将所观察到的临床前PK/PD数据外推至临床预测。在最近欧洲管理指南(EMEA(2007)Guideline onstrategies to identify and mitigate risks for first-in-human clinical trials withinvestigational medicinal products.，(EMEA编)，London)中，在设计高风险治疗剂的人类首次使用剂量中，除无不利作用量(NOAEL)外，也已提出考虑MABEL。
为预测huMabJC18的有效剂量，用于拟合大鼠及猴中的临床前数据的机构性TMDD模型经改适用于人类PK/PD模拟。将IgG2抗体药物动力学参数(非靶标介导)的文献报导值与得自大鼠及猴PK/PD模型化的Dkk-1靶标动力学及huMabJC18-Dkk-1复合物动力学的知识组合。
使用人类Dkk-1的体外BIAcore值来测定模型中复合物的缔合及解离速率(kon及koff)。对kon及koff进行敏感性分析，且由于在人类中关于此抗体所预测的快速结合速录及缓慢解离速率，故Dkk-1抑制及因此剂量对Kd的相当大的变化不敏感。实际上，Kd值＜10pM时，预测剂量无变化。这是因为huMabJC18-Dkk-1复合物的转换率快于自受体的解离速率。在这些情况下，可避免候选物选择中的亲和力成熟步骤。
将在来自骨量疏松患者的样品中测量的平均Dkk-1基线浓度(参见结果章节)用于模拟中。假设Dkk-1在人类中具有慢于猴或大鼠的转换率。因此，使用猴及大鼠半衰期值的异速生长类推来计算人类Dkk-1半衰期。此得到Dkk-1在人类中的估计半衰期为49分钟。应注意因为Dkk-1为迅速转换的抗原，所以Dkk-1的总体抑制，及因此剂量对模拟中所用的Dkk-1半衰期值具高度敏感性。
通过异速生长类推通过猴PK/PD模型估计的复合物半衰期，预测人类中huMabJC18-Dkk-1复合物的半衰期为2.3天(kel＝0.3天-1)。人类中较短复合物半衰期通过异速生长类推通过大鼠PK/PD模型化估计的复合物半衰期来预测。然而，进行敏感性分析且Dkk-1抑制(及因此剂量)对自大鼠相对于猴预测的复合物半衰期的变化不敏感。
OVX小鼠(即停经后骨量流失模型)中的先前实验表明Dkk-1含量降低约50％与统计学上显著的骨密度提高相关(数据未图示)。因此，基于在给药时间间隔(1个月)中，需要自基线抑制＞50％的Dkk1含量，对huMabJC18进行剂量预测。在此缓解(remit)下且用上述假设，huMabJC18的预测有效剂量为每月一次皮下给予3.57mg/kg。通过模拟，预测在人类中得到最小作用(MABEL)(Dkk-1降低＜20％)的剂量为0.03mg/kg。在临床中预测非线性药物动力学(图13)，其中由于TMDD，因此在较低剂量下，huMabJC18展现较高清除率及较短半衰期。
预测人类药理学的替代性方法使用以下基于平衡-药物相互作用理论的公式来预测最大受体占用率(RO)：
RO ( % ) = [ mAb ] K d + [ mAb ] × 100
(图14，(Duff(2006)Expert Scientific Group on Phase One Clinical Trials：Final Report，Department of Health，UK，London))。使用此方法估计RO仅依赖于Kd且不考虑靶标或mAb-靶标复合物动力学。Dkk-1已显示具有高转换率且huMabJC18结合Dkk-1改变靶标的动力学(TMDD)。在这些条件下，RO通过药理学平衡方法常无法预测，且基于简单Kd的RO计算已显示对特定剂量下的RO的预测值实质上过量(Agoram(2009)Br J Clin Pharmacol67：153-160)。对于Dkk-1，使用平衡公式计算的RO估计的ED50为0.00001mg/kg，而机构性PK/PD模型估计ED50为0.01mg/kg(图14)。使用平衡计算可使得选择的剂量在临床中过低且延迟初次人体研究的进展。另一极端为在大鼠及猴中观察到的NOAEL(100mg/kg)超过靶标100％结合于抗体所需，从而无法推荐其用于提供临床起始剂量估计值。推断基于PK/PD模型的计算MABEL剂量的方法具有较大可能性预测Dkk-1且确保临床研究的安全性及效率。
观察到的NOAEL(100mg/kg)超过Dkk-1100％结合于抗体所需。另一极端为根据达夫方程序计算的MABEL可能因对Dkk-1的快速转换欠考虑而为严重低估的值。因此，这些方法在此情况下为不可接受的设置起始临床剂量的方法。相反地，TMDD模型提供临床前数据的优良表征，其表明靶标转换在测定Dkk-1结合％中的作用。因此，来源于TMDD模型的MABEL估计值(0.03mg/kg)将确保FIH研究的安全性与效率。
总之，huMabJC18为治疗骨质疏松症以及其他病症的人源化原型抗Dkk-1抗体。使用机构性TMDD模型来表征大鼠及猴中huMabJC18相对于Dkk-1浓度反应关系。此模型通过并入关于靶标表达及转换率的信息翻译为人类来预测有效剂量及MABEL。发现此机构的这些参数对剂量反应关系的影响大于对亲和力的影响。
保藏信息
申请人已将本文中命名为huMAbJC18的抗体的重链及轻链可变区保藏于美国菌种保存中心(ATCC)Manassas，VA 20110-2209U.S.A。如上文所述，huMabJC18HC可变区为保藏于2009年3月19日，且指定为ATCC保藏编号PTA-9835，而huMabJC18LC可变区保藏于2009年3月19日，且指定为ATCC保藏编号PTA-9836。这些保藏依据涉及专利程序目的的微生物保藏的国际认可的布达佩斯条约及其中(布达佩斯条约)规定的条款而进行。这些保藏将无限制保存于ATCC存放处至最近请求后30年或5年的时段或至专利有效期(时间较长者)，且若在该时段期间保藏变得无活力则被替代。不应将保藏物质的可用性视为许可在违反任何政府当局根据其专利法授予的权利下实施本发明的任何方面。前述书面说明书被视为足以使本领域技术人员能够实施本发明的所有方面。本发明的范畴不应受限于所保藏物质，因为所保藏的实施方案仅要说明本发明的某些方面，且功能等效的任何构建物均在本发明的范畴内。本文中物质的保藏并不构成承认以下：本文中的书面说明书不足以使能够实施本发明的任何方面(包括其最优选方式)，也不将其视为将申请专利范围的范畴限于其所呈现的特定说明。实际上，除本文所示及所述外的本发明的各种修改将由前述说明书而为本领域技术人员显而易见且属于随附申请专利范围的范畴。
