CN101641373A - Dkk-1的特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明描述Dkk－1的特异性抗体，Dkk－1是促骨合成代谢的(osteoanabolic)Wnt/LRP5信号通路的抑制剂。抑制Dkk－1与LPR5结合的抗体可用于刺激骨生长的组合物中，具体来说，用于治疗如骨质疏松之类的导致骨损失的骨病的组合物中。

Description

DKK-1的特异性抗体
发明背景
(1)发明领域
本发明涉及选择性结合Dkk-1的抗体及其免疫功能片段，以及它们用于治疗多种不同疾病的用途，包括预防或治疗涉及骨量损失或刺激新骨产生的病况，以及多种非骨相关疾病。
(2)相关背景描述
骨骼疾病骨质疏松是老年人重要的发病原因。骨质疏松的特征在于骨再吸收(破坏)和骨形成之间不平衡所导致的骨损失。这种病况会导致增加的骨折(bone fracture)风险，该风险在低程度的损伤后发生。在美国，目前有约2千万人具有可检测的因骨质疏松所致的椎骨骨折。因骨折所引起的死亡在老年患者人群中并不罕见。
绝经后的老年女子患骨质疏松的风险最高，这是由于雌激素不足所致，雌激素是适当的骨维持所必需的。不足的雌激素水平会导致破坏性的破骨细胞的产生和存在时间增加，这继而会导致骨的再吸收增加。结果，发现在椎骨中平均每年有5％的骨量损失。尽管不太多见，但是骨质疏松也影响老年男子。老年男子中骨质疏松的存在可能部分也是由于循环的睾丸激素降低而引起的雌激素水平不足所致。
克服骨损失的治疗策略包括防止骨再吸收和刺激骨生长两者。大多数引起有效的骨质疏松治疗的治疗靶标都属于前者的范畴。因此，治疗/预防这种病症的首要方法在以前是使用如下的化合物抑制骨再吸收：例如双膦酸盐、雌激素、选择性雌激素受体调控剂(SERMs)和降血钙素。由于骨再吸收的抑制不能恢复骨量，因此这个方法对于已经损失了大量骨的患者来说是无效的治疗。此外，通过这种机制起作用的骨质疏松治疗的有效性在骨骼结构(skeletal anatomy)上并不一致，这是因为骨转化速度在不同位点之间不同。例如，在椎骨的脊柱骨中的骨转化速度高于长骨骨密质中；因此，骨再吸收抑制剂在增加髋骨矿物质密度(BMD)和防止髋骨骨折方面不太有效。因此，增加长骨的密质骨/骨膜骨形成和骨量的促骨合成代谢剂(osteoanabolicagent)将能解决骨质疏松治疗中未得到满足的需求，尤其是对于具有高风险的髋骨骨折的患者。
一种针对代谢紊乱(包括骨质疏松)的可能治疗靶标为低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)。LRP5属于细胞表面受体的低密度脂蛋白受体(LDLR)基因家族，其特征在于富含半胱氨酸、补体型LDLR配体结合结构域。LRP5是基于其接近骨质疏松假性神经性胶质瘤综合征(osteoporosis pseudogliomasyndrome，OPPG)位点而分离的，骨质疏松假性神经性胶质瘤综合征是一种特征为重度骨质疏松的常染色体隐性病(Hey等人Gene 216：103-111(1998)；美国专利No.6,555,654和6,545,137)。LRP5代表了骨质疏松的治疗靶标的另一证据来自于观察到了LPR5功能突变缺失会导致OPPG(Gong等人Cell107：513-523(2001))。
有趣的是，LRP5的异常表达还与高骨量特征(high bone mass trait，HBM)相关，高骨量特征是一种特点为骨量显著增加的常染色体显性人类骨骼遗传病。HMB突变的定位克隆证明，能引起功能增加的LRP5基因的G171V突变会产生HBM(参加，例如Little等人，Am.J.Hum.Genet.70：11-19(2002)；美国专利No.6,770,461和6,780,609；美国公布的专利申请No.20040038860和20050070699)。这些发现，连同小鼠中LRP5的无义突变会导致重度骨量损失这一事实(Kato，J.Cell Biol.157(2)：303-314(2002))一起证明了LRP5在人类的骨形成和骨量中有重要的作用。
尽管LRP5基因在刺激骨生长中具有特定的作用，但据显示其具有几乎遍在的表达谱。LRP5的激活导致骨发生的机制还不知道。在分子水平上，最近显示LRP5和极为相关的LRP6作为Wnt的共受体(co-receptors)而参与Wnt信号转导。Wnt基因编码参与一系列发育和成人生理过程(如在中枢神经系统中介导细胞生长和分化)的分泌型蛋白。还已知的是LRP5和LRP6是分泌型蛋白dickkopf-1(Dkk-1)的受体，并且它们与Dkk-1的结合抑制Wnt信号转导(Mao等人，Nature 411：321-325(2001)；Semenov等人，Curr.Biol.，(2001)；Bafico等人，Nat Cell Biol 3：683-686(2001))。
Dickkopf-1(Dkk-1)是参与胚胎头部诱导并拮抗Wnt的分泌型蛋白(Glinka等人，Nature 391：357-362(1998))。人Dkk-1的氨基酸序列和编码它的核苷酸已经有所描述(美国专利No.6,344,541；6844422；7,057,017；公布的专利申请No.20050069915；Krupnick等人，Gene 238：301-313(1999))。据认为Dkk-1在人中的表达限制在胎盘中，这表明了Dkk-1在胚胎发育中起作用(Krupnick等人，如上)。Allen和同事(美国公布的专利申请No.20040038860)描述了涉及LRP5、HBM或LRP6与Dkk-1之间相互作用的分析。结合Dkk-1的抗体在上述专利和专利申请以及美国公布的专利申请No.20050079173和20060127393中有所描述。
人Dkk-1是Dickkopf基因家族的成员，该基因家族包括Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3、和Dkk-4(Krupnick等人，如上)。尽管已经显示Dkk-1和Dkk-4在爪蟾胚胎中抑制Wnt诱导的副轴诱导，但Dkk-1和Dkk-4不阻断由爪蟾Dishevelled或Frizzled触发的轴诱导，这表明它们的Wnt抑制活性在Wnt信号通路的Frizzled上游(Krupnick等人，如上)。据显示Dkk-1可能对骨形成具有抑制效果，这使得它们成为用于预防或治疗骨质疏松的可能靶标(Patel和Karensky，N.Eng.J.Med.346：1572-1573(2002)；Boyden等人，N.Eng.J.Med.346：1513-1521(2002))。业内还需要具有如下特性的试剂和方法：能够选择性抑制Dkk-1与LRP5/6的相互作用并因而刺激骨中的Wnt信号通路，相应增加骨的合成代谢而不与Dickkopf基因家族的其他成员交叉反应。
发明概述
本发明提供选择性结合Dkk-1的抗体及其免疫功能片段。该抗体和免疫活性片段还阻断或减少Dkk-1和LRP5和/或LRP6的结合，从而刺激至少一种与Wnt信号转导相关的活性。具体来说，该抗体及其免疫功能片段选择性地抑制Dkk-1与LRP5/6的相互作用并因而刺激骨中的Wnt信号通路以相应增加骨量而不与Dickkopf基因家族的其他成员发生可检测的交叉反应。该抗体和片段包括具有天然产生的结构的抗体、以及具有抗原结合结构域的多肽(例如，域抗体)。该抗体和片段可以用于治疗多种不同的疾病，包括预防或治疗涉及骨量损失或刺激新骨产生的病况、以及多种非骨相关疾病。本发明还提供了可用于制备抗体和选择性结合药剂的核酸分子、载体和宿主细胞。
所提供的一些抗体和免疫功能片段包含(a)一个或多个选自下列的轻链(LC)互补决定区(CDR)：(i)与SEQ ID NO：12具有至少80％序列相同性的LCCDR1、(ii)与SEQ ID NO：13具有至少80％序列相同性的LC CDR2、以及(iii)与SEQ ID NO：14具有至少80％序列相同性的LC CDR3；(b)一个或多个选自下列的重链(HC)CDR：(i)与SEQ ID NO：9具有至少80％序列相同性的HC CDR1、(ii)与SEQ ID NO：10具有至少80％序列相同性的HC CDR2、和(iii)与SEQ ID NO：11具有至少80％序列相同性的HC CDR3；或(c)一个或多个(a)的LC CDR和一个或多个(b)的HC CDR。
这种抗体或片段能够特异性结合Dkk-1多肽。某些抗体或片段包含上述CDR的1种、2种、3种、4种、5种或所有6种。
所提供的其他抗体或片段的轻链和重链如上所述但与上述序列具有至少90％序列相同性。其他的抗体或其片段具有的轻链中，CDR1具有SEQ IDNO：12所示氨基酸序列、CDR2具有SEQ ID NO：13所示氨基酸序列和/或CDR3具有SEQ ID NO：14所示氨基酸序列。一些抗体或片段也可以是其具有的重链中：CDR1具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列、CDR2具有SEQ IDNO：10所示氨基酸序列和/或HC CDR3具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列。具体的抗体或片段包含具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链CDR3和/或具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链CDR3。
还提供包含下列结构的抗体和免疫功能片段：(a)与SEQ ID NO：4具有至少80％序列相同性的轻链可变区(VL)；(b)与SEQ ID NO：8具有至少80％序列相同性的重链可变区(VH)；或(c)(a)的VL和(b)的VH。
另外，提供了结构相似但是VL与SEQ ID NO：4具有至少90％序列相同性、VH与SEQ ID NO：8具有至少90％序列相同性的抗体或免疫功能片段。在具体的抗体或功能片段中，VL与SEQ ID NO：4具有至少95％序列相同性；VH与SEQ ID NO：8具有至少95％序列相同性。在另外的方面，抗体或免疫功能片段包含具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的VL、和/或具有SEQ IDNO：8的氨基酸序列的VH。
一些抗体或片段具有包含SEQ ID NO：2或3的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的轻链和/或包含SEQ ID NO：6或7的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的重链。
还包括的是特异性结合成熟的人Dkk-1蛋白的抗体或免疫功能片段，该人Dkk-1蛋白由SEQ ID NO：35的氨基酸32-266组成，并且具有半胱氨酸残基220和245之间的二硫键所建立的三级结构，其中所述抗体结合至表位，该表位部分地包含由SEQ ID NO：35的半胱氨酸残基201和210之间的氨基酸组成的环。
还提供与如上所述的抗体竞争与Dkk-1多肽的特异性结合的抗体或片段。例如，一些抗体和片段与由两个相同的重链和两个相同的轻链组成的抗体竞争，其中所述重链由SEQ ID NO：3所示氨基酸序列组成并且所述轻链由SEQ ID NO：7所示氨基酸序列组成。
所提供的各种抗体和片段可以包括单个轻链和/或重链或单个轻链可变区和/或单个重链可变区。其他抗体和片段包括两个轻链和/或两个重链。在其中抗体或片段包括两个轻链和/或重链的情况下，两条轻链在一些情况下彼此相同；同样，两条重链在一些情况下也相同。所提供的抗体可以包括：例如单克隆抗体、人抗体、嵌合抗体、或人源化抗体。免疫功能片段可以包括但不限于：scFv、Fab、Fab′、(Fab′)2、或域抗体(domain antibody)。在一些情况下，抗体或片段以约269pM或更低的Kd与Dkk-1多肽解离。
还提供包含任何上述抗体和免疫活性片段的药物组合物。此类组合物通常还包含缓冲剂、药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、或防腐剂。还描述了上述抗体和免疫活性片段在制备药物组合物或药物中的用途。
还提供了编码上述抗体的多种核酸。一些核酸编码：例如，(a)具有SEQID NO：14所示氨基酸序列的轻链CDR；和/或(b)具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的重链CDR，以便所编码的CDR编码可以特异性结合Dkk-1多肽的抗体或其免疫功能片段。在具体的方面，核酸包含编码抗体或免疫活性片段的轻链可变区(VL)和/或重链可变区(VH)的序列或由该序列组成，其中所述VL与SEQ ID NO：4具有至少80％、90％或95％序列相同性，VH与SEQID NO：8具有至少80％、90％或95％序列相同性。一些核酸包括：编码包含SEQ ID NO：4或由其组成的VL的序列和/或编码包含SEQ ID NO：8或由其组成的VH的序列。还有其他核酸包括编码具有上述序列特征的VL或VH二者的序列。本文还公开了包含上述核酸的表达载体、和包含此类表达载体的细胞(例如，低等真核细胞，如酵母细胞；或高等真核细胞，如CHO细胞等哺乳动物细胞或昆虫细胞)。还描述了通过培养含有此类表达载体的细胞制备抗体或其免疫活性片段的方法。
在另一方面，公开了上述抗体或免疫功能片段在治疗多种疾病中的用途。在具体方法中，将有效量的本文所述的抗体或免疫活性片段给予需要它们的个体来治疗骨质疏松、关节炎、多发性骨髓瘤、转移性骨病(metastaticbone disease)、牙周病、响应干细胞再生的疾病、炎症疾病、神经系统疾病、眼病、肾病、肺病、和皮肤病。一些治疗方法涉及治疗类风湿性关节炎、银屑病性关节炎或骨关节炎。
本文还提供了治疗或预防骨量损失的方法，该方法包括将治疗有效量的本文所述的抗体或其免疫功能片段给予需要它们的个体。在具体的方面，所述个体是患有骨质疏松或其他骨损失疾病或紊乱者，例如骨质减少、佩吉特氏(Paget′s)病、牙周炎、类风湿性关节炎和因固定术所致的骨损失。在此实施方式的另一个方面，所述个体为患有转移到骨的癌症的个体，在另一方面，患者为患有多发性骨髓瘤的患者。
还公开了诱导或刺激骨量增加的方法。此类方法包括给予个体治疗有效量的本文所公开的抗体或免疫功能片段。在一个方面，个体患有转移到骨的癌症，在另一方面，患者患有多发性骨髓瘤。在又一方面，个体选自患有下列疾病的那些：骨质疏松、骨质减少、佩吉特氏病、牙周炎、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、和因固定术所致的骨损失。在此方法的又一方面，个体为骨移植的接受者或患有骨折者。
本文所公开的Dkk-1抗体及其免疫功能片段可以提供缓解入侵骨微环境的癌细胞(例如，多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌等)的骨破坏效果的治疗。
根据上文，还提供了诱导个体中Wnt活性的方法，该方法包括给予个体治疗有效量的本文所述的抗体或其免疫功能片段。
定义
如本文所用，术语“抗体”、“免疫球蛋白”和“免疫球蛋白分子”可以互换使用。各免疫球蛋白分子具有独特的结构，该结构使其能够结合其特异性抗原，但是所有免疫球蛋白都具有本文所述的相同的总体结构。已知基本的免疫球蛋白结构单元包括亚单位的四聚体。各四聚体具有两个相同的多肽链对，每对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包括约100至110或更多个氨基酸的可变区，该可变区主要负责抗原识别。各链的羧基末端界定了主要负责效应因子功能的恒定区。轻链分为κ或λ类。重链分为γ、μ、α、δ或ε类，界定了抗体的同种型分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
轻链和重链进一步分为可变区和恒定区(一般参见FundamentalImmunology(Paul，W.，编辑，第二版.Raven Press，N.Y.，1989)第7章)。各轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中之外，两个结合位点是相同的。所有链都展现由三个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)的相同一般结构。来自各对的两条链的CDR通过框架区对准，使得能够结合特异的表位。该术语包括天然产生的形式以及片段和衍生物。该术语的范围包括免疫球蛋白(Ig)类，即，IgG、IgA、IgE、IgM和IgD。该术语的范围还包括IgG的同种型，即，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。该术语以其最广的含义使用并且包括单独的单克隆抗体(包括激动剂和拮抗剂抗体)以及结合多个表位或抗原的抗体组合物。该术语具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段(只要所述抗体片段含有或经修饰含有至少重链免疫球蛋白恒定区的CH2结构域部分即可，所述部分包含CH2结构域的N-连接的糖基化位点)，或它们的变体。此外，这些术语可以指至少含有N-连接的糖基化位点的至少Fab区的抗体片段。
术语“Fc”片段是指含有CH2和CH3结构域的抗体的“片段结晶”C末端区(图1)。术语“Fab”片段是指含有VH、CH1、VL和CL结构域的抗体“片段抗原结合”区(参见图1)。
本文所用的术语“单克隆抗体”(mAb)是指从基本上均质的抗体群所得的抗体，即，单独的抗体(individual antibodies)，其包含的群体是相同的，但除了那些可能少量存在的可能自然产生的突变。单克隆抗体是高度特异的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的传统(多克隆)抗体制剂相反，各mAb针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的优点还在于它们可以通过杂交瘤细胞培养来合成，不受其他免疫球蛋白的污染。术语“单克隆”表明了抗体自基本均质的抗体群获得这一特征，不应理解为需要任何特定方法来制备该抗体。例如，本文的单克隆抗体可以通过由Kohler等人((1975)Nature，256：495)首次描述的杂交瘤方法制备；或者可以通过重组DNA方法制备(参见，例如美国专利No.4,816,567)。
术语“片段”在术语“抗体”或“免疫球蛋白”的范围内包括：通过用各种蛋白酶消化来制备的那些、通过化学断裂和/或化学解离制备的那些和重组制备的那些，只要该片段仍能够特异地结合靶分子即可。这些片段包括Fc、Fab、Fab’、Fv、F(ab’)2、和单链Fv(scFv)片段。在下文中术语“免疫球蛋白”也包括术语“片段”。
免疫球蛋白还包括序列上经修饰但仍能够特异地结合靶分子的免疫球蛋白或片段，包括：种间嵌合和人源化抗体；抗体融合体；异源(heteromeric)抗体复合体和抗体融合体，如双功能抗体(双特异性抗体)、单链双功能抗体和胞内抗体(intrabody)(参见，例如Intracellular Antibodies：Research andDisease Applications，(Marasco，编辑，Springer-Verlag New York，Inc.，1998))。
术语“表位”是指在抗原上B和/或T细胞对其反应的位点；或分子上的位点，针对该位点而产生抗体；和/或抗体结合的位点。例如，表位可以被界定该表位的抗体识别。线性表位是其中氨基酸一级序列包括被识别的表位的表位。线性表位通常包括至少3个，并且更通常至少5个(例如，约8至约10个)独特(unique)序列的氨基酸。与线性表位相反，构象表位是这样一种表位，其中包含表位的氨基酸一级序列不是界定所识别的表位的唯一组分(例如，其中氨基酸的一级结构不一定被界定表位的抗体所识别)。通常构象表位含有比线性表位数量更多的氨基酸。对于构象表位的识别来说，抗体识别肽或蛋白的三维结构。例如，当蛋白分子折叠形成三维结构时，形成构象表位的某些氨基酸和/或多肽骨架并列起来(juxtaposed)使得抗体能够识别表位。
测定表位构象的方法包括但不限于：例如x-射线晶体学、二维核磁共振波普法和定点自旋标记及电子顺磁共振波谱法。参加，例如Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology(1996)第66卷，Morris(编辑)。
如本文所用的术语″Dkk-1″包括：例如猕猴(rhesus monkey)、鼠和人形式的Dkk-1。人和猕猴Dkk-1蛋白的氨基酸序列分别显示在SEQ IDNO：35和38中。人Dkk-1蛋白(SEQ ID NO：35)具有由SEQ ID NO：35的氨基酸1-31组成的前导序列。鼠Dkk-1蛋白序列公开于Glinka等人的Nature 391：357-362(1998)中。猕猴Dkk-1公开于国际公布No.WO2005049640中。术语“Dkk-1”还包括在免疫学上与此类天然蛋白交叉反应的此类天然序列的变体。这些Dkk-1蛋白可以抑制LRP5或LRP6蛋白与Wnt之间的相互作用。人LRP5的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO：39中给出。编码人LRP6的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO：40中给出。该术语还可以指天然或变体形式的Dkk-1的片段，其含有本文所公开的抗体可以特异性结合的表位。
术语“骨质减少”是指与认为具有正常骨质密度(BMD)的标准患者相比具有至少一个标准偏差的骨损失的患者。为了本发明的目的，测量是由双能X射线吸收分光光度法(DEXA)测定并且将患者的BMD与年龄和性别相匹配的标准相比(Z评分)。在测定骨质减少时，可以取一个或多个骨进行BMD测量。
术语“治疗有效量”是指经测定能在哺乳动物中产生治疗反应的抗Dkk-1抗体的量。本领域的普通技术人员可以容易地确定此治疗有效量。
附图简述
图1A显示编码RH2-18轻链的质粒图。OriP是在真核细胞中表达的爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barr virus)复制起点。HCMV内含子A启动子是人巨细胞病毒启动子和第一内含子。LCλ编码轻链λ恒定区。前导序列编码用于将轻链多肽分泌到培养基中的前导序列或信号序列。BGH pA是牛生长激素多聚腺苷酸化信号序列。SV40启动子是SV40病毒启动子。GS是谷氨酰胺合成酶。SV40是SV40多聚腺苷酸化信号序列。Kan是用于在大肠杆菌中选择载体的卡那霉素基因。
图1B显示编码RH2-18重链的质粒图。OriP是在真核细胞中表达的爱泼斯坦巴尔病毒复制起点。HCMV内含子A启动子是人巨细胞病毒启动子和第一内含子。IgG2M4编码重链IgG2M4恒定区。前导序列编码用于将轻链多肽分泌到培养基中的前导序列或信号序列。BGH pA是牛生长激素多聚腺苷酸化信号序列。Kan是用于在大肠杆菌中选择载体的卡那霉素基因。
图1C显示RH2-18轻链的氨基酸序列和重链氨基酸序列(分别为SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：7)。未显示轻链和重链序列的前导序列。可变区显示为斜体。
图1D显示与种系(germline)的轻链可变区序列(SEQ ID NO：16)比对的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。将三个轻链(LC)互补决定区(CDRs)下面划线并且以黑体形式显示RH2-18和种系序列可变区序列之间在框架内的氨基酸序列差别。
图1E显示与种系的重链可变区序列(SEQ ID NO：15)比对的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。将三个重链(HC)CDR下面划线并且以黑体形式显示RH2-18和种系序列可变区序列之间在框架内的氨基酸序列差别。
图1F显示经纯化用于体外分析的12个经转化的(converted)抗-Dkk-1抗体的LABCHIP 90毛细管电泳结果。泳道2是RH2-18抗-Dkk-1抗体。
图2A显示结合HEK293hLrp5细胞的Eu-Dkk-1以及各种浓度下抗-Dkk-1抗体RH2-10、RH2-18、RH2-31、RH2-59和RH2-80的抑制活性。8B4是对Dkk-1非特异性的对照抗体。
图2B显示使用扩展的剂量范围再滴定RH2-18抗体的结果。该结果显示对于这个分析形式，RH2-18抗体的有效剂量为约5nM。
图3显示抗-Dkk-1抗体RH1-10、RH2-18、RH2-31、RH2-59和RH2-80抗体对Wnt3A诱导的信号转导中Dkk-1功能的中和活性。用Wnt3A进行处理(黑色柱子)与对照处理(空白柱子)相比显著刺激了信号通路。抗-Dkk-1抗体以指定的浓度添加。
图4显示RH2-18、Rh2-59、和Rh2-80抗体对成骨细胞分化的影响。C3H10T1/2细胞向成骨细胞表型的分化通过增加的内源ALP活性来确定。
图5A显示使用抗体RH2-18的斑点印迹结合分析，显示了该抗体对Dkk-1C-末端区的特异性。猕猴Dkk-1蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)标签融合(上样对照)。表达全长的猕猴Dkk-1蛋白、C-末端区(ΔN-Dkk-1，编码残基159至266)或N-末端区(ΔC-Dkk-1，编码残基1-158)并使用RH2-18抗体通过斑点免疫印迹进行分析。
图5B显示的斑点印迹分析表明，当在Dkk-1C-末端区进行多种氨基酸取代时，RH2-18抗体结合损失。猕猴Dkk-1蛋白与GFP标签融合(上样对照)。表达全长猕猴Dkk-1蛋白、C-末端区(ΔN-Dkk-1，编码残基159至266)或N-末端区(ΔC-Dkk-1)并使用RH2-18抗体通过斑点免疫印迹进行分析。在ΔN-Dkk-1中引入了丙氨酸取代并且显示了被取代的氨基酸残基的位置编号。
图5C显示Dkk-1C-末端区(氨基酸187至266)的结构同源性模型，其显示了结合RH2-18抗体所必需的氨基酸残基。给出编号的氨基酸通过丙氨酸扫描而被取代。导致在使用非变性蛋白的免疫印迹实验中抗原-抗体相互作用减弱的氨基酸残基取代为氨基酸S187至V188、R203至K208、E241、和L243)。列出了Dkk-1-同源模型外对于RH2-18抗体结合表位而言很重要的氨基酸残基(R171至L174)。氨基酸C220的取代也会引起RH2-18抗体与Dkk-1结合的损失。其余氨基酸残基的取代似乎不影响RH2-18抗体与Dkk-1的结合。
图6A显示人Dkk-1、Dkk-2、Dkk-4和猕猴Dkk-1的氨基酸序列比对。保守氨基酸显示为红色，非保守氨基酸显示为绿色。Dkk-1中对于RH2-18结合所必需的氨基酸残基显示在蓝色框中。注意在Dkk-1和Dkk-2和Dkk-4之间氨基酸残基R171至L174、S187至V188、S207和E241缺乏序列保守性。
图6B显示使用不同Dkk同种型(isoform)的斑点印迹分析，显示RH2-18抗体对Dkk-1的特异性。使用原初的(native)重组猕猴Dkk-1、Dkk-2和食蟹猴(cynomolgus monkey)Dkk-4蛋白(0.1ng至100ng)。上样不相关的重组蛋白作为非特异的分析信号的对照(HIS蛋白)并用RH2-18抗体探测。
图7显示在0.5至5mg/kg剂量范围内RH2-18抗体使远端股骨矿物质密度(BMD)以剂量影响方式增加了5.2至8.7％。误差棒＝SEM。N＝11/组。
图8显示在1.5至5mg/kg剂量范围内RH2-18抗体使整个股骨BMD增加了4.7至4.8％。误差棒＝SEM。N＝11/组。
图9显示在1.5至5mg/kg剂量范围内RH2-18抗体使中心股骨BMD以剂量影响方式增加了3.2至3.5％。误差棒＝SEM。N＝11/组。
图10A显示在完全培养基中的HCT116细胞中进行的TOPflash转录分析中Rh2-80抗体(Dkk-1AB)对培养的癌细胞的转录影响。8B4为对照非特异性抗体。Con为溶媒对照。
图10B显示在完全培养基中的HCT116细胞中进行的细胞增殖分析中RH2-80抗体(Dkk-1AB)对培养的癌细胞的转录影响。8B4为对照非特异性抗体。Con为溶媒对照。
图11显示肿瘤生长的异种移植模型和RH2-59抗体对肿瘤生长的影响。将在100μL PBS中的1×107个HCT116细胞皮下注射到六周龄的NOD.CB17-Prkdcscid/J(SCID)小鼠的右侧腹。在注射后第二天进行处理并且再持续处理两周，共进行7次。用磷酸盐缓冲液(PBS)和非特异性抗体(NS AB)作为阴性对照。在约3.5周时分离肿瘤。通过在尸检后切除肿瘤并称重而获得肿瘤质量。使用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计。在所有样品之间都没观察到统计学差异。x肿瘤细胞非故意注射到真皮中。各组中有1/5小鼠具有肿瘤破裂。
发明详述
本发明提供包含抗体或其免疫功能片段的组合物，所述抗体或其免疫功能片段通过靶向Dkk-1C-末端区的多维构象表位而选择性地抑制Dkk-1与LRP5的结合。该抗体还包括对抗体Fc结构域的修饰，该修饰使抗体不能以生理学相关的程度结合任何Fc受体或C1q，但是不进行与FcRn结合的实质修饰或半衰期的修饰。换言之，所提供的包含抗体的组合物识别Dkk-1的多维构象表位，同时即不引起抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)或补体介导的细胞毒作用(CMC)，也不形成免疫复合体。在当前的一个优选实施方式中，抗体为全长的人单克隆抗体，其优选不以任何程度引起抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)、补体介导的细胞毒作用(CMC)或形成免疫复合体，同时还保持其正常的药代动力学(PK)特性。包含抗体的组合物在生长的小鼠模型中刺激骨的合成代谢，表明了含有抗体的组合物可用于治疗骨质疏松。
在各种促骨合成代谢靶标中，骨中典型的Wnt信号通路提供了引起对治疗的有效和安全的合成代谢反应的最佳机会。典型的Wnts通过两个共受体frizzled和LDL受体相关蛋白(LRPs)5和6(分别参见SEQ ID NOS：39和40)进行信号转导。与年龄相匹配的正常对照相比，LRP5的超等位基因突变引起BMD显著增加(在临床群体中高于平均值约5SD)。在转基因小鼠中检测到了引起骨量和骨形成速率增加的突变(如，G171V))。典型的Wnt信号转导在存在抑制性蛋白Dickkopf-1(Dkk1)的情况下被阻断，该抑制性蛋白在骨中高度表达。Dkk-1是具有26kDa分子量的266个氨基酸的蛋白。该蛋白具有两个富含半胱氨酸的结构域-氨基酸97至138、和183至245，该基序在种间高度保守。Dkk-1在种间具有高百分比的序列相同性/相似性(人∶猕猴97/99、人∶小鼠80/87以及猕猴∶小鼠79/87)。有趣的是，Dkk-1丧失了抑制LRP5的超等位基因G171突变的能力，这是突变受体重要的信号缺陷。此外，缺乏Dkk-1的杂合基因敲除小鼠也类似地显示增加的骨量(如同G171V-LRP5小鼠一样)，这伴随着骨形成速率的4倍增加。关于LRP5和其被dkk-1抑制的复合数据表明，可以通过在骨微环境中防止LRP5信号的Dkk-1抑制的干扰治疗或通过受体的选择性激活而产生促骨合成代谢反应。的确，如实施例中所示，本文所公开的抗-Dkk-1中和抗体(0.5至5.0mg/kg，皮下注射，每周两次)在生长的小鼠中能增加骨量，并对远端和整个股骨具有类PTH-作用。据显示其他抗-Dkk-1抗体也能在生长的小鼠内增加骨量，例如，参见如美国公布的申请No.20060127393。
因此，提供了可用于调控Dkk-1活性的多种抗-Dkk-1抗体和其免疫功能片段，包括单链抗体、域抗体、和具有抗原结合区的多肽。这些抗-Dkk-1抗体及其免疫功能片段特异地结合人Dkk-1多肽，缓解Wnt信号通路的Dkk-1抑制，并诱导骨组织中的骨形成。
在本发明的某些实施方式中，抗-Dkk-1抗体为IgG1、IgG2或IgG4亚型。在优选的实施方式中，抗体为全长的人单克隆抗体，该单克隆体优选不以任何程度引起抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)、补体介导的细胞毒作用(CMC)、或形成免疫复合体，同时保持其正常药代动力学(PK)特性。在当前的优选实施方式中，抗体具有IgG2m4同种型(参见2006年10月17日提交的美国申请No.11/581,931和2005年10月21日提交的美国申请11/256,332)。
包括抗体的各轻链/重链免疫球蛋白链对的可变区通常形成抗原结合位点。免疫球蛋白链的可变区一般展示相同的总体结构，该总体结构由通过三个高变区或“互补决定区”(CDR)连接的相对保守的框架区(FR)组成。来自各轻链/重链对的两条链的CDR通常通过框架区对准，以形成能特异性结合靶蛋白上的特异表位的结构。从免疫球蛋白链的N-末端至C-末端，天然产生的轻链和重链可变区两者通常都符合以下元件的下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。已经设计了用于给在这些结构域的每个之中占据位置的氨基酸分配号码的编号系统。这个编号系统在Chothia和Lesk，J.Mol.Viol.196：901-917(1987)；Chothia等人，Nature 342：878-883(1989)中描述。
所提供的一些抗-Dkk-1抗体的全长的免疫球蛋白轻链和重链以及其相应的核苷酸和氨基酸序列的具体实例总结在表1中。
表1
轻链和重链
Figure A20088000937400201
抗-Dkk-1抗体可以通过组合任何一种表1所示轻链和任何表1所示重链来形成。在一些情况下，抗体包括来自表1所示那些的至少一个重链和一个轻链，在其他情况下，抗体含有两个相同的轻链和两个相同的重链。举例来说，抗体或免疫球蛋白功能片段可以包括：2个L2轻链和2个H1重链；或2个L2轻链和2个H3重链，或2个L2轻链和2个H4重链；以及表1所示轻链对和重链对的其他类似组合。
能够结合上述Dkk-1C-末端区中的多维构象表位的示例性抗-Dkk-1抗体为单克隆抗体RH1-10、RH2-18、RH2-59、和RH2-80(参见，下面的实施例)，它们的每个都包含轻链和重链。
完整的RH1-10轻链由SEQ ID NO：17中所示的核苷酸序列编码，完整的RH1-10重链由SEQ ID NO：19中所示的核苷酸序列编码。对应的RH1-10的轻链和重链氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：18和20中。SEQ ID NO：18的氨基酸残基1至20和SEQ ID NO：20的残基1至19分别对应于RH1-10的轻链和重链的信号序列。没有信号序列的轻链氨基酸序列显示在SEQ IDNO：42中，缺乏信号序列的重链氨基酸序列显示在SEQ ID NO：41中。因此，在上述实施方式的一个方面，重链可以由SEQ ID NO：20的氨基酸20至457组成(H1，对应于SEQ ID NO：41)，在此实施方式的另一方面，轻链可以由SEQ ID NO：18的氨基酸21至237组成(L1，对应于SEQ ID NO：42)。在本实施方式的又一方面中，抗体包含由SEQ ID NO：20的氨基酸20至457组成的重链和由SEQ ID NO：18的氨基酸21至237组成的轻链这两者。在一些情况下，抗体由各自由SEQ ID NO：20的氨基酸20-457组成的两个相同的重链和各自由SEQ ID NO：18的氨基酸21至237组成的两个相同的轻链组成。
完整的RH2-18轻链由SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列编码，完整的RH2-18重链由SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列编码。对应的RH2-18轻链和重链氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：2和6中。SEQ ID NO：2的氨基酸残基1至20和SEQ ID NO：6的残基1至19分别对应于RH2-18的轻链和重链的信号序列。没有信号序列的轻链氨基酸序列显示在SEQ ID NO：3中，缺乏信号序列的重链氨基酸序列显示在SEQ ID NO：7中。因此，在上述实施方式的一个方面，重链可以由SEQ ID NO：6的氨基酸20至457组成(H2，对应于SEQ ID NO：7)，并且在此实施方式的另一方面，轻链可以由SEQ IDNO：2的氨基酸21至237组成(L2，对应于SEQ ID NO：3)。在本实施方式的又一方面中，抗体包含由SEQ ID NO：6的氨基酸20至457组成的重链和由SEQ ID NO：2的氨基酸21至237组成的轻链这两者。在一些情况下，抗体由各自由SEQ ID NO：6的氨基酸20-457组成的两个相同的重链和各自由SEQ ID NO：2的氨基酸21至237组成的两个相同的轻链组成。
完整的RH2-59轻链由SEQ ID NO：21中所示的核苷酸序列编码，并且完整的RH2-59重链由SEQ ID NO：23中所示的核苷酸序列编码。对应的RH2-59轻链和重链氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：22和24中。SEQ IDNO：22的氨基酸残基1至20和SEQ ID NO：24的残基1至19分别对应于RH2-59的轻链和重链的信号序列。没有信号序列的轻链氨基酸序列显示在SEQ ID NO：44中，缺乏信号序列的重链氨基酸序列显示在SEQ ID NO：43中。因此，在上述实施方式的一个方面，重链可以由SEQ ID NO：24的氨基酸20至457组成(H3，对应于SEQ ID NO：43)，并且在此实施方式的另一方面，轻链可以由SEQ ID NO：22的氨基酸21至237组成(L3，对应于SEQ IDNO：44)。在本实施方式的又一方面中，抗体包含由SEQ ID NO：24的氨基酸20至457组成的重链和由SEQ ID NO：22的氨基酸21-237组成的轻链这两者。在一些情况下，抗体由各自由SEQ ID NO：24的氨基酸20至457组成的两个相同的重链和各自由SEQ ID NO：22的氨基酸21至237组成的两个相同的轻链组成。
完整的RH2-80轻链由SEQ ID NO：25中所示的核苷酸序列编码，并且完整的RH2-80重链由SEQ ID NO：27中所示的核苷酸序列编码。对应的RH2-80轻链和重链氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：26和28中。SEQ IDNO：26的氨基酸残基1至20和SEQ ID NO：28的残基1至19分别对应于RH2-80的轻链和重链的信号序列。没有信号序列的轻链氨基酸序列显示在SEQ ID NO：46中，缺乏信号序列的重链氨基酸序列显示在SEQ ID NO：45中。因此，在上述实施方式的一个方面，重链可以由SEQ ID NO：28的氨基酸20至457组成(H4，对应于SEQ ID NO：45)，并且在此实施方式的另一方面，轻链可以由SEQ ID NO：26的氨基酸21至237组成(L4，对应于SEQ IDNO：46)。在本实施方式的又一方面中，抗体包含由SEQ ID NO：28的氨基酸20至457组成的重链和由SEQ ID NO：26的氨基酸21-237组成的轻链这两者。在一些情况下，抗体由各自由SEQ ID NO：28的氨基酸20至457组成的两个相同的重链和各自由SEQ ID NO：26的氨基酸21至237组成的两个相同的轻链组成。
所提供的其他抗-Dkk-1抗体是由上述重链和轻链的任何组合形成的抗体的变体并且包含各自与这些轻链和重链的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、或99％相同性的轻链和/或重链。在一些情况下，这些抗体包括至少一个重链和一个轻链，而在其他情况下，这些变体形式含有两个相同的轻链和两个相同的重链。
