TWI411444B - Ｄｋｋ－１專一性抗體及其用途 - Google Patents

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TWI411444B
TWI411444B TW099115010A TW99115010A TWI411444B TW I411444 B TWI411444 B TW I411444B TW 099115010 A TW099115010 A TW 099115010A TW 99115010 A TW99115010 A TW 99115010A TW I411444 B TWI411444 B TW I411444B
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Vishwas Madhav Paralkar
Jaume Pons
Donna Marie Stone
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Description

DKK-1專一性抗體及其用途
本發明係關於結合於Dkk-1之抗體及其片段，且特定言之係關於結合於Dkk-1之人類化抗體及其片段，且甚至更特定言之係關於專一性結合於Dkk-1(尤其為人類Dkk-1)之完全人類化抗體及片段。提供編碼抗Dkk-1抗體或其片段之核酸，以及併有此等核酸以便重組表現抗Dkk-1抗體之表現載體及宿主細胞。亦提供骨同化劑。亦提供包含本發明之抗體或其片段的醫藥組合物。進一步提供治療導致骨質流失之疾病、病狀及病症(諸如骨病症)之方法。亦提供治療或預防骨質流失之方法、誘導骨質增加之方法及誘導Wnt活性之方法。
本申請案主張2009年5月12日申請之美國臨時申請案第61/177,650號及2009年9月22日申請之美國臨時申請案第61/244,638號的權益，該等案均以全文引用的方式併入本文中。
Wnt為分泌型醣蛋白，其結合及活化包括低密度受體相關蛋白質(LRP5/6)及卷曲蛋白(frizzled protein)之受體複合物。Cadigan,K.M.及Y.I. Liu,(2005) Journal of Cell Science 119,395-402；Nusse,R.(2003) Development 130(22):5297-305；及Pinson,K.I.(2000) Nature 2000 407(6803):535-8。
已揭示Wnt/LRP5調控骨質及Wnt信號傳導路徑之活化使得骨質增加。Boyden,L.M.等人,(2002) N Engl J Med 346:1513-1521；Little,R.D.等人,(2002) Am J Hum Genet 70:11-19；及Gong,Y.等人,(2001) Cell 107:513-523。Wnt信號傳導受包括諸如Dickkopf 1(Dkk-1)之分泌型分子之拮抗劑密切調控。Tian,E.等人,(2003) N Engl J Med 349:2483-2494。發現在人類中觀察到之高骨質(HBM)表型係由於LRP5(G171V)中之單點突變，其抑制Dkk-1結合LRP5之能力。Zhang,Y.等人,(2004) Mol Cell Biol. 24(11):4677-84。
Wnt信號傳導在骨形成及骨生長中之關鍵作用使得Dkk-1成為治療滿足以下之疾病或病狀之適用標靶，在該等疾病或病狀中骨胚細胞活性增加(骨質密度增加、骨形成增加而無骨再吸收相應增加)將有利於患者，包括例如藉由減少例如由於骨質疏鬆症未經治療而發生之骨折數。WO 2006/015373(US 2006/0127393)揭示治療各種疾病(包括骨病症)的Dkk-1之抗體。US 2008/0193449揭示抑制Dkk-1結合於LRP5之Dkk-1專一性抗體；包含此等抗體以刺激骨生長之組合物；及包含此等抗體以治療骨病症(諸如骨質疏鬆症)之組合物。
對拮抗Dkk-1活性，藉此增加骨胚細胞活性以治療此骨形成增加將有利於患者之疾病、病狀及病症(諸如骨質疏鬆症)之新穎骨同化劑仍存在需要。
本發明係關於結合於Dkk-1之抗體及其片段(例如抗原結合部分)，且特定言之係關於結合於Dkk-1之人類化抗體及其片段，且甚至更特定言之係關於結合於Dkk-1之完全人類化抗體及免疫功能片段。該等抗體及其片段拮抗Dkk-1抑制Wnt活性之能力。抗體及其免疫功能片段拮抗Dkk-1抑制骨中Wnt信號傳導路徑之能力，使得骨質相應增加。抗體及其免疫功能片段包括具有天然存在之結構的抗體，以及具有抗原結合域之多肽(例如域抗體)。抗體及其免疫功能片段可用以治療各種疾病、病狀及病症，包括彼等與骨質流失有關者，諸如骨質疏鬆症。抗體及其免疫功能片段亦可用以治療與繼發性骨質流失有關之疾病、病狀或病症，諸如由以下引起或伴隨以下之骨質流失：例如用皮質類固醇、芳香酶抑制劑或噻唑啶硫酮(TZD)長期治療；厭食症；或與性腺低能症或腎性骨營養不良有關之骨質流失。
所提供之一些抗體及其功能片段包括：
(a)一或多個選自由以下組成之群的輕鏈(LC)互補決定區(CDR)：
(i)與SEQ ID NO: 22具有至少80%序列一致性之CDR1；
(ii)與SEQ ID NO: 24具有至少80%序列一致性之CDR2；及
(iii)與SEQ ID NO: 26具有至少80%序列一致性之CDR3；
(b)一或多個選自由以下組成之群的重鏈(HC)互補決定區(CDR)：
(i)與SEQ ID NO: 30、49或50具有至少80%序列一致性之CDR1；
(ii)與SEQ ID NO: 32或51具有至少80%序列一致性之CDR2；及
(iii)與SEQ ID NO: 34或52具有至少80%序列一致性之CDR3；或
(c)(a)之一或多個CDR及(b)之一或多個CDR。
此等抗體及其免疫功能片段可專一性結合Dkk-1多肽。一些此等抗體及其免疫功能片段包括一、二、三、四、五或所有六個前述CDR。
亦提供所提供序列之保守性修飾。
進一步提供之抗體及其免疫功能片段之LC及HC與前述序列具有至少90%序列一致性。
進一步提供具有CDR1具有如SEQ ID NO: 22所述之胺基酸序列、CDR2具有如SEQ ID NO: 24所述之胺基酸序列及/或CDR3具有如SEQ ID NO: 26所述之胺基酸序列的LC之抗體及其免疫功能片段。
進一步提供具有CDR1具有如SEQ ID NO: 30、49或50所述之胺基酸序列、CDR2具有如SEQ ID NO: 32或51所述之胺基酸序列及/或CDR3具有如SEQ ID NO: 34或52所述之胺基酸序列的HC之抗體及其免疫功能片段。
進一步提供具有CDR1具有如SEQ ID NO: 22所述之胺基酸序列、CDR2具有如SEQ ID NO: 24所述之胺基酸序列及/或CDR3具有如SEQ ID NO: 26所述之胺基酸序列的LC，及CDR1具有如SEQ ID NO: 30、49或50所述之胺基酸序列、CDR2具有如SEQ ID NO: 32或51所述之胺基酸序列及/或CDR3具有如SEQ ID NO: 34或52所述之胺基酸序列的HC之抗體及其免疫功能片段。
進一步提供具有CDR1具有如SEQ ID NO: 22所述之胺基酸序列、CDR2具有如SEQ ID NO: 24所述之胺基酸序列且CDR3具有如SEQ ID NO: 26所述之胺基酸序列的LC，及CDR1具有如SEQ ID NO: 30、49或50所述之胺基酸序列、CDR2具有如SEQ ID NO: 32或51所述之胺基酸序列且CDR3具有如SEQ ID NO: 34或52所述之胺基酸序列的HC之抗體及其免疫功能片段。
亦提供包括以下之抗體及其免疫功能片段：(a)與如SEQ ID NO: 20所述之序列具有至少80%序列一致性之LC可變區(VL)；(b)與如SEQ ID NO: 28所述之序列具有至少80%序列一致性之HC可變區(VH)；或(c)(a)之VL及(b)之VH。
亦提供結構類似但VL與如SEQ ID NO: 20所述之序列具有至少90%序列一致性且VH與如SEQ ID NO: 28所述之序列具有至少90%序列一致性的抗體及其免疫功能片段。
亦提供結構類似但VL與如SEQ ID NO: 20所述之序列具有至少95%序列一致性且VH與如SEQ ID NO: 28所述之序列具有至少95%序列一致性的抗體及其免疫功能片段。
亦提供包括具有如SEQ ID NO: 20所述之序列之VL及具有如SEQ ID NO: 28所述之序列之VH的抗體及其免疫功能片段。
所提供之一些抗體及其功能片段具有包含以下或由以下組成之LC：如SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 42所述之胺基酸序列；及/或包含以下或由以下組成之HC：如SEQ ID NO: 36或SEQ ID NO: 40所述之胺基酸序列。
所提供之一些抗體及其功能片段具有由如SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 42所述之胺基酸序列組成之LC，及由如SEQ ID NO: 36或SEQ ID NO: 40所述之胺基酸序列組成之HC。
進一步提供可與小鼠MabJC18競爭結合於Dkk-1+ 細胞之抗體及其免疫功能片段。在一實施例中，本發明提供人類化抗體或其片段，其中該抗體或片段專一性結合於人類Dkk-1抗原，其中LC可變區之CDR(CDR1、CDR2及CDR3)及HC可變區之CDR(CDR1、CDR2及CDR3)具有以下胺基酸序列且其中抗體或片段可與小鼠MabJC18競爭結合於Dkk-1+ 細胞：LC：(i) CDR1(SEQ ID NO: 22)、(ii) CDR2(SEQ ID NO: 24)及(iii) CDR3(SEQ ID NO: 26)；及HC：(i) CDR1(SEQ ID NO: 30、49或50)、(ii) CDR2(SEQ ID NO: 32或51)及(iii) CDR3(SEQ ID NO: 34或52)。
本發明亦提供人類化抗體或其片段，其中該抗體或片段專一性結合於人類Dkk-1抗原，其中LC可變區之互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3)及HC可變區之互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3)具有以下胺基酸序列：LC：(i) CDR1(SEQ ID NO: 22)、(ii) CDR2(SEQ ID NO: 24)及(iii) CDR3(SEQ ID NO: 26)；及HC：(i) CDR1(SEQ ID NO: 30、49或50)、(ii) CDR2(SEQ ID NO: 32或51)及(iii) CDR3(SEQ ID NO: 34或52)，其中LC之可變域構架含有人類IGKV3-11生殖系構架及IGKJ4區域。
本發明亦提供人類化抗體或其片段，其中該抗體或片段專一性結合於人類Dkk-1抗原，其中LC可變區之互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3)及HC可變區之互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3)具有以下胺基酸序列：LC：(i) CDR1(SEQ ID NO: 22)、(ii) CDR2(SEQ ID NO: 24)及(iii) CDR3(SEQ ID NO: 26)；及HC：(i) CDR1(SEQ ID NO: 30、49或50)、(ii) CDR2(SEQ ID NO: 32或51)及(iii) CDR3(SEQ ID NO: 34或52)，其中HC之可變域構架含有人類IGHV3-07生殖系構架(具有單一回復突變：R100突變為T)及IGHJ6區。
本發明亦提供人類化抗體或其片段，其中該抗體或片段專一性結合於人類Dkk-1抗原，其中LC可變區之互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3)及HC可變區之互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3)具有以下胺基酸序列：LC：(i) CDR1(SEQ ID NO: 22)、(ii) CDR2(SEQ ID NO: 24)及(iii) CDR3(SEQ ID NO: 26)；及HC：(i) CDR1(SEQ ID NO: 30、49或50)、(ii) CDR2(SEQ ID NO: 32或51)及(iii) CDR3(SEQ ID NO: 34或52)，其中LC之可變域構架含有人類IGKV3-11生殖系構架及IGKJ4區且HC之可變域構架含有人類IGHV3-07生殖系構架(具有單一回復突變：R100突變為T)及IGHJ6區。
進一步提供包含本發明抗體之一或多個片段或區域的融合蛋白。在一實施例中，提供包含如SEQ ID NO: 20所述之LC可變區之至少10個相鄰胺基酸及/或如SEQ ID NO: 28所述之HC可變區之至少10個胺基酸的融合多肽。
在另一實施例中，融合蛋白包含如SEQ ID NO: 20所述之LC可變區及/或如SEQ ID NO: 28所述之HC可變區。
在另一實施例中，融合多肽包含以下一或多者：
(a)選自由以下組成之群的輕鏈(LC)互補決定區(CDR)：
(i)與SEQ ID NO: 22具有至少80%序列一致性之CDR1；
(ii)與SEQ ID NO: 24具有至少80%序列一致性之CDR2；及
(iii)與SEQ ID NO: 26具有至少80%序列一致性之CDR3；或
(b)一或多個選自由以下組成之群的重鏈(HC)互補決定區(CDR)：
(i)與SEQ ID NO: 30、49或50具有至少80%序列一致性之CDR1；
(ii)與SEQ ID NO: 32或51具有至少80%序列一致性之CDR2；及
(iii)與SEQ ID NO: 34或52具有至少80%序列一致性之CDR3。
在另一實施例中，融合蛋白包含HC CDR3(SEQ ID NO: 34或52)及LC CDR3(SEQ ID NO: 26)。
在另一實施例中，融合蛋白包含一或多種本發明抗體，及其在原生分子中未連接之胺基酸序列，諸如異源序列或來自另一區域之同源序列。在一實施例中，異源序列為選自FLAG標籤或6His標籤之標籤。
亦提供結合至有助於偶合於固體支撐物之藥劑的抗體及其免疫功能片段。在一實施例中，抗體及其片段連接於有助於偶合於固體支撐物之藥劑。在一實施例中，固體支撐物為生物素或抗生物素蛋白。
亦提供連接於標記劑之抗體及其免疫功能片段。在一實施例中，標記劑為螢光分子或放射性分子。
所提供之各種抗體及其免疫功能片段可包括單一LC或HC，或單一可變輕鏈域及/或單一可變重鏈域。所提供之其他抗體及片段可包括兩條LC及/或兩條HC，其中在一些實施例中，兩條LC彼此相同；及/或其中在一些實施例中，兩條HC彼此相同。所提供之抗體可包括例如單株抗體、人類抗體、嵌合抗體或人類化抗體。所提供抗體之免疫功能片段可包括(但不限於)scFv、Fab、Fab'、(FAB')2 或域抗體。在一實施例中，抗體以約100 pM或100 pM以下之Kd自Dkk-1多肽解離。
亦提供各種編碼抗體及其片段之核酸。一些核酸例如編碼具有如SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 26所述之胺基酸序列的LC CDR，使得所編碼之CDR編碼可專一性結合Dkk-1多肽之抗體或其免疫功能片段。一些核酸例如編碼具有如SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 34所述之胺基酸序列的HC CDR，使得所編碼之CDR編碼可專一性結合Dkk-1多肽之抗體或其免疫功能片段。在一些實施例中，核酸包含以下或由以下組成：編碼抗體或其免疫功能片段之VL及/或VH區域之序列，其中VL與SEQ ID NO: 20所述之序列具有至少70%、80%、90%或95%序列一致性，且VH與SEQ ID NO: 28所述之序列具有至少70%、80%、90%或95%序列一致性。在一些實施例中，核酸包括編碼包含如SEQ ID NO: 20所述之序列或由如SEQ ID NO: 20所述之序列組成之VL的序列，及/或編碼包含如SEQ ID NO: 28所述之序列或由如SEQ ID NO: 28所述之序列組成之VH的序列。在其他實施例中，核酸包括編碼具有前述序列特徵之VL與VH兩者的序列。
進一步提供編碼以下任一者之聚核苷酸：(a)表4中所示之huMabJC18或其變異體；(b)表4中所示之抗體huMabJC18或其變異體之片段或區域；(c)表4中所示之抗體huMabJC18或其變異體之輕鏈；(c)表4中所示之抗體huMabJC18或其變異體之重鏈；(d)一或多個來自表4中所示之抗體huMabJC18或其變異體之LC及/或HC的可變區；(e)表4中所示之抗體huMabJC18或其變異體之一或多個CDR(一、二、三、四、五或六個CDR)；(f)來自抗體huMabJC18之HC的CDR H3；(g)來自抗體huMabJC18之HC的CDR H1；(h)來自抗體huMabJC18之HC的CDR H2，其中胺基酸G57為G或W，及/或F58為F、L、G、Y、M或V，及/或Q59為Q、D、H、G、R或W；(i)來自抗體huMabJC18之HC的CDR H3，其中胺基酸T100為T或S，及/或胺基酸L102為L或Y，及/或胺基酸E103為E、R、Q、D或K；(j)來自抗體huMabJC18之LC的CDR L1，其中胺基酸E27為E、Q，及/或胺基酸D30為D或S，及/或胺基酸D31為D或S，及/或胺基酸F32為F或S，及/或胺基酸G33為G或Y，及/或胺基酸I34為I或L，及/或胺基酸S35為S或A，及/或胺基酸F36為F或W，及/或胺基酸I37為I或M；(k)來自抗體huMabJC18之LC的CDR L2，其中胺基酸G55為G或A，及/或胺基酸S56為S或T；(l)來自抗體huMabJC18之LC的CDR L3，其中胺基酸Q94為Q或H，及/或胺基酸L95為L、S、A或G，及/或胺基酸K96為K、I、L、W、M或S，及/或胺基酸E97為E或D，及/或胺基酸V98為V或L，及/或胺基酸P99為P或W，及/或胺基酸P100為P、S或G，及/或胺基酸T101為T、Y或L；(m)三個來自表4中所示之抗體huMabJC18或其變異體之LC的CDR；(n)三個來自表4中所示之抗體huMabJC18或其變異體之HC的CDR；(o)三個來自表4中所示之抗體huMabJC18或其變異體之LC的CDR，及三個來自表4中所示之抗體huMabJC18或其變異體之HC的CDR；及(p)包含(b)至(p)中任一者之抗體。
亦提供與任何此等核酸序列互補之聚核苷酸。聚核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股，且可為DNA(基因組、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子包括例如含有內含子且以一對一方式對應於DNA分子之HnRNA分子，及不含有內含子之mRNA分子。其他編碼或非編碼序列可能(但不一定)存在於所提供之聚核苷酸內，且聚核苷酸可能(但不一定)連接於其他分子及/或支撐材料。
提供可包含原生序列(亦即編碼抗體或其部分之內源序列)或可包含此序列之變異體的聚核苷酸。聚核苷酸變異體可含有一或多個取代、添加、缺失及/或插入，使得經編碼之多肽的免疫反應性相對於原生免疫反應性分子並不減小。變異體較佳與編碼原生抗體或其部分之聚核苷酸序列展現至少約70%一致性，更佳至少約80%一致性，更佳至少約90%且最佳約95%一致性。
本發明亦提供編碼人類化抗體或其片段之胺基酸序列的DNA分子，其包含：
(a)一或多個選自由以下組成之群的LC CDR：
(i)與SEQ ID NO: 22具有至少80%序列一致性之CDR1；
(ii)與SEQ ID NO: 24具有至少80%序列一致性之CDR2；及
(iii)與SEQ ID NO: 26具有至少80%序列一致性之CDR3；
(b)一或多個選自由以下組成之群的HC CDR：
(i)與SEQ ID NO: 30、49或50具有至少80%序列一致性之CDR1；
(ii)與SEQ ID NO: 32或51具有至少80%序列一致性之CDR2；及
(iii)與SEQ ID NO: 34或52具有至少80%序列一致性之CDR3；或
(c)(a)之一或多個CDR及(b)之一或多個CDR，
其中LC之可變域構架含有人類IGKV3-11生殖系構架及IGKJ4區。
本發明亦提供編碼人類化抗體或其片段之胺基酸序列的DNA分子，其包含：
(a)一或多個選自由以下組成之群的LC CDR：
(i)與SEQ ID NO: 22具有至少80%序列一致性之CDR1；
(ii)與SEQ ID NO: 24具有至少80%序列一致性之CDR2；及
(iii)與SEQ ID NO: 26具有至少80%序列一致性之CDR3；
(b)一或多個選自由以下組成之群的HC CDR：
(i)與SEQ ID NO: 30、49或50具有至少80%序列一致性之CDR1；
(ii)與SEQ ID NO: 32或51具有至少80%序列一致性之CDR2；及
(iii)與SEQ ID NO: 34或52具有至少80%序列一致性之CDR3；或
(c)(a)之一或多個CDR及(b)之一或多個CDR，
其中HC之可變域構架含有人類IGHV3-07生殖系構架(具有單一回復突變：R100突變為T)及IGHJ6區。
本發明亦提供編碼人類化抗體或其片段之胺基酸序列的DNA分子，其包含：
(a)一或多個選自由以下組成之群的LC CDR：
(i)與SEQ ID NO: 22具有至少80%序列一致性之CDR1；
(ii)與SEQ ID NO: 24具有至少80%序列一致性之CDR2；及
(iii)與SEQ ID NO: 26具有至少80%序列一致性之CDR3；
(b)一或多個選自由以下組成之群的HC CDR：
(i)與SEQ ID NO: 30、49或50具有至少80%序列一致性之CDR1；
(ii)與SEQ ID NO: 32或51具有至少80%序列一致性之CDR2；及
(iii)與SEQ ID NO: 34或52具有至少80%序列一致性之CDR3；或
(c)(a)之一或多個CDR及(b)之一或多個CDR，
其中LC之可變域構架含有人類IGKV3-11生殖系構架及IGKJ4區，且HC之可變域構架含有人類IGHV3-07生殖系構架(具有單一回復突變：R100突變為T)及IGHJ6區。
本發明亦提供編碼人類化抗體或其片段之胺基酸序列的DNA分子，其包含：
(a)一或多個選自由以下組成之群的LC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 22)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 24)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 26)；
(b)一或多個選自由以下組成之群的HC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 30、49或50)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 32或51)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 34或52)；或
(c)(a)之一或多個CDR及(b)之一或多個CDR，
其中LC之可變域構架含有人類IGKV3-11生殖系構架及IGKJ4區，且HC之可變域構架含有人類IGHV3-07生殖系構架(具有單一回復突變：R100突變為T)及IGHJ6區。
在DNA分子之一些實施例中，LC CDR之核苷酸序列係如下：
CDR1：如SEQ ID NO: 21所述
CDR2：如SEQ ID NO: 23所述
CDR3：如SEQ ID NO: 25所述。
在DNA分子之一些實施例中，HC CDR之核苷酸序列係如下：
CDR1：如SEQ ID NO: 29所述
CDR2：如SEQ ID NO: 31所述
CDR3：如SEQ ID NO: 33所述。
在DNA分子之一些實施例中，LC可變區之核苷酸序列係如SEQ ID NO: 19所述。
在DNA分子之一些實施例中，HC可變區之核苷酸序列係如SEQ ID NO: 27所述。
在DNA分子之一些實施例中，LC之核苷酸序列係如SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 41所述。
在DNA分子之一些實施例中，HC之核苷酸序列係如SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 39所述。
進一步提供載體，例如表現載體，其包含編碼抗體或其片段之任何聚核苷酸序列或DNA分子。
在一實施例中，提供編碼人類化抗體或其片段之胺基酸序列的DNA分子，其包含：
(a)一或多個選自由以下組成之群的LC CDR：
(i)與SEQ ID NO: 22具有至少80%序列一致性之CDR1；
(ii)與SEQ ID NO: 24具有至少80%序列一致性之CDR2；及
(iii)與SEQ ID NO: 26具有至少80%序列一致性之CDR3；
(b)一或多個選自由以下組成之群的HC CDR：
(i)與SEQ ID NO: 30、49或50具有至少80%序列一致性之CDR1；
(ii)與SEQ ID NO: 32或51具有至少80%序列一致性之CDR2；及
(iii)與SEQ ID NO: 34或52具有至少80%序列一致性之CDR3；或
(c)(a)之一或多個CDR及(b)之一或多個CDR，
其中LC之可變域構架含有呈表現載體形式之人類IGKV3-11生殖系構架及IGKJ4區。
在一實施例中，提供編碼人類化抗體或其片段之胺基酸序列的DNA分子，其包含：
(a)一或多個選自由以下組成之群的LC CDR：