在本文中所用的章节标题仅用于结构目的且不应被视为以任何方式限制所述标的物。应了解，在本发明教示中论述的温度、浓度、时间等之前暗含“约”，使得略微偏离及非实质性偏离落入本文的本发明教示的范畴内。在本申请中，除非另外特定规定，否则使用单数包括复数。另外，使用“包含”、“含有”及”包括”并不是要作限制。应了解，前述一般描述与随后详细描述均仅为示例性及说明性的且并不限制本发明。
本文中所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书及其类似物，及其中所引用的参考文献均在其尚未并入的程度上以全文引用的方式并入本文中。在一或多种所并入的文献及类似材料不同于本申请或与本申请抵触的情况下(包括(但不限于)所定义的术语、术语用法、所述技术或其类似者)，以本申请为准。
Figure IPA00001497440700011
Figure IPA00001497440700021
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Figure IPA00001497440700211
Figure IPA00001497440700221

Claims (18)

1.一种分离的抗体或其免疫功能片段，其特异性结合Dickkopf 1(Dkk-1)多肽并且包含抗原结合区，所述抗原结合区在Dkk-1上与单克隆抗体JC18结合相同的表位。
2.一种分离的抗体，其特异性地结合Dkk-1，其包含：含有SEQ ID NO：30、49或50所示氨基酸序列的重链可变区(VH)互补决定区1(CDR1)、含有SEQ ID NO：32或51所示氨基酸序列的VH CDR2、和/或含有SEQ ID NO：34或52所示氨基酸序列的VH CDR3，或者在VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3中包含一或多个保守性氨基酸取代的其变体。
3.权利要求2的抗体，其进一步包含：含有SEQ ID NO：22所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1、含有SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的VL CDR2、及含有SEQ ID NO：26所示氨基酸序列的VL CDR3。
4.权利要求3的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。
5.权利要求4的抗体，其中所述抗体包含：含有SEQ ID NO：42或38所示氨基酸序列的轻链，以及含有SEQ ID NO：40或36所示氨基酸序列、并且有或者无SEQ ID NO：40或36的C端赖氨酸的重链。
6.一种分离的抗体，其特异性地结合Dkk-1，其包含：含有SEQ ID NO：22所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)互补决定区1(CDR1)、含有SEQ IDNO：24所示氨基酸序列的VL CDR2、和/或含有SEQ ID NO：26所示氨基酸序列的VL CDR3，或者在VL CDR1、VH CDR2、和/或VL CDR3中包含一或多个保守性氨基酸取代的其变体。
7.一种核酸，其包含编码权利要求3的抗体或免疫活性片段的VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和/或VL CDR3的序列。
8.一种核酸，其包含编码权利要求4的抗体或免疫活性片段的VH、VL、或VH与VL两者的序列。
9.一种核酸，其包含编码权利要求5的抗体或免疫活性片段的轻链、重链、或轻链与重链两者的序列。
10.一种核酸，其包含编码权利要求6的抗体或免疫活性片段的VLCDR1、VL CDR2和/或VL CDR3的序列。
11.一种包含权利要求7至10中任一项的核酸的表达载体。
12.一种包含权利要求11的表达载体的分离的细胞。
13.一种产生抗体或其免疫活性片段的方法，其包括培养权利要求12的细胞的步骤。
14.一种组合物，其包含权利要求1至6中任一项的抗体或片段，以及药用可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
15.一种治疗或预防骨量流失的方法，其包括对有需要的患者施用有效量的权利要求1至6中任一项的抗体或片段。
16.权利要求15的方法，其中所述患者选自患有骨质疏松症、骨质减少、佩吉特病、牙周炎、类风湿性关节炎、及不活动所致的骨量流失的患者。
17.一种诱导骨量增加的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的权利要求1至6中任一项的抗体或片段。
18.一种诱导Wnt活性的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的权利要求1至6中任一项的抗体或片段。
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