还提供了包含选自VL1、VL2、VL3、和VL4的轻链可变区和/或选自VH1、VH2、VH3、和VH4的重链可变区的抗Dkk-1抗体，如下表2所示，和这些轻链和重链可变区的免疫功能片段、衍生物、突变体和变体。
表2
可变区
Figure A20088000937400231
因此，所提供的抗-Dkk-1抗体包括但不限于具有下列形式的那些：VL1VH1、VL1VH2、VL1VH3、VL1VH4、VL2VH1、VL2VH2、VL2VH3、VL2VH4、VL3VH1、VL3VH2、VL3VH3、VL3VH4、VL4VH1、VL4VH2、VL4VH3、和VL4VH3。在一些情况下，上述抗体包括两个轻链可变区和两个重链可变区，其中各个轻链相同并且各个重链相同。在其他情况下，上述抗体包括两个轻链可变区和两个重链可变区，其中各个轻链不同并且各个重链不同。
作为此类抗-Dkk-1抗体的具体实例，具体的抗体或其免疫功能片段可以包含RH2-18的轻链可变区或重链可变区，其中所述轻链可变区由SEQ IDNO：2的氨基酸21至132(VL1，对应于SEQ ID NO：4)组成并且所述重链可变区由SEQ ID NO：6的氨基酸20至131(VH1，对应于SEQ ID NO：8)。在此实施方式的一个方面，抗体由两个相同的重链和两个相同的轻链组成。还提供了(例如)抗体，其包含由SEQ ID NO：2的氨基酸21至132组成的轻链可变区或其抗原结合或免疫功能片段并且包含由SEQ ID NO：6的氨基酸20至131组成的重链可变区。
具体的抗-Dkk-1抗体可以包含含有与选自VL1、VL2、VL3、或VL4的轻链可变区序列有1至约20个氨基酸残基差异的氨基酸序列的轻链可变区，其中每个这种序列差异独立地为剔除、插入或取代一个氨基酸。在一些抗体中轻链可变区包含与VL1、VL2、VL3、或VL4的轻链可变区氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、或99％序列相同性的氨基酸序列。
具体的抗-Dkk-1抗体可以包含与选自VH1、VH2、VH3、或VH4的重链可变区序列有1至约20个氨基酸残基差异的氨基酸序列的重链可变区，其中每个这种序列差异独立地为剔除、插入或取代一个氨基酸。在一些抗体中重链可变区包含与VH1、VH2、VH3、或VH4的重链可变区氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、或99％序列相同性的氨基酸序列。
本文所公开的具体的抗-Dkk-1抗体可以包含与表3中所总结的一个或多个CDR的氨基酸序列相同或具有显著序列相同性的一个或多个氨基酸序列。
表3
CDR
Figure A20088000937400251
所提供的抗-Dkk-1抗体和免疫功能片段可以包括上面所列的一个或多个CDR并且可以包括CDR的任何组合。例如，一些抗体或片段可以包括轻链CDR3和重链CDR3。某些抗体具有表3所示CDR的变体形式，其中一个所多个CDR各自与表3所示CDR序列具有至少80％、85％、90％或95％的序列相同性。例如，抗体或片段可以包括各自分别与表3所示轻链CDR3序列和重链CDR3具有至少80％、85％、90％或95％序列相同性的轻链CDR3和重链CDR3。与所列序列的差异通常为保守性取代。包含一个或多个轻链或重链CDR的多肽可以通过使用合适的载体在合适的宿主细胞中表达多肽来制备，如下面更详细的描述。
在表2和3中公开的重链和轻链可变区和CDR可用于制备本领域内已知的多种免疫功能片段的任何类型，包括但不限于：域抗体、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)：片段、Fv：片段、单链抗体和scFv。
抗-Dkk-1抗体表位
抗-Dkk-1抗体结合Dkk-1C-末端区的复合(complex)多维构象表位。通过同源模型用共脂肪酶预测到Dkk-1的C-末端区能形成球形三级结构(如下面所述)。实施例5中的结果显示，诸如RH2-18抗体等的抗-Dkk-1抗体所识别的表位是受Dkk-1C-末端富含半胱氨酸的结构域2中的Dkk-1序列和三级结构二者影响的复合表位。图5C显示Dkk-1C-末端区(氨基酸残基187至266)的结构同源模型，该模型表明了经丙氨酸扫描测定的Dkk-1与RH2-18抗体结合所必需的氨基酸残基(参见图5C)。发现氨基酸残基S187至V188、R203至K208、E24和L243的取代会导致在使用非变性蛋白的免疫印迹实验中抗原-抗体相互作用减弱。因此，这些氨基酸残基似乎在复合表位的形成中发挥着重要作用。还发现在C-末端同源模型所显示的氨基酸序列之外的氨基酸残基R171至L174对复合表位也有影响。此外，用丙氨酸取代氨基酸C220也会导致RH2-18与Dkk-1的结合损失。然而，如图5c所示的位于Dkk-1C-末端结构域的第二和第三指结构(环)的氨基酸残基的特定取代似乎不会不利地影响RH2-18与Dkk-1的结合，因此认为它们不是RH2-18与Dkk-1结合所必需的。
因此，RH2-18抗体结合复合表位，该表位包含来自第二半胱氨酸富含结构域的不同离散区域的、经鉴定为抗体结合所必需的氨基酸残基：氨基酸残基S187和V188，二者都在第一指结构域之前的区域中；氨基酸R203、H204、F205、W206、S207、和K208，它们所有构成了结构域的第一指结构。进一步接近结构域的C-末端，并且在第二指结构之前为E241和L243，它们也是RH2-18结合Dkk-1所需。最后，Cys220是RH2-18结合Dkk-1所必需的。预测Cys220在适当的三级结构的建立中起重要作用，这又一次表明了该表位的复合性质。总之，数据表明，RH2-18表位是由Dkk-1C-末端区域的拓扑表面所限定的，所述Dkk-1C-末端区域包括但不限于Dkk-1的第一指结构域A202-1209。因此，抗-Dkk-1抗体结合成熟人Dkk-1蛋白的复合表位，该蛋白由SEQ IDNO：35的氨基酸32-266组成并且具有通过半胱氨酸残基220和245之间的二硫键建立的三级结构，其中该抗体结合至包含环的表位，所述环由SEQ IDNO：35的半胱氨酸残基201和210之间的氨基酸组成。
Dkk-1氨基酸序列在氨基酸水平上与Dkk-2和Dkk-4极为相关，分别与它们具有50％和45％的相同性。人Dkk-1、-2、-4、和猕猴Dkk-1的氨基酸序列比较(图6A)显示缺乏位于Dkk-1内、如上所述被鉴定为对RH2-18结合Dkk-1很重要的氨基酸残基的保守性。在Dkk-1内的、RH2-18结合所必需的氨基酸残基在蓝色框内显示。如所看到的，其中完全缺乏在Dkk-2和Dkk-4中相应区域内的序列保守性。根据Dkk-1中氨基酸残基的表位图，该图显示了氨基酸残基Arg171至Leu174、Ser187、Val188、Ser207、和Glu241是RH2-18结合Dkk-1所必需的；并且根据Dkk-1和Dkk-2和Dkk-4在氨基酸残基Arg171至Leu174、Ser187、Val188、Ser207、和Glu241处序列保守性的缺乏，预计RH2-18和具有相似表位的其他抗-Dkk-1抗体对Dkk-1具有高度选择性。如实施例5中所示，几乎没有或检测不到RH2-18与Dkk-2或Dkk-4的特异性结合。抗体对Dkk-1的选择性最小为100倍，发现RH2-18与猕猴Dkk-1结合的检出限为约1ng。这些数据表明本文所述的RH2-18抗体和类似的抗-Dkk-1抗体识别新的、复合的、涵盖Dkk-1的几个离散区域的三维表位，这表明RH2-18及类似的抗体是独特的。
抗-Dkk-1抗体的制备
本文的抗-Dkk-1抗体可以通过Kohler等人在(1975)Nature，256：495首次描述的杂交瘤方法制备；或者可以通过重组DNA方法制备(参见，例如美国专利No.4,816,567的实施例1)。在当前优选的方面，本文的抗-Dkk-1抗体通过重组DNA方法制备。
编码本文抗-Dkk-1抗体的重组DNA构建体可以用于转化低等真核宿主细胞(如酵母或丝状真菌)、植物宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、昆虫宿主细胞或微生物宿主细胞。转化可以使用将核酸引入宿主细胞的任何已知方法来进行。所用的最佳转化程序取决于所转化的宿主细胞的类型。
典型的重组DNA表达构建体包含编码多肽的核酸分子，其编码一个或多个下列结构：抗-Dkk-1抗体的重链恒定区(例如，CH1、CH2和/或CH3)；重链可变区；轻链恒定区；轻链可变区；和轻链或重链的一个或多个CDR。使用标准的连接技术将这些核酸序列插入适当的载体中。例如，在一个实施方式中，将编码RH2-18重链的核酸和编码RH2-18轻链的核酸各自连接到表达载体中并且每个链单独表达。或者，单个核酸编码通过肽裂解位点连接的重链和轻链以便在轻链和重链作为单个多肽表达之后，裂解多肽裂解位点以产生单独的轻链和重链。
通常选择在所采用的具体宿主细胞中有功能的表达载体。合适的表达载体可以购自(例如)Invitrogen Life Technologies或BD Biosciences。其他可用于克隆和表达本发明的抗体和片段的载体包括在Bianchi和McGrew，Biotech.Biotechnol.Bioeng.84(4)：439-44(2003)中所述的那些。其他合适的表达载体在(例如)Methods Enzymol.185(D.V.Goeddel，编辑)，1990，NewYork：Academic Press中有所讨论。
通常，表达载体还包括用于质粒或病毒维持和用于克隆和表达外源核苷酸序列的核酸序列。这些核酸序列通常包括一个或多个下列可操作连接的核苷酸表达序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪切位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、多聚腺苷酸化序列、用于插入编码要表达的多肽的核酸的多接头区、和可检测的标记物元件。
任选地，载体可以含有位于编码序列5′或3′末端并且编码多聚组氨酸标签(例如6聚组氨酸)的编码标签的序列或市售抗体所存在的另外的标签，如FLAG、HA(来自流感病毒的血凝素)、或myc。标签可以作为来自宿主细胞的抗体亲和纯化的方法。亲和纯化可以通过(例如)使用抗标签的抗体作为亲和基质的柱层析法来进行。可任选地，标签可以通过多种方法(如使用用于裂解的肽酶)从纯化的抗体多肽中移除。
表达载体中的核苷酸表达序列可以是同源的(来自与宿主细胞相同的物种或株系)、异源的(来自非宿主细胞物种或株系的物种)、杂交的(来自不止一种来源的序列的组合)、合成的、或固有的。如此，表达序列的来源可以是任何原核或真核有机体。可用于载体的表达序列可以通过本领域内熟知的一些方法中的任何方法获得。复制起点通常是原核表达载体(尤其是市售的那些)的一部分，并且起点有助于载体在宿主细胞内的扩增。如果载体不含有复制位点的起点，可以根据已知的序列将其化学合成并连接到载体中。
表达载体通常含有被宿主有机体识别的启动子，并且该启动子可操作地连接到编码其抗-Dkk-1抗体的核酸上以产生抗-Dkk-1抗体。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。诱导型启动子响应培养条件中的一些变化(如存在或不存在营养物质或温度改变)在它们的控制下启动增加水平的DNA转录。另一方面，组成型启动子启动连续的基因产物制备；即，很少或没有对基因表达的实验控制。已熟知被多种可能的宿主细胞识别的大量启动子。合适的启动子通过如下步骤可操作地连接至编码抗-Dkk-1抗体的DNA：通过限制酶切消化从源DNA去除启动子或通过聚合酶链式反应扩增启动子并将所需的启动子序列插入载体中。用于酵母宿主的合适启动子也是本领域所熟知的。有利地，与酵母启动子一起使用酵母增强子。用于哺乳动物宿主细胞的合适启动子是熟知的并且包括但不限于：从病毒基因组获得的那些，如多瘤病毒、鸟痘病毒、腺病毒(如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒并且最优选为猿病毒40(SV40)。其他合适的哺乳动物启动子包括异源的哺乳动物启动子，例如，热休克启动子和肌动蛋白启动子。可以将增强子序列插入到载体中以增加编码抗Dkk-1抗体的核酸在高等真核细胞中的转录。增强子是长度通常为约10至300bp的作用于启动子以增加转录的DNA顺式作用元件。增强子相对不依赖于方向和位置。
在表达载体中，转录终止序列通常位于多肽编码区的3’末端并且用于终止转录。用于在原核细胞中表达的转录终止序列通常为富含G-C的片段后接多聚T序列。
可选择的标记基因元件编码在选择性培养基中生长的宿主细胞存活和生长所必需的蛋白。用于表达载体的典型的选择标记基因编码如下的蛋白：(a)赋予原核宿主细胞抗体或其他毒素抗性，例如氨苄青霉素(ampicillin)、四环素、或卡那霉素；(b)补充细胞的营养缺陷；或(c)提供从复杂培养基中不可得到的关键营养物质。可选择标记的实例包括：卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。细菌新霉素(neomycin)抗性基因也可用于原核和真核宿主细胞中的选择。
核糖体结合位点通常是mRNA翻译起始所必需的并且其特征为SD(Shine-Dalgarno)序列(原核)或Kozak序列(真核)。该元件通常位于启动子的3’端和要表达的多肽编码序列的5’端。
在一些情况下，需要具有特定糖基化结构或模式的抗-Dkk-1抗体。例如，很多哺乳动物和植物细胞会产生具有特定N-聚糖的蛋白，这使得该蛋白在引入个体时具有免疫原性。在不期望引起针对抗-Dkk-1抗体的免疫反应的抗-Dkk-1抗体的情况下，优选对哺乳动物宿主细胞的糖基化通路进行修饰以产生不含不期望的N-聚糖的抗-Dkk-1抗体。在哺乳动物中修饰糖基化通路以产生具有特定N-聚糖的抗体的方法描述在：例如国际专利申请No.WO0061739和U.S.公布的专利申请20040093621、20040259150、20030157108、20040191256、20040136986、和美国专利No.6,946,292中。用于在植物中修饰糖基化通路的方法已经被Cox等人在NatureBiotechnology，doi：10.1038/nbt1260，published on-line 26 November 2006中描述。很多低等真核细胞会也产生具有特定N-聚糖的蛋白，使得该蛋白在引入个体时具有免疫原性。在抗-Dkk-1抗体的情况下，优选对低等真核宿主细胞的糖基化通路进行修饰以产生不含不期望的N-聚糖的抗-Dkk-1抗体。用于在低等真核细胞(包括酵母)中修饰糖基化通路以产生具有特定N-聚糖和糖基化模式的抗体的方法描述在例如美国专利No.7,029,872和公布的美国专利申请No.20060034829、20060024304、20060034828、20060034830、20060029604、和20060024292。
转化的宿主细胞，当在适当条件下培养时，合成抗-Dkk-1抗体，这些抗体可以随后从培养基中收集(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从产生该抗体的宿主细胞中收集(如果未被分泌)。适当的宿主细胞的选择取决于多种因素，如所需的表达水平、对于活性所期望的或必须的多肽修饰(如糖基化或磷酸化)以及易于折叠成生物活性分子所期望或必须的多肽修饰。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系在本领域内是熟知的，其包括但不限于一些得自美国典型培养物保藏种心(American Type Culture Collection，ATCC)的永生化细胞系，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、和一些其他细胞系。在一些实施方式中，用于表达特定DNA构建体的最佳细胞系通过测试各细胞系以测定哪种具有最高的表达水平并且能产生具有组成型Dkk-1结合特性的抗体来选择。
在具体实施方式中，优选在经遗传工程化以产生具有类人N-聚糖结构的糖蛋白的低等真核细胞中制备抗体。美国专利No.7,029,872和公布的美国专利申请No.20060034829、20060024304、20060034828、20060034830、20060029604、和20060024292公开了在低等真核细胞(如酵母和丝状真菌)中制备具有大量特定N-聚糖结构的抗体。经过遗传工程化的可用于制备抗体的低等真核细胞包括选自下列的那些：巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、Pichiamembranaefaciens、Pichia opuntiae、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、酵母菌(Saccharomyces sp.)、汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichodermareesei)、Chrysosporium lucknowense、镰刀菌(Fusarium sp.)、谷镰刀菌(Fusarium gramineum)、镰孢霉(Fusarium venenatum)和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)。
抗-Dkk-1抗体组合物
还提供了组合物，该组合物包含有效量的抗-Dkk-1抗体或其免疫功能片段以及一种或多种下列物质：药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。因此，还包括了本文所提供的抗体和免疫活性片段用于制备药物组合物或药物的用途。此类组合物可用于治疗多种骨病，如骨质疏松。用于药物制剂的可接受的配方组分在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的。
除了所提供的抗-Dkk-1抗体和免疫功能片段之外，组合物还可以含有用于改变、维持或保持(例如)组合物的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的组分。用于调配药物组合物的合适材料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如乙酸盐、硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；膨胀剂(bulking agents)(如甘露醇或甘氨酸)；螯合(chelating)剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合(complexing)剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精(beta-t cyclodextrin)或羟丙基β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；和其他碳水化合物(如葡糖糖、甘露糖或葡聚糖)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、矫味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(如钠)；防腐剂(苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞(thimerosal)、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚丙二醇；糖醇(如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(如普朗尼克(pluronic)、PEG、聚山梨酸酯、聚山梨酸酯(如聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80)、曲通(triton)、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、四丁酚醛(tyloxapal))；稳定性增强剂(蔗糖或山梨醇)；张性增强剂(如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾；甘露醇；山梨醇)；递送溶媒；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。
药物组合物中主要的溶媒或载体在性质上可以为水性或非水性的。用于此类组合物的合适的溶媒或载体包括注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，它们可能补充有组合物中常见的用于肠外给药的其他物质。中性缓冲盐或盐与血清白蛋白的混合物是另一种示例性溶媒。包含抗-Dkk-1抗体或其免疫功能片段的组合物可以通过将所选的具有所需纯度的组分与可任选的调配剂以冷冻饼或水溶液形式混合来制备以便储存。另外，抗-Dkk-1抗体或其免疫功能片段可以用适当的赋形剂(如蔗糖)调配成冻干粉。制剂组分以给药位点可接受的浓度存在。可以使用缓冲剂来有利地将组合物维持在生理pH或稍低的pH下，通常在约4.0至约8.5或者约5.0至8.0之间的pH范围内。药物组合物可以包含约pH6.5至8.5的TRIS缓冲剂、或约pH4.0至5.5的柠檬酸盐缓冲剂，它们还可以包括山梨醇或其合适的替代物。
包含抗-Dkk-1抗体或其免疫功能片段的药物组合物的有效量取决于(例如)治疗内容和目标。本领域的技术人员应了解根据某些实施方式用于治疗的合适剂量水平一部分是根据所递送的分子、抗-Dkk-1抗体所用于的病症、给药途径、大小(体重、体表或器官大小)和/或患者的状况(年龄和一般健康状况)而改变。临床医师可以滴定剂量并改变给药途径以获得最佳治疗效果。通常的剂量范围为约0.1μg/kg至最多约100mg/kg或更高，根据上述因素而定。在某些实施方式中，剂量可以介于：0.1μg/kg至约150mg/kg；或1μg/kg至约100mg/kg；或5μg/kg至约50mg/kg。一般来说，目前希望抗-Dkk-1抗体或其免疫功能片段调配为在等渗缓冲盐(20mM组氨酸、150mM氯化钠、0.05％聚山梨酸酯80，pH 6.4)中浓度为至少10mg/mL的无菌的、清澈液体。通常的抗体制剂以单剂量形式装填，将0.6ml玻璃瓶装上每瓶3.3ml的溶液并且用West Fluortec Teflon涂覆的塞子塞封各瓶并用铝盖密封。
尽管用于骨质疏松适应症的抗体治疗的静脉内给药被认为是可接受的，但是本文抗体的最佳特征(profile)是皮下或腹膜内给药，两周一次或一月一次。
抗-Dkk-1抗体或片段在刺激成骨细胞活性和增加骨矿物质密度或骨量方面具有治疗用途。这些抗体和片段可因此用于治疗患有涉及过量骨损失的各种医学紊乱的患者或治疗甚至可以不必有过量破骨细胞活性之处需要新骨形成的患者。阻断Dkk-1活性会通过Wnt蛋白传递信号而导致成骨细胞活性增强。过量的破骨细胞活性与很多成骨病有关，这些成骨病可以用所提供的抗-Dkk-1抗体和免疫功能片段治疗，所述成骨病包括骨质减少、骨质疏松、牙周炎、佩吉特氏病、因固定术(immobilization)所致的骨质丢失、溶解性骨转移和关节炎，包括类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎和涉及骨侵蚀的其他病况。
还可以治疗各种其他低骨量病况，包括各种形式的骨质疏松，包括但不限于糖皮质激素诱导的骨质疏松、移植后诱导的骨质疏松、与化疗相关的骨质疏松、固定术诱导的骨质疏松、因机械卸荷(mechanical unloading)所致的骨质疏松、和与抗惊厥药物使用相关的骨质疏松。可用一些抗体或片段治疗的其他骨病包括与肾衰竭和营养相关的骨病、与肠胃和/或肝相关的骨病。
还可以治疗不同形式的关节炎，实例包括骨关节炎和类风湿性关节炎。抗体和片段还可以用于治疗与关节炎(例如，类风湿性关节炎)相关的全身骨损失。在治疗关节炎方面，患者可以通过本发明抗体或其片段的病灶周围或病灶内注射而获益。例如，抗体或其片段可以临近或直接注射到发炎的关节，从而刺激该部位受损的骨的修复。
已知一些癌症能够增加破骨细胞的活性并诱导骨再吸收，例如乳腺癌和前列腺癌。在骨髓中发生的多发性骨髓瘤也与骨损失相关，其可能部分是因为血浆细胞Dkk-1表达增加，这然后抑制临近的成骨细胞的造骨活性。通过给予本发明抗体或其免疫功能片段降低Dkk-1活性可以引起用于抗衡过量破故细胞活性的成骨细胞活性增加，从而降低上述疾病的严重程度，减少骨侵蚀并诱导患者的新骨形成。
用某些抗-Dkk-1-特异的抗体或免疫功能片段治疗可以在患有骨质减少疾病的患者中诱导骨矿物质密度显著增加。用本文所述的抗体或免疫功能片段进行的Dkk-1抑制还可用于各种骨修复应用中。例如，某些抗体和片段可以用于延缓与人工关节相关的磨损性碎片的骨质溶解，加速骨折修复，并增强骨移植物整合到它们所移植到的周围活骨之中。
抗-Dkk-1抗体或其免疫功能片段可以单独或与其他治疗剂组合给药，例如与癌症治疗剂、与抑制破骨细胞活性的药剂或与其他增强成骨细胞活性的药剂组合。例如，本发明的抗体可以给予正在经受放射治疗或化疗的癌症患者。
抗-Dkk-1抗体及其免疫功能片段可以单独用于治疗上面所提及的导致骨量损失的病况或者与治疗有效量的骨生长促进(合成代谢)剂或抗骨再吸收剂组合，该骨生长促进剂或抗骨再吸收剂包括但不限于：称为BMP-1至BMP-12的骨形态发生因子；转化生长因子-β和TGF-β家族成员；成纤维细胞生长因子FGF-1至FGF-10；白细胞介素-1抑制剂、INFα抑制剂；RANK配体抑制剂、甲状旁腺激素(PTH)、E系列前列腺素、双膦酸盐、和强骨矿物质，如氟化物和钙。可与本发明的抗体及其功能片段组合的合成代谢剂包括甲状旁腺激素和胰岛素样生长因子(IGF)，其中后一种药剂优选与IGF结合蛋白络合。
此外，抗-Dkk-1抗体可以与结合肿瘤细胞并诱导对肿瘤生长的细胞毒和/或细胞抑制作用的抗体组合给予患者。此类抗体的实例包括结合肿瘤细胞上存在的细胞表面蛋白Her2、CDC20、CDC33、粘蛋白样糖蛋白I和表皮生长因子受体(EGFR)并且诱导对展示这些蛋白的肿瘤细胞的细胞抑制和/或细胞毒作用的那些。而且，组合治疗可以包括选择性诱导肿瘤细胞调亡的癌症治疗剂多肽，如TNF-相关的TRAIL。
抗-Dkk-1抗体或其免疫功能片段可以与用于相同病况给药的其他治疗和治疗剂同时给药。抗-Dkk-1抗体或其免疫功能片段可以预防性地给药以防止或减轻早期癌症(I期或II期)引发的骨量损失，或者可以被给药以改善因为肿瘤转移到骨上而引起的骨量损失的现有病况。本发明的抗-Dkk-1抗体可以用于预防和/或治疗骨内肿瘤细胞的生长。在肿瘤细胞刺激破骨细胞吸收内部骨基质时转移到骨的癌症可以容易地扩散。用抗-Dkk-1抗体或其免疫功能片段的治疗通过刺激成骨细胞活性增加而有助于维持此转移瘤处的骨矿物质密度。任何可能转移到骨的癌症都可以在癌转移发生之前或之后用给药抗-Dkk-1抗体来预防或治疗。
期望本文的抗体可以作为单一疗法起效。然而，还期望的是本文的抗体可以与如下的现有骨质疏松治疗剂一起给药：例如(但不限于)阿仑膦酸钠(alendronate)、利塞膦酸钠(risedronate)、艾本膦酸钠(ibandronate)、唑来膦酸(zoledronic acid)、降血钙素、雌激素、PTH、和结合雌激素、雷洛昔芬(raloxifene)和其他选择性雌激素受体调节剂、特立帕肽(teriparatide)、维生素D及其代谢物等。除了这些经认可的治疗外，还期望本文的抗体提供目前正在开发的用于治疗骨质疏松的一些方法中任何方法的协同/附加效果，所述方法包括但不限于组织蛋白酶K抑制剂、ATP6抑制剂、氯离子通道-7抑制剂、denosumab、或其他抗-RANK抗体或抑制剂、护骨素-Fc、αvβ3膜整连蛋白拮抗剂、和calcilytic等。
Dkk-1还通过抑制成骨细胞分化而参与骨髓瘤骨病的发病中。Tian等人(N.Engl.J.Med.349：2483-2494(2003))发现在具有局部骨病灶的多发性骨髓瘤(MM)患者中Dkk-1基因和Dkk-1蛋白过度表达。在体外，重组人Dkk-1或具有高Dkk-1水平的骨髓血浆抑制成骨细胞功能。这种影响通过用多克隆的抗-Dkk-1抗体可以中和。还显示治疗(自体干细胞移植)后Dkk-1水平的降低可能与成骨细胞功能的正常化相关，这可以为开发阻断Dkk-1活性的药剂(如本文所公开的抗体)从而恢复成骨细胞的功能并抵抗在骨髓瘤中观察到的破骨细胞生成增加提供基础(参见，Politou等人In J Cancer 119：1728(2006))。
移植了表达不同水平的Dkk-1的原代多发性骨髓瘤细胞(primarymultiple myeloma cells)的小鼠在用对照或Dkk-1中和抗体处理4至6周时，显示在对照中BMD降低，但是在抗-Dkk抗体组BMD则比处理前水平增加了(p＜0.001)。抗-DKK1抗体的骨合成代谢作用与降低的多发性骨髓瘤负荷相关(p＜0.04)。作者的结论是，Dkk-1在多发性骨髓瘤骨病中有重要作用，在多发性骨髓瘤的骨中阻断Dkk-1的活性能减少溶骨再吸收、增加骨形成、并且帮助控制多发性骨髓瘤生长(参见，Yaccoby等人，Blood.2006Oct 26；[在印刷前电子出版])。此外，PC-3前列腺癌细胞表达Wnt抑制剂Dkk-1。在鼠骨髓间质(bone marrow stromal)细胞中降低Dkk-1水平使得PC-3细胞能够诱导成骨细胞活性，包括碱性磷酸酶产生和矿化作用，这表明Dkk-1在PC-3细胞中组断了Wnt介导的成骨活性(Hall等人Cancer Res 65：7554(2005))。总之，上述结果表明Wnt信号和Dkk-1参与了已知癌细胞向骨微环境的侵袭。因此，本文所公开的Dkk-1抗体及其免疫功能片段可提供用于缓解癌细胞(例如，多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌等)侵袭骨微环境的骨破坏作用的治疗。
下面的实施例用于进一步增加对本发明的理解。
实施例1
使用剑桥抗体技术(Cambridge Antibody Technology)(CAT)人单链Fv噬菌体展示文库(Cambridgeshire，英国)制备人抗-Dkk-1抗体。针对猕猴和小鼠Dkk-1(分别为RhDkk-1和MsDkk-1)二者筛选文库。对每个文库进行针对生物素标记的Dkk-1(100nM)的三轮溶液基(solution-based)筛选。尽管小鼠和猕猴Dkk-1之间的序列相同性和相似性的百分比很高，但是采用了6种不同的筛选策略来确保选择的文库能与来自两个物种的Dkk-1交叉反应(表4)。所有后续数据来源于方案(E)。
表4
Figure A20088000937400371
为验证所选的scFv-噬菌体克隆的抗原特异性，对来自各文库第2轮的176个噬菌体克隆和来自各文库第三轮的88个克隆进行时间分辨荧光(TRF)ELISA分析的测试，该分析使用过度表达LRP5或LRP6的HEK293细胞和用荧光铕螯合物(Eu)标记的猕猴或小鼠Dkk-1蛋白进行。通过测定结合配体的时间分辨荧光来监控Eu-Dkk-1蛋白与过度表达人LRP5或LRP6的人胚胎肾脏HEK293细胞的结合。当Dkk-1蛋白结合表达LRP5(或6)的细胞时，检测到强烈的信号。当在抗-Dkk-1抗体存在下检测Dkk-1时，荧光信号的降低表明了对Dkk-1/LRP5(或6)相互作用的干扰。在此次初步分析中，测试了264个Dkk-1scFV抑制Dkk-1蛋白结合细胞表面的能力。根据上面的分析，选择在小组中经鉴别能抑制Dkk-1结合细胞表面的20个scFV(表5)来转化成全长的人IgG。
Figure A20088000937400391
编码重链可变区的DNA与编码IgG2M4恒定区的DNA框内融合，而编码轻链可变区的DNA与编码与相应可变区对准的λ或κ轻链恒定区的DNA框内融合。所得抗体表达载体显示在质粒图(图1A和1B)中，使用编码抗体RH2-18的表达载体作为实例。克隆步骤在下面描述。所用的轻链λ载体由我们自己构建(built in-house)并且包含与人CMV(HCMV)启动子侧接的克隆位点、在一个克隆位点5’端的前导序列、轻链λ序列和另一个克隆位点3’端的牛生长激素(BGH)pA多聚腺苷酸化信号。所用的重链IgG2M4恒定区载体由我们自己构建并且包含与HCMV启动子侧接的克隆位点、在一个克隆位点5’端的前导序列、重链IgG2M4序列和另一个克隆位点3’端的BGH pA多聚腺苷酸化信号。表达载体携带用于在293EBNA细胞中延长表达的来自爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)病毒基因组的oriP、用于卡巴霉素选择标记的细菌序列、和大肠杆菌中的复制起点。抗体氨基末端的前导序列介导表达的抗体分泌到培养基中。重链的前导序列为MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(SEQ ID NO：29)，轻链的为：MSVPTQVLGLLLLWLTDARC(SEQ ID NO：30)。剩余的19个scFv前导序列以相同的方式转化为IgG。
为制备图1A和1B中所示的载体，在25μL体积的高保真PCR主混合物、1μL体积的模板和分别为1μL体积的正向和反向引物中对各可变区进行PCR扩增。PCR条件为94℃2分钟的一个循环，94℃1.5分钟、60℃1.5分钟和72℃1.5分钟的25个循环以及最后在72℃下延伸7分钟。使用下面的PCR引物：重链正向引物5’-ACAGG TGTCC ACTCG GAGGT GCAGCTGGTG CAGTC T-3′(SEQ ID NO：31)；重链反向引物5’-GCCCT TGGTGGATGC ACTCG AGACG GTGAC CAGGG T-3′(SEQ ID NO：32)和轻链正向引物5’-ACAGA TGCCA GATGC CAGTC TGTGT TGACG CAGCC G-3′(SEQ ID NO：33)；轻链反向引物5’-GTTGG CCTTG GGCTG ACTTA AAACGGTGAG CTGGG T-3′(SEQ ID NO：34)。使用内融合(In-Fusion)策略(Clontech，Palo Alto，CA)将扩增的轻链和重链可变区PCR产物与适当的5’端前导序列和3’恒定区进行框内克隆，然后将它们克隆到得自Stratagene(La Jolla，CA)的大肠杆菌XL10细胞内。通过测序来确定克隆的DNA序列并且从DNA序列推断氨基酸序列。RH2-18轻链和重链(没有前导序列)的氨基酸序列显示在图1C中。可变区为斜体。图1D和1E显示用于RH2-18轻链和重链可变区的CDR区，框内还标明了RH2-18轻链和重链可变区与种系中相应区域之间的序列差异。
用FUGENE转染试剂(FUGENE是Fugent LLC的商标，可得自RocheDiagnostics，Nutley，NJ)将上述质粒转染到293EBNA单层细胞中。在不含血清的OPTI-MEM培养基(Invitrogen)中孵育转染的细胞并用蛋白A/G亲和层析从培养基中纯化分泌的抗体。纯化抗体的浓度通过280nm处的OD测定，纯度通过LABCHIP毛细管SDS凝胶电泳(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)测定。图1F显示12个转化的抗体的LABCHIP电泳分析结果。泳道2显示RH2-18抗体。纯化的抗体用于如本文所述的体外鉴定。上述质粒还用于RH2-18抗体的批量生产，用于体内动物研究的其他抗体描述于动物研究部分。
对于所有的生物分析，猕猴Dkk-1蛋白通过杆状病毒表达来制备并且经由金属亲和树脂纯化。根据与猕猴(和小鼠)Dkk-1蛋白的结合能力来选择从CAT-文库筛选分离的抗-Dkk-1抗体。为测定抗体是否抑制Dkk-1与细胞表面受体(LRP5/6)的相互作用以及是否抑制Dkk-1的功能，建立了下列分析：基于细胞的Dkk-1-结合分析、测量典型(canonical)Wnt-信号转导的Dkk-1功能分析、和使用成骨细胞分化标记碱性磷酸酶(ALP)进行的用于Dkk-1功能分析的细胞分化分析。以连续顺序进行上述分析以选择用于如下目的的中和抗体：(a)阻断Dkk-1与LRP5/6的结合；(b)抑制Wnt信号转导中的Dkk-1-功能；(c)在体外中和Dkk-1对骨细胞分化的负面功能。
实施例2
使用基于时间分辨荧光(TRF)细胞的分析来显示4种抗-Dkk-1抗体对Dkk-1与LRP5/6结合的抑制。
对于该分析，将终浓度为0.2、0.6、2.0、6.0、和20nM的抗-Dkk-1抗体添加到过度表达LRP5(HEK293hLrp5细胞)的HEK细胞中。使用抗-IL3受体单克隆抗体(8B4)作为阴性对照。在不存在或存在抗体的条件下用Eu-标记的Dkk-1(100pM)孵育细胞20分钟。用4次洗涤步骤除去在溶液中被抗体结合从而与HEK293hLrp5细胞的细胞表面结合受到阻断的DKK-1，通过TRF信号检测Eu-标记的Dkk-1与细胞表面的结合。通过测定结合配体的时间分辨荧光来监测Eu-标记的Dkk-1蛋白与过度表达人LRP5或LRP6的HEK293细胞的结合。这些抗体的前5种(RH1-10、RH2-18、RH2-31、RH2-59、和RH2-80)的结果显示在图2A和2B中。图2A显示Eu-Dkk-1与HEK293hLrp5细胞的结合以及上述5种抗体抑制Dkk-1与LRP5结合的能力。图2A显示RH2-18抗体在扩大的剂量范围内抑制Dkk-1结合LRP5的效价。图2B显示在这种分析形式下，RH2-18的有效剂量为约5nM。图2A和2B的数据显示抗-Dkk-1抗体的抑制活性基本能在低纳摩范围(对于RH2-18抗体为4.75nM)完成(substantial to complete in the low nanomolarrange)。使用Eu-标记的重组小鼠Dkk-1的另外分析提供了类似的结果，这表明所选择的抗-Dkk-1抗体的抑制机制对于小鼠和猕猴Dkk-1蛋白来说是保守的。
实施例3
此实施例显示抗-Dkk-1抗体对Wnt信号转导中的Dkk-1功能的中和活性。Dkk-1是通过β-连环素(β-catenin)和核Lef-1/TCF进行的典型Wnt信号转导的负调节子。
用具有Lef-1/TCF结合位点的报告质粒(pTOPflash)和编码Lef-1的表达载体共转染HEK293hLrp5细胞。如由报告物(荧光素酶)的活性增加所表明，经pTOPflash/Lef-1转染的细胞对Wnt配体高度反应。猕猴Dkk-1(50nM)在此细胞系统中有力地抑制pTopflash活性。在此还测试了抗-Dkk-1抗体RH1-10、RH2-18、RH2-31、和RH2-80在20小时的时间期间内中和Dkk-1功能的能力。以10、30、和100nM的浓度添加抗-Dkk-1抗体。图3中所示的结果表明，所有受测的抗-Dkk-1抗体都阻断了Dkk-1与细胞表面LRP5的结合并因此抑制了Wnt3A信号转导通路中Dkk-1的功能活性。如图3中所示，用Wnt3A的处理与对照相比显著刺激了信号通路并且猕猴Dkk-1抑制报告物读数的Wnt3A激活。抗体在30nM和更高的浓度中和Dkk-1的作用。注意对于受测的所有抗-Dkk-1抗体，信号都会升高至高于仅有Wnt3A配体时。(观察到的)这种作用要求将重组Dkk-1蛋白添加到分析系统，因为在平行分析中，在没有外源添加的猕猴-Dkk-1蛋白的条件下观察不到此抗体对Wnt信号转导的影响。
实施例4
测试了体外中和Dkk-1抗体对成骨细胞分化的影响。通过用成骨因子处理会使多能间充质细胞系C3H10T1/2分化成成骨细胞系。Wnt3A处理3天能诱导早期成骨标记碱性磷酸酶(ALP)表达。Dkk-1抑制Wnt3A诱导的分化，如通过测量内源ALP活性所测定。这种成骨细胞分化系统提供了相关的细胞背景和更长的3天分析期。
C3H10T1/2细胞的成骨细胞分化通过检测内源ALP活性的增加来测定。细胞在培养中生长至汇合并用Wnt3A处理3天以诱导成骨细胞分化。用重组Dkk-1进行并行处理抑制Wnt3A诱导的ALP活性。如在图4中所示，当以10nM、30nM或100nM的终浓度添加抗-Dkk-1抗体RH2-18、RH2-59、或RH2-80时，Dkk-1对成骨细胞分化的抑制功能以剂量依赖的方式被中和。100nM RH2-18对Dkk-1的中和作用几乎是完全的并且其稳定性足以在3天的分析期内产生并维持中和作用。发现RH2-31几乎没有效力/稳定性，因此在进一步的研究中将其排除(数据未显示)。在处理的前24小时内所诱导的内源标记基因(TROY、IGFBP2、Axin2)的相关分析显示，这些抗体在这种细胞背景下阻断Dkk-1对Wnt3a诱导的基因表达的抑制的能力类似。