(i)與SEQ ID NO: 22具有至少80%序列一致性之CDR1；
(ii)與SEQ ID NO: 24具有至少80%序列一致性之CDR2；及
(iii)與SEQ ID NO: 26具有至少80%序列一致性之CDR3；
(b)一或多個選自由以下組成之群的HC CDR：
(i)與SEQ ID NO: 30、49或50具有至少80%序列一致性之CDR1；
(ii)與SEQ ID NO: 32或51具有至少80%序列一致性之CDR2；及
(iii)與SEQ ID NO: 34或52具有至少80%序列一致性之CDR3；或
(c)(a)之一或多個CDR及(b)之一或多個CDR，
其中HC之可變域構架含有呈表現載體形式之人類IGHV3-07生殖系構架(具有單一回復突變：R100突變為T)及IGHJ6區。
在一實施例中，提供編碼人類化抗體或其片段之胺基酸序列的DNA分子，其包含：
(a)一或多個選自由以下組成之群的LC CDR：
(i)與SEQ ID NO: 22具有至少80%序列一致性之CDR1；
(ii)與SEQ ID NO: 24具有至少80%序列一致性之CDR2；及
(iii)與SEQ ID NO: 26具有至少80%序列一致性之CDR3；
(b)一或多個選自由以下組成之群的HC CDR：
(i)與SEQ ID NO: 30、49或50具有至少80%序列一致性之CDR1；
(ii)與SEQ ID NO: 32或51具有至少80%序列一致性之CDR2；及
(iii)與SEQ ID NO: 34或52具有至少80%序列一致性之CDR3；或
(c)(a)之一或多個CDR及(b)之一或多個CDR，
其中LC之可變域構架含有人類IGKV3-11生殖系構架及IGKJ4區，且HC之可變域構架含有呈表現載體形式之人類IGHV3-07生殖系構架(具有單一回復突變：R100突變為T)及IGHJ6區。
在一實施例中，提供編碼人類化抗體或其片段之胺基酸序列的DNA分子，其包含：
(a)一或多個選自由以下組成之群的LC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 22)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 24)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 26)；
(b)一或多個選自由以下組成之群的HC CDR：
(i)CDR1(SEQ ID NO: 30、49或50)；
(ii)CDR2(SEQ ID NO: 32或51)；及
(iii)CDR3(SEQ ID NO: 34或52)；或
(c)(a)之一或多個CDR及(b)之一或多個CDR，
其中LC之可變域構架含有人類IGKV3-11生殖系構架及IGKJ4區域，且HC之可變域構架含有呈表現載體形式之人類IGHV3-07生殖系構架(具有單一回復突變：R100突變為T)及IGHJ6區。
亦提供以本發明之表現載體轉型的宿主。在一實施例中，提供以包含編碼人類化抗體或其片段之胺基酸序列的DNA分子之表現載體轉型的宿主，該DNA分子包含：
(a)一或多個選自由以下組成之群的LC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 22)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 24)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 26)；
(b)一或多個選自由以下組成之群的HC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 30、49或50)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 32或51)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 34或52)；或
(c)(a)之一或多個CDR及(b)之一或多個CDR，
其中LC之可變域構架含有人類IGKV3-11生殖系構架及IGKJ4區域，且HC之可變域構架含有人類IGHV3-07生殖系構架(具有單一回復突變：R100突變為T)及IGHJ6區。
亦提供一種宿主細胞，其包含編碼人類化抗體或其片段之輕鏈及重鏈的重組表現系統，其中該抗體或片段專一性結合於人類DKK-1抗原，且其中LC及HC之CDR具有以下胺基酸序列：
(a)一或多個選自由以下組成之群的LC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 22)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 24)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 26)；
(b)一或多個選自由以下組成之群的HC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 30、49或50)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 32或51)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 34或52)；或
(c)(a)之一或多個CDR及(b)之一或多個CDR。
進一步提供一種製備人類化抗體或其片段之方法，其中該抗體或片段專一性結合於人類Dkk-1抗原，且其中LC及HC之CDR具有以下胺基酸序列：
(a)一或多個選自由以下組成之群的LC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 22)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 24)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 26)；
(b)一或多個選自由以下組成之群的HC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 30、49或50)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 32或51)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 34或52)；或
(c)(a)之一或多個CDR及(b)之一或多個CDR，
該方法包含提供用以下轉型之宿主：(i)編碼人類化抗體或其片段之輕鏈的第一表現載體，及編碼人類化抗體或其片段之重鏈的第二表現載體，或(ii)編碼人類化抗體或其片段之輕鏈與重鏈兩者的單一表現載體；及維持該宿主在表現各鏈之條件下，及分離藉由組裝因此表現之鏈所形成之人類化抗體或其片段。
進一步提供一種製造人類化抗體或其片段之方法，該人類化抗體或其片段專一性結合於人類DKK-1抗原，且其中LC及HC之CDR具有以下胺基酸序列：
(a)一或多個選自由以下組成之群的LC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 22)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 24)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 26)；
(b)一或多個選自由以下組成之群的HC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 30、49或50)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 32或51)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 34或52)；或
(c)(a)之一或多個CDR及(b)之一或多個CDR，
該方法包含培養宿主細胞，其中該宿主細胞包含編碼該抗體或其片段之LC及HC的重組表現系統；及回收該抗體或其片段。
本發明提供人類化抗體或其片段，其包含培養包含編碼人類化抗體或其片段之輕鏈及重鏈的重組表現系統之宿主細胞，其中該抗體或片段專一性結合於人類DKK-1抗原，且其中LC及HC之CDR具有以下胺基酸序列：
(a)一或多個選自由以下組成之群的LC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 22)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 24)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 26)；
(b)一或多個選自由以下組成之群的HC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 30、49或50)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 32或51)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 34或52)；或
(c)(a)之一或多個CDR及(b)之一或多個CDR，
且其中該人類化抗體或其片段可與muMabJC18競爭結合於人類Dkk-1抗原。
亦提供一種醫藥組合物，其包含人類化抗體或其片段，其中該抗體或片段專一性結合於人類Dkk-1抗原，且其中LC及HC之CDR具有以下胺基酸序列：
(a)一或多個選自由以下組成之群的LC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 22)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 24)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 26)；
(b)一或多個選自由以下組成之群的HC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 30、49或50)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 32或51)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 34或52)；或
(c)(a)之一或多個CDR及(b)之一或多個CDR；
及醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
亦提供一種醫藥組合物，其包含人類化抗體或其片段，其中該抗體或片段專一性結合於人類Dkk-1抗原，且其中LC及HC之CDR具有以下胺基酸序列：
(a)一或多個選自由以下組成之群的LC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 22)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 24)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 26)；
(b)一或多個選自由以下組成之群的HC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 30、49或50)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 32或51)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 34或52)；或
(c)(a)之一或多個CDR及(b)之一或多個CDR，
其中該人類化抗體或其片段可與muMabJC18競爭結合於人類DKK-1抗原；及醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
進一步提供一種製造人類化抗體或其片段之方法，其包含培養包含編碼人類化抗體或其片段之LC及HC的重組表現系統之宿主細胞，其中該抗體或片段專一性結合於人類Dkk-1抗原，且其中LC及HC之CDR具有以下胺基酸序列：
(a)一或多個選自由以下組成之群的LC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 22)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 24)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 26)；
(b)一或多個選自由以下組成之群的HC CDR：
(i) CDR1(SEQ ID NO: 30、49或50)；
(ii) CDR2(SEQ ID NO: 32或51)；及
(iii) CDR3(SEQ ID NO: 34或52)；或
(c)(a)之一或多個CDR及(b)之一或多個CDR，
其中該人類化抗體或其片段可與muMabJC18競爭結合於人類Dkk-1抗原；及回收該人類化抗體或其片段。
本發明亦提供一種治療或預防骨質流失之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明之人類化抗體及其片段。在一實施例中，患者為罹患轉移至骨骼之癌症的患者。在一實施例中，患者為罹患多發性骨髓瘤之患者。在一實施例中，患者係選自罹患骨質疏鬆症、骨質減少、佩吉特氏病(Paget's Disease)、牙周炎、類風濕性關節炎及不活動所致之骨質流失的患者。在一實施例中，患者罹患骨質疏鬆症。在一實施例中，患者罹患雌激素缺乏症。
本發明亦提供一種誘導骨質增加之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明之人類化抗體及其片段。在一實施例中，患者為罹患轉移至骨骼之癌症的患者。在一實施例中，患者為罹患多發性骨髓瘤之患者。在一實施例中，患者係選自罹患骨質疏鬆症、骨質減少、佩吉特氏病、牙周炎、類風濕性關節炎及不活動所致之骨質流失的患者。在一實施例中，患者罹患骨質疏鬆症。在一實施例中，患者為骨移植接受者或罹患骨折之患者。在一實施例中，患者患有由用皮質類固醇、芳香酶抑制劑或TZD長期治療；厭食症所致或由性腺低能症或腎性骨營養不良引起之繼發性骨質流失。
本發明亦提供一種誘導Wnt活性之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明之人類化抗體或其片段。
本發明亦提供抗Dkk-1中和單株抗體及其免疫功能片段。在一實施例中，抗體或其片段以<100 pM之Kd結合於人類Dkk-1。在一實施例中，在基於功能細胞之檢定中，抗體或其片段以<100 nM之IC50 拮抗Dkk-1作用。在一實施例中，在一月一次給藥250 mg之後，抗體或其片段具有預期提高骨密度(BMD)量值的預測之人類暴露概況。
亦提供拮抗Dkk-1抑制Wnt活性之能力且因此使骨質增加的骨同化劑，其適用於治療此骨形成增加將有利於患者之疾病、病狀及病症，諸如骨質疏鬆症及導致繼發性骨質流失之疾病、病狀及病症(例如由用皮質類固醇、芳香酶抑制劑或TZD長期治療；厭食症所致；或由性腺低能症或腎性骨營養不良引起)。
本發明之抗體及其片段可與其他醫藥劑(詳言之，用以治療或預防原發性及繼發性骨質流失、骨質減少及如下文所述削弱骨強度者之藥劑)組合投與。組合療法可以任何適合之方式投與，諸如：(a)以單一醫藥組合物之形式，其包含本發明之人類化抗體或其片段、至少一種本文所述之額外醫藥劑及醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑；或(b)以兩種個別醫藥組合物之形式，其包含(i)第一組合物，其包含本發明之人類化抗體或其片段及醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑，及(ii)第二組合物，其包含至少一種本文所述之額外醫藥劑及醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。醫藥組合物可同時投與或依次並以任何適合之順序投與。
進一步提供包含本發明提供之抗體及/或其片段或包含本發明提供之醫藥組合物的套組。在一實施例中，該套組進一步包括關於如何製備抗體或片段及/或如何投與抗體或片段之說明書。在另一實施例中，將該套組用於診斷以確定患者是否能夠藉由抑制Wnt信號傳導路徑來增加骨質。
亦提供在2009年2月18日由ATCC(依據布達佩斯條約(Budapest Treaty)之條款)進行之兩次寄存。寄存攜有具有huMabJC18之HC可變區之質體的大腸桿菌(E.coli )DH5α：宿主大腸桿菌DH5α中來自大腸桿菌之pCR2.1 TOPO(UC 25553，ATCC專利寄存編號PTA-9835)。寄存攜有具有huMabJC18之LC可變區之質體的大腸桿菌DH5α：宿主大腸桿菌DH5α中來自大腸桿菌之pCR2.1 TOPO(UC 25554，ATCC專利寄存編號PTA-9836)。對如此寄存之質體之公眾可獲得性的所有限制將在專利頒予後自本發明說明書不可撤銷地消除。
本發明之其他特徵及優勢將自不應視為限制性之以下實施方式及實例顯而易見。貫穿本說明書全文所引用之所有參考文獻、Genbank條目、專利及公開專利申請案之內容均以全文引用的方式明確併入本文中。
本發明係關於經分離抗體及其片段(例如抗原結合部分)，特定言之係關於專一性結合於Dkk-1之人類化單株抗體及其片段。在一些實施例中，本發明之抗體及其片段係源自特定重鏈及輕鏈生殖系序列及/或包含特定結構特徵，諸如包含特定胺基酸序列之CDR區。本發明提供例如經分離抗體及其片段、製造此等抗體或其片段之方法、及含有該等抗體或其片段之醫藥組合物。本發明亦關於使用該等抗體及其片段諸如偵測Dkk-1以及治療各種導致骨質流失之疾病、病狀或病症(諸如骨病症)的方法。亦提供治療或預防骨質流失之方法、誘導骨質增加之方法及誘導Wnt活性之方法。
定義
除非在本文中另作定義，否則關於本發明使用之科學及技術術語應具有一般技術者通常所瞭解之含義。此外，除非文中另有要求，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。一般而言，本文所述之關於細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白質及核酸化學及雜交所使用之命名法及技術為此項技術中所熟知且常用。除非另外說明，否則本發明之方法及技術一般根據此項技術中熟知之習知方法及本說明書中所引用及論述之各種一般性及較特定之參考文獻中所述執行。參看例如Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)，及Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)，及Harlow及Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，其係以引用的方式併入本文中。如此項技術中通常實現或如本文所述，根據製造商說明書來執行酶反應及純化技術。本文所述之關於分析化學、合成有機化學及醫藥及藥物化學使用之術語及實驗程序及技術為此項技術中熟知及常用者。可使用標準技術來進行化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞，以及治療患者。
除非另外說明，否則本發明中所用之以下術語應瞭解為具有以下含義：
如本文中所用，「Dkk-1」包括例如鼠類及人類原生形式之Dkk-1。例示性Dkk-1蛋白及核苷酸序列揭示於例如US 2006/0127393(WO 2006/015373)及US 2008/0193449中。該術語亦包括與此等原生蛋白具有免疫交叉反應性之此等原生序列之變異體。此等蛋白質可抑制LRP5或LRP6與Wnt之間的相互作用。該術語亦可指原生或變異體形式之Dkk-1中含有抗體可專一性結合之抗原決定基的片段。
術語「聚核苷酸」或「核酸」意謂單股或雙股聚合物。構成聚核苷酸之核苷酸可為核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或任一類型核苷酸之經修飾形式。該等修飾包括鹼基修飾，諸如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修飾，諸如2',3'-二去氧核糖；及核苷酸間鍵修飾，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯及磷醯胺酸。該術語包括單股及雙股形式兩者。
術語「寡核苷酸」意謂包含200個或200個以下核苷酸之聚核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸長度為10至60個鹼基。在其他實施例中，寡核苷酸長度為12、13、14、15、16、17、18、19或20至40個核苷酸。寡核苷酸可為例如用於建構突變基因之單股或雙股寡核苷酸。本發明之寡核苷酸可為有義或反義寡核苷酸。本發明之寡核苷酸可包括供偵測檢定用的標記，包括放射性標記、螢光標記、半抗原或抗原標記。本發明之寡核苷酸可用作例如PCR引子、選殖引子或雜交探針。
「經分離核酸分子」意謂基因組DNA或RNA、mRNA、cDNA或合成來源之DNA或RNA，或其一些組合，其不與在自然界中可發現該經分離聚核苷酸之之全部或一部分聚核苷酸締合，或與在自然界中所不連接的聚核苷酸連接。為達成本發明之目的，應瞭解「包含特定核苷酸序列之核酸分子」並不涵蓋完整染色體。「包含」指定核酸序列的經分離核酸分子除指定序列外亦可包括多達十個或甚至多達二十個其他蛋白質或其部分之編碼序列；或可包括可操作地連接之調控序列，其控制所述核酸序列之編碼區表現；及/或可包括載體序列。
除非另有規定，否則本文中論述之任何單股聚核苷酸序列之左手端為5'端；雙股聚核苷酸序列之左手方向稱作5'方向。新生RNA轉錄物之5'至3'添加方向稱作轉錄方向；在與RNA轉錄物具有相同序列之DNA股上且5'定位於RNA轉錄物之5'端的序列區域稱作「上游序列」；在與RNA轉錄物具有相同序列之DNA股上且3'定位於RNA轉錄物之3'端的序列區域稱作「下游序列」。
術語「控制序列」係指可影響其所接合之編碼序列表現及加工之聚核苷酸序列。此等控制序列之性質可視宿主生物體而定。在特定實施例中，原核生物之控制序列可包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列。舉例而言，真核生物之控制序列可包括啟動子，該等啟動子包含轉錄因子之一或複數個識別位點；轉錄強化子序列；及轉錄終止序列。本發明之「控制序列」可包括前導序列及/或融合搭配物序列。
術語「載體」意謂用以將蛋白質編碼資訊轉移至宿主細胞中之任何分子或實體(例如核酸、質體、噬菌體或病毒)。
術語「表現載體」或「表現構築體」係指適於轉型宿主細胞且含有導引及/或控制(聯合宿主細胞)一或多個其可操作地連接之異源編碼區表現之核酸序列的載體。表現構築體可包括(但不限於)影響或控制轉錄、轉譯且若存在內含子則影響與其可操作地連接之編碼區之RNA剪接的序列。
如本文中所用，「可操作地連接」意謂應用該術語之組分之關係允許其在適合條件下實現其固有功能。舉例而言，載體中「可操作地連接」至蛋白質編碼序列之控制序列係以使得在與控制序列之轉錄活性相容的條件下達成蛋白質編碼序列之表現的方式與其接合。
術語「宿主細胞」意謂已經或能夠經核酸序列轉型且藉此表現相關基因之細胞。該術語包括母細胞之子代(無論子代之形態或遺傳構成是否與原始母細胞一致，只要相關基因存在即可)。
術語「轉導」意謂通常藉由噬菌體使基因自一個細菌轉移至另一者中。「轉導」亦指藉由反轉錄病毒獲取及轉移真核細胞序列。
術語「轉染」意謂細胞吸收外來或外源DNA，且當外源DNA已引入細胞膜內時，該細胞已經「轉染」。在此項技術中熟知且於本文中揭示許多轉染技術。例如參看Graham等人,1973,Virology 52:456；Sambrook等人,2001,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,同上文；Davis等人,1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；及Chu等人,1981,Gene 13:197。此等技術可用以將一或多個外源DNA部分引入適合宿主細胞中。
術語「轉型」係指細胞遺傳特徵改變，且當細胞已經修飾為含有新DNA或RNA時，該細胞已經轉型。舉例而言，當細胞經由轉染、轉導或其他技術引入新遺傳物質而自其原生狀態經遺傳修飾時，該細胞經轉型。轉染或轉導之後，轉型DNA可藉由實體整合於細胞之染色體內而與細胞DNA重組，或可短暫維持為游離型元件而不複製，或可以質體形式獨立複製。當轉型DNA隨細胞分裂而複製時，細胞被視為已經「穩定轉型」。
術語「多肽」或「蛋白質」意謂具有原生蛋白之胺基酸序列的大分子，亦即由天然存在及非重組細胞產生，或由經遺傳工程改造或重組細胞產生的蛋白質，且包含具有原生蛋白之胺基酸序列的分子，或具有對原生序列之一或多個胺基酸缺失、添加及/或取代之分子。術語「多肽」及「蛋白質」特別涵蓋抗Dkk-1抗體，或具有針對抗Dkk-1抗體之一或多個胺基酸缺失、添加及/或取代之序列。術語「多肽片段」係指相較於全長原生蛋白具有胺基端缺失、羧基端缺失及/或內部缺失之多肽。相較於原生蛋白，此等片段亦可含有經修飾之胺基酸。在某些實施例中，片段長約5至500個胺基酸。舉例而言，片段長可為至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450個胺基酸。本發明之適用多肽片段包括抗體之免疫功能片段，包括結合域。在抗Dkk-1抗體之情況下，適用片段包括(但不限於)CDR區、重鏈或輕鏈之可變域、抗體鏈之一部分或僅其可變區(包括兩個CDR)及其類似物。