实施例5
构建了RH2-18抗体的表位图。Dkk-1蛋白由分别位于N-末端和C-末端区的两个半胱氨酸富含区构成。我们制备了编码猕猴Dkk-1的N末端或C末端区的Dkk-1缺失构建体，并且确定了位于Dkk-1的C末端半部的富含半胱氨酸的结构域2对于Dkk-1结合受体LRP5/6是必需和足够的。
本文所公开的中和抗-Dkk-1抗体不能检测Western免疫印迹上的变性Dkk-1蛋白。另外，它们不结合衍生自Dkk-1C末端的离散的肽。这表明被本文抗-Dkk-1抗体所识别的Dkk-1上的表位是复合的(即，基于拓扑构象的而非基于肽的)。
图5A显示Rh2-18的斑点印迹结合分析。猕猴Dkk-1蛋白与GFP标签融合(上样对照)。表达全长的猕猴Dkk-1蛋白、C末端区(ΔN-Dkk-1，编码氨基酸残基159至266)或N末端区(ΔC-Dkk-1)并通过斑点免疫印迹用RH2-18抗体分析。简言之，在瞬时转染的293细胞中表达带GFP标签的DKK1变体，原始的(native)条件培养基直接印迹到硝酸纤维素膜上。用标签抗体(抗-GFP，Abcam Inc.，Cambridge，MA)或抗-Dkk-1抗体RH2-18探测结合的天然蛋白。用偶合至碱性磷酸酶的二抗检测结合的抗体。
斑点印迹分析显示中和抗体RH2-18(以及RH1-10、RH2-31、RH2-59、RH2-80)与Dkk-1C末端区(氨基酸159至266)的结合。这表明抗体表位主要位于Dkk-1的富含半胱氨酸的结构域2内。此外，斑点印迹分析显示抗体结合天然蛋白(而Western印迹不显示与变性蛋白的结合)。通过同源模型用共脂肪酶预测Dkk-1的C-末端区能形成球形三级结构(如下面所述)。这些数据总体表明，本文抗Dkk-1抗体(尤其是RH2-18)的表位由复合表位限定，该复合表位受该抗体内富含半胱氨酸的结构域2的序列和三级结构二者的影响。
使用定点突变(丙氨酸扫描方法)的C末端区的另外分析鉴定了氨基酸残基S187至V188、R203至K208、以及E241至L243是对RH2-18与Dkk-1的结合而言最重要的Dkk-1氨基酸残基。在这个方面，这些残基的突变引起了在斑点印迹分析中抗体结合突变Dkk-1的能力显著下降(参见图5B)。图5B显示，在Dkk-1C末端结构域中通过多种氨基酸取代引起了Rh2-18结合的损失，如斑点印迹结合分析所测定。猕猴Dkk-1蛋白与GFP标签融合(上样对照)。表达全长的猕猴Dkk-1蛋白、C末端区(ΔN-Dkk-1，编码氨基酸残基159至266)或N末端区(ΔC-Dkk-1，编码残基1至158)并通过斑点免疫印迹用RH2-18抗体分析。将丙氨酸取代引入ΔN-Dkk-1并且指出了受影响的氨基酸残基。根据通过丙氨酸扫描进行的独立的结构/功能分析，经鉴定C末端区的氨基酸残基R203、H204(F205)为Dkk-1结合LRP6所必需的(参见Identification of DKK1 Residues Necessary for Interaction withLRP5/6.Lipfert等人，J.Bone Miner.Res.21：S99(2006))。因此，这些残基对于Dkk-1功能(结合LRP5/6)和结合RH2-18抗体来说都很重要。Dkk-1与LRP5相互作用所需的关键氨基酸残基与用于Dkk1结合RH2-18的氨基酸残基的重叠为RH2-18抗体的抑制活性提供了解释。
最好在第二富含半胱氨酸的结构域的三维模型背景中考虑对图5B中所示的突变影响的解释(参见图5C)。图5C显示Dkk-1C-末端区(氨基酸187至266)的结构同源性模型，其显示了Dkk-1结合RH2-18抗体所必需的氨基酸残基，如丙氨酸扫描所测定(参见图5C)。发现被取代会导致在使用非变性蛋白的免疫印迹实验中抗原-抗体相互作用减弱的氨基酸残基是氨基酸残基S187至V188、R203至K208、E24和L243，这些氨基酸残基似乎在复合表位的形成中发挥作用。在C-末端同源模型中显示的氨基酸序列之外的氨基酸残基R171至L174对复合表位也有影响。此外，用丙氨酸取代氨基酸C220也会导致RH2-18与Dkk-1结合损失。
因此，RH2-18抗体结合的复合表位包含来自第二半胱氨酸富含结构域的不同离散区域的、经鉴定为抗体结合所必需的氨基酸残基：氨基酸残基S187和V188，二者都在第一指结构域之前的区域中；氨基酸R203、H204、F205、W206、S207、和K208，它们所有构成了结构域的第一指结构。进一步接近结构域的C-末端，并且在第二指结构之前为E241和L243，它们也是RH2-18结合Dkk-1所需的。最后，Cys220是RH2-18结合Dkk-1所必需的。预测Cys220在适当的三级结构的建立及RH2-18与Dkk-1的结合中起重要作用，再次表明该表位的复合性质。总之，数据表明RH2-18表位是由包括但不限于Dkk-1的第一指结构域A202-I209的Dkk-1C-末端区的拓扑表面所限定的。
人Dkk-1、-2、-4、和猕猴Dkk-1的氨基酸序列比较(图6A)显示，位于Dkk-1内、如上所述鉴定为对RH2-18结合Dkk-1很重要的氨基酸残基缺乏保守性。在Dkk-1内的认为是RH2-18结合所必需的氨基酸残基在蓝色框内显示。注意在Dkk-1和Dkk-2和Dkk-4之间缺乏下列氨基酸残基的序列保守性：Arg171至Leu174、Ser187至Val188、Ser207和Glu241。根据Dkk-1中结合RH2-18所必需的残基的表位图并且根据Dkk-1和Dkk-2和Dkk-4在氨基酸残基Arg171至Leu174、Ser187、Val188、Ser207、和Glu241处序列保守性的缺乏，预计RH2-18和具有相似表位的其他抗体对Dkk-1具有高度选择性。
Dkk-1氨基酸序列在氨基酸水平上与Dkk-2和Dkk-4极为相关，分别与它们具有50％和45％的相同性。通过斑点杂交用重组蛋白测试RH2-18对猕猴Dkk-2(使用嵌合蛋白，其由融合了猕猴Dkk-2C末端区的猕猴Dkk-1N末端区组成，在Dkk-2C末端区的C末端有myc和His-6标签；参见SEQ IDNO：71)和食蟹猴Dkk-4(SEQ ID NO：70)的交叉反应。使用原初的重组(nativerecombinant)猕猴Dkk-1、Dkk-2、和食蟹猴Dkk-4蛋白(0.1ng至100ng)。上样不相关的重组蛋白作为非特异性分析信号的对照(HIS蛋白)。用RH2-18探测斑点印迹。图6B显示几乎没有或没有可检测的RH2-18与Dkk-2或Dkk-4的特异性结合。抗体对Dkk-1的选择性最小为100倍。在这个分析形式中，RH2-18结合猕猴Dkk-1的检出限为约1ng。这些Dkk同种型的所有浓度的信号强度与不相关的HIS标签蛋白的信号强度是相当的。与表位图和序列比对数据一致，该结果显示抗体几乎没有乃至没有与这些蛋白的交叉反应，这表明RH2-18结合Dkk-2或Dkk-4的可能性很小。这些数据表明RH2-18和类似抗体识别新的、复合的、涵盖Dkk-1的几个离散区域的三维表位，这表明Rh2-18和类似抗体是独特的。
实施例6
用于人Dkk-1和猕猴Dkk-1的RH2-18的亲和性通过测量RH2-18的结合动力来测定，RH2-18的结合动力通过在Biacore 3000仪器(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ)上根据厂家说明进行的表面等离子体共振来测定。使用抗人Dkk-1和猕猴Dkk-1的不同RH2-18抗体批次进行一些独立的亲和研究。对于各个实验，结合人Dkk-1的计算的Kd值范围为202至269pM，平均值为251pM。对于猕猴Dkk-1，范围在771至934pM之间，平均值为858pM。
Rh2-18抗体的质量通过尺寸排阻色谱法与其他经充分鉴定的mAB比较来评估。结果表明RH2-18抗体具有优良的稳定性，因为没有明显的聚集。
实施例7
在体内药效学和效力研究中评定了RH2-18。
存在的遗传学观念证据(proof-of-concept)数据表明在发育的骨骼中破坏Dkk-1/Wnt相互作用会引起骨量增加。此外，Amgen所开发的抗-Dkk-1抗体在三周的研究中注入大鼠时是促成骨的(30mg/kg，每周两次，皮下)(参见，DKK1 Inhibition Increases Bone Mineral Density in Rodents Grisanti M等人，J.Bone Miner.Res.21：S25(2006))。以类似的方式给药类似的时间期间时，在生长的小鼠和成年小鼠内都观察到了骨量增加。用RH2-18进行体内观念证据研究以在药理学上验证表型。此研究在生长的小鼠中进行，并且计划以后在成年骨骼中测试反应。因此，本研究的目的是建立以下事实：在体外中和所有受测Dkk-1功能的Rh2-18抗体增加生长的骨骼中的骨量。因此，测试的假设是Rh2-18能在生长的小鼠的长骨中以剂量影响方式增加骨量。
获得5周龄的C57BL/6J雌性小鼠并使其适应动物房一周。以每只小鼠0.1mL磷酸盐缓冲液皮下(s.c.)给药RH2-18抗体。每组11只小鼠。用0、0.5、1.5、或5mg/kg RH2-18抗体或0.4mg/kg PTH(1-34)(皮下，3次/周)连续处理小鼠4周，每周2次。在尸检时，将股骨和椎骨分离并固定在70％乙醇中。通过Piximus(GE/Lunar；Schenectady，NY)双能X射线吸收分光光度法扫描整个股骨。将股骨再分为位于距远端0至3mm处的远端感兴趣区域(ROI)和位于距远端5至10mm处的中心感兴趣区域。中心ROI由100％骨密质(cortical bone)构成，而远端ROI为约20％脊柱骨(trabecular bone)。Piximus软件计算整个骨(WFBMD)、远端股骨(DFBMD)、和中心股骨(CFBMD)的骨矿物质密度(BMD，mg/m2)。结果显示在图7至9中。
图7显示在0.5至5mg/kg剂量范围内RH2-18抗体使远端股骨骨矿物质密度(BMD)以剂量影响方式增加了5.2至8.7％。这种BMD的改变很可能表示对骨松质和骨密质二者的影响。图8显示在1.5至5mg/kg剂量范围内RH2-18抗体使整个股骨BMD增加了4.7至4.8％。这种BMD的改变很可能表示对松质骨和密质骨二者的影响。图9显示在1.5至5mg/kg剂量范围内RH2-18抗体使中心股骨BMD以剂量影响方式增加了3.2至3.5％。这种BMD的改变主要表示对骨密质的影响。
这些结果表明，给药RH2-18抗体至小鼠4周的时间以剂量依赖的方式引起生长的雌性小鼠中骨量的显著增加。
可以从这些结果中得出结论，给药Rh2-18抗体(它阻断Dkk-1与Wnt的相互作用)至小鼠将在生长的小鼠中产生高的骨密度。因此，有可能使用诸如RH2-18之类的抗体中和Dkk-1/Wnt信号阻断从而增加生长的骨骼中的骨量。
实施例8
典型的Wnt信号级联调控肠上皮细胞的增殖。编码胞质信号中间物(β-连环素、APC、axin)的基因中的基因损害会引起增强的转录活性，这与所有结肠癌中的90％以上都有关联。至今为止，还没有描述调控此通路的细胞表面受体或分泌型中间物(包括Dkk-1)的此类致瘤突变。但是，评定了中和Dkk-1的抗体的可能的致瘤效果。
Dkk-1抗体应仅对表达Dkk-1的组织起作用。因此，Dkk-1的组织分布是测定安全性时的重要因素。在小鼠中，Dkk-1主要在骨中表达(约64倍于表达次高的组织)，如下表6所示。
表6
在选择的小鼠组织中Dkk-1表达的CT值
Figure A20088000937400471
表6显示在选择的小鼠组织中Dkk-1表达的CT值。为了参考，CT是阈值循环数。它是实时定量PCR分析中的PCR循环数，在该循环时可以检测到报告荧光相对于背景的统计学显著增加。在30s的中至高区间内的CT值(CT values in the mid-upper 30s)代表表达很低至没有表达。将mRNA水平定义为：低，30＜CT＜40；中度，30＜CT＜25，高，25＜CT＜15。如上所述，Dkk-1表达在膀胱、肠、肝、和子宫中很低或根本没有，在骨中为中度表达。
在人组织中，观察到相同组织中的Dkk-1表达水平根据供体而有所变化。在正常的肠(intestine)、结肠或肝中，表达一般为最低的检测水平(CT值在30s的高区间内(即，不可检测))，这些组织中Wnt信号转导异常与肿瘤发生相关。对于人膀胱、子宫颈、胃和子宫(与Wnt/β连环素诱导的肿瘤无关的组织)，平均的Dkk-1CT值在20s高区间内，而在我们从膝关节置换之后的患者中获得的几个骨样品中则为30左右。在此方面，Dkk-1表达在通常与Wnt信号诱导的肿瘤无关的组织中最高。相反，胞质突变可与肿瘤发生相关的组织显示没有显著的Dkk-1表达。
对于人细胞系，Dkk-1CT值在MG-63、Caco-2、MCF-7、SW480和HCT116细胞中为中等20s，而在HEK-293、SW48和DLD1细胞中则在30的范围内。后两种细胞系源自具有胞质Wnt信号通路突变的结肠癌组织。在人组织样品中，与相对应的正常组织相比，肿瘤中Dkk-1倾向于上调。在这些研究中，测量了在这些细胞中的Dkk-1表达并通过实时定量PCR分析使用TAQMAN系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)将其与其他增殖标记(Ki-67、PCNA、E2F1和IGFBP-3)的表达进行比较。将所有数据CT值都转化为对相应的正常样品的诱导倍数。总之，小鼠Dkk-1中Dkk-1的组织分布表明此基因的mRNA主要在骨中表达，而在人中则在骨、膀胱和子宫颈(cervix)表达。Dkk-1在大多数人肿瘤或癌细胞系中高度上调，如同几个已知的增殖标记一样。
为了监测抗-Dkk-1抗体在体内对正常组织增殖的影响，在处理4周(实施例7中所述的观念证据研究)的小鼠中对上文所述的增殖标记(Ki-67、PCNA、E2F1)的水平和与细胞增生相关的基因(IGFBP-3、Dkk-1)的水平进行定量。选择这些标记物作为所选组织(肠、肝、膀胱、子宫)中细胞增殖的量度。使用TAQMAN系统的定量PCR分析显示，在四周的处理后在抗-Dkk-1抗体处理样品与对照样品中增殖标记的表达没有任何的一致性或者是实质性的差异。
基于Dkk-1在结肠癌细胞系中表达更高，在体外评估了抗-Dkk-1抗体对转录和增殖的影响。使用显示组成性活性的Wnt信号的结肠癌细胞系-SW480、HCT116、SW48、DLD1和HEK293，在增殖分析中检测RH2-80抗体(30μg/mL)。使用MG-63骨肉瘤细胞和非特异性抗体8B4作为对照。对于细胞增殖的测量，根据美国模式培养物保藏种心(ATCC)的方案培养细胞。在进行增殖分析前一天，将在100μL相应培养基中的新制备的细胞以2至5×103细胞/孔接种到96孔Cytostar闪烁板中。在第二天，添加带有RH2-80抗体、8B4抗体、或Wnt3A的0.5μCi/mL[甲基-14C]胸苷到各孔中。在添加抗体后1天、2天、3天和5天用1450 MICROBETA Jet(Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)测量细胞生长。[甲基-14C]胸苷掺入细胞越多相应地在MICROBETA Jet上在Cytostar板内检测到的光就越强。在第三天，对细胞补充含有处理物的新鲜培养基。图10B中所示的数据表示第3天的处理。
使用显示组成性活性的Wnt信号的结肠癌细胞系-SW480、HCT116、SW48、DLD1和HEK293在TOPFlash转录分析中检测RH2-80抗体(30μg/mL)。使用MG-63骨肉瘤细胞和非特异性抗体8B4作为对照。
对于分析中Wnt/DKK1信号的测量，在转染前一天，将在100μL根据ATCC方案的完全培养基中的细胞以2500个细胞/孔接种到96孔板中。在转染当天，将60μL FuGene6、375ng pTopflash、80ng pTKrenilla、和5μgpcDNA3.1-LEF1添加到终体积为600μL的OPTIMEM中。将混合物在室温下孵育1小时。然后将1.4mL OPTIMEM添加到上述混合物中并轻轻地混合充分。然后将20μL DNA混合物添加到96孔板的各孔中。轻轻拍打板，放回37℃培养箱中。转染后一天，用RH2-80抗体、8B4抗体、或Wnt3A处理细胞。处理约24小时后，根据Promega方案进行双荧光素酶分析。在计算诱导之前首先将荧光素酶信号标准化为水母(renilla)(荧光素酶)信号。通过与对照信号比较获得诱导倍数。
使用HCT116细胞进行的转录和增殖分析的结果显示在图10A和10B中。总体来说，结果表明很多细胞具有高基线转录水平，不能进一步被Wnt处理增强。对于所有的细胞系，单独的RH2-80不能增强LEF-1/TCF启动子活性。观察到在对Wnt3a处理不反应的细胞(如HCT116)中缺乏反应性。独立的分析显示抗-Dkk-1抗体RH2-80没有改变内源Wnt靶基因的表达，这些内源Wnt靶基因包括myc、jun、PPARd、FGF18、COX2、IGF-1、和IGF-2。另外，在所有6个受测细胞系中，都没有如下的Wnt信号组分的诱导：Dkk-1、Dkk-2、Dkk-4、LRP5、LRP6、Sost、WIF1、和CTGF。
在细胞增殖研究中，结果显示，在各个受测的细胞系中，RH2-80(30μg/mL)没有增强任何细胞生长。分析在存在血清并且不补充或补充Wnt3a处理物的条件下进行。RH2-80抗体对HCT116细胞增殖的影响结果显示在图11B中。平行分析测试了RH2-80和RH2-59抗体(都为16μg/mL)对MG-63、HCT116和SW480细胞生长的影响。在含血清的培养基中没有观察到生长的增强。在不含血清的OPTIMEM培养基中测试时，与溶媒(N.S.)相比没有观察到RH2-80抗体处理对MG-63和HCT116细胞的细胞生长刺激。观察到了RH2-80和RH2-59(具有相似效力的抗-Dkk-1抗体)与20C2HA(阴性对照)相比的显著性，两者与溶媒对照(N.S.)相比倾向于具有轻微抗增生效果。重复的分析显示，在OPTIMEM中抗体对HCT116细胞(以更高的初始密度接种)和SW480细胞没有影响。在这个方面，对于用RH2-59或20C2HA处理的细胞，生长没有下降趋势，并且同样，RH2-80与溶媒对照的表现相同。
还在具有人结肠癌异种移植物的SCID小鼠中进行了抗-Dkk-1抗体的进一步研究。在用于肿瘤生长的这种异种移植模型中，使用磷酸盐缓冲液(PBS)作为溶媒，在毕赤(Pichia)菌株中表达的5mpk RH2-18抗体作为测试组，而0.02mpk Wnt3a作为阳性对照。将100μL PBS中的1×107HCT116细胞皮下注射到约6周龄的NOD.CB17-Prkdcscid/J(SCID)小鼠的右侧腹和左侧腹。在注射后第二天进行处理并持续进行两周，共处理7次。在3.5周后分离肿瘤。通过一只小鼠两个肿瘤的和除以小鼠总体重得到肿瘤重量百分比。用斯氏t检验进行统计。结果显示在图11中。与PBS(溶媒)处理组相比，Wnt3a显著增加了肿瘤生长，增加约为2倍。与溶媒处理相比抗体没有显著刺激肿瘤生长。在溶媒组的4只动物中有2只显示在腹部有一些肿瘤细胞的迹象，这在其他组中没有观察到。这种可能的HCT116细胞向腹部的浸润可能会由于感兴趣区域的细胞损失而造成这些小鼠中的表观肿瘤尺寸的假性(artificial)减少，因此可能降低这些组中的肿瘤大小。
***
尽管本发明在本文中参考所例示的实施方式进行说明，但是应理解本发明并不限于此。本领域的普通技术人员应认识到根据本文的指示可以在其范围内进行其他的修改和实施方式。因此，本发明仅受本文所附权利要求的限制。
序列表
<110>默克公司(Merck & Co.，Inc.)
     Z.安(An，Zhiqiang)
     F.陈(Chen，Fang)
     J.E.费希尔(Fisher，John E.)
     H.格兰特施尼希(Glantschnig，Helmut)
     D.B.基梅尔(Kimmel，Donald B.)
     A.A.雷什卡(Reszka，Alfred)
     F.王(Wang，Fubao)
<120>DKK-1的特异性抗体
<130>PCT-22295
<150>60/900,226
<151>2007-02-08
<160>71
<170>用于Windows 4.0版的FastSEQ
<210>1
<211>714
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-18抗体轻链DNA序列
<400>1
atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgc 60
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 120
tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 180
cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggttaca gcaatcggcc ctcaggggtc 240
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc gcctcagcct ccctggccat cactgggctc 300
cggcctgacg atgaggctga ttactattgc cagtcctatg acaacagcct gagttcttat 360
gtcttcggag gtgggaccca gctcaccgtt ttaagtcagc ccaaggccaa ccccaccgtg 420
accctgttcc ccccatcttc tgaggagctg caagccaaca aggccaccct ggtgtgcctg 480
atctctgact tctaccctgg cgctgtgaca gtggcctgga aggctgatgg ctctcctgtg 540
aaggctggcg tggagaccac caagccatct aagcagtcta acaacaagta tgctgcctct 600
tcttacctgt ctctgacccc tgagcagtgg aagagccacc ggtcttactc ttgccaggtg 660
acccatgagg gctctacagt ggagaagaca gtggccccca cagagtgctc ttga       714
<210>2
<211>237
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-18抗体轻链氨基酸序列
<400>2
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
 1               5                  10                  15
Asp Ala Arg Cys Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly
            20                  25                  30
Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn
        35                  40                  45
Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr
    50                  55                  60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Tyr Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala
                85                  90                  95
Ile Thr Gly Leu Arg Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
            100                 105                 110
Tyr Asp Asn Ser Leu Ser Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu
        115                 120                 125
Thr Val Leu Ser Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp
                165                 170                 175
Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln
            180                 185                 190
Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu
        195                 200                 205
Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly
    210                 215                 220
Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225                 230                 235
<210>3
<211>217
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>无前导序列的RH2-18抗体轻链氨基酸序列
<400>3
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
 1               5                  10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
            20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Tyr Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Ser
                85                  90                  95
Leu Ser Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser
            100                 105                 110
Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
        115                 120                 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
                165                 170                 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
            180                 185                 190
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
        195                 200                 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
    210                 215
<210>4
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-18抗体轻链可变区序列
<400>4
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
 1               5                  10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
            20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Tyr Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Ser
                85                  90                  95
Leu Ser Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser
            100                 105                 110
<210>5
<211>1374
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-18抗体重链DNA序列
<400>5
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcggag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120
tgcaaggctt ctggatacac cttcaccgac tactatatac actgggtgcg acaggcccct 180
ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc cactctaaca gtggcgccac aacctatgca 240
cagaagtttc aggccagggt caccatgagc agggacacgt ccagcagcac agcctacatg 300
gagttgagca ggctggaatc tgacgacacg gccatgtatt tttgttcgag agaggactac 360
tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg agtgcatcca ccaagggccc atccgtcttc 420
cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc 480
aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 540
gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 600
accgtgacct ccagcaactt tggcacgcag acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc 660
agcaacacca aggtggacaa gacagttgag cggaaatgct gcgtggagtg cccaccatgc 720
ccagcacctc cagtggccgg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 780
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 840
cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 900
ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 960
caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 1020
tccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 1080
ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1140
ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1200
tacaagacca cgcctcccat gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagcta 1260
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1320
gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctcctggtaa atga       1374
<210>6
<211>457
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-18抗体重链氨基酸序列
<400>6
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
 1               5                  10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
Thr Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Trp Ile His Ser Asn Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Gln Lys Phe Gln Ala Arg Val Thr Met Ser Arg Asp Thr Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Glu Ser Asp Asp Thr Ala Met
            100                 105                 110
Tyr Phe Cys Ser Arg Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
        115                 120                 125
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
    130                 135                 140
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
145                 150                 155                 160
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
                165                 170                 175
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
            180                 185                 190
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly
        195                 200                 205
Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
    210                 215                 220
Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys
225                 230                 235                 240
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
                245                 250                 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            260                 265                 270
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
        275                 280                 285
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Tnr Lys Pro Arg Glu Glu
    290                 295                 300
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305                 310                 315                 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                325                 330                 335
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
            340                 345                 350
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
        355                 360                 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
    370                 375                 380
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
385                 390                 395                 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
                405                 410                 415
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
            420                 425                 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
        435                 440                 445
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455
<210>7
<211>438
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>无前导序列的Rh2-18抗体重链氨基酸序列
<400>7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile His Ser Asn Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Ala Arg Val Thr Met Ser Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Glu Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
        115                 120                 125
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
    130                 135                 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145                 150                 155                 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
                165                 170                 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
            180                 185                 190
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
        195                 200                 205
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
    210                 215                 220
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
225                 230                 235                 240
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                245                 250                 255
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
            260                 265                 270
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
        275                 280                 285
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
    290                 295                 300
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
305                 310                 315                 320
Ser Ser Ile Glu Lys ThrIle Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
                325                 330                 335
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
            340                 345                 350
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
        355                 360                 365
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
    370                 375                 380
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
385                 390                 395                 400
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
                405                 410                 415
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
            420                 425                 430
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435
<210>8
<211>110
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Rh2-18重链可变区
<400>8
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
  1              5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile His Ser Asn Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Ala Arg Val Thr Met Ser Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Glu Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
<210>9
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-18 HC CDR1
<400>9
Asp Tyr Tyr Ile His
 1               5
<210>10
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-18 HC CDR2
<400>10
Trp Ile His Ser Asn Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
 1               5                  10                  15
Ala
<210>11
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-18 HC CDR3
<400>11
Glu Asp Tyr
 1
<210>12
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-18 LC CDR1
<400>12
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
 1               5                   10
<210>13
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-18 LC CDR2
<400>13
Gly Tyr Ser Asn Arg Pro Ser
 1               5
<210>14
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-18LC CDR3
<400>14
Gln Ser Tyr Asp Asn Ser Leu Ser Ser Tyr Val
 1               5                  10
<210>15
<211>113
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH1 1-3 1-02重链可变区
<400>15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser
<210>16
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL1 14-7A轻链可变区序列
<400>16
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
 1               5                  10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
            20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
                85                  90                  95
Leu Ser Gly Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>17
<211>714
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RH1-10抗体轻链DNA序列
<400>17
atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgc 60
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 120
tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gctggttatg atgtacactg gtaccagcag 180
cttccaggag cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca gcaatcggcc ctcaggggtc 240
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 300
caggctgagg atgaggctga ttattattgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttat 360
gtcttcggaa ctgggaccaa ggtcaccgtc ctaggtcagc ccaaggccaa ccccaccgtg 420
accctgttcc ccccatcttc tgaggagctg caagccaaca aggccaccct ggtgtgcctg 480
atctctgact tctaccctgg cgctgtgaca gtggcctgga aggctgatgg ctctcctgtg 540
aaggctggcg tggagaccac caagccatct aagcagtcta acaacaagta tgctgcctct 600
tcttacctgt ctctgacccc tgagcagtgg aagagccacc ggtcttactc ttgccaggtg 660
acccatgagg gctctacagt ggagaagaca gtggccccca cagagtgctc ttga       714
<210>18
<211>237
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH1-10抗体轻链氨基酸序列
<400>18
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
 1               5                  10                  15
Asp Ala Arg Cys Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly
            20                  25                  30
Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn
        35                  40                  45
Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala
    50                  55                  60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala
                85                  90                  95
Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
            100                 105                 110
Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val
        115                 120                 125
Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp
                165                 170                 175
Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln
            180                 185                 190
Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu
        195                 200                 205
Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly
    210                 215                 220
Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225                 230                 235
<210>19
<211>1374
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RH1-10抗体重链DNA序列
<400>19
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcgcag 60
gtgcagctgt tgcagtctgc agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 120
tgtaagggtt ctggatacga ctttcccggc tactatctgc actgggtgcg acaggcccct 180
ggacaaggcc ttgagtggat gggctggatc aacgctaaca gtggtgccac aaattatgca 240
cagaactttc agggcagggt caccatgacc agggacacgt ccatcagcgc agcttacatg 300
gagctgagca gcctgagatc tgacgacacg gccgtctatt attgtacgag agaggaccac 360
tggggccgag ggaccacggt caccgtctcc tcagcatcca ccaagggccc atccgtcttc 420
cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc 480
aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 540
gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 600
accgtgacct ccagcaactt tggcacgcag acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc 660
agcaacacca aggtggacaa gacagttgag cggaaatgct gcgtggagtg cccaccatgc 720
ccagcacctc cagtggccgg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 780
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 840
cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 900
ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 960
caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 1020
tccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 1080
ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1140
ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1200
tacaagacca cgcctcccat gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagcta 1260
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1320
gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctcctggtaa atga       1374
<210>20
<211>457
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH1-10抗体重链氨基酸序列
<400>20
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
 1               5                  10                  15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asp Phe
        35                  40                  45
Pro Gly Tyr Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Asn Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Gln Asn Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser
                85                  90                  95
Ala Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Asp His Trp Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr
        115                 120                 125
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
    130                 135                 140
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
145                 150                 155                 160
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
                165                 170                 175
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
            180                 185                 190
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly
        195                 200                 205
Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
    210                 215                 220
Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys
225                 230                 235                 240
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
                245                 250                 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            260                 265                 270
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
        275                 280                 285
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
    290                 295                 300
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305                 310                 315                 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                325                 330                 335
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
            340                 345                 350
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
        355                 360                 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
    370                 375                 380
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
385                 390                 395                 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
                405                 410                 415
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
            420                 425                 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
        435                 440                 445
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455
<210>21
<211>700
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-59抗体轻链DNA序列
<400>21
atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgc 60
caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 120
tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 180
cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatgctaaca ccaatcggcc ctcagggatc 240
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcggcct ccctggccat cactgggctc 300
cagactgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acaccagccc gagtgcctct 360
tatgtcttcg gaactgggac caagctgacc gtcctaggtc agcccaaggc caaccccacc 420
gtgaccctgt tccccccatc ttctgaggag ctgcaagcca acaaggccac cctggtgtgc 480
ctgatctctg acttctaccc tggcgctgtg acagtggcct ggaaggctga tggctctcct 540
gtgaaggctg gcgtggagac caccaagcca tctaagcagt ctaacaacaa gtatgctgcc 600
tcttcttacc tgtctctgac ccctgagcag tggaagagcc accggtctta ctcttgccag 660
gtgacccatg agggctctac agtggagaag acagtggccc                       700
<210>22
<211>238
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-59抗体轻链氨基酸序列
<400>22
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
 1               5                  10                  15
Asp Ala Arg Cys Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly
            20                  25                  30
Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn
        35                  40                  45
Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr
    50                  55                  60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Ile
65                  70                  75                  80
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala
                85                  90                  95
Ile Thr Gly Leu Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
            100                 105                 110
Tyr Asp Thr Ser Pro Ser Ala Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys
        115                 120                 125
Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe
    130                 135                 140
Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys
145                 150                 155                 160
Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala
                165                 170                 175
Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys
            180                 185                 190
Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro
        195                 200                 205
Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu
    210                 215                 220
Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225                 230                 235
<210>23
<211>1374
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-59抗体重链DNA序列
<400>23
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcggaa 60
gtgcagetgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120
tgcaaggctt ctggatacac cttcaccgac tactatatac actgggtgcg acaggcccct 180
ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc cactctaaca gtggcgccae aacctatgca 240
cagaagtttc aggccagggt caccatgagc agggacacgt ccagcagcac agcctacatg 300
gagttgagca ggctggaatc tgacgacacg gccatgtatt tttgttcgag agaggactac 360
tggggcagag ggacaatggt caccgtctcg agtgcatcca ccaagggccc atccgtcttc 420
cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc 480
aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 540
gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 600
accgtgacct ccagcaactt tggcacgcag acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc 660
agcaacacca aggtggacaa gacagttgag cggaaatgct gcgtggagtg cccaccatgc 720
ccagcacctc cagtggccgg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 780
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 840
cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 900
ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 960
caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 1020
tccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 1080
ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1140
ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1200
tacaagacca cgcctcccat gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagcta 1260
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1320
gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctcctggtaa atga       1374
<210>24
<211>457
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-59抗体重链氨基酸序列
<400>24
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
 1               5                  10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
Thr Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Trp Ile His Ser Asn Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Gln Lys Phe Gln Ala Arg Val Thr Met Ser Arg Asp Thr Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Glu Ser Asp Asp Thr Ala Met
            100                 105                 110
Tyr Phe Cys Ser Arg Glu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr
        115                 120                 125
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
    130                 135                 140
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
145                 150                 155                 160
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
                165                 170                 175
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
            180                 185                 190
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly
        195                 200                 205
Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
    210                 215                 220
Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys
225                 230                 235                 240