在本文中提及之術語「經分離蛋白質」意謂本發明之蛋白質(1)不含至少一些在正常情況下伴隨可見之其他蛋白質，(2)基本上不含相同來源(例如相同物種)之其他蛋白質，(3)藉由不同物種之細胞表現，(4)已與至少約50%之在自然界中與其締合之聚核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質分離，(5)與在自然界中不與其締合之多肽可操作地締合(藉由共價或非共價相互作用)，或(6)不存在於自然界中。基因組DNA、cDNA、mRNA或其他RNA、具有合成來源者，或其任何組合可編碼此經分離蛋白質。經分離蛋白質較佳實質上不含其自然環境中可見之會干擾其治療、診斷、預防、研究或其他用途的蛋白質或多肽或其他污染物。
多肽(例如抗體)之「變異體」包含胺基酸序列相對於另一多肽序列已插入、缺失及/或取代一或多個胺基酸殘基之胺基酸序列。本發明之變異體包括融合蛋白。
多肽之「衍生物」為已以一些不同於插入、缺失或取代變異體之方式(例如經由結合於另一化學部分)經化學修飾之多肽(例如抗體)。
如熟習此項技術者應瞭解，「免疫反應」包括(但不限於)輔助T細胞或細胞毒性T細胞反應之任何可偵測抗原專一性或外來活化、抗體產生、T細胞介導之過敏反應活化，及其類似者。該術語涵蓋例如淋巴細胞、抗原呈現細胞、吞噬細胞、粒細胞及由上述細胞或肝臟產生之可溶大分子(包括抗體、細胞激素及補體)致使自人體選擇性損害、破壞或消除侵入病原體、感染病原體之細胞或組織、癌細胞或在自體免疫或病理學發炎之情況下，正常人類細胞或組織之作用。
「信號轉導路徑」係指在信號自細胞之一部分傳輸至細胞之另一部分中起作用之各種信號轉導分子之間的生化關係。如本文中所用，片語「細胞表面受體」包括例如能夠接收信號且使此信號傳輸穿過細胞質膜之分子及分子複合物。
「抗體」為能夠經由至少一個位於免疫球蛋白分子之可變區中的抗原識別位點專一性結合於諸如碳水化合物、聚核苷酸、脂質、多肽等之標靶的免疫球蛋白分子。如本文中所用，該術語不僅涵蓋完整多株或單株抗體，而且亦涵蓋其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、單鏈(ScFv)及域抗體，包括鯊魚及駱駝抗體)，及包含抗體部分之融合蛋白，及包含抗原識別位點之免疫球蛋白分子之任何其他經修飾之組態。抗體包括任何類別之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或其子類)，且抗體不一定屬於任何特定類別。視免疫球蛋白重鏈恆定域的抗體胺基酸序列而定，免疫球蛋白可歸為不同類別。有五個主要類別之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之幾類可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱作α、δ、ε、γ及μ。熟知不同類別免疫球蛋白之次單元結構及三維構型。
本發明之抗體可僅來源於單一來源，或可為「嵌合」抗體，亦即抗體之不同部分可來源於兩種不同抗體。舉例而言，CDR區可來源於大鼠或鼠類來源，而V區之構架區來源於不同動物來源，諸如人類。本發明之抗體或結合片段可藉由重組DNA技術於融合瘤中產生，或藉由使完整抗體酶促或化學裂解而產生。除非另有說明，否則除包含兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈之抗體外，術語「抗體」亦包括其衍生物、變異體、片段及突變形成之蛋白質，其實例描述於下文中。
術語「輕鏈」包括具有足以賦予結合專一性之可變區序列之全長輕鏈及其片段。全長輕鏈包括可變區結構域VL及恆定區結構域CL。輕鏈之可變區結構域位於多肽之胺基端。本發明之輕鏈包括κ鏈及λ鏈。
術語「重鏈」包括具有足以賦予結合專一性之可變區序列之全長重鏈及其片段。全長重鏈包括可變區結構域VH及三個恆定區結構域CH1、CH2及CH3。VH域位於多肽之胺基端，且CH域位於羧基端，其中CH3最接近-COOH端。本發明之重鏈可為任何同型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亞型)、IgA(包括IgA1及IgA2亞型)、IgM。VH及VL區可進一步再分為稱為互補決定區(CDR)之高變區，穿插有稱為構架區(FR)之較保守區域。各VH及VL由三個CDR及四個FR構成，其自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈可變區及輕鏈可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體恆定區可介導免疫球蛋白結合於宿主組織或包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)的因子。在輕鏈及重鏈中，可變區與恆定區藉由約12個或12個以上胺基酸之「J」區接合，其中重鏈亦包括約10個或10個以上胺基酸之「D」區。一般參看Fundamental Immunology第7章(Paul,W.編，第2版. Raven Press,N.Y.(1989))。
如本文中所用，術語抗體之「抗原結合部分」(或簡稱「抗體部分」)係指抗體中保留專一性結合於抗原(例如α5β1)之能力的一或多個片段。已顯示抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段來執行。涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」中之結合片段的實例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii)F(ab')2 片段，即包含兩個在鉸鏈區藉由二硫橋連接之Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH域組成之Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人,(1989) Nature 341:544-546)，其係由VH域組成；及(vi)經分離互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個結構域(VL及VH)係由單獨基因編碼，但可使用重組法藉由合成連接子將其接合使其能夠成為VL區與VH區配對形成單價分子的單一蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；例如參看Bird等人,(1988) Science 242:423-426；及Huston等人,(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。此等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」中。此等抗體片段可使用任何適合技術(包括熟習此項技術者已知之習知技術)獲得，且該等片段可以與完整抗體相同之方式經篩選以便使用。
如本文中所用，「經分離抗體」意欲指實質上不含具有不同抗原專一性之其他抗體的抗體(例如專一性結合Dkk-1之經分離抗體實質上不含專一性結合除Dkk-1外之抗原的抗體)。然而，專一性結合Dkk-1之經分離抗體可對其他抗原(諸如來自其他物種之Dkk-1分子)具有交叉反應性。此外，經分離抗體可實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。
如本文中所用，術語免疫球蛋白鏈之「免疫功能片段」(或簡稱「片段」)係指缺少至少一些在全長鏈中存在之肽基酸但能夠專一性結合於抗原之抗體輕鏈或重鏈的一部分。此等片段因其專一性結合於標靶抗原且可與完整抗體競爭專一性結合於既定抗原決定基而具有生物活性。在本發明之一態樣中，此片段將保留至少一個存在於全長輕鏈或重鏈中之CDR，且在一些實施例中將包含單一重鏈及/或輕鏈或其部分。此等生物活性片段可藉由重組DNA技術產生，或可藉由使完整抗體酶促或化學裂解來產生。本發明之免疫功能免疫球蛋白片段包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、域抗體及單鏈抗體，且可來源於任何哺乳動物來源，包括(但不限於)人類、小鼠、大鼠、駱駝或兔。進一步涵蓋本發明抗體之功能部分(例如一或多個CDR)可共價結合於第二蛋白或小分子產生針對體內特定標靶之治療劑，從而具有雙功能治療特性，或具有長時間的血清半衰期。
「Fab片段」包含一條輕鏈，及一條重鏈之CH1及可變區。Fab分子之重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。
「Fc」區含有兩個包含抗體之CH1及CH2域的重鏈片段。兩個重鏈片段係藉由兩個或兩個以上二硫鍵且藉由CH3域之疏水性相互作用固持在一起。
「Fab'片段」含有一條輕鏈，及一條含有VH域及CH1域以及CH1與CH2域之間之區域的重鏈之一部分，使得可在兩個Fab'片段之兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab')2分子。
「F(ab')2片段」含有兩條輕鏈及兩條含有CH1與CH2域之間恆定區的一部分之重鏈，使得兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此F(ab')2片段由兩個藉由兩條重鏈之間的二硫鍵固持在一起之Fab'片段構成。
「Fv區」包含來自重鏈及輕鏈兩者之可變區，但缺少恆定區。
「單鏈抗體」為重鏈可變區與輕鏈可變區已藉由可撓性連接子相連接形成單一多肽鏈，從而形成抗原結合區之Fv分子。單鏈抗體於例如WO 88/01649及美國專利第4,946,778號及第5,260,203號中詳細論述。
「域抗體」為僅含有重鏈之可變區或輕鏈之可變區的免疫功能免疫球蛋白片段。在一些情況下，兩個或兩個以上VH區經肽連接子共價接合產生二價域抗體。二價域抗體之兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
「二價抗體」包含兩個抗原結合位點。在一些情況下，兩個結合位點具有相同抗原專一性。然而，二價抗體可呈雙專一性(參看下文)。
「多專一性抗體」為靶向一種以上抗原或抗原決定基之抗體。
「雙專一性」、「雙重專一性」或「雙功能」抗體為具有兩個不同抗原結合位點之雜交抗體。雙專一性抗體為一種多專一性抗體，且可藉由各種方法(包括(但不限於)融合瘤融合或Fab'片段連接)產生。例如參看Songsivilai及Lachmann(1990),Clin. Exp. Immunol. 79:315-321；及Kostelny等人,(1992),J. Immunol. 148:1547-1553。雙專一性抗體之兩個結合位點將結合於兩個可位於相同或不同蛋白質標靶上之不同抗原決定基。
如本文中所用，「單株抗體」係指獲自實質上同源抗體之群體的抗體，亦即構成該群體之個別抗體除可能之可以微量存在之天然存在的突變外為相同的。單株抗體針對單一抗原位點具有高度專一性。此外，與多株抗體製劑(其通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體)相反，各單株抗體針對抗原上之單一決定子。修飾語「單株」表示抗體獲自實質上同源抗體群之特徵，且不應視為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由Kohler及Milstein(1975) Nature 256:495首先描述之融合瘤法製得，或可藉由諸如描述於美國專利第4,816,567號中之重組DNA方法製得。單株抗體亦可自使用例如McCafferty等人,(1990) Nature 348:552-554中所述之技術產生之噬菌體文庫分離。
術語「人類抗體衍生物」係指人類抗體之任何修飾形式，例如抗體與另一藥劑或抗體之結合物。
術語「人類化抗體」意欲指來源於另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已移植於人類構架序列上之抗體。可在人類構架序列內進行額外構架區修飾。
如本文中所用，「人類化」抗體係指非人類(例如鼠類)抗體形式，其為含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈，或其片段(諸如抗體之Fv、Fab、Fab'、F(ab')2 或其他抗原結合子序列)。人類化抗體較佳為人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者之互補決定區(CDR)的殘基經具有所需專一性、親和力及能力之來自非人類物種(供者抗體)(諸如小鼠、大鼠或兔)之CDR的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含在接受者抗體或輸入CDR或構架序列中均未見，但包括以使抗體效能進一步改進及最佳化之殘基。一般而言，人類化抗體將包含實質上所有至少一個及通常兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區均對應於非人類免疫球蛋白之CDR區，且所有或實質上所有FR區均為人類免疫球蛋白共同序列之FR區。人類化抗體最佳亦將包含免疫球蛋白恆定區或恆定域(Fc)之至少一部分，通常包含人類免疫球蛋白恆定區或恆定域之至少一部分。較佳為Fc區如在WO 99/58572中所述經修飾之抗體。其他形式之人類化抗體具有一或多個相對於原始抗體經改變之CDR(CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2及/或CDR H3)。
如本文中所用，術語「人類抗體」或「完全人類抗體」意欲包括具有構架區及CDR區兩者均來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區的抗體。此外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦來源於人類生殖系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體或其抗原結合部分可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位點專一性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。然而，如本文中所用，術語「人類抗體」並不意欲包括來源於另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已移植於人類構架序列上之抗體。
術語「人類單株抗體」或「完全人類單株抗體」係指顯示單一結合專一性且具有構架區及CDR區兩者均來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區的抗體。在一實施例中，人類單株抗體係由包括獲自具有包含人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之基因組的轉殖基因非人類動物(例如轉殖基因小鼠)之B細胞的融合瘤產生，其中該B細胞係融合於永生化細胞。
如本文中所用，術語「重組人類抗體」包括所有藉由重組手段製備、表現、產生或分離之人類抗體，諸如(a)自人免疫球蛋白基因之轉殖基因或轉染色體動物(例如小鼠)或由此製備之融合瘤分離之抗體(下文進一步描述)；(b)自經轉型以表現人類抗體之宿主細胞，例如自轉染瘤分離之抗體；(c)自重組組合人類抗體文庫分離之抗體；及(d)藉由任何其他涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之手段製備、表現、產生或分離的抗體。此等重組人類抗體具有構架區及CDR區來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。然而，在某些實施例中，可對此等重組人類抗體進行活體外突變誘發(或當使用人類Ig序列之轉殖基因動物時進行活體內體細胞突變誘發)且因此重組抗體之VH區及VL區之胺基酸序列為儘管來源於且有關於人類生殖系VH及VL序列但可能並非天然活體內存在於人類抗體生殖系譜系中之序列。
如本文中所用，「同型」或「類別」係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別(例如IgM或IgG)。抗體之恆定域不涉及於結合於抗原中，但顯示各種效應功能。視重鏈恆定區之胺基酸序列而定，既定人類抗體或免疫球蛋白可歸於以下五個主要類別之免疫球蛋白之一：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。熟知不同類別免疫球蛋白之結構及三維構型。在各種人類免疫球蛋白類別中，已知僅人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgM活化補體。已知人類IgG1及IgG3在人類中介導ADCC。
如本文中所用，「子類」係指重鏈恆定區基因之同型內之進一步分類，諸如IgG同型內之IgG1、IgG2、IgG3或IgG4子類。
如本文中所用，術語「化合物」或「醫藥化合物」包括抗體、其抗原結合部分、免疫結合物及雙專一性分子。
片語「識別抗原之抗體」及「對抗原具專一性之抗體」與術語「專一性結合於抗原之抗體」在本文中可互換使用。
術語「抗體依賴性細胞毒性」或「ADCC」係指一種細胞介導反應，其中非專一性細胞毒性細胞(例如NK細胞、嗜中性白血球、巨噬細胞等)識別結合於標靶細胞上之抗體且隨後引起標靶細胞溶解。此等介導ADCC之細胞毒性細胞一般表現Fc受體(FcR)。介導ADCC之初級細胞(NK細胞)表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII、FcγRIII及/或FcγRIV。造血細胞上之FcR表現係於Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol .,9:457-92(1991)中概述。為評估分子之ADCC活性，可執行活體外ADCC檢定，諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中所述之檢定。適用於此等檢定之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，相關分子之ADCC活性可於活體內，例如在動物模型(諸如Clynes等人,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),95:652-656(1998)中所揭示者)中加以評估。
使用術語「Fc受體」或「FcR」來描述結合於抗體之Fc區的受體，其中該Fc區包含鉸鏈區及重鏈之CH 2及CH 3域。舉例而言，FcR可為原生序列人類FcR。FcR可為結合IgG抗體之受體(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII及FcγRIV子類之受體，包括對偶基因變異體及此等受體之替代性剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，其具有不同之處主要在於細胞質域之類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(ITIM)(參看Daeron,Annu. Rev. Immunol.,15:203-234(1997))。FcR係於Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol.,9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods,4:25-34(1994)；及de Haas等人,J. Lab. Clin. Med.,126:330-41(1995)中評述。在本文中術語「FcR」涵蓋包括有待將來鑑別之其他FcR。該術語亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，Immunol.,117:587(1976)及Kim等人，J. Immunol.,24:249(1994))。免疫球蛋白Fc片段上之主要FcR結合位點存在於CH 1域與CH 2域之間的鉸鏈區中。此鉸鏈區與各種白血球上之FcR1-3相互作用且觸發此等細胞攻擊標靶(Wines等人,J. Immunol.,164:5313-5318(2000))。鉸鏈區涵蓋(但不限於)美國專利第6,165,476號中所述之序列。
術語「能夠誘導抗體依賴性細胞毒性」係指如藉由熟習此項技術者已知之檢定所量測，諸如抗體之藥劑表現ADCC之能力。此活性之特徵通常在於使Fc區與各種FcR結合。不受限於任何特定機制，熟習此項技術者應認識到抗體表現ADCC之能力可例如藉助於其子類(諸如IgG1或IgG3)、藉由引入Fc區中之突變，或藉助於抗體之Fc區中碳水化合物模式之修飾而實現。此等修飾係於例如美國專利申請公開案第2007/0092521號中描述。
術語「中和抗體」係指結合於配位體、防止配位體結合於其結合搭配物且中斷否則會由配位體結合於其結合搭配物引起之生物反應的抗體。在評估抗體或其免疫功能片段之結合及專一性中，當過量抗體使結合於配位體之結合搭配物之量減少至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或99%以上(如在活體外競爭結合檢定中所量測)時，抗體或片段將實質上抑制配位體結合於其結合搭配物。在Dkk-1之抗體的情況下，中和抗體將減小Dkk-1結合LRP5或LRP6之能力，藉此誘導Wnt活性可量測之提高。
術語「競爭」當在競爭同一抗原決定基之抗體的上下文中使用時意謂藉由檢定測定抗體之間的競爭，其中所測試之抗體或免疫功能片段防止或抑制參考抗體專一性結合於共同抗原(例如Dkk-1或其片段)。可使用眾多類型之競爭結合檢定，例如：固相直接或間接放射免疫檢定(RIA)、固相直接或間接酶免疫檢定(EIA)、夾層競爭檢定(例如參看Stahli等人,(1983)Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(例如參看Kirkland等人,(1986) J. Immunol. 137:3614-3619)、固相直接標記檢定、固相直接標記夾層檢定(例如參看Harlow及Lane(1988) Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125標記之固相直接標記RIA(例如參看Morel等人,(1988) Molec. Immunol. 25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(例如參看Cheung等人,(1990) Virology 176:546-552)；及直接標記RIA(Moldenhauer等人,(1990) Scand. J. Immunol. 32:77-82)。此檢定通常涉及使用結合於帶有此等未標記測試免疫球蛋白及標記之參考免疫球蛋白中任一者之固體表面或細胞的經純化抗原。競爭性抑制係藉由測定在測試免疫球蛋白存在下結合於固體表面或細胞之標記量來量測。存在之測試免疫球蛋白通常過量。由競爭檢定鑑別之抗體(競爭抗體)包括與參考抗體結合於相同抗原決定基之抗體，及結合於足夠接近由參考抗體所結合之抗原決定基的鄰近抗原決定基以產生位阻之抗體。關於測定競爭結合之方法的其他細節在本文實例中提供。當存在之競爭抗體過量時，其通常將抑制參考抗體專一性結合於共同抗原達至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情況下，結合被抑制達至少80%、85%、90%、95%、或97%或97%以上。
術語「抗原」係指能夠經選擇性結合劑(諸如抗體)結合且另外能夠用於動物中以產生能夠結合於彼抗原之抗體的分子或分子之一部分。抗原可具有一或多個能夠與不同抗體相互作用之抗原決定基。
術語「抗原決定基」包括任何能夠專一性結合於免疫球蛋白或T-細胞受體之決定子。抗原決定基為抗原中經專一性靶向彼抗原之抗體結合且當抗原為蛋白質時包括直接接觸抗體之專一性胺基酸的區域。抗原決定基最常存在於蛋白質上，但在一些情況下可存在於其他種類之分子(諸如核酸)上。抗原決定基決定子可包括化學活性表面分類之分子，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。一般而言，對特定標靶抗原具有專一性之抗體將在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中優先識別標靶抗原上之抗原決定基。
如本文中所用，片語「專一性結合」意謂化合物(例如蛋白質、核酸、抗體及其類似物)識別及結合專一性分子，但實質上不識別或結合樣品中之其他分子。舉例而言，識別及結合樣品中同源配位體(例如與其同源抗原Dkk-1結合之抗Dkk-1抗體)但實質上不識別或結合樣品中其他分子之抗體或肽抑制劑。因此，在指定檢定條件下，指定結合部分(例如抗體或其片段(例如其抗原結合部分))優先結合於特定標靶分子(例如Dkk-1)，且並不大量結合於測試樣品中存在之其他組分。可使用各種檢定形式來選擇專一性結合相關分子之抗體。舉例而言，固相ELISA免疫檢定、免疫沈澱、BIAcore、FACS及西方墨點分析(Western blot analysis)為可用以鑑別與Dkk-1專一性反應之抗體的許多檢定中之幾種。專一性或選擇性反應通常為背景信號或雜訊之至少兩倍，且更通常大於背景之10倍，甚至更特定言之，當平衡解離常數(KD )1 μM，例如100 nM，且進一步例如10 nM時，稱抗體為「專一性結合」抗原。
當解離常數(Kd)較佳為約100 pM或100 pM以下、約1×10-9 或1×10-9 以下，或1×10-8 或1×10-8 以下時，稱本發明之抗體「專一性結合」其標靶抗原。