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
                245                 250                 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            260                 265                 270
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
        275                 280                 285
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
    290                 295                 300
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305                 310                 315                 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                325                 330                 335
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
            340                 345                 350
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
        355                 360                 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
    370                 375                 380
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
385                 390                 395                 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
                405                 410                 415
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
            420                 425                 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
        435                 440                 445
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455
<210>25
<211>714
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-80抗体轻链DNA序列
<400>25
atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgc 60
caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtctccatc 120
tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcagcttatg atgtacactg gtaccagcag 180
cttccaggaa cagcccccag actcctcatc tatgttaaca acaatcggcc ctcaggggtc 240
cctgaccgat tctctggctc caagtcgggc acctcagcct ccctagtcat tgctgggctc 300
caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acaatagtct gaatgcttat 360
gtcttcggaa ctgggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggccaa ccccaccgtg 420
accctgttcc ccccatcttc tgaggagctg caagccaaca aggccaccct ggtgtgcctg 480
atctctgact tctaccctgg cgctgtgaca gtggcctgga aggctgatgg ctctcctgtg 540
aaggctggcg tggagaccac caagccatct aagcagtcta acaacaagta tgctgcctct 600
tcttacctgt ctctgacccc tgagcagtgg aagagccacc ggtcttactc ttgccaggtg 660
acccatgagg gctctacagt ggagaagaca gtggccccca cagagtgctc ttga       714
<210>26
<211>237
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-80抗体轻链氨基酸序列
<400>26
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
 1               5                  10                  15
Asp Ala Arg Cys Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly
            20                  25                  30
Ala Pro Gly Gln Arg Val Ser Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn
        35                  40                  45
Ile Gly Ala Ala Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr
    50                  55                  60
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Val Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Val
                85                  90                  95
Ile Ala Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
            100                 105                 110
Tyr Asp Asn Ser Leu Asn Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu
        115                 120                 125
Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp
                165                 170                 175
Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln
            180                 185                 190
Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu
        195                 200                 205
Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly
    210                 215                 220
Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225                 230                 235
<210>27
<211>1374
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-80抗体重链DNA序列
<400>27
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcggag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120
tgcaaggctt ctggatacac cttcaccgac tactatatac actgggtgcg acaggcccct 180
ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc cactctaaca gtggcgccac aacctatgca 240
cagaagtttc aggccagggt caccatgagc agggacacgt ccagcagcac agcctacatg 300
gagttgagca ggctggaatc tgacgacacg gccatgtatt tttgttcgag agaggactac 360
tggggcaaag ggacaatggt caccgtctcg agtgcatcca ccaagggccc atccgtcttc 420
cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc 480
aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 540
gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 600
accgtgacct ccagcaactt tggcacgcag acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc 660
agcaacacca aggtggacaa gacagttgag cggaaatgct gcgtggagtg cccaccatgc 720
ccagcacctc cagtggccgg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 780
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 840
cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 900
ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 960
caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 1020
tccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 1080
ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1140
ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1200
tacaagacca cgcctcccat gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagcta 1260
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1320
gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctcctggtaa atga       1374
<210>28
<211>457
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-80抗体重链氨基酸序列
<400>28
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
 1               5                  10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
Thr Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Trp Ile His Ser Asn Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Gln Lys Phe Gln Ala Arg Val Thr Met Ser Arg Asp Thr Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Glu Ser Asp Asp Thr Ala Met
            100                 105                 110
Tyr Phe Cys Ser Arg Glu Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Met Val Thr
        115                 120                 125
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
    130                 135                 140
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
145                 150                 155                 160
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
                165                 170                 175
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
            180                 185                 190
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly
        195                 200                 205
Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
    210                 215                 220
Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys
225                 230                 235                 240
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
                245                 250                 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            260                 265                 270
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
        275                 280                 285
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
    290                 295                 300
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305                 310                 315                 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                325                 330                 335
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
            340                 345                 350
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
        355                 360                 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
    370                 375                 380
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
385                 390                 395                 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
                405                 410                 415
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
            420                 425                 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
        435                 440                 445
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455
<210>29
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链的前导序列
<400>29
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
 1               5                  10                  15
Val His Ser
<210>30
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的前导序列
<400>30
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
 1               5                  10                  15
Asp Ala Arg Cys
            20
<210>31
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物，重链正向
<400>31
acaggtgtcc actcggaggt gcagctggtg cagtct    36
<210>32
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物，重链反向
<400>32
gcccttggtg gatgcactcg agacggtgac cagggt    36
<210>33
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物，轻链正向
<400>33
acagatgcca gatgccagtc tgtgttgacg cagccg    36
<210>34
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物，轻链反向
<400>34
gttggccttg ggctgactta aaacggtgag ctgggt    36
<210>35
<211>266
<212>PRT
<213>智人(Homo Sapien)
<220>
<221>变体
<222>(1)...(266)
<223>Dkk-1前体
<400>35
Met Met Ala Leu Gly Ala Ala Gly Ala Thr Arg Val Phe Val Ala Met
 1               5                  10                  15
Val Ala Ala Ala Leu Gly Gly His Pro Leu Leu Gly Val Ser Ala Thr
            20                  25                  30
Leu Asn Ser Val Leu Asn Ser Asn Ala Ile Lys Asn Leu Pro Pro Pro
        35                  40                  45
Leu Gly Gly Ala Ala Gly His Pro Gly Ser Ala Val Ser Ala Ala Pro
    50                  55                  60
Gly Ile Leu Tyr Pro Gly Gly Asn Lys Tyr Gln Thr Ile Asp Asn Tyr
65                  70                  75                  80
Gln Pro Tyr Pro Cys Ala Glu Asp Glu Glu Cys Gly Thr Asp Glu Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Ser Pro Thr Arg Gly Gly Asp Ala Gly Val Gln Ile Cys Leu
            100                 105                 110
Ala Cys Arg Lys Arg Arg Lys Arg Cys Met Arg His Ala Met Cys Cys
        115                 120                 125
Pro Gly Asn Tyr Cys Lys Asn Gly Ile Cys Val Ser Ser Asp Gln Asn
    130                 135                 140
His Phe Arg Gly Glu Ile Glu Glu Thr Ile Thr Glu Ser Phe Gly Asn
145                 150                 155                 160
Asp His Ser Thr Leu Asp Gly Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Leu Ser Ser
                165                 170                 175
Lys Met Tyr His Thr Lys Gly Gln Glu Gly Ser Val Cys Leu Arg Ser
            180                 185                 190
Ser Asp Cys Ala Ser Gly Leu Cys Cys Ala Arg His Phe Trp Ser Lys
        195                 200                 205
Ile Cys Lys Pro Val Leu Lys Glu Gly Gln Val Cys Thr Lys His Arg
    210                 215                 220
Arg Lys Gly Ser His Gly Leu Glu Ile Phe Gln Arg Cys Tyr Cys Gly
225                 230                 235                 240
Glu Gly Leu Ser Cys Arg Ile Gln Lys Asp His His Gln Ala Ser Asn
                245                 250                 255
Ser Ser Arg Leu His Thr Cys Gln Arg His
            260                 265
<210>36
<211>259
<212>PRT
<213>智人(Homo Sapien)
<220>
<221>变体
<222>(1)...(259)
<223>Dkk-2前体
<400>36
Met Ala Ala Leu Met Arg Ser Lys Asp Ser Ser Cys Cys Leu Leu Leu
 1               5                  10                  15
Leu Ala Ala Val Leu Met Val Glu Ser Ser Gln Ile Gly Ser Ser Arg
            20                  25                  30
Ala Lys Leu Asn Ser Ile Lys Ser Ser Leu Gly Gly Glu Thr Pro Gly
        35                  40                  45
Gln Ala Ala Asn Arg Ser Ala Gly Met Tyr Gln Gly Leu Ala Phe Gly
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Lys Gly Lys Asn Leu Gly Gln Ala Tyr Pro Cys Ser Ser
65                  70                  75                  80
Asp Lys Glu Cys Glu Val Gly Arg Tyr Cys His Ser Pro His Gln Gly
                85                  90                  95
Ser Ser Ala Cys Met Val Cys Arg Arg Lys Lys Lys Arg Cys His Arg
            100                 105                 110
Asp Gly Met Cys Cys Pro Ser Thr Arg Cys Asn Asn Gly Ile Cys Ile
        115                 120                 125
Pro Val Thr Glu Ser Ile Leu Thr Pro His Ile Pro Ala Leu Asp Gly
    130                 135                 140
Thr Arg His Arg Asp Arg Asn His Gly His Tyr Ser Asn His Asp Leu
145                 150                 155                 160
Gly Trp Gln Asn Leu Gly Arg Pro His Thr Lys Met Ser His Ile Lys
                165                 170                 175
Gly His Glu Gly Asp Pro Cys Leu Arg Ser Ser Asp Cys Ile Glu Gly
            180                 185                 190
Phe Cys Cys Ala Arg His Phe Trp Thr Lys Ile Cys Lys Pro Val Leu
        195                 200                 205
His Gln Gly Glu Val Cys Thr Lys Gln Arg Lys Lys Gly Ser His Gly
    210                 215                 220
Leu Glu Ile Phe Gln Arg Cys Asp Cys Ala Lys Gly Leu Ser Cys Lys
225                 230                 235                 240
Val Trp Lys Asp Ala Thr Tyr Ser Ser Lys Ala Arg Leu His Val Cys
                245                 250                 255
Gln Lys Ile
<210>37
<211>224
<212>PRT
<213>智人(Homo Sapien)
<220>
<221>变体
<222>(1)...(224)
<223>Dkk-4前体
<400>37
Met Val Ala Ala Val Leu Leu Gly Leu Ser Trp Leu Cys Ser Pro Leu
 1               5                  10                  15
Gly Ala Leu Val Leu Asp Phe Asn Asn Ile Arg Ser Ser Ala Asp Leu
            20                  25                  30
His Gly Ala Arg Lys Gly Ser Gln Cys Leu Ser Asp Thr Asp Cys Asn
        35                  40                  45
Thr Arg Lys Phe Cys Leu Gln Pro Arg Asp Glu Lys Pro Phe Cys Ala
    50                  55                  60
Thr Cys Arg Gly Leu Arg Arg Arg Cys Gln Arg Asp Ala Met Cys Cys
65                  70                  75                  80
Pro Gly Thr Leu Cys Val Asn Asp Val Cys Thr Thr Met Glu Asp Ala
                85                  90                  95
Thr Pro Ile Leu Glu Arg Gln Leu Asp Glu Gln Asp Gly Thr His Ala
            100                 105                 110
Glu Gly Thr Thr Gly His Pro Val Gln Glu Asn Gln Pro Lys Arg Lys
        115                 120                 125
Pro Ser Ile Lys Lys Ser Gln Gly Arg Lys Gly Gln Glu Gly Glu Ser
    130                 135                 140
Cys Leu Arg Thr Phe Asp Cys Gly Pro Gly Leu Cys Cys Ala Arg His
145                 150                 155                 160
Phe Trp Thr Lys Ile Cys Lys Pro Val Leu Leu Glu Gly Gln Val Cys
                165                 170                 175
Ser Arg Arg Gly His Lys Asp Thr Ala Gln Ala Pro Glu Ile Phe Gln
            180                 185                 190
Arg Cys Asp Cys Gly Pro Gly Leu Leu Cys Arg Ser Gln Leu Thr Ser
        195                 200                 205
Asn Arg Gln His Ala Arg Leu Arg Val Cys Gln Lys Ile Glu Lys Leu
    210                 215                 220
<210>38
<211>250
<212>PRT
<213>猕猴(Maccaca Mulatta)
<220>
<221>变体
<222>(1)...(250)
<223>Dkk-1前体
<400>38
Met Met Ala Leu Gly Ala Ala Gly Ala Ala Arg Val Leu Val Ala Leu
 1               5                  10                  15
Ala Ala Ala Leu Gly Gly His Pro Leu Leu Gly Val Ser Ala Thr Asn
            20                  25                  30
Ser Val Leu Asn Ser Asn Ala Ile Lys Asn Leu Pro Pro Pro Gly Gly
        35                  40                  45
Ala Ala Gly His Pro Gly Ser Ala Val Ser Ala Ala Pro Ile Leu Tyr
    50                  55                  60
Pro Gly Gly Asn Lys Tyr Gln Thr Ile Asp Asn Tyr Pro Tyr Pro Cys
65                  70                  75                  80
Ala Glu Asp Glu Glu Cys Gly Thr Asp Glu Tyr Ala Ser Pro Thr Arg
                85                  90                  95
Gly Gly Asp Ala Gly Val Gln Ile Cys Leu Cys Arg Lys Arg Arg Lys
            100                 105                 110
Arg Cys Met Arg His Ala Met Cys Cys Gly Asn Tyr Cys Lys Asn Gly
        115                 120                 125
Ile Cys Val Ser Ser Asp Gln Asn Phe Arg Gly Glu Ile Glu Glu Thr
    130                 135                 140
Ile Thr Glu Ser Phe Gly Asn His Ser Thr Leu Asp Gly Tyr Ser Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Thr Leu Ser Ser Met Tyr His Ser Lys Gly Gln Glu Gly Ser
                165                 170                 175
Val Cys Leu Arg Ser Asp Cys Ala Thr Gly Leu Cys Cys Ala Arg His
            180                 185                 190
Phe Trp Ser Lys Cys Lys Pro Val Leu Lys Glu Gly Gln Val Cys Thr
        195                 200                 205
Lys His Arg Lys Gly Ser His Gly Leu Glu Ile Phe Gln Arg Cys Tyr
    210                 215                 220
Cys Gly Gly Leu Ser Cys Arg Ile Gln Lys Asp His His Gln Ala Ser
225                 230                 235                 240
Asn Ser Arg Leu His Thr Cys Gln Arg His
                245                 250
<210>39
<211>1615
<212>PRT
<213>智人(Homo Sapien)
<220>
<221>变体
<222>(1)...(1615)
<223>LRP5
<400>39
Met Glu Ala Ala Pro Pro Gly Pro Pro Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu
 1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Leu Ala Leu Cys Gly Cys Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ser
            20                  25                  30
Pro Leu Leu Leu Phe Ala Asn Arg Arg Asp Val Arg Leu Val Asp Ala
        35                  40                  45
Gly Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Ile Val Val Ser Gly Leu Glu Asp
    50                  55                  60
Ala Ala Ala Val Asp Phe Gln Phe Ser Lys Gly Ala Val Tyr Trp Thr
65                  70                  75                  80
Asp Val Ser Glu Glu Ala Ile Lys Gln Thr Tyr Leu Asn Gln Thr Gly
                85                  90                  95
Ala Ala Val Gln Asn Val Val Ile Ser Gly Leu Val Ser Pro Asp Gly
            100                 105                 110
Leu Ala Cys Asp Trp Val Gly Lys Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Glu
        115                 120                 125
Thr Asn Arg Ile Glu Val Ala Asn Leu Asn Gly Thr Ser Arg Lys Val
    130                 135                 140
Leu Phe Trp Gln Asp Leu Asp Gln Pro Arg Ala Ile Ala Leu Asp Pro
145                 150                 155                 160
Ala His Gly Tyr Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Glu Thr Pro Arg Ile
                165                 170                 175
Glu Arg Ala Gly Met Asp Gly Ser Thr Arg Lys Ile Ile Val Asp Ser
            180                 185                 190
Asp Ile Tyr Trp Pro Asn Gly Leu Thr Ile Asp Leu Glu Glu Gln Lys
        195                 200                 205
Leu Tyr Trp Ala Asp Ala Lys Leu Ser Phe I1e His Arg Ala Asn Leu
    210                 215                 220
Asp Gly Ser Phe Arg Gln Lys Val Val Glu Gly Ser Leu Thr His Pro
225                 230                 235                 240
Phe Ala Leu Thr Leu Ser Gly Asp Thr Leu Tyr Trp Thr Asp Trp Gln
                245                 250                 255
Thr Arg Ser Ile His Ala Cys Asn Lys Arg Thr Gly Gly Lys Arg Lys
            260                 265                 270
Glu Ile Leu Ser Ala Leu Tyr Ser Pro Met Asp Ile Gln Val Leu Ser
        275                 280                 285
Gln Glu Arg Gln Pro Phe Phe His Thr Arg Cys Glu Glu Asp Asn Gly
    290                 295                 300
Gly Cys Ser His Leu Cys Leu Leu Ser Pro Ser Glu Pro Phe Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Cys Ala Cys Pro Thr Gly Val Gln Leu Gln Asp Asn Gly Arg Thr Cys
                325                 330                 335
Lys Ala Gly Ala Glu Glu Val Leu Leu Leu Ala Arg Arg Thr Asp Leu
            340                 345                 350
Arg Arg Ile Ser Leu Asp Thr Pro Asp Phe Thr Asp Ile Val Leu Gln
        355                 360                 365
Val Asp Asp Ile Arg His Ala Ile Ala Ile Asp Tyr Asp Pro Leu Glu
    370                 375                 380
Gly Tyr Val Tyr Trp Thr Asp Asp Glu Val Arg Ala Ile Arg Arg Ala
385                 390                 395                 400
Tyr Leu Asp Gly Ser Gly Ala Gln Thr Leu Val Asn Thr Glu Ile Asn
                405                 410                 415
Asp Pro Asp Gly Ile Ala Val Asp Trp Val Ala Arg Asn Leu Tyr Trp
            420                 425                 430
Thr Asp Thr Gly Thr Asp Arg Ile Glu Val Thr Arg Leu Asn Gly Thr
        435                 440                 445
Ser Arg Lys Ile Leu Val Ser Glu Asp Leu Asp Glu Pro Arg Ala Ile
    450                 45                 5460
Ala Leu His Pro Val Met Gly Leu Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Glu
465                 470                 475                 480
Asn Pro Lys Ile Glu Cys Ala Asn Leu Asp Gly Gln Glu Arg Arg Val
                485                 490                 495
Leu Val Asn Ala Ser Leu Gly Trp Pro Asn Gly Leu Ala Leu Asp Leu
            500                 505                 510
Gln Glu Gly Lys Leu Tyr Trp Gly Asp Ala Lys Thr Asp Lys Ile Glu
        515                 520                 525
Val Ile Asn Val Asp Gly Thr Lys Arg Arg Thr Leu Leu Glu Asp Lys
    530                 535                 540
Leu Pro His Ile Phe Gly Phe Thr Leu Leu Gly Asp Phe Ile Tyr Trp
545                 550                 555                 560
Thr Asp Trp Gln Arg Arg Ser Ile Glu Arg Val His Lys Val Lys Ala
                565                 570                 575
Ser Arg Asp Val Ile Ile Asp Gln Leu Pro Asp Leu Met Gly Leu Lys
            580                 585                 590
Ala Val Asn Val Ala Lys Val Val Gly Thr Asn Pro Cys Ala Asp Arg
        595                 600                 605
Asn Gly Gly Cys Ser His Leu Cys Phe Phe Thr Pro His Ala Thr Arg
    610                 615                 620
Cys Gly Cys Pro Ile Gly Leu Glu Leu Leu Ser Asp Met Lys Thr Cys
625                 630                 635                 640
Ile Val Pro Glu Ala Phe Leu Val Phe Thr Ser Arg Ala Ala Ile His
                645                 650                 655
Arg Ile Ser Leu Glu Thr Asn Asn Asn Asp Val Ala Ile Pro Leu Thr
            660                 665                 670
Gly Val Lys Glu Ala Ser Ala Leu Asp Phe Asp Val Ser Asn Asn His
        675                 680                 685
Ile Tyr Trp Thr Asp Val Ser Leu Lys Thr Ile Ser Arg Ala Phe Met
    690                 695                 700
Asn Gly Ser Ser Val Glu His Val Val Glu Phe Gly Leu Asp Tyr Pro
705                 710                 715                 720
Glu Gly Met Ala Val Asp Trp Met Gly Lys Asn Leu Tyr Trp Ala Asp
                725                 730                 735
Thr Gly Thr Asn Arg Ile Glu Val Ala Arg Leu Asp Gly Gln Phe Arg
            740                 745                 750
Gln Val Leu Val Trp Arg Asp Leu Asp Asn Pro Arg Ser Leu Ala Leu
        755                 760                 765
Asp Pro Thr Lys Gly TyrIle Tyr Trp Thr Glu Trp Gly Gly Lys Pro
    770                 775                 780
Arg Ile Val Arg Ala Phe Met Asp Gly Thr Asn Cys Met Thr Leu Val
785                 790                 795                 800
Asp Lys Val Gly Arg Ala Asn Asp Leu Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Gln
                805                 810                 815
Arg Leu Tyr Trp Thr Asp Leu Asp Thr Asn Met Ile Glu Ser Ser Asn
            820                 825                 830
Met Leu Gly Gln Glu Arg Val Val Ile Ala Asp Asp Leu Pro His Pro
        835                 840                 845
Phe Gly Leu Thr Gln Tyr Ser Asp Tyr Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Asn
    850                 855                 860
Leu His Ser Ile Glu Arg Ala Asp Lys Thr Ser Gly Arg Asn Arg Thr
865                 870                 875                 880
Leu Ile Gln Gly His Leu Asp Phe Val Met Asp Ile Leu Val Phe His
                885                 890                 895
Ser Ser Arg Gln Asp Gly Leu Asn Asp Cys Met His Asn Asn Gly Gln
            900                 905                 910
Cys Gly Gln Leu Cys Leu Ala Ile Pro Gly Gly His Arg Cys Gly Cys
        915                 920                 925
Ala Ser His Tyr Thr Leu Asp Pro Ser Ser Arg Asn Cys Ser Pro Pro
    930                 935                 940
Thr Thr Phe Leu Leu Phe Ser Gln Lys Ser Ala Ile Ser Arg Met Ile
945                 950                 955                 960
Pro Asp Asp Gln His Ser Pro Asp Leu Ile Leu Pro Leu His Gly Leu
                965                 970                 975
Arg Asn Val Lys Ala Ile Asp Tyr Asp Pro Leu Asp Lys Phe Ile Tyr
            980                 985                 990
Trp Val Asp Gly Arg Gln Asn Ile Lys Arg Ala Lys Asp Asp Gly Thr
        995                 1000                1005
Gln Pro Phe Val Leu Thr Ser Leu Ser Gln Gly Gln Asn Pro Asp Arg
    1010                1015                1020
Gln Pro His Asp Leu Ser Ile Asp Ile Tyr Ser Arg Thr Leu Phe Trp
1025                1030                1035               1040
Thr Cys Glu Ala Thr Asn Thr Ile Asn Val His Arg Leu Ser Gly Glu
                1045                1050                1055
Ala Met Gly Val Val Leu Arg Gly Asp Arg Asp Lys Pro Arg Ala Ile
            1060                1065                1070
Val Val Asn Ala Glu Arg Gly Tyr Leu Tyr Phe Thr Asn Met Gln Asp
        1075                1080                1085
Arg Ala Ala Lys Ile Glu Arg Ala Ala Leu Asp Gly Thr Glu Arg Glu
    1090                1095                1100
Val Leu Phe Thr Thr Gly Leu Ile Arg Pro Val Ala Leu Val Val Asp
1105                1110                1115               1120
Asn Thr Leu Gly Lys Leu Phe Trp Val Asp Ala Asp Leu Lys Arg Ile
                1125                1130                1135
Glu Ser Cys Asp Leu Ser Gly Ala Asn Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ala
            1140                1145                1150
Asn Ile Val Gln Pro Leu Gly Leu Thr Ile Leu Gly Lys His Leu Tyr
        1155                1160                1165
Trp Ile Asp Arg Gln Gln Gln Met Ile Glu Arg Val Glu Lys Thr Thr
    1170                1175                1180
Gly Asp Lys Arg Thr Arg Ile Gln Gly Arg Val Ala His Leu Thr Gly
1185                1190                1195               1200
Ile His Ala Val Glu Glu Val Ser Leu Glu Glu Phe Ser Ala His Pro
                1205                1210                1215
Cys Ala Arg Asp Asn Gly Gly Cys Ser His Ile Cys Ile Ala Lys Gly
            1220                1225                1230
Asp Gly Thr Pro Arg Cys Ser Cys Pro Val His Leu Val Leu Leu Gln
        1235                1240                1245
Asn Leu Leu Thr Cys Gly Glu Pro Pro Thr Cys Ser Pro Asp Gln Phe
    1250                1255                1260
Ala Cys Ala Thr Gly Glu Ile Asp Cys Ile Pro Gly Ala Trp Arg Cys
1265                1270                1275               1280
Asp Gly Phe Pro Glu Cys Asp Asp Gln Ser Asp Glu Glu Gly Cys Pro
                1285                1290                1295
Val Cys Ser Ala Ala Gln Phe Pro Cys Ala Arg Gly Gln Cys Val Asp
            1300                1305                1310
Leu Arg Leu Arg Cys Asp Gly Glu Ala Asp Cys Gln Asp Arg Ser Asp
        1315                1320                1325
Glu Ala Asp Cys Asp Ala Ile Cys Leu Pro Asn Gln Phe Arg Cys Ala
    1330                1335                1340
Ser Gly Gln Cys Val Leu Ile Lys Gln Gln Cys Asp Ser Phe Pro Asp
1345                1350                1355               1360
Cys Ile Asp Gly Ser Asp Glu Leu Met Cys Glu Ile Thr Lys Pro Pro
                1365                1370                1375
Ser Asp Asp Ser Pro Ala His Ser Ser Ala Ile Gly Pro Val Ile Gly
            1380                1385                1390
Ile Ile Leu Ser Leu Phe Val Met Gly Gly Val Tyr Phe Val Cys Gln
        1395                1400                1405
Arg Val Val Cys Gln Arg Tyr Ala Gly Ala Asn Gly Pro Phe Pro His
    1410                1415                1420
Glu Tyr Val Ser Gly Thr Pro His Val Pro Leu Asn Phe Ile Ala Pro
1425                1430                1435               1440
Gly Gly Ser Gln His Gly Pro Phe Thr Gly Ile Ala Cys Gly Lys Ser
                1445                1450                1455
Met Met Ser Ser Val Ser Leu Met Gly Gly Arg Gly Gly Val Pro Leu
            1460                1465                1470
Tyr Asp Arg Asn His Val Thr Gly Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
        1475                1480                1485
Thr Lys Ala Thr Leu Tyr Pro Pro Ile Leu Asn Pro Pro Pro Ser Pro
    1490                1495                1500
Ala Thr Asp Pro Ser Leu Tyr Asn Met Asp Met Phe Tyr Ser Ser Asn
1505                1510                1515               1520
Ile Pro Ala Thr Val Arg Pro Tyr Arg Pro Tyr Ile Ile Arg Gly Met
                1525                1530                1535
Ala Pro Pro Thr Thr Pro Cys Ser Thr Asp Val Cys Asp Ser Asp Tyr
            1540                1545                1550
Ser Ala Ser Arg Trp Lys Ala Ser Lys Tyr Tyr Leu Asp Leu Asn Ser
        1555                1560                1565
Asp Ser Asp Pro Tyr Pro Pro Pro Pro Thr Pro His Ser Gln Tyr Leu
    1570                1575                1580
Ser Ala Glu Asp Ser Cys Pro Pro Ser Pro Ala Thr Glu Arg Ser Tyr
1585                1590                1595               1600
Phe His Leu Phe Pro Pro Pro Pro Ser Pro Cys Thr Asp Ser Ser
                1605                1610                1615
<210>40
<211>1613
<212>PRT
<213>智人(Homo Sapien)
<220>
<221>变体
<222>(1)...(1613)
<223>LRP6
<400>40
Met Gly Ala Val Leu Arg Ser Leu Leu Ala Cys Ser Phe Cys Val Leu
 1               5                  10                  15
Leu Arg Ala Ala Pro Leu Leu Leu Tyr Ala Asn Arg Arg Asp Leu Arg
            20                  25                  30
Leu Val Asp Ala Thr Asn Gly Lys Glu Asn Ala Thr Ile Val Val Gly
        35                  40                  45
Gly Leu Glu Asp Ala Ala Ala Val Asp Phe Val Phe Ser His Gly Leu
    50                  55                  60
Ile Tyr Trp Ser Asp Val Ser Glu Glu Ala Ile Lys Arg Thr Glu Phe
65                  70                  75                  80
Asn Lys Thr Glu Ser Val Gln Asn Val Val Val Ser Gly Leu Leu Ser
                85                  90                  95
Pro Asp Gly Leu Ala Cys Asp Trp Leu Gly Glu Lys Leu Tyr Trp Thr
            100                 105                 110
Asp Ser Glu Thr Asn Arg Ile Glu Val Ser Asn Leu Asp Gly Ser Leu
        115                 120                 125
Arg Lys Val Leu Phe Trp Gln Glu Leu Asp Gln Pro Arg Ala Ile Ala
    130                 135                 140
Leu Asp Pro Ser Ser Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Glu Val
145                 150                 155                 160
Pro Lys Ile Glu Arg Ala Gly Met Asp Gly Ser Ser Arg Phe Ile Ile
                165                 170                 175
Ile Asn Ser Glu Ile Tyr Trp Pro Asn Gly Leu Thr Leu Asp Tyr Glu
            180                 185                 190
Glu Gln Lys Leu Tyr Trp Ala Asp Ala Lys Leu Asn Phe Ile His Lys
        195                 200                 205
Ser Asn Leu Asp Gly Thr Asn Arg Gln Ala Val Val Lys Gly Ser Leu
    210                 215                 220
Pro His Pro Phe Ala Leu Thr Leu Phe Glu Asp Ile Leu Tyr Trp Thr
225                 230                 235                 240
Asp Trp Ser Thr His Ser Ile Leu Ala Cys Asn Lys Tyr Thr Gly Glu
                245                 250                 255
Gly Leu Arg Glu Ile His Ser Asp Ile Phe Ser Pro Met Asp Ile His
            260                 265                 270
Ala Phe Ser Gln Gln Arg Gln Pro Asn Ala Thr Asn Pro Cys Gly Ile
        275                 280                 285
Asp Asn Gly Gly Cys Ser His Leu Cys Leu Met Ser Pro Val Lys Pro
    290                 295                 300
Phe Tyr Gln Cys Ala Cys Pro Thr Gly Val Lys Leu Leu Glu Asn Gly
305                 310                 315                 320
Lys Thr Cys Lys Asp Gly Ala Thr Glu Leu Leu Leu Leu Ala Arg Arg
                325                 330                 335
Thr Asp Leu Arg Arg Ile Ser Leu Asp Thr Pro Asp Phe Thr Asp Ile
           340                 345                 350
Val Leu Gln Leu Glu Asp Ile Arg His Ala Ile Ala Ile Asp Tyr Asp
        355                 360                 365
Pro Val Glu Gly Tyr Ile Tyr Trp Thr Asp Asp Glu Val Arg Ala Ile
    370                 375                 380
Arg Arg Ser Phe Ile Asp Gly Ser Gly Ser Gln Phe Val Val Thr Ala
385                 390                 395                 400
Gln Ile Ala His Pro Asp Gly Ile Ala Val Asp Trp Val Ala Arg Asn
                405                 410                 415
Leu Tyr Trp Thr Asp Thr Gly Thr Asp ArgIle Glu Val Thr Arg Leu
            420                 425                 430
Asn Gly Thr Met Arg Lys Ile Leu Ile Ser Glu Asp Leu Glu Glu Pro
        435                 440                 445
Arg Ala Ile Val Leu Asp Pro Met Val Gly Tyr Met Tyr Trp Thr Asp
    450                 455                 460
Trp Gly Glu Ile Pro Lys Ile Glu Arg Ala Ala Leu Asp Gly Ser Asp
465                 470                 475                 480
Arg Val Val Leu Val Asn Thr Ser Leu Gly Trp Pro Asn Gly Leu Ala
                485                 490                 495
Leu Asp Tyr Asp Glu Gly Lys Ile Tyr Trp Gly Asp Ala Lys Thr Asp
            500                 505                 510
Lys Ile Glu Val Met Asn Thr Asp Gly Thr Gly Arg Arg Val Leu Val
        515                 520                 525
Glu Asp Lys Ile Pro His Ile Phe Gly Phe Thr Leu Leu Gly Asp Tyr
    530                 535                 540
Val Tyr Trp Thr Asp Trp Gln Arg Arg Ser Ile Glu Arg Val His Lys
545                 550                 555                 560
Arg Ser Ala Glu Arg Glu Val Ile Ile Asp Gln Leu Pro Asp Leu Met
                565                 570                 575
Gly Leu Lys Ala Thr Asn Val His Arg Val Ile Gly Ser Asn Pro Cys
            580                 585                 590
Ala Glu Glu Asn Gly Gly Cys Ser His Leu Cys Leu Tyr Arg Pro Gln
        595                 600                 605
Gly Leu Arg Cys Ala Cys Pro Ile Gly Phe Glu Leu Ile Ser Asp Met
    610                 615                 620
Lys Thr Cys Ile Val Pro Glu Ala Phe Leu Leu Phe Ser Arg Arg Ala
625                 630                 635                 640
AspIle Arg Arg Ile Ser Leu Glu Thr Asn Asn Asn Asn Val Ala Ile
               645                 650                 655
Pro Leu Thr Gly Val Lys Glu Ala Ser Ala Leu Asp Phe Asp Val Thr