如本文中所用，術語「kon 」意欲指特定抗體-抗原相互作用之締合速率，而如本文中所用，術語「koff 」意欲指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。如本文中所用，術語「KD 」意欲指解離常數，其由koff 與kon 之比(亦即koff /kon )獲得且以莫耳濃度(M)之形式表述。抗體之KD 值可使用在此項技術中已確立之方法來測定。一種測定抗體KD 之方法係藉由使用表面電漿共振，其通常使用生物感測器系統，諸如BIAcore系統。
術語IgG抗體之「高親和力」一般係指抗體對標靶抗原之KD 為1×10-7 M或1×10-7 M以下、5×10-8 M或5×10-8 M以下，或5×10-9 M或5×10-9 M以下。然而，對於其他抗體同型，「高親和力」結合可不同。舉例而言，對IgM同型之「高親和力」結合係指抗體之KD 為10-6 M或10-6 M以下、10-7 M或10-7 M以下，或10-8 M或10-8 M以下。
術語「一致性」係指如藉由比對及比較序列所測定，兩種或兩種以上多肽分子或兩種或兩種以上核酸分子之序列之間的關係。「一致性百分比」意謂在所比較分子之胺基酸或核苷酸之間一致殘基之百分比且基於所比較之最小分子之大小來計算。對於此等計算，必須藉由特定數學模型或電腦程式(亦即「演算法」)來處理比對中之間隙(若存在)。可用以計算所比對核酸或多肽之一致性的方法包括以下文獻中所述者：Computational Molecular Biology,(Lesk,A. M.編)(1988) New York: Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D. W.編)(1993) New York: Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data,第I部分,(Griffin,A. M.及Griffin,H. G.編)(1994) New Jersey: Humana Press；von Heinje,G.(1987) Sequence Analysis in Molecular Biology,New York: Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.及Devereux,J.編)(1991) New York: M. Stockton Press；及Carillo等人,(1988) SIAM J. Applied Math. 48: 1073。
計算一致性百分比時，以得到序列之間最大匹配之方式比對所比較之序列。用以測定一致性百分比之電腦程式為GCG程式包，其包括GAP(Devereux等人,(1984) Nucl Acid Res 12:387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wisc.)。使用電腦演算法GAP來比對兩種欲測定序列一致性百分比之多肽或聚核苷酸。序列經比對以便達成其各別胺基酸或核苷酸之最佳匹配(「匹配範圍(matched span)」，如依據演算法所測定)。間隙開放罰分(gap opening penalty)(其經計算為平均對角線(average diagonal)之3倍，其中「平均對角線」為所用比較矩陣對角線平均值；「對角線」為藉由特定比較矩陣賦予各完全胺基酸匹配之評分或數字)及間隙延長罰分(gap extension penalty)(其通常為間隙開放罰分之1/10)，以及諸如PAM 250或BLOSUM 62之比較矩陣與演算法聯合使用。在某些實施例中，演算法亦使用標準比較矩陣(參看Dayhoff等人,(1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352，關於PAM 250比較矩陣；Henikoff等人,(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919，關於BLOSUM 62比較矩陣)。
使用GAP程式測定多肽或核苷酸序列之一致性百分比的推薦參數如下：
演算法：Needleman等人,(1970) J. Mol. Biol. 48:443-453；
比較矩陣：BLOSUM 62，獲自Henikoff等人,(1992),同上文；
間隙罰分：12(但末端間隙無罰分)
間隙長度罰分：4
類似性之臨限值：0。
比對兩個胺基酸序列之某些比對方案僅可產生兩個序列之短區域匹配，且此小比對區域可具有極高序列一致性，儘管該兩種全長序列之間不存在顯著關係。因此，所選比對方法(GAP程式)可視需要加以調整以產生跨越標靶多肽之至少50個相鄰胺基酸的比對。
如本文中所用，「實質上純」意謂所述分子物質為存在之主要物質，亦即以莫耳濃度計，其豐度大於同一混合物中之任何其他個別物質。在某些實施例中，實質上純分子為目標物質佔存在之全部大分子物質的至少50%(以莫耳濃度計)之組合物。在其他實施例中，實質上純組合物將佔組合物中所存在之全部大分子物質的至少80%、85%、90%、95%或99%。在其他實施例中，將目標物質純化至基本均質，其中藉由習知偵測方法在組合物中無法偵測到污染物質，且因此組合物係由單一可偵測大分子物質組成。
「胺基酸」包括其在此項技術中之一般含義。二十種天然存在之胺基酸及其縮寫遵循習知用法。參看Immunology-A Synthesis,第2版,(E. S. Golub及D. R. Gren編),Sinauer Associates: Sunderland,Mass.(1991)，該文獻係出於任何目的以引用的方式併入本文中。二十種習知胺基酸之立體異構體(例如D-胺基酸)、非天然胺基酸(諸如α-,α-雙取代胺基酸、N-烷基胺基酸)、及其他非習知胺基酸亦可為本發明多肽之適合組分。非習知胺基酸之實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸，及其他類似胺基酸及亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文所用之多肽符號中，根據標準用法及慣例，左手方向為胺基端方向且右手方向為羧基端方向。
術語「骨質減少」係指患者之骨質流失相較於被視為具有正常骨密度(BMD)之標準患者為至少一個標準差。舉例而言，量值可藉由雙能量X射線吸收測定術(Dual Energy X-ray Absorptiometry/DEXA)測定且將患者之BMD與年齡及性別匹配之標準比較(Z評分)。在測定骨質減少時，可獲取一或多個骨骼之BMD量值。
術語「治療有效量」係指經測定在哺乳動物中產生治療反應的抗Dkk-1抗體量。此等治療有效量可由一般技術者輕易地確定。
「糖型(Glycoform)」係指包含各種碳水化合物單元之鍵聯的複雜寡醣結構。此等結構係描述於例如Essentials of Glycobiology Varki等人編,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1999)，其亦提供標準糖生物學命名法之評述。此等糖型包括(但不限於)G2、G1、G0、G-1及G-2(例如參看WO 99/22764)。
「糖基化模式」經定義為碳水化合物單元共價連接至蛋白質(例如糖型)以及共價連接至糖型共價連接至蛋白質之肽主鏈的位點，更特定言之共價連接至免疫球蛋白的模式。
由不同細胞株或在轉殖基因動物中表現之抗體相較於彼此可能具有不同糖型及/或糖基化模式。然而，不論此等抗體之糖基化如何，所有由本文提供之核酸分子編碼，或包含本文提供之胺基酸序列的抗體均為本發明之一部分。
如本文中所用，術語「個體」包括任何人類或非人類動物。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。
如本文中所用，「治療」意謂降低患者所經歷疾病症狀之頻率。該術語包括投與本發明之化合物或藥劑以預防或延遲疾病症狀、併發症或生化指標之發作；緩解症狀或停止或抑制疾病、病狀或病症進一步發展。治療可為預防性(預防或延遲疾病發作，或預防其臨床或亞臨床症狀之表現)或治療性抑制或緩解疾病表現之後之症狀。
在以下分段中進一步詳細描述本發明之各種一般態樣。
概述
本發明提供包含Dkk-1專一性抗體及免疫球蛋白抗原結合位點的新穎組合物。一些此等抗體及抗體片段可與來自若干哺乳動物來源之Dkk-1(包括大鼠、小鼠及人類Dkk-1)交叉反應。一些抗體及片段對於來自一種物種之Dkk-1之親和力高於對來自另一物種之Dkk-1之親和力。本發明亦提供新穎中和抗體，其包括嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體，以及抗體及其免疫功能片段。亦揭示編碼抗體及片段之核酸，以及使用此等核酸表現該等抗體之方法。在另一態樣中，本發明係關於能夠展現抗體抗原結合位點之免疫結合特性的分子(例如免疫功能片段及多肽)。
本文揭示之抗體及免疫功能片段具有各種效用。一些抗體及片段例如適用於Dkk-1或其配位體之專一性結合檢定、親和力純化，且適用於篩選檢定中以鑑別Dkk-1活性之其他拮抗劑。某些抗體可用以治療與Dkk-1活性相關之各種疾病。因此一些抗體及片段可用於各種與骨骼有關之治療，諸如提高BMD、合成新骨骼、治療全身性骨質流失(例如骨侵蝕)、骨修復及治療各種形式之關節炎。然而，所揭示之某些抗體及片段可用以治療各種與骨疾病無關之不同疾病。
抗體及片段
提供各種適用於調控Dkk-1活性之選擇性結合劑。此等藥劑包括例如含有抗原結合域之抗體及其免疫功能片段(例如具有抗原結合區之單鏈抗體、域抗體、免疫黏附物及多肽)且專一性結合於Dkk-1多肽(例如人類、大鼠及/或鼠類Dkk-1多肽)。一些藥劑例如適用於抑制Dkk-1結合於LRP5及/或LRP6，且因此可用以刺激一或多種與Wnt信號傳導相關之活性。
天然存在之抗體結構
所提供之一些結合劑具有通常與天然存在之抗體相關的結構。此等抗體之結構單元通常包含一或多個各自由兩個相同多肽鏈對構成之四聚體，但一些哺乳動物物種亦產生僅具有單一重鏈之抗體。在典型抗體中，各對包括一條全長「輕」鏈(在某些實施例中，約25 kDa)及一條全長「重」鏈(在某些實施例中，約50-70 kDa)。各個免疫球蛋白鏈係由若干「免疫球蛋白域」構成，各「免疫球蛋白域」係由約90至110個胺基酸組成且表現特徵摺疊模式。此等結構域為組成抗體多肽之基本單位。各鏈之胺基端部分通常包括負責抗原識別之可變域。羧基端部分在進化上比鏈之另一端更保守且稱作「恆定區」或「C區」。人類輕鏈一般分類為κ及λ輕鏈，且此等鏈各含有一個可變域及一個恆定域。重鏈通常分類為μ、δ、γ、α或ε鏈，且據此將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有若干亞型，包括(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM亞型包括IgM及IgM2。IgA亞型包括IgA1及IgA2。在人類中，IgA及IgD同型含有四條重鏈及四條輕鏈；IgG及IgE同型含有兩條重鏈及兩條輕鏈；且IgM同型含有五條重鏈及五條輕鏈。重鏈C區通常包含一或多個可負責效應功能之結構域。重鏈恆定區結構域之數目視同型而定。舉例而言，IgG重鏈各含有三個C區結構域，稱為CH1、CH2及CH3。所提供之抗體可具有任一此等同型及亞型。
在全長輕鏈及重鏈中，可變區及恆定區係藉由約12個或12個以上胺基酸之「J」區接合，其中重鏈亦包括約10個或10個以上胺基酸之「D」區。例如參看Fundamental Immunology,第2版,第7章(Paul,W編)(1989)New York: Raven Press(出於所有目的以全文引用的方式併入本文中)。各輕鏈/重鏈對之可變區通常形成抗原結合位點。
免疫球蛋白鏈之可變區一般展現相同總體結構，包含相對保守性構架區(FR)由三個高變區(更通常稱為「互補決定區」或CDR)接合。來自上述各重鏈/輕鏈對之兩條鏈的CDR通常藉由構架區比對以形成與標靶蛋白質(例如Dkk-1)上特定抗原決定基專一性結合之結構。天然存在之輕鏈及重鏈可變區自N端至C端通常均符合此等元件之以下順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。已設計編號系統以便對佔據此等各結構域中之位置之胺基酸指定編號。此編號系統係定義於Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest((1987及1991)美國國立衛生研究院(National Institutes of Health),Bethesda,Md.)，或Chothia及Lesk(1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917；Chothia等人,(1989) Nature 342: 878-883。本發明提供之輕鏈各可與本發明提供之任何重鏈組合以形成抗體。在一些實施例中，抗體含有兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈。所提供之其他抗體為所提供之重鏈及輕鏈之組合形成之抗體的變異體，且包含的輕鏈及/或重鏈各與此等鏈之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%一致性。在一些情況下，此等抗體包括至少一條重鏈及一條輕鏈，而在其他情況下，此等變異體形式含有兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈。
抗體之CDR
既定抗體之互補決定區(CDR)及構架區(FR)可使用以下所述之系統鑑別：Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，美國健康與人類服務部(US Dept. of Health and Human Services),PHS,NIH,NIH出版物第91-3242號(1991)。本文所揭示之某些抗體包含一或多個與一或多個所提供之CDR之胺基酸序列一致或具有實質序列一致性的胺基酸序列。
所提供之抗體及片段可包括一、二、三、四、五或所有六個以上所列CDR。一些抗體具有表4中所列之CDR之變異體形式，其中一或多個(亦即2、3、4、5或6個)CDR各與所提供之專一性CDR序列具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性。
競爭抗體及片段
亦提供與所例示抗體或功能片段競爭專一性結合於Dkk-1之抗體及其免疫功能片段。此等抗體及片段亦可與一種例示抗體結合於相同抗原決定基。預期與所例示抗體或片段競爭或結合於相同抗原決定基之抗體及片段顯示類似功能特性。
單株抗體
所提供之抗體包括結合於Dkk-1之單株抗體。可使用此項技術中已知之任何技術，例如藉由使自完成免疫時程後之轉殖基因動物收集之脾臟細胞永生化而產生單株抗體。脾臟細胞可使用此項技術中已知之任何技術，例如使其與骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤而永生化。用於產生融合瘤之融合程序中之骨髓瘤細胞較佳不產生抗體，具有高融合效率，且缺乏酶，致使其不能生長於某些僅支持所需融合細胞(融合瘤)生長之選擇性培養基中。適用於小鼠融合之細胞株的實例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7及S194/5XXO Bul；用於大鼠融合之細胞株的實例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F及4B210。適用於細胞融合之其他細胞株為U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2及UC729-6。
在一些情況下，融合瘤細胞株係如下製得：以Dkk-1免疫原使動物(例如具有人類免疫球蛋白序列之轉殖基因動物)免疫；自經免疫之動物收集脾臟細胞；使所收集之脾臟細胞與骨髓瘤細胞株融合，藉此產生融合瘤細胞；自融合瘤細胞建立融合瘤細胞株，及鑑別產生結合Dkk-1多肽之抗體的融合瘤細胞株。本發明涵蓋此等融合瘤細胞株及其所產生之抗Dkk-1單株抗體。
可使用此項技術中已知之任何技術純化融合瘤細胞株所分泌之單株抗體。可進一步篩選融合瘤或Mab以鑑別具有特定特性(諸如阻斷Wnt誘導活性之能力)之Mab。在下文實例中提供此等篩選之實例。
嵌合及人類化抗體
亦提供基於前述序列之嵌合及人類化抗體。適用作治療劑之單株抗體可在使用前以多種方式修飾。一個實例為「嵌合」抗體，其為由不同抗體之蛋白質區段構成的抗體，該等蛋白質區段共價接合以產生功能免疫球蛋白輕鏈或重鏈或其免疫功能部分。一般而言，該重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中之相應序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中之相應序列一致或同源。關於與嵌合抗體有關之方法，參看例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1985)。CDR移植描述於例如美國專利第6,180,370號、第5,693,762號、第5,693,761號、第5,585,089號及第5,530,101號中。
一般而言，製造嵌合抗體之目標在於產生來自預定患者物種之胺基酸數目最大化的嵌合體。一個實例為「CDR移植」抗體，其中該抗體包含一或多個來自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之互補決定區(CDR)，而該(該等)抗體鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類的抗體中之相應序列一致或同源。為用於人類，常將來自齧齒動物抗體之V區或所選CDR移植於人類抗體中，從而置換人類抗體之天然存在之V區或CDR。
一種適用類型之嵌合抗體為「人類化」抗體。一般而言，人類化抗體由最初在非人類動物中產生之單株抗體產生。此單株抗體中之某些胺基酸殘基(通常來自抗體之非抗原識別部分)經修飾為與相應同型之人類抗體中相應殘基同源。人類化可例如使用各種方法，藉由使齧齒動物可變區之至少一部分經人類抗體之相應區域取代來執行(例如參看美國專利第5,585,089號及第5,693,762號；Jones等人,(1986) Nature 321:522-25；Riechmann等人,(1988) Nature 332:323-27；Verhoeyen等人,(1988) Science 239:1534-36)。在一些實施例中，來自除人類外之物種的恆定區可與人類可變區一起使用以產生雜交抗體。
完全人類抗體
亦提供完全人類抗體。可使用製得對既定抗原具有專一性之完全人類抗體而不使人類暴露於抗原(「完全人類抗體」)的方法。產生完全人類抗體之一種手段為小鼠體液免疫系統之「人類化」。將人類免疫球蛋白(Ig)基因座引入內源性Ig基因已失活之小鼠中為一種在小鼠(可以任何所需抗原免疫之動物)中產生完全人類單株抗體(Mab)之手段。使用完全人類抗體可使有時可因向人類投與小鼠或小鼠產生之Mab作為治療劑所引起的免疫原性反應及過敏反應降至最低。
完全人類抗體可藉由使能夠在不產生內源免疫球蛋白之情況下產生人類抗體譜系之轉殖基因動物(通常為小鼠)免疫來產生。用於此目的之抗原通常具有六個或六個以上相鄰胺基酸，且視情況結合至載劑，諸如半抗原。例如參看Jakobovits等人,(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555；Jakobovits等人,(1993) Nature 362:255-258；及Bruggermann等人,(1993) Year in Immunol. 7:33。在此方法之一個實例中，轉殖基因動物係如下產生：使編碼小鼠免疫球蛋白重鏈及輕鏈之內源性小鼠免疫球蛋白基因座失能，且插入含有編碼人類重鏈及輕鏈蛋白質之基因座的人類基因組DNA之小鼠基因組大片段中。接著雜交育種經部分修飾之動物(其具有人類免疫球蛋白基因座之不完整互補序列)以獲得具有所有所需免疫系統修飾之動物。當投與免疫原時，此等轉殖基因動物產生對免疫原具有免疫專一性，但具有人類而非鼠類胺基酸序列(包括可變區)之抗體。關於此等方法之其他細節，參看例如WO 96/33735及WO 94/02602，其係以引用的方式併入本文中。關於製得人類抗體之轉殖基因小鼠之其他方法描述於美國專利第5,545,807號；第6,713,610號；第6,673,986號；第6,162,963號；第5,545,807號；第6,300,129號；第6,255,458號；第5,877,397號；第5,874,299號及第5,545,806號；WO 91/10741及WO 90/04036，及EP 546073B1及EP 546073A1中。
本文中稱作「HuMab」小鼠之上述轉殖基因小鼠含有編碼未重排人類免疫球蛋白重鏈(μ及γ)及κ輕鏈序列之人類免疫球蛋白基因小基因座，以及使內源性μ及k鏈基因座失活之靶向突變(Lonberg等人,(1994) Nature 368: 856-859)。因此，小鼠展現小鼠IgM及k回應於免疫之表現降低，且所引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因進行類別轉換及體細胞突變以產生高親和力人類IgG κ單株抗體(Lonberg等人，同上文；Lonberg及Huszar(1995) Intern. Rev. Immunol.,13: 65-93；Harding及Lonberg(1995) Ann. N. Y Acad. Sci 764: 536-546)。HuMab小鼠之製備詳述於Taylor等人,(1992)Nucleic Acids Research,20: 6287-6295；Chen等人,(1993) International Immunology 5: 647-656；Tuaillon等人,(1994) J. Immunol. 152: 2912-2920；Lonberg等人,(1994) Nature 368: 856-859；Lonberg(1994) Handbook of Exp. Pharmacology 113: 49-101；Taylor等人,(1994) International Immunology 6: 579-591；Lonberg及Huszar(1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93；Harding及Lonberg,1995,Ann. N.Y Acad. Sci. 764: 536-546；Fishwild等人,(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851；前述參考文獻係出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。進一步參看美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,789,650號；第5,877,397號；第5,661,016號；第5,814,318號；第5,874,299號；及第5,770,429號；以及美國專利第5,545,807號；及WO 93/1227；WO 92/22646；及WO 92/03918。用於在此等轉殖基因小鼠中產生人類抗體之技術亦揭示於WO 98/24893，及Mendez等人,(1997) Nature Genetics 15: 146-156，其係以引用的方式併入本文中。舉例而言，HCo7及HCo12轉殖基因小鼠品系可用以產生人類抗Dkk-1抗體。
使用融合瘤技術，可自轉殖基因小鼠(諸如上述轉殖基因小鼠)產生並選擇具有所需專一性之抗原專一性人類MAb。可使用適合載體及宿主細胞選殖並表現此等抗體，或可自所培養之融合瘤細胞收集抗體。
完全人類抗體亦可來源於噬菌體呈現文庫(如於Hoogenboom等人,(1991) J. Mol. Biol. 227:381；及Marks等人,(1991) J. Mol. Biol. 222:581所揭示)。噬菌體呈現技術係經由在絲狀噬菌體表面上呈現抗體譜系及隨後依據噬菌體與所選抗原之結合來選擇噬菌體而模擬免疫選擇。一種此技術描述於WO 99/10494中(以引用的方式併入本文中)，其描述使用此方法分離針對MPL受體及msk受體之高親和力及功能促效性抗體。
雙專一性或雙功能抗體
所提供之抗體亦包括雙專一性及雙功能抗體，該等抗體如上所述包括一或多個CDR或一或多個可變區。雙專一性或雙功能抗體在一些情況下為具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人工雜交抗體。雙專一性抗體可由各種方法(包括(但不限於)融合瘤融合或Fab'片段連接)產生。例如參看Songsivilai及Lachmann(1990)Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321；Kostelny等人,(1992)J. Immunol. 148: 1547-1553。
各種其他形式
所提供之一些抗體或免疫功能片段為如上文揭示之抗體及片段之變異體形式。天然存在之胺基酸可基於共同側鏈特性分類：[0149] 1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；[0150] 2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；[0151] 3)酸性：Asp、Glu；[0152] 4)鹼性：His、Lys、Arg；[0153] 5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；及[0154] 6)芳族：Trp、Tyr、Phe。保守性胺基酸取代可包括一種此等類別之成員交換為同類別中之另一成員。保守性胺基酸取代可涵蓋非天然存在之胺基酸殘基，其通常藉由化學肽合成而非藉由在生物系統中合成而併入。此等包括肽模擬物及其他逆向或反向形式之胺基酸部分。非保守性取代可包括將一種上述類別之成員交換為另一類別之成員。此等經取代之殘基可引入與人類抗體同源的抗體區域中或該分子之非同源區域中。