            660                 665                 670
Asp Asn Arg Ile Tyr Trp Thr Asp Ile Ser Leu Lys Thr Ile Ser Arg
        675                 680                 685
Ala Phe Met Asn Gly Ser Ala Leu Glu His Val Val Glu Phe Gly Leu
    690                 695                 700
Asp Tyr Pro Glu Gly Met Ala Val Asp Trp Leu Gly Lys Asn Leu Tyr
705                 710                 715                 720
Trp Ala Asp Thr Gly Thr Asn Arg Ile Glu Val Ser Lys Leu Asp Gly
                725                 730                 735
Gln His Arg Gln Val Leu Val Trp Lys Asp Leu Asp Ser Pro Arg Ala
            740                 745                 750
Leu Ala Leu Asp Pro Ala Glu Gly Phe Met Tyr Trp Thr Glu Trp Gly
        755                 760                 765
Gly Lys Pro Lys Ile Asp Arg Ala Ala Met Asp Gly Ser Glu Arg Thr
    770                 775                 780
Thr Leu Val Pro Asn Val Gly Arg Ala Asn Gly Leu Thr Ile Asp Tyr
785                 790                 795                 800
Ala Lys Arg Arg Leu Tyr Trp Thr Asp Leu Asp Thr Asn Leu Ile Glu
                805                 810                 815
Ser Ser Asn Met Leu Gly Leu Asn Arg Glu Val Ile Ala Asp Asp Leu
            820                 825                 830
Pro His Pro Phe Gly Leu Thr Gln Tyr Gln Asp Tyr Ile Tyr Trp Thr
        835                 840                 845
Asp Trp Ser Arg Arg Ser Ile Glu Arg Ala Asn Lys Thr Ser Gly Gln
    850                 855                 860
Asn Arg Thr Ile Ile Gln Gly His Leu Asp Tyr Val Met Asp Ile Leu
865                 870                 875                 880
Val Phe His Ser Ser Arg Gln Ser Gly Trp Asn Glu Cys Ala Ser Ser
                885                 890                 895
Asn Gly His Cys Ser His Leu Cys Leu Ala Val Pro Val Gly Gly Phe
            900                 905                 910
Val Cys Gly Cys Pro Ala His Tyr Ser Leu Asn Ala Asp Asn Arg Thr
        915                 920                 925
Cys Ser Ala Pro Thr Thr Phe Leu Leu Phe Ser Gln Lys Ser Ala Ile
    930                 935                 940
Asn Arg Met Val Ile Asp Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ile Leu Pro
945                 950                 955                 960
Ile His Ser Leu Arg Asn Val Arg Ala Ile Asp Tyr Asp Pro Leu Asp
                965                 970                 975
Lys Gln Leu Tyr Trp Ile Asp Ser Arg Gln Asn Met Ile Arg Lys Ala
            980                 985                 990
Gln Glu Asp Gly Ser Gln Gly Phe Thr Val Val Val Ser Ser Val Pro
        995                 1000                1005
Ser Gln Asn Leu Glu Ile Gln Pro Tyr Asp Leu Ser Ile Asp Ile Tyr
    1010                1015                1020
Ser Arg Tyr Ile Tyr Trp Thr Cys Glu Ala Thr Asn Val Ile Asn Val
1025                1030                1035               1040
Thr Arg Leu Asp Gly Arg Ser Val Gly Val Val Leu Lys Gly Glu Gln
                1045                1050                1055
Asp Arg Pro Arg Ala Ile Val Val Asn Pro Glu Lys Gly Tyr Met Tyr
            1060                1065                1070
Phe Thr Asn Leu Gln Glu Arg Ser Pro Lys Ile Glu Arg Ala Ala Leu
        1075                1080                1085
Asp Gly Thr Glu Arg Glu Val Leu Phe Phe Ser Gly Leu Ser Lys Pro
    1090                1095                1100
Ile Ala Leu Ala Leu Asp Ser Arg Leu Gly Lys Leu Phe Trp Ala Asp
1105                1110                1115               1120
Ser Asp Leu Arg Arg Ile Glu Ser Ser Asp Leu Ser Gly Ala Asn Arg
                1125                1130                1135
Ile Val Leu Glu Asp Ser Asn Ile Leu Gln Pro Val Gly Leu Thr Val
            1140                1145                1150
Phe Glu Asn Trp Leu Tyr Trp Ile Asp Lys Gln Gln Gln Met Ile Glu
        1155                1160                1165
Lys Ile Asp Met Thr Gly Arg Glu Gly Arg Thr Lys Val Gln Ala Arg
    1170                1175                1180
Ile Ala Gln Leu Ser Asp Ile His Ala Val Lys Glu Leu Asn Leu Gln
1185                1190                1195               1200
Glu Tyr Arg Gln His Pro Cys Ala Gln Asp Asn Gly Gly Cys Ser His
                1205                1210                1215
Ile Cys Leu Val Lys Gly Asp Gly Thr Thr Arg Cys Ser Cys Pro Met
            1220                1225                1230
His Leu Val Leu Leu Gln Asp Glu Leu Ser Cys Gly Glu Pro Pro Thr
        1235                1240                1245
Cys Ser Pro Gln Gln Phe Thr Cys Phe Thr Gly Glu Ile Asp Cys Ile
    1250                1255                1260
Pro Val Ala Trp Arg Cys Asp Gly Phe Thr Glu Cys Glu Asp His Ser
1265                1270                1275               1280
Asp Glu Leu Asn Cys Pro Val Cys Ser Glu Ser Gln Phe Gln Cys Ala
                1285                1290               1295
Ser Gly Gln Cys Ile Asp Gly Ala Leu Arg Cys Asn Gly Asp Ala Asn
            1300                1305               1310
Cys Gln Asp Lys Ser Asp Glu Lys Asn Cys Glu Val Leu Cys Leu Ile
        1315                1320                1325
Asp Gln Phe Arg Cys Ala Asn Gly Gln Cys Ile Gly Lys His Lys Lys
    1330                1335                1340
Cys Asp His Asn Val Asp Cys Ser Asp Lys Ser Asp Glu Leu Asp Cys
1345                1350                1355               1360
Tyr Pro Thr Glu Glu Pro Ala Pro Gln Ala Thr Asn Thr Val Gly Ser
                1365                1370                1375
Val Ile Gly Val Ile Val Thr Ile Phe Val Ser Gly Thr Val Tyr Phe
            1380                1385                1390
Ile Cys Gln Arg Met Leu Cys Pro Arg Met Lys Gly Asp Gly Glu Thr
        1395                1400                1405
Met Thr Asn Asp Tyr Val Val His Gly Pro Ala Ser Val Pro Leu Gly
    1410                1415                1420
Tyr Val Pro His Pro Ser Ser Leu Ser Gly Ser Leu Pro Gly Met Ser
1425                1430                1435               1440
Arg Gly Lys Ser Met Ile Ser Ser Leu Ser Ile Met Gly Gly Ser Ser
                1445                1450                1455
Gly Pro Pro Tyr Asp Arg Ala His Val Thr Gly Ala Ser Ser Ser Ser
            1460                1465                1470
Ser Ser Ser Thr Lys Gly Thr Tyr Phe Pro Ala Ile Leu Asn Pro Pro
        1475                1480                1485
Pro Ser Pro Ala Thr Glu Arg Ser His Tyr Thr Met Glu Phe Gly Tyr
    1490                1495                1500
Ser Ser Asn Ser Pro Ser Thr His Arg Ser Tyr Ser Tyr Arg Pro Tyr
1505                1510                1515               1520
Ser Tyr Arg His Phe Ala Pro Pro Thr Thr Pro Cys Ser Thr Asp Val
                1525                1530                1535
Cys Asp Ser Asp Tyr Ala Pro Ser Arg Arg Met Thr Ser Val Ala Thr
            1540                1545                1550
Ala Lys Gly Tyr Thr Ser Asp Leu Asn Tyr Asp Ser Glu Pro Val Pro
        1555                1560                1565
Pro Pro Pro Thr Pro Arg Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Glu Glu Asn Tyr
    1570                1575                1580
Glu Ser Cys Pro Pro Ser Pro Tyr Thr Glu Arg Ser Tyr Ser His His
1585                1590                1595               1600
Leu Tyr Pro Pro Pro Pro Ser Pro Cys Thr Asp Ser Ser
                1605                1610
<210>41
<211>438
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>无前导序列的RH1-10抗体重链氨基酸序列
<400>41
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asp Phe Pro Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Ala Asn Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Ala Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Arg Glu Asp His Trp Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
        115                 120                 125
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
    130                 135                 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145                 150                 155                 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
                165                 170                 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
            180                 185                 190
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
        195                 200                 205
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
    210                 215                 220
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
225                 230                 235                 240
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                245                 250                 255
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
            260                 265                 270
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
        275                 280                 285
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
    290                 295                 300
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
305                 310                 315                 320
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
                325                 330                 335
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
            340                 345                 350
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
        355                 360                 365
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
    370                 375                 380
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
385                 390                 395                 400
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
                405                 410                 415
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
            420                 425                 430
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435
<210>42
<211>217
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>无前导序列的RH1-10抗体轻链氨基酸序列
<400>42
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ala Pro Gly Gln
 1               5                  10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
            20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
                85                  90                  95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
        115                 120                 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
                165                 170                 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
           180                 185                 190
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
        195                 200                 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
    210                 215
<210>43
<211>438
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>无前导序列的RH2-59抗体重链氨基酸序列
<400>43
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile His Ser Asn Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Ala Arg Val Thr Met Ser Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Glu Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Glu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
        115                 120                 125
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
    130                 135                 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145                 150                 155                 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
                165                 170                 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
            180                 185                 190
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
        195                 200                 205
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
    210                 215                 220
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
225                 230                 235                 240
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                245                 250                 255
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
            260                 265                 270
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
        275                 280                 285
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
    290                 295                 300
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
305                 310                 315                 320
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
                325                 330                 335
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
            340                 345                 350
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
        355                 360                 365
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
    370                 375                 380
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
385                 390                 395                 400
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
                405                 410                 415
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
            420                 425                 430
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435
<210>44
<211>218
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>无前导序列的RH2-59抗体轻链氨基酸序列
<400>44
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
 1               5                  10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
            20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ser
                85                  90                  95
Pro Ser Ala Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
        115                 120                 125
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
    130                 135                 140
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
145                 150                 155                 160
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
                165                 170                 175
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
            180                 185                 190
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
        195                 200                 205
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
    210                 215
<210>45
<211>438
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>无前导序列的RH2-80抗体重链氨基酸序列
<400>45
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile His Ser Asn Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Ala Arg Val Thr Met Ser Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Glu Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Glu Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
        115                 120                 125
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
    130                 135                 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145                 150                 155                 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
                165                 170                 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
            180                 185                 190
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
        195                 200                 205
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
    210                 215                 220
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
225                 230                 235                 240
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                245                 250                 255
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
            260                 265                 270
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
        275                 280                 285
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
    290                 295                 300
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
305                 310                 315                 320
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
                325                 330                 335
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
            340                 345                 350
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
        355                 360                 365
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
    370                 375                 380
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
385                 390                 395                 400
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
                405                 410                 415
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
            420                 425                 430
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435
<210>46
<211>217
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>无前导序列的RH2-80抗体轻链氨基酸序列
<400>46
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
 1               5                  10                  15
Arg Val Ser Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Ala
            20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Arg Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Val Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Val Ile Ala Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Ser