產生此等變化時，根據某些實施例，可考慮胺基酸之親水指數(hydropathic index)。蛋白質之親水概況係如下計算：賦予各胺基酸一個數值(「親水指數」)且接著沿肽鏈反覆求此等值之平均值。各胺基酸已基於其疏水性及電荷特徵賦予親水指數。其為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。
親水概況對賦予蛋白質相互作用生物功能的重要性在此項技術中已瞭解(例如參看Kyte等人,1982,J. Mol. Biol. 157:105-131)。已知某些胺基酸可經具有類似親水指數或評數之其他胺基酸取代且仍保留類似生物活性。在基於親水指數進行變化時，在某些實施例中，包括取代親水指數在.+-.2內之胺基酸。在本發明之一些態樣中，包括彼等在.+-.1內者，且在本發明之其他態樣中，包括彼等在.+-.0.5內者。
在此項技術中亦瞭解，可基於親水性有效進行相似胺基酸之取代，尤其在藉此產生之生物功能蛋白或肽意欲用於免疫實施例的情況下，如在本發明情況下更是如此。在一些實施例中，蛋白質之最大局部平均親水性(如取決於其相鄰胺基酸之親水性)係與其免疫原性及抗原結合或免疫原性(亦即與蛋白質之生物特性)相關。
已賦予此等胺基酸殘基以下親水性值：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0)；天冬胺酸(+3.0.+-.1)；麩胺酸(+3.0.+-.1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；麩醯胺酸(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5.+-.1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)及色胺酸(-3.4)。在基於類似親水性值進行變化時，在一些實施例中，包括取代親水性值在.+-.2內之胺基酸，在其他實施例中，包括取代親水性值在.+-.1內之胺基酸，且在其他實施例中，包括取代親水性值在.+-.0.5內之胺基酸。在一些情況下，亦可基於親水性自一級胺基酸序列鑑別抗原決定基。此等區域亦稱作「抗原決定基核心區」。
熟習此項技術者將能夠使用熟知技術測定如本文所述之多肽的適合變異體。熟習此項技術者可鑑別分子中可經變化的適合區域，且藉由靶向咸信對活性不重要之區域而不會破壞活性。熟習此項技術者亦將能夠鑑別分子中在類似多肽中保守殘基及部分。在其他實施例中，甚至可使對生物活性或對結構重要之區域進行保守性胺基酸取代而不破壞生物活性或對多肽結構無不利影響。
另外，熟習此項技術者可回顧鑑別類似多肽中對活性或結構重要之殘基的結構功能研究。鑒於此比較，可預測蛋白質中與類似蛋白質中對活性或結構重要之胺基酸殘基對應的胺基酸殘基的重要性。對於此等經預測重要之胺基酸殘基，熟習此項技術者可選擇化學上類似之胺基酸取代。
熟習此項技術者亦可分析類似多肽之3維結構及與類似多肽之彼結構相關的胺基酸序列。鑒於此資訊，熟習此項技術者可關於三維結構預測抗體之胺基酸殘基比對。熟習此項技術者可選擇不使經預測位於蛋白質表面上之胺基酸殘基產生根本變化，因為此等殘基可能涉及於與其他分子之重要相互作用中。此外，熟習此項技術者可產生在各所需胺基酸殘基處含有單一胺基酸取代之測試變異體。接著可使用檢定針對Dkk-1中和活性篩選此等變異體，(參看下文實例)從而產生關於哪個胺基酸可經變化及哪個胺基酸必須不變之資訊。換言之，基於自此等常規實驗所收集之資訊，熟習此項技術者可輕易地測定應避免進一步取代(單獨或與其他突變組合)之胺基酸位置。
許多科學出版物已專注於預測二級結構。參看Moult(1996) Curr. Op. in Biotech. 7:422-427；Chou等人,(1974) Biochemistry 13:222-245;Chou等人,(1974) Biochemistry 113:211-222；Chou等人,(1978) Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148；Chou等人,(1979) Ann. Rev. Biochem. 47:251-276；及Chou等人,(1979) Biophys. J. 26:367-384。此外，目前可利用電腦程式協助預測二級結構。一種預測二級結構之方法係基於同源模型化法。舉例而言，序列一致性大於30%或類似性大於40%之兩種多肽或蛋白質常具有相似結構拓撲。蛋白質結構資料庫(PDB)之最新發展已提供增強之二級結構可預測性，包括多肽結構或蛋白質結構內之潛在摺疊數目。參看Holm等人,(1999) Nucl. Acid. Res. 27:244-247。已提出(Brenner等人,(1997) Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376)，既定多肽或蛋白質中存在有限數目之摺疊且一旦解出結構之臨界值，則結構預測將變得大為精確。
預測二級結構之其他方法包括「穿線法(threading)」(Jones(1997) Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87；Sippl等人,(1996) Structure 4:15-19)、「概況分析法」(Bowie等人,(1991) Science 253:164-170；Gribskov等人,(1990) Meth. Enzym. 183:146-159；Gribskov等人,(1987) Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358)，及「進化關聯法(evolutionary linkage)」(參看Holm(1999),同上文；及Brenner(1997),同上文)。
在本發明之一些實施例中，胺基酸取代應：(1)降低蛋白易分解性，(2)降低易氧化性，(3)改變形成蛋白質複合物之結合親和力，(4)改變配位體或抗原結合親和力，及/或(4)賦予或改變此等多肽之其他物理化學或功能特性。舉例而言，可在天然存在之序列中進行單個或多個胺基酸取代(在某些實施例中，保守性胺基酸取代)。可在抗體中位於形成分子間接點之結構域外的彼部分中進行取代。在此等實施例中，可使用不實質上改變親本序列之結構特徵的保守性胺基酸取代(例如不破壞為親本或原生抗體特徵之二級結構之一或多個置換胺基酸)。此項技術認可之多肽二級及三級結構之實例描述於Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton編),(1984)W. H. New York: Freeman and Company；Introduction to Protein Structure(Branden及Tooze編),(1991)New York: Garland Publishing；及Thornton等人,(1991) Nature 354:105中。
本發明亦涵蓋本發明抗體之糖基化變異體，其中相較於親本多肽之胺基酸序列，糖基化位點之數目及/或類型已改變。在某些實施例中，抗體蛋白質變異體包含比原生抗體多或少之數目之N連接糖基化位點。N連接糖基化位點特徵在於序列:Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定為X之胺基酸殘基可為除脯胺酸外之任何胺基酸殘基。產生此序列之胺基酸殘基取代為添加N連接碳水化合物鏈提供潛在新位點。或者，消除或改變此序列之取代將防止添加原生多肽中存在之N連接碳水化合物鏈。舉例而言，可藉由缺失Asn或藉由用不同胺基酸取代Asn來減少糖基化。在其他實施例中，產生一或多個新N連接位點。抗體通常在Fc區中具有N連接糖基化位點。
其他較佳抗體變異體包括半胱胺酸變異體，其中親本或原生胺基酸序列中之一或多個半胱胺酸殘基缺失或經另一胺基酸(例如絲胺酸)取代。半胱胺酸變異體為適用的，尤其當抗體必須再摺疊為生物活性構形時更是如此。半胱胺酸變異體可具有少於原生抗體之半胱胺酸殘基，且通常為偶數以使不成對半胱胺酸所引起之相互作用降至最低。
所揭示之重鏈及輕鏈、可變區結構域及CDR可用以製備含有可專一性結合於Dkk-1多肽之抗原結合區的多肽。舉例而言，可將表4中所列之一或多個CDR以共價或非共價方式併入分子(例如多肽)中以製得免疫黏附物。免疫黏附物可併有CDR作為較大多肽鏈之一部分，可使CDR共價連接於另一多肽鏈，或可以非共價方式併有CDR。CDR使免疫黏附物能夠專一性結合於特定相關抗原(例如Dkk-1多肽或其抗原決定基)。
亦提供基於本文所述之可變區結構域及CDR的模擬物(例如「肽模擬物」)。此等類似物可為肽、非肽，或肽與非肽區之組合。Fauchere,(1986) Adv. Drug Res. 15:29；Veber及Freidinger,(1985) TINS第392頁；及Evans等人,(1987) J. Med. Chem. 30:1229，該等文獻係出於任何目的以引用的方式併入本文中。可使用結構上類似於治療適用肽的肽模擬物來產生類似治療或預防作用。此等化合物通常藉助於電腦化分子模型化法來開發。一般而言，本發明之肽模擬物為結構上類似於呈現所需生物活性(在本文中諸如專一性結合Dkk-1之能力)之抗體的蛋白質，但一或多個肽鍵視情況藉由此項技術中熟知之方法置換為以下之鍵：-CH2 NH-、-CH2 S-、-CH2 -CH2 -、-CH=CH-(順式及反式)、-COCH2 -、-CH(OH)CH2 -及-CH2 SO-。共同序列之一或多個胺基酸經相同類型之D-胺基酸系統性取代(例如D-離胺酸置換L-離胺酸)可在本發明之某些實施例中用於產生較穩定之蛋白質。另外，可藉由此項技術中已知之方法(Rizo及Gierasch,(1992) Ann. Rev. Biochem. 61:387，以引用的方式併入本文中)，例如藉由添加能夠形成使肽環化之分子內二硫橋之內部半胱胺酸殘基來產生包含共同序列或實質上一致共同序列變異體之限制性肽。
亦提供本文所述之抗體及免疫功能片段之衍生物。所衍生之抗體或片段可包含賦予抗體或片段所需特性(諸如在特定用途中半衰期延長)之任何分子或物質。所衍生之抗體可包含例如可偵測(或標記)部分(例如放射性分子、比色分子、抗原分子或酶促分子)、可偵測珠粒(諸如磁性或電緻密(例如金)珠粒)、或結合於另一分子之分子(例如生物素或抗生蛋白鏈菌素(streptavidin))、治療或診斷部分(例如放射性部分、細胞毒性部分或醫藥學活性部分)、或提高抗體對於特定用途(例如投與個體，諸如人類個體，或其他活體內或活體外用途)之適用性的分子。可用以衍生抗體之分子的實例包括白蛋白(例如人類血清白蛋白)及聚乙二醇(PEG)。可使用此項技術中熟知之技術製備抗體之白蛋白連接衍生物及聚乙二醇化衍生物。在一項實施例中，抗體結合於或以其他方式連接於運甲狀腺素蛋白(transthyretin，TTR)或TTR變異體。TTR或TTR變異體可經例如選自由以下組成之群的化學物質化學修飾：聚葡萄糖、聚(n-乙烯基吡咯啶酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚合物、聚氧乙烯化多元醇及聚乙烯醇。
其他衍生物包括抗Dkk-1抗體或其片段與其他蛋白質或多肽諸如藉由表現重組融合蛋白之共價或聚集性結合物，該重組融合蛋白包含異源多肽與抗Dkk-1抗體多肽之N端或C端之融合。舉例而言，經結合肽可為異源信號(或前導)多肽，例如酵母α因子前導多肽；或肽，諸如抗原決定基標籤。含抗Dkk-1抗體之融合蛋白可包含為有助於純化或鑑別抗Dkk-1抗體所添加之肽(例如聚His)。如Hopp等人,Bio/Technology 6:1204(1988)及美國專利第5,011,912號中所述抗Dkk-1抗體多肽亦可連接於FLAG肽。FLAG肽具高度抗原性且提供專一性單株抗體(Mab)可逆性結合之抗原決定基，使得能夠快速檢定及易於純化所表現之重組蛋白。適用於製備融合蛋白(其中FLAG肽融合於既定多肽)之試劑可購得(Sigma,St. Louis,Mo.)。
含有一或多種抗Dkk-1抗體多肽之寡聚物可用作Dkk-1拮抗劑。寡聚物可呈共價連接或非共價連接之二聚物、三聚物或較高寡聚物形式。涵蓋包含兩種或兩種以上抗Dkk-1抗體多肽之寡聚物以供使用，其中一個實例為均二聚物。其他寡聚物包括雜二聚物、均三聚物、雜三聚物、均四聚物、雜四聚物等。
一個實施例係關於包含經由肽部分之間共價或非共價相互作用融合於抗Dkk-1抗體多肽而接合之多個抗Dkk-1抗體多肽之寡聚物。此等肽可為肽連接子(間隔子)，或具有促進寡聚化之特性的肽。如下文較詳細描述，白胺酸拉鏈及來源於抗體之某些多肽屬於可促進與其連接之抗Dkk-1抗體多肽寡聚化之肽。
在特定實施例中，寡聚物包含二至四種抗Dkk-1抗體多肽。寡聚物之抗Dkk-1抗體部分可呈上述任何形式，例如變異體或片段。寡聚物較佳包含具有Dkk-1結合活性之抗Dkk-1抗體多肽。
在一項實施例中，使用來源於免疫球蛋白之多肽製備寡聚物。包含某些異源多肽融合於來源於抗體之多肽之各部分(包括Fc域)的融合蛋白的製備已描述於例如Ashkenazi等人,(1991) PNAS USA 88:10535；Byrn等人,(1990) Nature 344:677；及Hollenbaugh等人,(1992)「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins」,Current Protocols in Immunology,增刊4,第10.19.1-10.19.11頁。
本發明之一項實施例係關於包含兩個藉由使抗Dkk-1抗體之Dkk-1結合片段融合於抗體之Fc區所產生之融合蛋白之二聚體。二聚體可如下製得：例如將編碼融合蛋白之基因融合物插入適當表現載體中，在經重組表現載體轉型之宿主細胞中表現基因融合物，且允許所表現之融合蛋白組裝更為類似之抗體分子，隨後在Fc部分之間形成鏈間二硫鍵以產生二聚體。
如本文中所用，術語「Fc多肽」包括來源於抗體之Fc區的多肽之原生及突變蛋白形式。亦包括含有促進二聚化之鉸鏈區的此等多肽之截短形式。包含Fc部分之融合蛋白(及由此形成之寡聚物)提供易於在蛋白質A或蛋白質G管柱上藉由親和力層析純化之優勢。
PCT申請案WO 93/10151及美國專利第5,426,048號及第5,262,522號中所述之一種適合Fc多肽為一種單鏈多肽，其自人類IgG1抗體之Fc區之N端鉸鏈區延伸至原生C端。另一適用之Fc多肽為美國專利第5,457,035號，及Baum等人,(1994),EMBO J. 13:3992-4001中所述之Fc突變蛋白。此突變蛋白之胺基酸序列與WO 93/10151中所呈現的原生Fc序列之胺基酸序列一致，但胺基酸19已自Leu變為Ala，胺基酸20已自Leu變為Glu，且胺基酸22已自Gly變為Ala。突變蛋白對Fc受體展現低親和力。
在其他實施例中，諸如本文所揭示之抗Dkk-1抗體之重鏈及/或輕鏈的可變部分可經一種抗體重鏈及/或輕鏈之可變部分取代。
或者，寡聚物為包含多種抗Dkk-1抗體多肽、有或無肽連接子(間隔肽)之融合蛋白。適合之肽連接子包括美國專利第4,751,180號及第4,935,233號所述者。
另一種製備寡聚抗Dkk-1抗體衍生物之方法涉及使用白胺酸拉鏈。白胺酸拉鏈域為促進存在其之蛋白質寡聚化的肽。白胺酸拉鏈最初在若干DNA結合蛋白中得以鑑別(Landschulz等人,(1988) Science 240:1759)，且此後於各種不同蛋白質中發現。已知白胺酸拉鏈包括天然存在之肽及其二聚或三聚衍生物。適於產生可溶性寡聚蛋白質之白胺酸拉鏈域的實例於WO 94/10308中描述，且來源於肺界面活性劑蛋白質D(SPD)之白胺酸拉鏈描述於Hoppe等人,(1994) FEBS Letters 344:191中，其以引用的方式併入本文中。使用經修飾之白胺酸拉鏈，允許與其融合之異源蛋白質穩定三聚化係描述於Fanslow等人,(1994) Semin. Immunol. 6:267-78中。在一種方法中，包含抗Dkk-1抗體片段或衍生物融合於白胺酸拉鏈肽之重組融合蛋白係表現於適合宿主細胞中，且自培養物上清液中回收所形成之可溶性寡聚抗Dkk-1抗體片段或衍生物。
核酸
亦提供編碼本發明抗體之一或兩條鏈、或其片段、衍生物、突變形成之蛋白質或變異體之核酸；足以用作雜交探針之聚核苷酸；用於鑑別、分析、突變或擴增編碼多肽之聚核苷酸的PCR引子或定序引子；抑制聚核苷酸表現之反義核酸；及前述各物之互補序列。核酸可為任何長度。其長度可為例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000或5,000個以上核苷酸，及/或可包含一或多個額外序列(例如調控序列)，及/或為較大核酸(例如載體)之一部分。核酸可為單股或雙股且可包含RNA及/或DNA核苷酸，及其人工變異體(例如肽核酸)。亦提供編碼包括此等肽之融合蛋白之核酸。
編碼抗體多肽(例如重鏈或輕鏈、僅可變域，或全長)之DNA可與已用Dkk-1或其免疫原性片段免疫之小鼠的B細胞分離。可藉由諸如聚合酶鏈反應(PCR)之習知程序分離DNA。噬菌體呈現為已知技術之另一實例，藉此可製備抗體之衍生物。在一種方法中，作為相關抗體之組分的多肽係表現於任何適合之重組表現系統中，且允許所表現之多肽組裝以形成抗體分子。
提供編碼抗體及免疫功能片段之輕鏈及重鏈、可變區及CDR之例示性核酸。由於遺傳密碼子之簡併性，因此各多肽序列亦由除所列者外之大量其他核酸序列編碼。本發明提供編碼本發明各抗體之各簡併核苷酸序列。
本發明進一步提供與其他核酸在特定雜交條件下雜交之核酸。在此項技術中熟知將核酸雜交之方法。例如參看Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley及Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。已知中等嚴格雜交條件的實例使用含有5倍氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、0.5% SDS、1.0 mM EDTA(pH 8.0)之預洗溶液；約50%甲醯胺、6倍SSC之雜交緩衝液；及雜交溫度為55℃(或其他類似雜交溶液，諸如含有約50%甲醯胺之雜交溶液，雜交溫度為42℃)，及洗滌條件為60℃、0.5倍SSC、0.1% SDS。已知之嚴格雜交條件的實例係在6倍SSC中、在45℃下雜交，隨後在68℃下、在0.1倍SSC、0.2% SDS中洗滌一或多次。此外，熟習此項技術者可操作雜交及/或洗滌條件以提高或降低雜交嚴格度，使得包含彼此至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致之核苷酸序列的核酸通常保持彼此雜交。
影響雜交條件選擇之基本參數及設計適合條件之指南闡述於以下文獻中：例如Sam brook,Fritsch,及Maniatis(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,第9章及第11章；及Current Protocols in Molecular Biology(1995) Ausubel等人編,John Wiley & Sons,Inc.,章節2.10及6.3-6.4，且可由一般熟習此項技術者基於例如DNA之長度及/或鹼基組成而輕易地測定。
可藉由突變將變化引入核酸中，藉此使得其所編碼之多肽(例如本發明之抗體或抗體衍生物)之胺基酸序列產生變化。可使用此項技術中已知之任何技術來引入突變。在一項實施例中，使用例如定點突變誘發方案來改變一或多個特定胺基酸殘基。在另一實施例中，使用例如隨機突變誘發方案來改變一或多個隨機選擇之殘基。無論以何方式產生變化，均可針對所需特性表現並篩選突變體多肽。
可將突變引入核酸中而不顯著改變其所編碼之多肽的生物活性。舉例而言，可使核苷酸取代在非必需胺基酸殘基處引起胺基酸取代。或者，可將一或多個突變引入核酸中，從而選擇性改變其所編碼之多肽的生物活性。舉例而言，突變可定量或定性地改變生物活性。定量改變之實例包括提高、降低或消除活性。定性改變之實例包括改變抗體之抗原專一性。
在另一態樣中，本發明提供適用作偵測本發明之核酸序列的引子或雜交探針之核酸分子。本發明之核酸分子可僅包含核酸序列中編碼本發明之全長多肽的一部分，例如可用作探針或引子之片段或編碼本發明多肽之活性部分(例如Dkk-1結合部分)的片段。
基於本發明核酸序列之探針可用以偵測核酸或類似核酸，例如編碼本發明之多肽的轉錄物。探針可包含標記基團，例如放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔助因子。此等探針可用以鑑別表現多肽之細胞。
在另一態樣中，本發明提供載體，其包含編碼本發明之多肽或其一部分(例如含有一或多個CDR或一或多個可變區結構域之片段)之核酸。載體之實例包括(但不限於)質體、病毒載體、非游離型哺乳動物載體及表現載體，例如重組表現載體。本發明之重組表現載體可以適於在宿主細胞中表現核酸之形式包含本發明之核酸。重組表現載體包括一或多個基於欲用於表現之宿主細胞所選擇之調控序列，其可操作地連接至欲表現之核酸序列。調控序列包括在許多類型宿主細胞中導引核苷酸序列組成性表現之調控序列(例如SV40早期基因強化子、勞斯(Rous)肉瘤病毒啟動子及細胞巨大病毒啟動子)；僅在某些宿主細胞中導引核苷酸序列表現之調控序列(例如組織專一性調控序列，參看Voss等人,(1986) Trends Biochem. Sci. 11:287,Maniatis等人,(1987) Science 236:1237，其係以全文引用的方式併入本文中)；及導引核苷酸序列回應於特定處理或條件而誘導性表現之調控序列(例如哺乳動物細胞中之金屬硫蛋白啟動子，及原核與真核系統中之tet反應性啟動子及/或鏈黴素(streptomycin)反應性啟動子(參看上文))。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計可視諸如欲轉型之宿主細胞之選擇、所需蛋白質表現量等因素而定。可將本發明之表現載體引入宿主細胞中以藉此產生由如本文所述之核酸編碼之蛋白質或肽，包括融合蛋白或肽。
在另一態樣中，本發明提供已引入本發明之重組表現載體的宿主細胞。宿主細胞可為任何原核細胞(例如大腸桿菌)或真核細胞(例如酵母、昆蟲、或哺乳動物細胞(例如CHO細胞))。可經由習知轉型或轉染技術將載體DNA引入原核或真核細胞中。對於哺乳動物細胞之穩定轉染，視所用表現載體及轉染技術而定，已知僅一小部分細胞可將外源DNA整合至其基因組中。為鑑別及選擇此等整合物(integrant)，一般將編碼可選標誌(例如達成對抗生素之抗性)之基因連同相關基因一起引入宿主細胞中。較佳可選標誌包括賦予抗藥性之標誌，諸如G418、潮黴素(hygromycin)及甲胺喋呤(methotrexate)。經所引入之核酸穩定轉染之細胞可藉由藥物選擇(例如已併有可選標誌基因之細胞將存活，而其他細胞死亡)以及其他方法來鑑別。
抗體之製備
所提供之非人類抗體可例如來源於產生抗體之任何動物，諸如小鼠、大鼠、兔、山羊、驢或非人類靈長類動物(諸如猴(例如獼猴或恆河猴)或猿(例如黑猩猩))。非人類抗體可用於例如活體外細胞培養及基於細胞培養之應用中，或對抗體之免疫反應不發生或可忽略、可預防、不成問題或合乎需要之任何其他應用中。在本發明之某些實施例中，可藉由用全長Dkk-1或用Dkk-1之羧基端部分進行免疫來產生抗體。抗體可為多株抗體、單株抗體，或可在宿主細胞中藉由表現重組DNA來合成。
完全人類抗體可如上所述藉由使含有人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物免疫或藉由選擇表現人類抗體譜系之噬菌體呈現文庫來製備。
本發明之單株抗體(Mab)可藉由各種技術產生，包括習知單株抗體方法，例如Kohler及Milstein,(1975)Nature 256: 495之標準體細胞雜交技術。或者，可採用產生單株抗體之其他技術，例如B淋巴細胞之病毒或致癌轉型。一種適用於製備融合瘤之動物系統為鼠類系統，其為已完全建立之程序。在此項技術中已知免疫方案及分離用於融合之經免疫脾細胞的技術。對於此等程序，使來自經免疫小鼠之B細胞與適合之永生化融合搭配物(諸如鼠類骨髓瘤細胞株)融合。此外，必要時，可使大鼠或其他哺乳動物免疫以代替小鼠，且可使來自此等動物之B細胞與鼠類骨髓瘤細胞株融合以形成融合瘤。或者，可使用來自除小鼠外之來源的骨髓瘤細胞株。製得融合瘤之融合程序亦熟知。
所提供之單鏈抗體可藉由將重鏈與輕鏈可變域(Fv區)片段經由胺基酸橋(短肽連接子)連接，產生單一多肽鏈來形成。此等單鏈Fv(scFv)可藉由融合編碼兩個可變域多肽(VL及VH)之DNA之間編碼肽連接子之DNA來製備。視兩個可變域之間可撓性連接子之長度而定，所得多肽可自身折回以形成抗原結合單體，或其可形成多聚體(例如二聚體、三聚體或四聚體)(Kortt等人,(1997)Prot. Eng. 10:423；Kortt等人,(2001) Biomol. Eng. 18:95-108)。藉由組合包含不同VL及VH之多肽，可形成結合於不同抗原決定基之多聚scFv(Kriangkum等人,(2001) Biomol. Eng. 18:31-40)。為產生單鏈抗體所開發之技術包括以下文獻中所述者：美國專利第4,946,778號；Bird(1988) Science 242:423；Huston等人,(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879；Ward等人,(1989) Nature 334:544,de Graaf等人,(2002) Methods Mol Biol. 178:379-87。