                85                  90                  95
Leu Asn Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
        115                 120                 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
                165                 170                 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
            180                 185                 190
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
        195                 200                 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
      210                 215
<210>47
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH1-10抗体轻链可变区序列
<400>47
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ala Pro Gly Gln
 1               5                  10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
            20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
                85                  90                  95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
<210>48
<211>113
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-59抗体轻链可变区序列
<400>48
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
 1               5                  10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
            20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ser
                85                  90                  95
Pro Ser Ala Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
Gly
<210>49
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-80抗体轻链可变区序列
<400>49
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
 1               5                  10                  15
Arg Val Ser Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Ala
            20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Arg Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Val Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Val Ile Ala Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Ser
                85                  90                  95
Leu Asn Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
<210>50
<211>336
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-18抗体轻链可变区序列
<400>50
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60
tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gctggttatg atgtacactg gtaccagcag 120
cttccaggag cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca gcaatcggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240
caggctgagg atgaggctga ttattattgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttat 300
gtcttcggaa ctgggaccaa ggtcaccgtc ctaggt                           336
<210>51
<211>336
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-18抗体轻链可变区序列
<400>51
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60
tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 120
cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggttaca gcaatcggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc gcctcagcct ccctggccat cactgggctc 240
cggcctgacg atgaggctga ttactattgc cagtcctatg acaacagcct gagttcttat 300
gtcttcggag gtgggaccca gctcaccgtt ttaagt                           336
<210>52
<211>339
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-59抗体轻链可变区序列
<400>52
caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60
tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 120
cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatgctaaca ccaatcggcc ctcagggatc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcggcct ccctggccat cactgggctc 240
cagactgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acaccagccc gagtgcctct 300
tatgtcttcg gaactgggac caagctgacc gtcctaggt                        339
<210>53
<211>336
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-80抗体轻链可变区序列
<400>53
caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtctccatc 60
tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcagcttatg atgtacactg gtaccagcag 120
cttccaggaa cagcccccag actcctcatc tatgttaaca acaatcggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtcgggc acctcagcct ccctagtcat tgctgggctc 240
caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acaatagtct gaatgcttat 300
gtcttcggaa ctgggaccaa gctgaccgtc ctaggt                           336
<210>54
<211>336
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RHl-10抗体重链可变区序列
<400>54
caggtgcagc tgttgcagtc tgcagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cgactttccc ggctactatc tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag gccttgagtg gatgggctgg atcaacgcta acagtggtgc cacaaattat 180
gcacagaact ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cgcagcttac 240
atggagctga gcagcctgag atctgacgac acggccgtct attattgtac gagagaggac 300
cactggggcc gagggaccac ggtcaccgtc tcctca                           336
<210>55
<211>336
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-18抗体重链可变区序列
<400>55
gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactactata tacactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atccactcta acagtggcgc cacaacctat 180
gcacagaagt ttcaggccag ggtcaccatg agcagggaca cgtccagcag cacagcctac 240
atggagttga gcaggctgga atctgacgac acggccatgt atttttgttc gagagaggac 300
tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc tcgagt                           336
<210>56
<211>336
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-59抗体重链可变区序列
<400>56
gaagtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactactata tacactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atccactcta acagtggcgc cacaacctat 180
gcacagaagt ttcaggccag ggtcaccatg agcagggaca cgtccagcag cacagcctac 240
atggagttga gcaggctgga atctgacgac acggccatgt atttttgttc gagagaggac 300
tactggggca gagggacaat ggtcaccgtc tcgagt                           336
<210>57
<211>336
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-80抗体重链可变区序列
<400>57
gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactactata tacactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atccactcta acagtggcgc cacaacctat 180
gcacagaagt ttcaggccag ggtcaccatg agcagggaca cgtccagcag cacagcctac 240
atggagttga gcaggctgga atctgacgac acggccatgt atttttgttc gagagaggac 300
tactggggca aagggacaat ggtcaccgtc tcgagt                           336
<210>58
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH1-10抗体重链可变区序列
<400>58
Gln Val Gln Leu Leu GlnSer Ala Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                 10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asp Phe Pro Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Ala Asn Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Ala Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Arg Glu Asp His Trp Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
<210>59
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-59抗体重链可变区序列
<400>59
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile His Ser Asn Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Ala Arg Val Thr Met Ser Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Glu Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Glu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
<210>60
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-80抗体重链可变区序列
<400>60
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile His Ser Asn Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Ala Arg Val Thr Met Ser Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Glu Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Glu Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
<210>61
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH1-10LC CDR3
<400>61
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr
 1               5                  10
<210>62
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-59LC CDR2
<400>62
Ala Asn Thr Asn Arg Pro Ser
 1               5
<210>63
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-59LC CDR3
<400>63
Gln Ser Tyr Asp Thr Ser Pro Ser Ala Ser Tyr Val
 1               5                  10
<210>64
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-80LC CDRl
<400>64
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Ala Tyr Asp Val His
 1               5                  10
<210>65
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-80LC CDR2
<400>65
Val Asn Asn Asn Arg Pro Ser
 1               5
<210>66
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH2-80LC CDR3
<400>66
Gln Ser Tyr Asp Asn Ser Leu Asn Ala Tyr Val
 1               5                  10
<210>67
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH1-10HC CDR1
<400>67
Gly Tyr Tyr Leu His
 1               5
<210>68
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH1-10HC CDR2
<400>68
Trp Ile Asn Ala Asn Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Phe Gln
 1               5                  10                  15
Gly
<210>69
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RH1-10HC CDR3
<400>69
Glu Asp His
 1
<210>70
<211>211
<212>PRT
<213>食蟹猴(Cynomologous Monkey)
<220>
<221>变体
<222>(1)...(211)
<223>前体DKK-4
<400>70
Met Ala Ala Ala Val Leu Leu Gly Leu Ser Trp Leu Cys Ser Pro Leu
 1               5                  10                  15
Ala Leu Val Leu Asp Phe Asn Asn Ile Arg Ser Ser Ala Asp Leu Gly
            20                  25                  30
Ala Arg Lys Gly Ser Gln Cys Leu Ser Asp Thr Asp Cys Asn Arg Lys
        35                  40                  45
Phe Cys Leu Gln Ser His Asn Glu Lys Pro Phe Cys Ala Cys Arg Gly
    50                  55                  60
Leu Gln Arg Arg Cys Gln Arg Asp Ala Met Cys Cys Gly Thr Leu Cys
65                  70                  75                  80
Met Asn Asp Val Cys Thr Thr Met Glu Asp Ala Pro Lys Leu Glu Arg
                85                  90                  95
Gln Leu Asp Glu Gln Asp Gly Thr His Ala Val Thr Thr Gly His Pro
            100                 105                 110
Val Gln Glu Asn Gln Pro Lys Arg Lys Ser Ile Lys Lys Ser Gln Gly
        115                 120                 125
Arg Lys Gly Gln Glu Gly Glu Ser Leu Arg Thr Phe Asp Cys Gly Pro
    130                 135                 140
Gly Leu Cys Cys Ala Arg His Trp Thr Lys Ile Cys Lys Pro Val Leu
145                 150                 155                 160
Leu Glu Gly Gln Val Cys Arg Arg Gly His Lys Asp Thr Ala Gln Ala
                165                 170                 175
Pro Glu Ile Phe Gln Cys Asp Cys Gly Pro Gly Leu Leu Cys Arg Ser
            180                 185                 190
Gln Leu Thr Ser Gln Gln His Ala Arg Leu Arg Val Cys Gln Lys Ile
        195                 200                 205
Glu Lys Leu
    210
<210>71
<211>313
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>猕猴Dkk-2融合蛋白
<220>
<221>变体
<222>(1)...(158)
<223>猕猴Dkk-1N-末端
<220>
<221>变体
<222>(159)...(274)
<223>猕猴Dkk-2C-末端
<220>
<221>变体
<222>(275)...(313)
<223>Myc和His表位标签
<400>71
Met Met Ala Leu Gly Ala Ala Gly Ala Ala Arg Val Leu Val Ala Leu
 1               5                  10                  15
Val Ala Ala Ala Leu Gly Gly His Pro Leu Leu Gly Val Ser Ala Thr
            20                  25                  30
Leu Asn Ser Val Leu Asn Ser Asn Ala Ile Lys Asn Leu Pro Pro Pro
        35                  40                  45
Leu Gly Gly Ala Ala Gly His Pro Gly Ser Ala Val Ser Ala Ala Pro
    50                  55                  60
Gly Ile Leu Tyr Pro Gly Gly Asn Lys Tyr Gln Thr Ile Asp Asn Tyr
65                  70                  75                  80
Gln Pro Tyr Pro Cys Ala Glu Asp Glu Glu Cys Gly Thr Asp Glu Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Ser Pro Thr Arg Gly Gly Asp Ala Gly Val Gln Ile Cys Leu
            100                 105                 110
Ala Cys Arg Lys Arg Arg Lys Arg Cys Met Arg His Ala Met Cys Cys
        115                 120                 125
Pro Gly Asn Tyr Cys Lys Asn Gly Ile Cys Val Ser Ser Asp Gln Asn
    130                 135                 140
Asn Phe Arg Gly Glu Ile Glu Glu Thr Ile Thr Glu Ser Phe Gly Thr
145                 150                 155                 160
Arg His Arg Asp Arg Asn His Gly His Tyr Ser Asn His Asp Leu Gly
                165                 170                 175
Trp Gln Asn Leu Gly Arg Pro His Thr Lys Met Ser His Ile Lys Gly
            180                 185                 190
His Glu Gly Asp Pro Cys Leu Arg Ser Ser Asp Cys Ile Glu Gly Phe
        195                 200                 205
Cys Cys Ala Arg His Phe Trp Thr Lys Ile Cys Lys Pro Val Leu His
    210                 215                 220
Gln Gly Glu Val Cys Thr Lys Gln Arg Lys Lys Gly Ser His Gly Leu
225                 230                 235                 240
Glu Ile Phe Gln Arg Cys Asp Cys Ala Lys Gly Leu Ser Cys Lys Val
                245                 250                 255
Trp Lys Asp Ala Thr Tyr Ser Ser Lys Ala Arg Leu His Val Cys Gln
            260                 265                 270
Lys Ile Glu Phe Cys Thr Tyr Pro Ala Gln Trp Arg Pro Leu Glu Ser
        275                 280                 285
Arg Gly Pro Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Gly Gly Asp Leu Asn Met
    290                 295                 300
His Thr Glu His His His His His His
305                 310

Claims (47)

1、分离的抗体或其免疫功能片段，包含：
(a)一个或多个选自下列的轻链(LC)互补决定区(CDR)：
(i)与SEQ ID NO：12具有至少80％序列相同性的LC CDR1，
(ii)与SEQ ID NO：13具有至少80％序列相同性的LC CDR2，和
(iii)与SEQ ID NO：14具有至少80％序列相同性的LC CDR3；
(b)一个或多个选自下列的重链(HC)CDR：
(i)与SEQ ID NO：9具有至少80％序列相同性的HC CDR1，
(ii)与SEQ ID NO：10具有至少80％序列相同性的HC CDR2，和
(iii)与SEQ ID NO：11具有至少80％序列相同性的HC CDR3；或
(c)一个或多个(a)的LC CDR和一个或多个(b)的HC CDR，其中所述抗体或其免疫功能片段能够特异性地结合Dkk-1多肽。
2、如权利要求1所述的分离的抗体或免疫功能片段，包含：
(a)一个或多个选自下列的轻链(LC)互补决定区(CDR)：
(i)与SEQ ID NO：12具有至少90％序列相同性的LC CDR1，
(ii)与SEQ ID NO：13具有至少90％序列相同性的LC CDR2，和
(iii)与SEQ ID NO：14具有至少90％序列相同性的LC CDR3；
(b)一个或多个选自下列的重链(HC)CDR：
(i)与SEQ ID NO：9具有至少90％序列相同性的HC CDR1，
(ii)与SEQ ID NO：10具有至少90％序列相同性的HC CDR2，和
(iii)与SEQ ID NO：11具有至少90％序列相同性的HC CDR3；或
(c)一个或多个(a)的LC CDR和一个或多个(b)的HC CDR，其中所述抗体或其免疫功能片段能够特异性地结合Dkk-1多肽。
3、如权利要求2所述的分离的抗体或免疫功能片段，包含：
(a)一个或多个选自下列的轻链(LC)互补决定区(CDR)：
(i)具有如SEQ ID NO：12所示序列的LC CDR1，
(ii)具有如SEQ ID NO：13所示序列的LC CDR2，和
(iii)具有如SEQ ID NO：14所示序列的LC CDR3；
(b)一个或多个选自下列的重链(HC)CDR：
(i)具有如SEQ ID NO：9所示序列的HC CDR1，
(ii)具有如SEQ ID NO：10所示序列的HC CDR2，和
(iii)具有如SEQ ID NO：11所示序列的HC CDR3；或
(c)一个或多个(a)的LC CDR和一个或多个(b)的HC CDR，其中所述抗体或其免疫功能片段能够特异性地结合Dkk-1多肽。
4、如权利要求3所述的分离的抗体或免疫功能片段，包含具有SEQ IDNO：14的氨基酸序列的LC CDR3或具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HCCDR3。
5、如权利要求4所述的分离的抗体或免疫功能片段，包含具有SEQ IDNO：14的氨基酸序列的LC CDR3和具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HCCDR3。
6、如权利要求1所述的分离的抗体或免疫功能片段，包含来自(a)和(b)所列的CDR的至少2个CDR。
7、如权利要求6所述的分离的抗体或免疫功能片段，包含来自(a)和(b)所列的CDR的至少3个CDR。
8、如权利要求7所述的分离的抗体或免疫功能片段，包含来自(a)和(b)所列的CDR的至少4个CDR。
9、如权利要求8所述的分离的抗体或免疫功能片段，包含来自(a)和(b)所列的CDR的至少5个CDR。
10、如权利要求9所述的分离的抗体或免疫功能片段，包含来自(a)和(b)所列的CDR的至少6个CDR。
11、如权利要求1所述的分离的抗体或免疫功能片段，为域抗体。
12、如权利要求1所述的分离的抗体或免疫功能片段，以约269pM或更低的Kd与Dkk-1多肽解离。
13、如权利要求1所述的分离的抗体或免疫功能片段，为单克隆抗体。
14、如权利要求1所述的分离的抗体或免疫功能片段，为scFv、Fab、Fab′或(Fab′)2。
15、如权利要求1所述的分离的抗体或免疫功能片段，为人抗体或人源化抗体。
16、分离的抗体或其免疫功能片段，包含：
(a)与SEQ ID NO：4具有至少80％序列相同性的轻链可变区(VL)；
(b)与SEQ ID NO：8具有至少80％序列相同性的重链可变区(VH)；或
(c)(a)的VL和(b)的VH。
17、如权利要求16所述的分离的抗体或免疫功能片段，由两个相同的VH和两个相同的VL组成。
18、如权利要求16所述的分离的抗体或免疫功能片段，其特征在于，所述VL与SEQ ID NO：4具有至少90％序列相同性；所述VH与SEQ ID NO：8具有至少90％序列相同性。
19、如权利要求18所述的分离的抗体或免疫功能片段，由两个相同的VH和两个相同的VL组成。
20、如权利要求16所述的分离的抗体或免疫功能片段，其特征在于，所述VL与SEQ ID NO：4具有至少95％序列相同性；所述VH与SEQ ID NO：8具有至少95％序列相同性。
21、如权利要求20所述的分离的抗体或免疫功能片段，由两个相同的VH和两个相同的VL组成。
22、如权利要求21所述的分离的抗体或免疫功能片段，其特征在于，所述VL具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列；所述VH具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
23、如权利要求22所述的分离的抗体或免疫功能片段，由两个相同的VH和两个相同的VL组成。
24、如权利要求22所述的分离的抗体或免疫功能片段，包含：
(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的轻链；
(b)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链；或
(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链。
25、如权利要求24所述的分离的抗体或免疫功能片段，由两个相同的轻链和两个相同的重链组成。
26、如权利要求16所述的分离的抗体或免疫功能片段，为单克隆抗体。
27、如权利要求16所述的分离的抗体或免疫功能片段，为scFv、Fab、Fab′或(Fab′)2。
28、如权利要求16所述的分离的抗体或免疫功能片段，为人抗体或人源化抗体。
29、分离的抗体或其免疫功能片段，其特异性结合成熟的人Dkk-1蛋白，所述蛋白由SEQ ID NO：35的氨基酸32-266组成并且具有通过半胱氨酸残基220和245之间的二硫键建立起来的三级结构，其中所述抗体结合包含环的表位，所述环由SEQ ID NO：35的半胱氨酸残基201和210之间的氨基酸组成。
30、如权利要求29所述的分离的抗体或免疫功能片段，为单克隆抗体。
31、如权利要求29所述的分离的抗体或免疫功能片段，为scFv、Fab、Fab′或(Fab′)2。
32、如权利要求29所述的分离的抗体或免疫功能片段，为人抗体或人源化抗体。
33、抗体或其免疫功能片段，与权利要求24所述的抗体竞争与Dkk-1多肽的特异性结合。
34、如权利要求33所述的分离的抗体或免疫功能片段，与由两个相同的重链和两个相同的轻链组成的抗体竞争，其中所述重链由SEQ ID NO：3所示氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO：7所示氨基酸序列组成。
35、如权利要求34所述的分离的抗体或免疫功能片段，以约269pM或更低的Kd与Dkk-1多肽解离。
36、核酸，其编码：(a)具有SEQ ID NO：14所示氨基酸序列的轻链CDR；和/或(b)具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的重链CDR，其中所述核酸编码抗体或其免疫功能片段。
37、一种核酸，包含编码如权利要求16所述的抗体或免疫活性片段的VH、VL或VH和VL二者的序列。
38、一种核酸，包含编码如权利要求22所述的抗体或免疫活性片段的VH、VL或VH和VL二者的核酸区段。
39、一种表达载体，包含如权利要求37所述的核酸。
40、一种分离的细胞，包含如权利要求39所述的表达载体。
41、一种制备抗体或其免疫活性片段的方法，包括培养如权利要求40所述的细胞的步骤。
42、一种组合物，包含如权利要求1所述的抗体或其免疫功能片段和选自下列的组分：缓冲剂、药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、和防腐剂。
43、一种组合物，包含如权利要求16所述的抗体或其免疫功能片段和选自下列的组分：缓冲剂、药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、和防腐剂。
44、一种在个体中治疗疾病的方法，包括给予所述个体有效量的如权利要求1所述的抗体或其免疫活性片段，其中所述疾病选自：关节炎、响应干细胞再生的疾病、炎症疾病、神经系统疾病、眼病、肾病、肺病、骨病和皮肤病。
45、如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述疾病选自：类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、和骨关节炎。
46、如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述疾病为骨质疏松.
47、一种在个体中刺激骨生长的方法，包括给予个体有效量的如权利要求1所述的抗体或其免疫活性片段。
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