本文提供之屬於一個子類的抗體可使用子類轉換法轉變為不同子類之抗體。因此，舉例而言，IgG抗體可來源於IgM抗體，且反之亦然。此等技術使得製備新穎抗體，其不僅具有既定抗體(親本抗體)之抗原結合特性，而且亦展現不同於親本抗體之生物特性之抗體同型或子類相關之生物特性。可採用重組DNA技術。此等程序中可採用編碼特定抗體多肽之經選殖DNA，例如編碼所需同型之抗體之恆定域的DNA。例如參看Lantto等人,(2002) Methods Mol. Biol. 178:303-16。
此外，亦已知產生具有不同特性(亦即針對其所結合之抗原的親和力不同)之抗體的技術。一種此技術稱作鏈改組，其包括在絲狀噬菌體表面上呈現免疫球蛋白可變域基因譜系，通常稱作噬菌體呈現。如Marks等人,(1992) BioTechnology,10:779所述，鏈改組已用以製備針對半抗原2-苯基噁唑-5-酮之高親和力抗體。
可對表1中所述之重鏈及輕鏈進行保守性修飾(及對編碼核酸進行相應修飾)以產生具有功能特徵及生物化學特徵之抗Dkk-1抗體。達成此等修飾之方法已描述於上文中。
可以各種方式進一步修飾本發明之抗體及其功能片段。舉例而言，若其欲用於治療目的，則其可與聚乙二醇結合(聚乙二醇化)以延長血清半衰期或增強蛋白質傳遞。或者，本發明抗體或其片段之V區可與不同抗體分子之Fc區融合。用於此目的之Fc區可經修飾以使其不結合補體，從而在將融合蛋白用作治療劑時降低誘導患者細胞溶解之可能性。另外，本發明抗體或其功能片段可與人類血清白蛋白結合以增強抗體或其片段之血清半衰期。本發明抗體或其片段之另一適用融合搭配物為運甲狀腺素蛋白(TTR)。TTR具有形成四聚體之能力，因此抗體-TTR融合蛋白可形成多價抗體，從而可提高其結合親和力。
或者，本文所述之抗體及片段的功能特徵及/或生物化學特徵之實質性修飾可如下達成：在重鏈及輕鏈之胺基酸序列中產生對以下之作用顯著不同的取代：維持(a)取代區中分子主鏈之結構，例如呈摺疊或螺旋構形，(b)分子在標靶位點之電荷或疏水性，或(c)側鏈之龐大性(bulkiness)。「保守性胺基酸取代」可包括原生胺基酸殘基經對彼位置處胺基酸殘基之極性或電荷具有極少或無影響的非原生殘基取代。此外，如先前已關於丙胺酸掃描突變誘發所述，多肽中之任何原生殘基亦均可經丙胺酸取代。
本發明抗體之胺基酸取代(不論保守性還是非保守性)可由熟習此項技術者藉由應用常規技術來實施。胺基酸取代可用以鑑別本文所提供之抗體的重要殘基，或提高或降低此等抗體對人類Dkk-1之親和力或改變本文所述之其他抗Dkk-1抗體之結合親和力。
抗Dkk-1抗體之表現
抗Dkk-1抗體及免疫功能片段可藉由許多習知技術中任一者來製備。舉例而言，可藉由重組表現系統，使用此項技術中已知之任何技術產生抗Dkk-1抗體。例如參看Monoclonal Antibodies,Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses,Kennet等人(編),Plenum Press,New York(1980)；及Antibodies: A Laboratory Manual,Harlow及Lane(編),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)。
本發明之抗體可表現於融合瘤細胞株或除融合瘤外之細胞株中。可使用編碼抗體之表現構築體來使哺乳動物、昆蟲或微生物宿主細胞轉型。可使用將聚核苷酸引入宿主細胞中之任何已知方法執行轉型，該已知方法包括例如將聚核苷酸封裝於病毒或噬菌體中且藉由此項技術中已知之轉染程序使用構築體來轉導宿主細胞，如美國專利第4,399,216號；第4,912,040號；第4,740,461號及第4,959,455號所例示。所用之最佳轉型程序將視所轉型之宿主細胞類型而定。將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法在此項技術中熟知且包括(但不限於)聚葡萄糖介導轉染、磷酸鈣沈澱、聚凝胺(polybrene)介導轉染、原生質體融合、電穿孔、囊封聚核苷酸於脂質體中、混合核酸與帶正電之脂質、及將DNA直接微注射於核中。
本發明之重組表現構築體通常包含編碼多肽之核酸分子，該多肽包含以下一或多者：重鏈恆定區；重鏈可變區；輕鏈恆定區；輕鏈可變區；抗Dkk-1抗體之輕鏈或重鏈之一或多個CDR。使用標準接合技術將此等核酸序列插入適當表現載體中。通常選擇在所用特定宿主細胞中具功能性的載體(亦即載體與宿主細胞機構相容，可發生許可基因擴增及/或表現)。在一些實施例中，所用載體採用使用報導蛋白(諸如二氫葉酸還原酶)之蛋白質片段互補檢定(例如參看美國專利第6,270,964號，其係以引用的方式併入本文中)。適合表現載體可購自例如Invitrogen Life Technologies或BD Biosciences(前身為「Clontech」)。選殖及表現本發明之抗體及片段之其他適用載體包括Bianchi及McGrew,Biotech Biotechnol Bioeng 84(4):439-44(2003)(其係以引用的方式併入本文中)中所述之載體。其他適合表現載體係於例如Methods Enzymol,第185卷(D. V. Goeddel編)(1990) New York: Academic Press中論述。
用於任一宿主細胞中之表現載體通常含有用於質體或病毒維持及選殖及表現外源核苷酸序列之序列。此等序列統稱「側接序列」，通常包括一或多個以下可操作地連接之核苷酸序列：啟動子、一或多個強化子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供者及受者剪接位點之完整內含子序列、編碼用於多肽分泌之前導序列的序列、核糖體結合位點、聚腺苷酸化序列、用於插入編碼待表現多肽之核酸的多連接子區域、及可選標誌元件。
載體視情況可含有「標籤」編碼序列，亦即位於編碼序列之5'或3'端的寡核苷酸分子、編碼聚His(諸如6His)之寡核苷酸序列、或存在用於其之市售抗體之另一「標籤」，諸如FLAG、HA(來自流感病毒之血球凝集素)或myc。該標籤通常在表現後融合於抗體蛋白質，且可充當自宿主細胞親和力純化抗體之工具。親和力純化可例如藉由管柱層析，使用針對標籤之抗體作為親和基質來實現。視情況可隨後藉由各種手段(諸如使用供裂解用之某些肽酶)自經純化之抗體多肽移除標籤。
表現載體中之側接序列可為同源(亦即來自與宿主細胞相同的物種及/或品系)、異源(亦即來自除宿主細胞物種或品系外之物種)、雜交(亦即來自一種以上來源之側接序列的組合)、合成或原生的。因此，側接序列之來源可為任何原核或真核生物體、任何脊椎動物或無脊椎動物生物體，或任何植物，其限制條件為側接序列在宿主細胞機構中具功能性且可由宿主細胞機構活化。
適用於本發明之載體的側接序列可藉由此項技術中熟知之若干方法中任一者獲得。本文中適用之側接序列通常已預先藉由定位及/或藉由限制性核酸內切酶消化加以鑑別，且因此可使用適當限制性核酸內切酶自適當組織來源分離。在一些情況下，側接序列之全核苷酸序列可能已知。在本文中，側接序列可使用本文所述之核酸合成或選殖方法合成。
當已知側接序列之全部或僅一部分時，其可使用PCR及/或藉由用來自相同物種或另一物種之適合寡核苷酸及/或側接序列片段篩選基因組文庫來獲得。當側接序列未知時，可自可含有例如編碼序列或甚至另一個或多個基因之一大段DNA中分離含有側接序列之DNA片段。分離可如下實現：限制性核酸內切酶消化以產生適當DNA片段，隨後使用瓊脂糖凝膠純化(Qiagen管柱層析(Chatsworth,Calif.))分離；或藉由熟習此項技術者已知之其他方法實現分離。實現此目的之適合酶之選擇為熟習此項技術者顯而易見。
複製起點通常為原核表現載體(尤其為市場上可購得之原核表現載體)之一部分，且起點有助於載體在宿主細胞中擴增。若所選載體不含有複製起點，則可基於已知序列進行化學合成，且接合至載體中。舉例而言，來自質體pBR322(New England Biolabs,Beverly,Mass)之複製起點適於大多數革蘭氏陰性(gram-negative)細菌，且各種起點(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、或諸如HPV或BPV之乳頭狀瘤病毒)適於在哺乳動物細胞中選殖載體。一般而言，哺乳動物表現載體不需要哺乳動物複製起點(例如通常僅使用SV40起點，因為其含有早期啟動子)。
本發明之表現及選殖載體通常將含有由宿主生物體識別且可操作地連接於編碼抗Dkk-1抗體或其免疫功能片段之核酸的啟動子。啟動子為位於結構基因起始密碼子上游(亦即5')(一般在約100 bp至1000 bp內)、控制結構基因轉錄之未轉錄序列。啟動子習知歸為兩類之一：誘導性啟動子及組成性啟動子。誘導性啟動子回應於培養條件之某些變化(諸如有或無營養素存在或溫度變化)引發在其控制下DNA轉錄量增加。另一方面，組成性啟動子引發連續產生基因產物；亦即對基因表現極少或無實驗控制。熟知由各種潛在宿主細胞識別之大量啟動子。適合啟動子如下可操作地連接至編碼抗Dkk-1抗體之DNA：藉由限制酶消化自源DNA移除啟動子，或藉由聚合酶鏈反應擴增啟動子，及將所需啟動子序列插入載體中。
在此項技術中亦熟知適用於酵母宿主之啟動子。酵母強化子宜與酵母啟動子一起使用。適用於哺乳動物宿主細胞之啟動子熟知且包括(但不限於)獲自病毒基因組之啟動子，該等病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽類肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒且最佳為猴病毒40(SV40)。其他適合哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如熱休克啟動子及肌動蛋白啟動子。
適用於實踐本發明之重組表現載體的特定啟動子包括(但不限於)：SV40早期啟動子區(Bemoist及Chambon(1981) Nature 290: 304-10)；CMV啟動子；勞斯肉瘤病毒之3'長末端重複序列中所含之啟動子(Yamamoto等人,(1980) Cell 22: 787-97)；疱疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人,(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-45)；金屬硫蛋白基因之調控序列(Brinster等人，(1982) Nature 296: 39-42)；原核表現載體，諸如β-內醯胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等人，(1978) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,75: 3727-31)；或tac啟動子(DeBoer等人，(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21-25)。亦可使用展現組織專一性且已用於轉殖基因動物中之以下動物轉錄控制區：在胰腺腺泡細胞中具活性之I型彈性蛋白酶基因控制區(Swift等人，(1984) Cell 38: 63946；Ornitz等人，(1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399409；MacDonald,1987,Hepatology 7: 425-515)；在胰腺β細胞中具活性之胰島素基因控制區(Hanahan(1985) Nature 315: 115-22)；在睾丸、乳房、淋巴及肥大細胞中具活性之小鼠乳腺瘤病毒控制區(Leder等人，(1986) Cell 45: 485-95)；在肝中具活性之白蛋白基因控制區(Pinkert等人，(1987) Genes and Devel.1: 268-76)；在肝中具活性之α-胎兒蛋白基因控制區(Krumlauf等人，(1985) Mol. Cell. Biol. 5: 1639-48；Hammer等人，(1987) Science 235:53-58)；在肝中具活性之α1-抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等人，(1987) Genes and Devel. 1: 161-71)；在骨髓細胞中具活性之β-血球蛋白基因控制區(Mogram等人，1985,Nature 315: 338-40；Kollias等人，(1986) Cell 46: 89-94)；在腦寡樹突神經膠質細胞中具活性之髓鞘鹼性蛋白基因控制區(Readhead等人，(1987) Cell 48: 703-12)；在骨骼肌中具活性之肌凝蛋白輕鏈-2基因控制區(Sani(1985) Nature 314: 283-86)；在丘腦下部具活性之促性腺釋放激素基因控制區(Mason等人,(1986) Science 234: 1372-78)；及最特定言之在淋巴細胞中具活性之免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等人,(1984) Cell 38: 647-58；Adames等人,(1985) Nature 318: 533-38；Alexander等人,(1987) Mol. Cell Biol. 7: 1436-44)。
可將強化子序列插入載體中以增強編碼本發明之抗Dkk-1抗體或其免疫功能片段的核酸在高等真核細胞中之轉錄。強化子為DNA之順式作用元件，長度通常為約10-300bp，其作用於啟動子以增強轉錄。增化子之取向及位置相對獨立。已發現其位於轉錄單元之5'及3'。已知可自哺乳動物基因獲得之若干強化子序列(例如血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎兒蛋白及胰島素)。亦可使用來自病毒之強化子序列。SV40強化子、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、多瘤強化子及腺病毒強化子為活化真核啟動子之例示性增強元件。儘管強化子可剪接於載體中核酸分子之位置5'或3'處，但其通常位於啟動子之5'位點。
在表現載體中，轉錄終止序列通常位於多肽編碼區之末端的3'處且用以終止轉錄。用於在原核細胞中表現之轉錄終止序列通常為富G-C片段，隨後為多T序列。儘管該序列易於自文庫選殖或甚至可作為載體之一部分在市場上購得，但其亦可使用核酸合成方法(諸如本文所述之方法)輕易地合成。
可選標誌基因元件編碼對選擇性培養基中生長之宿主細胞的存活及生長必需之蛋白質。表現載體中所用之典型選擇標誌基因編碼符合以下之蛋白質：(a)賦予原核宿主細胞對抗生素或其他毒素(例如安比西林(ampicillin)、四環素(tetracycline)或康黴素(kanamycin))之抗性；(b)補充細胞之營養缺陷；或(c)供應自複合培養基不可得之關鍵營養素。可選標誌之實例包括抗康黴素基因、抗安比西林基因及抗四環素基因。亦可使用抗細菌新黴素基因在原核與真核宿主細胞中選擇。
可使用其他選擇基因擴增將表現之基因。擴增為不能以單本形式以足夠高量表現以允許細胞在某些選擇條件下存活及生長之基因在連續代重組細胞之染色體內連續複製(reiterated in tandem)的過程。哺乳動物細胞之適合的可擴增可選標誌之實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)及無啟動子胸苷激酶。在使用此等標誌時，將哺乳動物細胞轉型體置於選擇壓力下，其中僅轉型體藉助於載體中存在之選擇基因而獨經改適以存活。藉由在連續提高選擇劑於培養基中之濃度的條件下培養所轉型之細胞來施加選擇壓力，藉此僅允許已擴增選擇基因之彼等細胞存活。在此等情形下，與選擇基因相鄰之DNA(諸如編碼本發明抗體之DNA)與選擇基因共擴增。因此，自所擴增之DNA合成更多量之抗Dkk-1多肽。
核糖體結合位點通常為mRNA之轉譯起始所必需且特徵在於Shine-Dalgarno序列(原核細胞)或Kozak序列(真核細胞)。該元件通常位於啟動子之3'處及待表現之多肽之編碼序列的5'處。
在一些情況下，例如當需要在真核宿主細胞表現系統中糖基化時，可操作各種前序列以改良糖基化或產量。舉例而言，可改變特定信號肽之肽酶裂解位點，或添加亦可影響糖基化的前導序列(pro-sequence)。最終蛋白質產物可在-1位置(相對於成熟蛋白質之第一胺基酸)具有一或多個可能尚未完全移除之易於表現的額外胺基酸。舉例而言，最終蛋白質產物可具有一或兩個可見於肽酶裂解位點之胺基酸殘基連接於胺基端。或者，若酶在成熟多肽內之此區域切割，則使用一些酶裂解位點可能產生略微截短但具活性形式之所需多肽。
當市售表現載體缺乏一些如上所述之所需側接序列時，可藉由將此等序列個別地接合於載體中來修飾該載體。在已視需要選擇載體及修飾之後，將編碼抗Dkk-1抗體或其免疫功能片段之核酸分子插入載體之適當位點。
將含有編碼本發明抗體或其免疫功能片段之序列的完整載體插入適合宿主細胞中以進行擴增及/或多肽表現。可藉由熟知方法實現抗Dkk-1抗體其免疫功能片段之表現載體轉型至所選宿主細胞中，該等熟知方法包括諸如轉染、感染、氯化鈣、電穿孔、微注射、脂質體轉染、DEAE-聚葡萄糖方法或其他已知技術之方法。所選方法將部分地隨欲使用宿主細胞之類型而變。此等方法及其他適合之方法為熟習此項技術者所熟知。
經轉型之宿主細胞當在適當條件下培養時合成抗Dkk-1抗體或其功能片段，其可隨後自培養基(若宿主細胞將其分泌至培養基中)或直接自產生其之宿主細胞(若其未分泌)收集。適當宿主細胞之選擇將視各種因素而定，諸如所需表現量、達成活性所需或必需之多肽修飾(諸如糖基化或磷酸化)、及易摺疊為生物活性分子。
可作為宿主用於表現之哺乳動物細胞株在此項技術中熟知且包括(但不限於)許多可獲自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection/ATCC)之永生化細胞株，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、海拉細胞(HeLa cell)、幼倉鼠腎臟(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)及許多其他細胞株。在某些實施例中，可藉由測試各種細胞株以確定具有最高表現量且產生具有組成性Dkk-1結合特性之抗體之細胞株來選擇表現特定DNA構築體之最佳細胞株。
醫藥組合物
在另一態樣中，本發明提供一種組合物，例如醫藥組合物，其含有與醫藥學上可接受之載劑一起調配之一種本發明之單株抗體或其抗原結合部分或其組合。此等組合物可包括一種本發明之抗體或免疫結合物或雙專一性分子，或其組合(例如兩種或兩種以上不同者)。舉例而言，本發明之醫藥組合物可包含結合於標靶抗原上不同抗原決定基或具有互補活性之抗體(或免疫結合物或雙專一性分子)的組合。
本發明之醫藥組合物亦可以組合療法(亦即與其他藥劑組合)形式投與。舉例而言，組合療法可包括本發明之抗Dkk-1抗體與至少一種其他消炎劑或免疫抑制劑之組合。下文在關於本發明之抗體之用途的章節中更詳細描述可用於組合療法之治療劑的實例。
如本文中所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有生理上相容之溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑、及類似物。載劑通常適於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊椎或表皮投與(例如藉由注射或輸注)。視投藥途徑而定，可將活性化合物(亦即抗體、其抗原結合部分、免疫結合物或雙專一性分子)包衣於一種材料中以保護化合物免受酸及可使化合物失活之其他自然條件的作用。
在一些實施例中，本發明之抗體可以中性形式(包括兩性離子形式)或以帶正電或帶負電之物質的形式存在。在一些情況下，可使抗體與相對離子複合以形成醫藥學上可接受之鹽。因此，本發明之醫藥化合物可包括一或多種醫藥學上可接受之鹽。
「醫藥學上可接受之鹽」係指保留親本化合物(例如抗體)之所需生物活性且不賦予不當毒物學作用之鹽(例如參看Berge,S.M.等人,(1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19)。舉例而言，術語「醫藥學上可接受之鹽」包括包含一或多種抗體及一或多種相對離子之複合物，其中相對離子來源於醫藥學上可接受之無機及有機之酸及鹼。
此等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括衍生自諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及其類似物之無毒性無機酸，以及衍生自諸如脂族單羧酸及二羧酸、苯基取代烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸及其類似物之無毒性有機酸的酸加成鹽。鹼加成鹽包括衍生自諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物之鹼土金屬，以及衍生自諸如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基還原葡糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因(procaine)及其類似物之無毒性有機胺的鹼加成鹽。
此外，醫藥學上可接受之無機鹼包括金屬離子。金屬離子包括(但不限於)適當鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽及其他生理學可接受之金屬離子。衍生自無機鹼之鹽包括鋁鹽、銨鹽、鈣鹽、鈷鹽、鎳鹽、鉬鹽、釩鹽、錳鹽、鉻鹽、硒鹽、錫鹽、銅鹽、鐵鹽、亞鐵鹽、鋰鹽、鎂鹽、錳鹽、亞錳鹽、鉀鹽、銣鹽、鈉鹽及鋅鹽，且呈其常見價。
本發明之抗體的醫藥學上可接受之酸加成鹽可由以下酸製備：其包括(但不限於)甲酸、乙酸、乙醯胺基苯甲酸、己二酸、抗壞血酸、硼酸、丙酸、苯甲酸、樟腦酸、碳酸、環己胺磺酸、去氫膽酸、丙二酸、依地酸(edetic)、乙基硫酸、芬地柞酸(fendizoic)、偏磷酸、丁二酸、乙醇酸、葡萄糖酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、鞣酸、檸檬酸、硝酸、抗壞血酸、葡糖醛酸、順丁烯二酸、葉酸、反丁烯二酸、丙酸、丙酮酸、天冬胺酸、麩胺酸、苯甲酸、鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、離胺酸、異檸檬酸、三氟乙酸、雙羥萘酸、丙酸、鄰胺基苯甲酸、甲磺酸、乳清酸、草酸、酮基丁二酸、油酸、硬脂酸、水楊酸、胺基水楊酸、矽酸鹽、對羥基苯甲酸、菸鹼酸、苯基乙酸、杏仁酸、恩波酸(embonic)、磺酸、甲烷磺酸、磷酸、膦酸、乙烷磺酸、乙烷二磺酸、銨、苯磺酸、泛酸、萘磺酸、甲苯磺酸、2-羥基乙烷磺酸、對胺基苯磺酸、硫酸、硝酸、亞硝酸、硫酸單甲酯、環己基胺基磺酸、β-羥基丁酸、甘胺酸、甘胺醯甘胺酸、麩胺酸、二甲胂酸鹽、二胺基己酸、樟腦磺酸、葡萄糖酸、硫氰酸、酮戊二酸、5-磷酸吡哆醛、氯苯氧基乙酸、十一酸、N-乙醯基-L-天冬胺酸、半乳糖二酸及半乳糖醛酸。
醫藥學上可接受之有機鹼包括三甲胺、二乙胺、N,N'-二苯甲基乙二胺、氯普魯卡因、膽鹼、二苯甲基胺、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基還原葡糖胺)、普魯卡因、環胺、四級銨陽離子、精胺酸、甜菜鹼、咖啡鹼、克立咪唑(clemizole)、2-乙胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、2-二甲胺基乙醇、乙烷二胺、丁胺、乙醇胺、乙二胺、N-乙基嗎啉、N-乙基哌啶、乙基還原葡糖胺、還原葡糖胺、葡糖胺、組胺酸、海卓胺(hydrabamine)、咪唑、異丙胺、甲基還原葡糖胺、嗎啉、哌嗪、吡啶、吡哆醇、釹、哌啶、多元胺樹脂、普魯卡因、嘌呤、可可豆鹼、三乙胺、三丙胺、三乙醇胺、緩血酸胺、甲胺、牛磺酸、膽酸鹽、6-胺基-2-甲基-2-庚醇、2-胺基-2-甲基-1,3-丙二醇、2-胺基-2-甲基-1-丙醇、脂族單羧酸及二羧酸、苯基取代烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸、鍶、三(羥基甲基)甲基甘胺酸(tricine)、肼、苯基環己胺、2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸、雙(2-羥基乙基)胺基-參(羥基甲基)甲烷、N -(2-乙醯胺基)-2-胺基乙烷磺酸、1,4-哌嗪二乙烷磺酸、3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙烷磺酸、1,3-雙[參(羥基甲基)甲胺基]丙烷、4-嗎啉丙烷磺酸、4-(2-羥基乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸、2-[(2-羥基-1,1-雙(羥基甲基)乙基)胺基]乙烷磺酸、N,N-雙(2-羥基乙基)-2-胺基乙烷磺酸、4-(N-嗎啉基)丁烷磺酸、3-(N,N -雙[2-羥基乙基]胺基)-2-羥基丙烷磺酸、2-羥基-3-[參(羥基甲基)甲胺基]-1-丙烷磺酸、4-(2-羥基乙基)哌嗪-1-(2-羥基丙烷磺酸)、二水合哌嗪-1,4-雙(2-羥基丙烷磺酸)、4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪丙烷磺酸、N,N -雙(2-羥基乙基)甘胺酸、N-(2-羥基乙基)哌嗪-N'-(4-丁烷磺酸)、N-[參(羥基甲基)甲基]-3-胺基丙烷磺酸、N-參(羥基甲基)甲基-4-胺基丁烷磺酸、N-(1,1-二甲基-2-羥基乙基)-3-胺基-2-羥基丙烷磺酸、2-(環己基胺基)乙烷磺酸、3-(環己基胺基)-2-羥基-1-丙烷磺酸、3-(環己基胺基)-1-丙烷磺酸、N -(2-乙醯胺基)亞胺二乙酸、4-(環己基胺基)-1-丁烷磺酸、N -[參(羥基甲基)甲基]甘胺酸、2-胺基-2-(羥基甲基)-1,3-丙二醇、及胺基丁三醇(trometamol)。
本發明之醫藥組合物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化劑。醫藥學上可接受之抗氧化劑的實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及其類似物；(2)油溶性抗氧化劑，諸如抗壞血基棕櫚酸酯、丁基化羥基甲氧苯(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及其類似物；及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其類似物。
可用於本發明之醫藥組合物中的適合之水性及非水性載劑的實例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其適合之混合物、諸如橄欖油之植物油，及諸如油酸乙酯之可注射有機酯。適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣物質；在分散液之情況下藉由維持所需粒度；及藉由使用界面活性劑來維持。
此等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。可藉由上述殺菌程序與藉由包括各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及其類似物)來確保預防微生物存在。在組合物中亦可適宜地包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，可藉由包括延遲吸收之藥劑，諸如單硬脂酸鋁及明膠來實現可注射藥物形式之長時間吸收。
醫藥學上可接受之載劑包括無菌水性溶液或分散液，及供臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。用於醫藥活性物質之此等介質及藥劑之使用在此項技術中已知。除非任何習知介質或藥劑與活性化合物不相容，否則涵蓋將其用於本發明之醫藥組合物中。亦可在組合物中併入補充性活性化合物。
治療組合物通常必須為無菌且在製造及儲存條件下穩定。可將組合物調配為溶液、微乳液、脂質體，或其他適於高藥物濃度之有序結構。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇，及液態聚乙二醇及其類似物)及其適合之混合物的溶劑或分散介質。適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣；在分散液情況下藉由維持所需粒度；及藉由使用界面活性劑來維持。在許多情況下，較佳在組合物中包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。可藉由在組合物中包括延遲吸收之藥劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來實現可注射組合物之長時間吸收。
可藉由將所需量之活性化合物併入含一種上列成分或其組合的適當溶劑中，視需要隨後進行殺菌微濾來製備無菌可注射溶液。一般而言，藉由將活性化合物併入含有基本分散介質及來自上列各成分之其他所需成分的無菌媒劑中來製備分散液。在製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，製備方法包括(但不限於)真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其由先前經無菌過濾之溶液產生活性成分加任何額外所需成分之粉末。
可與載劑物質組合以產生單一劑型之活性成分量將視所治療之個體及特定投藥模式而變。可與載劑物質組合以產生單一劑型之活性成分量一般將為產生治療作用的組合物量。一般而言，以100%計，此量將在約0.01%至約99%之活性成分、較佳約0.1%至約70%、最佳約1%至約30%之活性成分與醫藥學上可接受之載劑組合的範圍內。
調整給藥方案以提供最佳所需反應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單次劑量(single bolus)；可隨時間投與若干分次劑量；或可如治療情況之緊急程度所指示按比例降低或提高劑量。出於易於投藥及劑量均一性，尤其宜將非經腸組合物調配成單位劑型。如本文所用，單位劑型係指適合作為單位劑量用於欲治療個體的實體上離散單位；各單位含有經計算產生所需治療作用的預定量之活性化合物與所需醫藥載劑聯合。本發明之單位劑型之規格受以下因素支配且直接視該等因素而定：(a)活性化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療作用；及(b)在此項技術中為處理個體之敏感性而混配此活性化合物之固有侷限性。
對於投與該抗體而言，劑量在每公斤宿主體重約0.0001至100毫克，更通常0.01至5毫克之範圍內。舉例而言，劑量可為每公斤體重0.3毫克、每公斤體重1毫克、每公斤體重3毫克、每公斤體重5毫克或每公斤體重10毫克，或在每公斤體重1毫克至10毫克之範圍內。例示性治療方案要求每週投藥一次、每兩週投藥一次、每三週投藥一次、每四週投藥一次、每月投藥一次、每3個月投藥一次或每3至6個月投藥一次。本發明之抗Dkk-1抗體或其抗原結合部分之給藥方案包括例如經由皮下投與每公斤體重1毫克或每公斤體重3毫克，其中使用一種以下給藥時程給予抗體：(i)每四週投與六劑，接著每三個月；(ii)每三週；(iii)每公斤體重3毫克一次，隨後每三週每公斤體重1毫克。
在一些實施例中，同時投與具有不同結合專一性之兩種或兩種以上抗體或其片段，在該情況下所投與之各抗體劑量在指定範圍內。抗體通常分多次投與。單次劑量之間的時間間隔可為例如每週、每月、每三個月或每年。時間間隔亦可無規律，如由測量患者體內標靶抗原之抗體的血液含量所指示。在一些方法中，調整劑量以達成血漿抗體濃度約1至1000 μg/ml，而在一些方法中約25至300 μg/ml。
或者，抗體可以持續釋放型調配物投與，在該情況下需要之投藥頻率較低。劑量及頻率視患者體內抗體之半衰期而變化。一般而言，人類抗體顯示最長半衰期，其次為人類化抗體、嵌合抗體，及非人類抗體。投藥劑量及頻率可視治療為預防性或治療性而變化。在預防性應用中，以相對低頻率之時間間隔投與相對較低之劑量歷經長時間。一些患者在其餘生繼續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對較短時間間隔投與相對較高劑量直至疾病進展減緩或終止，較佳直至患者顯示疾病症狀部分或完全改善。此後，可向該患者施以預防性療法。
本發明之醫藥組合物中活性成分之實際劑量濃度可變化，以便獲得有效達成針對特定患者、組合物及投藥模式之所需治療反應，而對患者無毒性的活性成分量。所選劑量濃度將視多種藥物動力學因素而定，該等因素包括所用之本發明之特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性；投藥途徑；投藥時間；所用特定化合物之排泄速率；治療持續期間；與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料；所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史；及在醫學技術中所熟知之類似因素。
「治療有效劑量」之本發明之抗Dkk-1抗體較佳使得疾病症狀嚴重度降低，無疾病症狀期之頻率及持續時間增加，或預防由疾病病痛所致之損傷或殘疾。一般技術者將能夠基於諸如個體體型、個體症狀之嚴重度及所選特定組合物或投藥途徑之因素來決定此等量。
可使用諸如標靶介導藥物處置(TMDD)PK/PD模型之方法計算抗Dkk-1抗體之劑量。可使用此等模型計算抗體濃度反應關係。可使用PK/PD模型來評價抗體非標靶介導消除、抗體轉換及複合物形成及消除。可使用TMDD模型將使用動物模型(例如大鼠或猴)測定之資料轉譯為人類資料以預測有效劑量。可使用MABEL模型測定表現及轉換率。可使用PK/PD模型以基於Kd值來計算受體佔用率。為測定受體佔用率，考慮標靶及/或抗體-標靶複合物動力學之轉換率。可使用PK/PD模型預測臨床研究之安全性及效率。
可經由一或多種投藥途徑，使用在此項技術中已知之各種方法中一或多者來投與本發明之組合物。如熟習此項技術者應瞭解，投藥途徑及/或模式將視所需結果而變。本發明之抗體或其抗原結合部分之投與途徑包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、脊椎或其他非經腸投藥途徑，例如藉由注射或輸注。如本文中所用，片語「非經腸投與」意謂除腸及局部投與外，通常藉由注射之投藥模式，且包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眼眶內、心臟內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蜘蛛膜下、脊椎內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。
或者，本發明之抗體或其抗原結合部分可經由非經腸途徑來投與，該等非經腸途徑諸如局部、表皮或黏膜投藥途徑，例如鼻內、經口、經陰道、經直腸、舌下或局部。
活性化合物可與保護化合物避免快速釋放之載劑(諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼片及微囊封傳遞系統)一起製備。可使用生物可降解之生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。製備此等調配物之許多方法已獲專利或一般為熟習此項技術者己知。例如參看Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems ,J.R. Robinson編,Marcel Dekker,Inc.,New York(1978)。
可用此項技術中已知之醫學器件投與治療組合物。舉例而言，本發明之治療組合物可用無針皮下注射器件投與，該器件諸如美國專利第5,399,163號；第5,383,851號；第5,312,335號；第5,064,413號；第4,941,880號；第4,790,824號；或第4,596,556號中所揭示之器件。適用於本發明之熟知植入物及模組之實例包括：美國專利第4,487,603號，其揭示以控制速率分配藥物之可植入微輸注泵；美國專利第4,486,194號，其揭示經由皮膚投與藥物之治療器件；美國專利第4,447,233號，其揭示以精確輸注速率傳遞藥物之藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，其揭示用於連續藥物傳遞之可變流動速率可植入輸注裝置；美國專利第4,439,196號，其揭示具有多腔隔室之滲透藥物傳遞系統；及美國專利第4,475,196號，其揭示滲透藥物傳遞系統。熟習此項技術者已知許多其他此等植入物、傳遞系統及模組。
在一些實施例中，可調配本發明之抗體或其片段以確保適當之活體內分佈。舉例而言，血腦障壁(BBB)排除許多高度親水性化合物。為確保本發明之治療化合物穿過BBB(必要時)，可將其調配於例如脂質體中。關於製造脂質體之方法，例如參看美國專利第4,522,811號；第5,374,548號；及第5,399,331號。脂質體可包含一或多個部分，其經選擇性輸送至特定細胞或器官中，從而增強靶向藥物傳遞(例如參看V.V. Ranade(1989)J. Clin. Pharmacol. 29:685)。例示性靶向部分包括葉酸鹽或生物素(例如參看Low等人之美國專利第5,416,016號)；甘露糖(Umezawa等人,(1988)Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)；抗體(P.G. Bloeman等人,(1995)FEBS Lett. 357:140；M. Owais等人,(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；界面活性劑蛋白質A受體(Briscoe等人,(1995)Am. J. Physiol. 1233:134)；p120(Schreier等人,(1994)J. Biol. Chem. 269:9090)；亦參看K. Keinanen; M.L. Laukkanen(1994)FEBS Lett. 346:123; J.J. Ki11ion; I.J. Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
如本文所提供，可投與所提供之醫藥組合物用於預防性及/或治療性處理。「有效量」一般係指達成所需作用足夠但無毒性量之活性成分(亦即抗Dkk-1抗體或其免疫功能片段)之量，該所需作用為降低或消除症狀嚴重度及/或頻率，及/或改良或補救損害。「治療有效量」係指足以治療疾病病況或症狀，或預防、阻礙、延緩或逆轉疾病或任何其他不合需要之症狀的進展之量。「預防有效量」係指有效預防、阻礙或延緩疾病病況或症狀發作之量。
一般而言，抗體或片段之毒性及治療功效可根據標準醫藥程序在細胞培養物及/或實驗動物中測定，包括例如測定LD50(對50%群體致死之劑量)及ED50(在50%群體中治療有效之劑量)。毒性作用與治療作用之間的劑量比為治療指數且其可表示為比率LD50/ED50。展現大治療指數之組合物較佳。
獲自細胞培養及/或動物研究之資料可用於確定用於人類之劑量範圍。活性成分之劑量通常處於包括ED50、具有極少毒性或無毒性之循環濃度範圍內。劑量可視所用劑型及所用投藥途徑而在此範圍內變化。
如在本文中所提及，欲以治療或預防方式採用的包含抗Dkk-1抗體或其免疫功能片段之醫藥組合物之有效量將視例如治療情形及目標而定。根據某些實施例，熟習此項技術者將瞭解治療之適當劑量濃度因此將部分地視所傳遞之分子、正使用抗Dkk-1抗體所針對之適應症、投藥途徑，及患者之體型(體重、體表或器官尺寸)及/或病狀(年齡及一般健康狀況)而變。臨床醫師可滴定劑量且改變投藥途徑以獲得最佳治療作用。
給藥頻率將視調配物中抗Dkk-1抗體或其免疫功能片段之藥物動力學參數而定。舉例而言，臨床醫師將投與組合物直至達到實現所需作用之劑量為止。組合物因此可以單次劑量或隨時間以兩次或兩次以上劑量(其可能含有或可能不含有相同量之所需分子)投與，或以連續輸注方式經由植入器件或導管投與。治療可為隨時間連續或為間歇式。適當劑量之進一步改進由一般技術者常規進行且在其常規執行之任務的範圍內。適當劑量可經由使用適當劑量反應資料來確定。
為治療特徵在於Dkk-1異常或過量表現之醫學病症，可以足以誘導至少一個反映病症嚴重度之指標持續改良之量及時間向患者投與包含本發明之抗Dkk-1抗體或其免疫功能片段之組合物。若患者相隔至少一至七天或在一些情況下一至六週至少兩次展現改良，則改良被視為「持續」。適當時間間隔將在某種程度上視所治療之疾病病狀而定；其係在測定確定改良是否持續之適當時間間隔之熟練醫師之技能範圍內。改良程度基於徵兆或症狀，且亦可採用給予患者之問卷，諸如生活品質問卷來測定。
可評估反映患者疾病程度之各種指標以便確定治療之量及時間是否充分。藉由在投與第一劑抗體之前檢查患者來確定所選指標之基線值。較佳在投與第一劑之約60天內進行基線檢查。若投與抗體以治療急性症狀，諸如治療骨折，則在發生損傷後實際可能最短時間內投與第一劑。
藉由投與本發明之抗Dkk-1抗體或其免疫功能片段來誘導改良直至患者顯現所選指標超過基線之改良為止。在治療慢性病狀時，藉由重複投與此藥物歷時至少一個月或一個月以上(例如歷時一、二或三個月或三個月以上)之時段或無限期來獲得此改良程度。一至六週之時段，或甚至單次劑量通常足以治療急性病狀。對於損傷或急性病狀，單次劑量可能足夠。
儘管患者疾病程度在治療後根據一或多個指標可能表現獲改良，但治療可能以相同量或以降低之劑量或頻率無限期繼續。在治療已減少或中止後，若症狀重現，則該治療稍後可以初始量繼續。
抗Dkk-1抗體之例示效用
偵測及篩選
本發明之抗Dkk-1抗體及其免疫功能片段可用以偵測生物樣品中之Dkk-1。此等用途允許鑑別產生蛋白質之細胞或組織，或充當偵測Dkk-1產生過度或產生不足之病理學病狀之診斷劑。
所提供之抗體及片段亦可用於篩選結合於Dkk-1之分子的方法中。例如可使用各種競爭篩選法。在一些方法中，使抗Dkk-1抗體所結合之Dkk-1分子或其片段與本文所揭示之抗體或片段以及另一分子(亦即候選分子)接觸。抗體或片段與Dkk-1之間結合減少指示分子結合Dkk-1。可使用各種方法(例如ELISA)偵測抗體或片段之結合。偵測抗Dkk-1抗體或片段與Dkk-1之間之結合可藉由以可偵測方式標記抗體而簡化。在一些方法中，進一步分析在初始篩選中展現結合之分子以測定其是否抑制Dkk-1活性(例如分子是否活化Wnt信號傳導)。
治療骨骼相關病症
在其他態樣中，所提供之某些抗體及免疫功能片段可用以治療患有各種不同疾病之患者，該等疾病包括例如對Dkk-1活性抑制有反應之疾病。此等抗體及片段亦可用以治療對誘導Wnt信號傳導有反應的疾病。除非另有說明，否則如本文中所用，術語「患者」包括人類及動物個體。此等疾病之實例包括(但不限於)各種疾病，涉及骨骼病症，包括低骨質病狀、全身性骨質流失、骨形成受抑制及骨侵蝕。一些抗體及片段亦可用於骨修復。
在一些實施例中，抗體或片段具有刺激骨胚細胞活性及增加骨密度或骨質之治療用途。此等抗體及片段因此適用於治療罹患各種醫學病症(包括過度骨質流失)之患者或甚至在可能不一定存在過度蝕骨細胞活性之處亦需要形成新骨之患者。阻斷Dkk-1活性使得骨胚細胞經由Wnt蛋白質傳輸之信號傳導而活化。過度蝕骨細胞活性與眾多骨質減少病症相關，該等病症可用所提供之抗體及免疫功能片段治療，包括骨質減少、骨質疏鬆症、牙周炎、佩吉特氏病、不活動所致之骨質流失、溶解性骨轉移及關節炎(包括類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎)、僵直性脊椎炎及其他涉及骨侵蝕之病狀。
亦可治療各種其他低骨質病狀，包括各種形式之骨質疏鬆症，其包括(但不限於)糖皮質激素誘發之骨質疏鬆症、移植後誘發之骨質疏鬆症、與化學療法相關之骨質疏鬆症(亦即，化學療法誘導之骨質疏鬆症)、不活動誘發之骨質疏鬆症、機械減負荷(mechanical unloading)所致之骨質疏鬆症，及與抗痙劑使用相關之骨質疏鬆症。可用一些抗體或片段治療之其他骨疾病包括與腎衰竭相關之骨疾病及與營養、腸胃及/或肝相關骨疾病。
亦可治療不同形式之關節炎，實例包括骨關節炎及類風濕性關節炎。該等抗體及片段亦可用以治療與關節炎(例如類風濕性關節炎)相關之全身性骨質流失。在治療關節炎時，患者可受益於病灶周圍(perilesional)或病灶內注射本發明之抗體或其片段。舉例而言，該等抗體或其片段可與發炎關節相鄰注射或直接注射於發炎關節中，從而刺激該部位受損骨骼之修復。
已知一些癌症提高蝕骨細胞活性且誘導骨吸收，諸如乳癌及前列腺癌。出現於骨髓中之多發性骨髓瘤亦與骨質流失相關，其部分可能由以下引起：血漿細胞之Dkk-1表現增加，其接著抑制附近骨胚細胞之骨骼建造活性。藉由投與本發明之抗體或其免疫功能片段來降低Dkk-1活性可使得骨胚細胞活性提高，從而抵銷過度蝕骨細胞活性，藉此在患者中降低上述病症之嚴重度、減少骨侵蝕及誘導新骨形成。使用某些抗Dkk-1專一性抗體或免疫功能片段治療可誘導罹患骨質減少病症之患者骨密度顯著提高。
以本文所述之抗體或免疫功能片段抑制Dkk-1亦可用於各種骨修復應用中。舉例而言，某些抗體及片段可適用於延緩與人造關節相關之磨損碎片骨質溶解、加速骨折修復及增強骨移植物併入移植其之周圍活骨中。
如本文所揭示，抗Dkk-1抗體或其免疫功能片段可單獨投與或與其他治療劑組合投與，例如與癌症治療劑、與抑制蝕骨細胞活性之藥劑或與增強骨胚細胞活性之其他藥劑組合投與。舉例而言，可向進行放射療法或化學療法之癌症患者投與本發明抗體。與本發明抗體組合使用之化學治療劑可包括蒽環黴素(anthracycline)、紫杉醇(taxol)、他莫昔芬(tamoxifene)、小紅莓(doxorubicin)、5-氟尿嘧啶、奧賽力鉑(oxaloplatin)、Velcade([(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-1-側氧基(oxo)-3-苯基-2-[(吡嗪基羰基)胺基]丙基]胺基]丁基]酸)及/或用於治療癌症之其他小分子藥物。乳癌患者將受益於相伴投與芳香酶抑制劑與包含化學療劑及抗Dkk-1抗體或其免疫功能片段之組合治療。
抗Dkk-1抗體及其免疫功能片段可單獨用於治療導致骨質流失之上文提及之病狀，或與治療有效量之包括(但不限於)以下之骨生長促進(同化)劑或骨抗再吸收劑組合使用：表示為BMP-1至BMP-12之骨型態發生因子(bone morphogenic factor)；轉型生長因子-β及TGF-β家族成員；纖維母細胞生長因子FGF-1至FGF-10；介白素-1抑制劑(包括IL-1ra，IL-1之抗體及IL-1受體之抗體)；TNFα抑制劑(包括依那西普(etanercept)、阿達木單抗(Adalibumab)及英利昔單抗(infliximab))；RANK配位體抑制劑(包括可溶RANK，專一性結合RANK或RANK配位體之護骨素及拮抗抗體)、副甲狀腺素、E系列前列腺素、雙膦酸鹽及骨增強礦物，諸如氟化物及鈣。可與本發明抗體及其功能片段組合使用之同化劑包括副甲狀腺素及類胰島素生長因子(IGF)，其中後一藥劑較佳與IGF結合蛋白複合。WO 89/11540中描述適於此組合治療之IL-1受體拮抗劑且WO 98/01555中描述適合之可溶TNF受體-1。例示性RANK配位體拮抗劑於例如WO 03/086289、WO 03/002713、美國專利第6,740,511號及第6,479,635號中揭示。所有上述專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中。
另外，抗Dkk-1抗體可與結合於腫瘤細胞且誘導對腫瘤生長之細胞毒性及/或細胞抑制效應之抗體組合投與患者。此等抗體之實例包括結合於腫瘤細胞上存在之細胞表面蛋白Her2、CDC20、CDC33、黏液素樣醣蛋白及表皮生長因子受體(EGFR)且誘導對呈現此等蛋白質之腫瘤細胞之細胞抑制及/或細胞毒性效應的抗體。此等抗體之實例包括治療乳癌之HERCEPTIN及治療非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphom)之RITUXAN，且亦包括基於抗體之藥物，諸如ERBITUX及AVASTIN。又，組合療法可包括選擇性誘導腫瘤細胞細胞凋亡之多肽(諸如TNF相關多肽TRAIL)作為癌症治療劑。
本發明之抗體或其免疫功能片段可與投與用於相同病狀之其他治療及治療劑相伴投與。如本文中所用，「相伴投與」涵蓋同時或依次投與之治療。抗Dkk-1抗體或其免疫功能片段可以預防方式投與以預防或減輕早期癌症(第I期或第II期)所致之骨質流失發作，或可經給予以改善轉移至骨骼造成之現存骨質流失病狀。
本發明之抗Dkk-1抗體可用以預防及/或治療骨骼中腫瘤細胞之生長。因為腫瘤細胞刺激蝕骨細胞再吸收內部骨基質，所以轉移至骨骼之癌症可輕易地擴散。用抗Dkk-1抗體或其免疫功能片段治療藉由刺激骨胚細胞活性提高而有助於維持此等轉移部位之骨密度。可能轉移至骨骼之任何癌症均可在轉移發生之前或之後用投與之抗Dkk-1抗體來預防或治療。
多發性骨髓瘤為可用抗Dkk-1抗體或其抗原結合片段來預防及/或治療之一類癌症之實例。患病之患者通常由於骨骼局部區域中蝕骨細胞活化提高而展現骨質流失。骨髓瘤細胞直接或間接產生RANK配位體，即活化蝕骨細胞從而使得骨髓間隙中包埋之骨髓瘤細胞周圍之骨骼溶解的蛋白質。與骨髓瘤細胞相鄰之正常蝕骨細胞又產生IL-6，使得骨髓瘤細胞生長及增殖。另外，多發性骨髓瘤細胞產生Dkk-1，藉此在此疾病中抑制骨胚細胞活性且進一步促進骨骼再吸收活性。用抗Dkk-1抗體或其免疫功能片段治療動物將激發骨胚細胞活性，藉此使得腫瘤部位之骨質增加。此治療可使骨痛降低，且可藉由預防再吸收活性(其釋放腫瘤細胞所用之骨營養素)來阻斷進一步轉移至骨骼。在治療此疾病時，抗Dkk-1抗體或其免疫功能片段可與針對RANK配位體之拮抗抗體或針對IL-6之抗體相伴投與。
治療其他病症
除與骨骼病症有關之前述用途外，所提供之某些抗體及免疫功能片段可用以治療其他疾病。Dkk-1在此等各種疾病中之作用部分由其在各種不同組織中之表現支持。該等抗體及片段例如可用以治療需要促進幹細胞再生之疾病。此等疾病包括(但不限於)糖尿病、慢性心臟衰竭及各種肌肉疾病[例如由例如不活動或臥床休息所致之不用性萎縮)；衰老性脆弱(老年人少肌症)；肌肉營養不良；與癌症、AIDS或發炎相關之惡病質；腎衰竭/尿毒癥之蛋白質-能量營養不良症，及肥胖症之肌肉萎縮]。亦可治療各種發炎疾病，包括例如克羅恩氏病(Crohn's disease)、結腸炎及發炎性腸病。該等抗體及片段亦可用於治療各種神經疾病(例如阿茲海默氏症(Alzheimer's Disease)、帕金森氏症(Parkinson's disease)及亨丁頓氏病(Huntington's disease))。亦可用某些抗體及片段治療眼疾(例如黃斑退化及各種視網膜病)。亦可用一些抗體治療不同腎病(例如末期腎病、慢性腎病、絲球體腎炎、腎小管間質腎炎及IgA腎病變)。另外，亦可治療各種肺病(例如慢性阻塞性肺病、特發性肺纖維化及囊腫性纖維化)及各種皮膚病症，包括真皮及表皮疾病。可治療之皮膚病症的實例包括受損腸上皮(例如化學療法誘導之損害)，及需要刺激腸上皮生長及存活之其他疾病。
套組
亦提供包括如本文所述之抗體或免疫功能片段或醫藥組合物之套組。一些套組包括此抗體、片段或組合物於容器(例如小瓶或安瓿)中，且亦可包括將抗體或片段用於上文所揭示之各種偵測、篩選及治療應用之說明書。抗體、片段或組合物可呈各種形式，包括例如呈溶液之一部分的形式或呈固體(例如凍乾粉末)形式。說明書可包括如何在適當流體中製備(例如溶解或再懸浮)抗體或片段及/或如何投與抗體或片段以便治療上述疾病(例如骨病症，諸如低骨質、全身性骨質流失、骨形成受抑制及骨侵蝕；幹細胞再生；發炎疾病；神經疾病；眼疾；腎病及皮膚病)之描述。
該等套組亦可包括各種其他組分，諸如緩衝劑、鹽、錯合金屬離子及上文在關於醫藥組合物之章節中所述之其他藥劑。此等組分可與抗體或片段一起包括或可在單獨之容器中。套組亦可包括與抗體或片段一起投與之其他治療劑。此等藥劑之實例包括(但不限於)治療癌症之藥劑、骨促進劑及結合腫瘤細胞之抗體，及上列其他藥劑。
抗Dkk-1抗體之進一步特定描述
Fcγ部分之修飾
在重組人類化抗體中，可修飾Fcγ部分以避免與Fcγ受體及補體免疫系統相互作用。此類型之修飾係由劍橋大學病理學系(Department of Pathology at Cambridge University)之Mike Clark博士所設計，且製備此等抗體之技術例如在1999年11月18日公開之WO 99/58572中描述。舉例而言，若將抗體用於治療人類，則可將恆定區工程改造為更類似於人類恆定區以避免免疫反應。參看例如美國專利第5,997,867號及第5,866,692號。
對huMabJC18之修飾
huMabJC18為完全人類化抗Dkk-1單株抗體。本發明涵蓋對huMabJC18之修飾，包括不會顯著影響其特性之功能等效抗體及活性及/或親和力增強或降低之變異體。舉例而言，如熟習此項技術者應瞭解，huMabJC18之胺基酸序列可突變以獲得對Dkk-1具有所需結合親和力之抗體。多肽修飾在此項技術中為常規實踐且在本文中無需詳細描述。實例中例示多肽修飾。經修飾之多肽的實例包括：具有胺基酸殘基保守性取代、一或多種不會顯著不利地改變功能活性之胺基酸缺失或添加之多肽，或使用化學類似物。
胺基酸序列插入包括：長度在一個殘基至含有一百個或一百個以上殘基之多肽之範圍內的胺基端及/或羧基端融合物，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體或融合於抗原決定基標籤之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括酶或多肽與抗體之N端或C端的融合物，其延長抗體之血清半衰期。
取代變異體在經移除之抗體分子中具有至少一個胺基酸殘基及在其位置插入不同殘基。最受關注之供取代突變誘發的位點包括高變區，但亦涵蓋構架(FR)變化。表1中所示之保守性取代係在「保守性取代」標題下。若此等取代引起生物活性改變，則可引入在表1中命名為「例示性取代」，或如下文關於胺基酸類別進一步描述之更實質變化且篩選產物。
抗體生物特性之實質改變係藉由選擇對以下之作用顯著不同之取代而實現：維持(a)取代區中多肽主鏈之結構，例如呈摺疊或螺旋構形，(b)標靶位點處分子之電荷或疏水性，或(c)側鏈體積。基於常見側鏈特性將天然存在之殘基分組：
(1)非極性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)不帶電極性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性(帶負電荷)：Asp、Glu；
(4)鹼性(帶正電荷)：Lys、Arg；
(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；及
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe、His。
藉由將一種此等類別之成員交換為另一類別進行非保守性取代。
維持抗體適當構形中不涉及之任何半胱胺酸殘基均亦可經取代，一般經絲胺酸取代，以改良分子之氧化穩定性且防止異常交聯。相反地，可向抗體中添加半胱胺酸鍵以改良其穩定性，尤其當抗體為諸如Fv片段之抗體片段時更是如此。
胺基酸修飾可介於改變或修飾一或多個胺基酸至完全重新設計一個區域，諸如可變區。可變區之變化可改變結合親和力及/或專一性。在一些實施例中，在CDR域內產生不超過一至五個保守胺基酸取代。在其他實施例中，在CDR域內產生不超過一至三個保守性胺基酸取代。在其他實施例中，CDR域為CDR H3及/或CDR L3。
huMabJC18之糖基化
修飾亦包括糖基化及非糖基化多肽，以及具有其他轉譯後修飾之多肽，該等轉譯後修飾諸如用不同糖來糖基化、乙醯化及磷酸化。抗體在其恆定區中保守位置經糖基化(例如參看Jefferis及Lund(1997) Chem. Immunol. 65:111-128；Wright及Morrison(1997) TibTECH 15:26-32)。免疫球蛋白之寡醣側鏈影響蛋白質功能(例如參看Boyd等人,(1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318；Wittwe及Howard(1990) Biochem. 29:4175-4180)及醣蛋白之部分之間的分子內相互作用，其可影響醣蛋白之構形及所呈現之三維表面(Hefferis及Lund,同上文；Wyss及Wagner(1996) Current Opin. Biotech. 7:409-416)。寡醣亦可用以基於特定識別結構使既定醣蛋白靶向某些分子。亦已報導抗體之糖基化影響抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。特定言之，報導具有四環素調控之β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)(催化形成平分GlcNAc之糖基轉移酶)之表現的CHO細胞具有獲改良之ADCC活性(例如參看Umana等人,(1999) Nature Biotech. 17:176-180)。
抗體之糖基化通常為N連接或O連接。N連接係指碳水化合物部分連接至天冬醯胺殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸、天冬醯胺-X-蘇胺酸、及天冬醯胺-X-半胱胺酸(其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸)為碳水化合物部分酶促連接至天冬醯胺側鏈之識別序列。因此，多肽中存在任一此等三肽序列均會產生潛在糖基化位點。O連接糖基化係指糖N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖之一連接至羥基胺基酸，最通常連接至絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
向抗體中添加糖基化位點宜藉由改變胺基酸序列使得其含有一或多種上述三肽序列來實現(對於N連接糖基化位點)。該改變亦可藉由對初始抗體之序列進行一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添加或取代來進行(對於O連接糖基化位點)。
亦可改變抗體之糖基化模式而不改變基本核苷酸序列。糖基化在很大程度上視用以表現抗體之宿主細胞而定。由於用於表現作為潛在治療劑之重組醣蛋白(例如抗體)之細胞類型極少為原生細胞，因此可預期抗體之糖基化模式改變(例如參看Hse等人,(1997) J. Biol. Chem. 272:9062-9070)。
除宿主細胞之選擇外，在抗體之重組產生期間影響糖基化之因素亦包括生長模式、培養基調配物、培養物密度、氧合作用、pH值、純化流程及其類似因素。已提出各種方法來改變特定宿主生物體中達成之糖基化模式，包括引入或過度表現某些在寡醣產生中所涉及之酶(例如參看美國專利第5,047,335號；第5,510,261號及第5.278,299號)。可例如使用內切糖苷酶H(Endo H)自醣蛋白酶促移除糖基化或某些類型之糖基化。另外，重組宿主細胞可經遺傳工程改造，使得在某些類型之多醣加工中具有缺陷。此等及類似技術在此項技術中熟知。
偶合技術
如上文所示，其他修飾方法包括使用在此項技術中已知之偶合技術，其包括(但不限於)酶促手段、氧化取代及螯合。可使用修飾例如連接標記以便免疫檢定。經修飾之huMabJC18多肽可使用在此項技術中已確立之程序製得且可使用在此項技術中已知之標準檢定來篩選，其中一些描述於下文及實例中。熟習此項技術者應瞭解製造及篩選此等修飾之任何適合方法。
經修飾之恆定區
在本發明之一些實施例中，抗體包含經修飾之恆定區，諸如免疫惰性或部分惰性之恆定區，例如不觸發補體介導溶解、不刺激抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)，或不活化微神經膠質細胞；或在任一或多個以下各項中之活性降低(相較於未經修飾之抗體)：觸發補體介導溶解、刺激抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)，或活化微神經膠質細胞。恆定區之不同修飾可用以達成最佳程度及/或組合之效應功能。例如參看Morgan等人,Immunology 86:319-324(1995)；Lund等人,J. Immunology 157:4963-9157:4963-4969(1996)；Idusogie等人,J. Im munology 164:4178-4184(2000)；Tao等人,J. Immunology 143: 2595-2601(1989)；及Jefferis等人,Immunological Reviews 163:59-76(1998)。在一實施例中，恆定區如在以下文獻中所述經修飾：Eur. J. Immunol.(1999) 29:2613-2624；PCT申請案第PCT/GB99/01441號；及/或英國專利申請案第9809951.8號。
在一實施例中，抗體包含人類重鏈IgG2a恆定區，該恆定區包含以下突變：A330P331至S330S331(參考野生型IgG2a序列之胺基酸編號)。Eur. J. Immunol.(1999)29:2613-2624。在另一實施例中，恆定區經去糖基化(aglycosylated)。在另一實施例中，藉由使恆定區中之糖基化胺基酸殘基突變使恆定區去糖基化。舉例而言，N-糖基化位點N297可突變為A、Q、K或H。例如參看Tao等人,J. Immunology 143:2595-2601(1989)；及Jefferis等人,Immunological Reviews 163:59-76(1998)。在一實施例中，將恆定區酶促去糖基化(諸如藉由酶PNGase來移除碳水化合物)。
效應域
其他抗體修飾包括已如例如1999年11月18日公開之WO 99/58572中所述來修飾之抗體。除針對標靶分子之結合域外，此等抗體亦包含具有與人類免疫球蛋白重鏈之恆定域之全部或一部分實質上同源之胺基酸序列的效應域。此等抗體能夠結合標靶分子，而不觸發標靶之顯著補體依賴性溶解或細胞介導破壞。在一些實施例中，效應域能夠專一性結合FcRn及/或FcγRIIb。此等通常基於源自兩個或兩個以上人類免疫球蛋白重鏈CH 2域之嵌合域。以此方式修飾之抗體尤其適用於慢性抗體療法以避免對習知抗體療法之發炎及其他不利反應。
親和力成熟
在一實施例中，抗體為親和力成熟抗體。舉例而言，親和力成熟抗體可藉由在此項技術中已知之程序產生(例如Marks等人,1992,Bio/Technology,10:779-783；Barbas等人,(1994) Proc Nat. Acad. Sci,USA 91:3809-3813；Schier等人,(1995) Gene,169:147-155；Yelton等人,(1995) J. Immunol.,155:1994-2004；Jackson等人,(1995) J. Immumol.,154(7):3310-9；Hawkins等人，(1992) J. Mol.Biol.,226:889-896)。
文庫掃描突變誘發
以下方法可用於調整抗體親和力及表徵CDR。表徵抗體之CDR及/或改變(諸如改良)多肽(諸如抗體)之結合親和力的一種方式稱為「文庫掃描突變誘發」。一般而言，文庫掃描突變誘發如下運作。使用技術上認可之方法將CDR中之一或多個胺基酸位置用兩個或兩個以上(諸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)胺基酸置換。此產生純系之小文庫(在一些實施例中，為每個經分析之胺基酸位置一個)，各自具有兩個或兩個以上成員之複合(若在每個位置處兩個或兩個以上胺基酸經取代)。一般而言，該文庫亦包括包含原生(未經取代)胺基酸之純系。針對與標靶多肽(或其他結合標靶)之結合親和力篩選來自各文庫之少量純系，例如約20-80個純系(視文庫之複雜性而定)，且鑑別結合增加、相同、減少或無結合之候選物。
測定結合親和力
在此項技術中熟知測定結合親和力之方法。可使用BIAcore或ProteOn表面電漿共振分析測定結合親和力，該分析偵測約2倍或2倍以上之結合親和力差異。當起始抗體以相對高親和力(例如約10 nM或10 nM以下之KD )結合時，此等類型之分析尤其適用。在本文實例中描述使用BIAcore或ProteOn表面電漿共振之篩選。
可使用Kinexa Biocensor、閃爍鄰近檢定(scintillation proximity assay)、ELISA、ORIGEN免疫檢定(IGEN)、螢光淬減、螢光轉移及/或酵母呈現來測定結合親和力。亦可使用適合之生物檢定來篩選結合親和力。
在一些實施例中，使用技術上認可之突變誘發方法(其中一些描述於本文中)，CDR中之每個胺基酸位置經所有20個天然胺基酸置換(在一些實施例中一次一個)。此產生純系之小文庫(在一些實施例中，每個經分析之胺基酸位置一個)，其各自具有20個成員之複合(若在每個位置所有20個胺基酸均經取代)。
在一些實施例中，待篩選之文庫在兩個或兩個以上位置包含取代，其可在同一CDR中或在兩個或兩個以上CDR中。因此，文庫可包含在一個CDR中兩個或兩個以上位置之取代。文庫可在兩個或兩個以上CDR中兩個或兩個以上位置包含取代。文庫可在3、4、5個或5個以上位置包含取代，該等位置可見於二、三、四、五或六個CDR中。可使用低冗餘密碼子來製備取代。例如參看Balint等人,(1993) Gene 137(1):109-18之表2。
CDR可為CDRH3及/或CDRL3。CDR可為CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及/或CDRH3中一或多者。CDR可為Kabat CDR、Chothia CDR或延伸CDR。
可將結合改良之候選物定序，藉此鑑別產生獲改良親和力(亦稱為「獲改良」取代)之CDR取代突變體。亦可將結合之候選物定序，藉此鑑別保持結合之CDR取代。
可進行多輪篩選。舉例而言，結合獲改良之候選物(各自在一或多個CDR之一或多個位置包含胺基酸取代)亦適用於設計第二文庫，該第二文庫在各獲改良CDR位置(亦即，CDR中取代突變體顯示獲改良之結合之胺基酸位置)含有至少初始及經取代胺基酸。下文進一步討論此文庫之製備、及篩選或選擇。
就具有獲改良之結合、相同結合、減少之結合或無結合之純系頻率亦提供關於各胺基酸位置對抗體-抗原複合物穩定性之重要性的資訊而言，文庫掃描突變誘發亦提供表徵CDR之手段。舉例而言，若CDR之位置當變為所有20個胺基酸時均保持結合，則將彼位置鑑別為不可能為抗原結合所需之位置。相反地，若CDR之位置在僅小百分比取代下保持結合，則將彼位置鑑別為對CDR功能重要之位置。因此，文庫掃描突變誘發方法產生關於CDR中可變為許多不同胺基酸(包括所有20個胺基酸)之位置及CDR中不可變或只能改變少數胺基酸之位置的資訊。
親和力獲改良之候選物可在第二文庫中組合，其在彼位置包括獲改良胺基酸、初始胺基酸，且可在彼位置進一步包括額外取代(視所需文庫複雜性而定)，或允許使用所需篩選方法或選擇方法。另外，必要時，相鄰胺基酸位置可經隨機化為至少兩種或兩種以上胺基酸。相鄰胺基酸之隨機化可允許突變型CDR中具有額外構形靈活性，其又可允許或有助於引入較大數目之改良性突變。文庫亦可在第一輪篩選中不顯示親和力獲改良之位置包含取代。
使用在此項技術中已知之任何方法，包括使用BIAcore表面電漿共振分析篩選，及使用此項技術中已知用於選擇之任何方法(包括噬菌體呈現、酵母呈現及核糖體呈現)篩選或選擇第二文庫中結合親和力獲改良及/或改變之文庫成員。
融合蛋白
如上文所示，本發明亦涵蓋包含來自本發明之抗體(諸如huMabJC18)或多肽之一或多個片段或區域的融合蛋白。可藉由在此項技術中已知之方法，例如以合成或重組方式產生huMabJC18融合多肽。本發明之huMabJC18融合蛋白通常使用本文所述之重組方法，藉由製備及表現編碼其之聚核苷酸而製得，但其亦可藉由在此項技術中已知之其他手段(包括例如化學合成)來製備。
結合
如上文所示，本發明亦提供組合物，其包含huMabJC18抗體或多肽與有助於偶合於固體支撐物(諸如生物素或抗生物素蛋白)之藥劑之結合物(例如連接物)。為簡單起見，一般將參考huMabJC18或抗體，應瞭解此等方法適用於本文所述之任何Dkk-1結合實施例。結合一般係指連接此等如本文所述之組分。可以許多方式達成連接(其一般為至少出於投藥目的，將此等組分以緊密締合形式固定)。舉例而言，當藥劑與抗體各具有能夠與另一者反應之取代基時，則其之間可能發生直接反應。舉例而言，諸如胺基或硫氫基之親核基團一方面可能能夠與諸如酐或酸鹵化物之含羰基之基團反應，或另一方面與含有良好脫離基(例如鹵基)之烷基反應。
標記劑
如上文所示，本發明之抗體或多肽可連接於任何適合之標記劑(或者稱為「標記」)，諸如螢光分子、放射性分子或在此項技術中已知之任何其他標記。標記在此項技術中為已知，其一般提供(直接或間接)信號。
組合物
如上文所示，本發明亦提供組合物(包括醫藥組合物)及套組，其包含例如huMabJC18，或如本發明所闡明本文所述之任何或所有抗體及/或多肽。
聚核苷酸、載體(例如表現載體)及宿主細胞
如上文用所提供之若干特定實施例所示，本發明亦提供編碼本發明之抗體及多肽(包括包含圖1中所示之輕鏈及重鏈可變區之多肽序列的抗體)的經分離聚核苷酸，及包含聚核苷酸之載體及宿主細胞。
在另一態樣中，本發明提供編碼任何本文所述之抗體(包括抗體片段)及多肽之聚核苷酸。如熟習此項技術者應瞭解，所提供之聚核苷酸可藉由在此項技術中已知之程序來製得。
在另一態樣中，本發明提供包含任何本發明聚核苷酸之組合物(包括上文及下文較詳細描述之醫藥組合物)。在一實施例中，組合物包含表現載體，該表現載體包含編碼如本文所述之huMabJC18的聚核苷酸。在一實施例中，組合物包含表現載體，該表現載體包含編碼任何本文所述之抗體或多肽的聚核苷酸。在又一實施例中，組合物包含SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 28所示之任一或兩個聚核苷酸。本文進一步描述聚核苷酸組合物之表現載體及投與。
在另一態樣中，本發明提供製造任何本文所述之聚核苷酸的方法。
本發明亦涵蓋與任何此等序列互補之聚核苷酸。聚核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股，且可為DNA(基因組、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子包括含有內含子且以一對一方式對應於DNA分子之HnRNA分子，及不含有內含子之mRNA分子。其他編碼或非編碼序列可(但不必需)存在於本發明之聚核苷酸內，且聚核苷酸可(但不必需)連接至其他分子及/或載體材料。
聚核苷酸可包含原生序列(亦即編碼抗體或其部分之內源性序列)或可包含此序列之變異體。聚核苷酸變異體含有一或多個取代、添加、缺失及/或插入，使得編碼多肽之免疫反應性相對於原生免疫反應性分子不減小。一般可如本文所述評估對經編碼多肽之免疫反應性的影響。變異體較佳與編碼原生抗體或其部分之聚核苷酸序列展現至少約70%一致性，更佳至少約80%一致性及最佳至少約90%一致性。
若當如下所述為達最大對應進行比對時，兩個序列中之核苷酸或胺基酸之序列相同，則將兩個聚核苷酸或多肽序列稱為「一致」。通常藉由在比較窗上比較序列以鑑別及比較具有序列相似性之局部區域來進行兩個序列之間的比較。如本文中所用，「比較窗」係指至少約20個(通常30至約75個，或40至約50個)相鄰位置之區段，其中可將序列與具有相同數目之相鄰位置的參考序列在該兩個序列最佳比對之後相比較。
供比較之序列的最佳比對可使用生物資訊軟體Lasergene套件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)中之Megalign程式，使用系統內定參數來進行。此程式實施以下參考文獻中所述之若干比對方案：Dayhoff,M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships；Dayhoff,M.O. (編) Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC,第5卷，增刊3,第345-358頁；Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes,第626-645頁,Methods in Enzymology第183卷,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.及Sharp,P.M. (1989) CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.及Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb. Theor. 11:105；Santou,N.,Nes,M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425；Sneath,P.H.A.及Sokal,R.R. (1973) Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.及Lipman,D.J. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730。
較佳藉由在具有至少20個位置之比較窗上比較兩個最佳比對序列來測定「序列一致性百分比」，其中對於兩個序列最佳比對而言，相較於參考序列(其不包含添加或缺失)，比較視窗中聚核苷酸或多肽序列之部分可包含20%或20%以下，通常5%至15%，或10%至12%之添加或缺失(亦即間隙)。如下計算該百分比：測定在兩個序列中均存在之一致核酸鹼基或胺基酸殘基之位置數得到匹配位置數，用匹配位置數除以參考序列中位置總數(亦即窗尺寸)且將結果乘以100得到序列一致性百分比。
變異體亦可(或替代性地)與原生基因或其部分或補體實質上同源。此等聚核苷酸變異體能夠在中等嚴格條件下與天然存在之編碼原生抗體之DNA序列(或互補序列)雜交。
適合之「中等嚴格條件」包括在5×SSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA(pH 8.0)之溶液中預洗；在50℃-65℃、5×SSC下雜交隔夜；隨後在65℃下洗滌兩次歷時20分鐘，每次用2×、0.5×及0.2×SSC(含有0.1% SDS)。
如本文中所用，「高嚴格條件」或「高嚴格性條件」為如下條件：(1)採用低離子強度及高溫來洗滌，例如0.015 M氯化鈉/0.0015 M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉，50℃；(2)在雜交期間採用變性劑，諸如甲醯胺，例如含0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯啶酮之50%(v/v)甲醯胺/含750 mM氯化鈉、75 mM檸檬酸鈉之50 mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.5)，42℃；或(3)在42℃下採用50%甲醯胺、5×SSC(0.75 M NaCl、0.075 M檸檬酸鈉)、50 mM 磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5×登哈特溶液(Denhardt's solution)、音波處理之鮭魚精DNA(50 μg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，洗滌為在42℃下於0.2×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中及在55℃下50%甲醯胺，隨後為由在55℃下含有EDTA之0.1×SSC組成的高嚴格性洗滌。熟習此項技術者應認識到如何視需要調整溫度、離子強度等以適應諸如探針長度及其類似因素之所需因素。
一般技術者應瞭解由於遺傳密碼子之簡併性，因此存在許多編碼如本文所述之多肽的核苷酸序列。一些此等聚核苷酸與任何原生基因之核苷酸序列均具有最小同源性。然而，本發明特定涵蓋因密碼子使用差異而不同之聚核苷酸。此外，包含本文中所提供之聚核苷酸序列之基因的對偶基因係在本發明之範疇內。對偶基因為內源性基因，其因一或多個突變，諸如核苷酸之缺失、添加及/或取代而改變。所得mRNA及蛋白質可能(但不一定)具有改變之結構或功能。可使用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)鑑別對偶基因。
可使用化學合成、重組方法或PCR獲得本發明之聚核苷酸。化學聚核苷酸合成之方法在此項技術中熟知且無需在本文中詳述。熟習此項技術者可使用本文提供之序列及商業DNA合成器以產生所需DNA序列。
對於使用重組方法製備聚核苷酸，如本文進一步論述，可將包含所需序列之聚核苷酸插入適合載體中，且該載體又可引入至適合宿主細胞中以便複製及擴增。可藉由在此項技術中已知之任何手段將聚核苷酸插入宿主細胞中。藉由直接吸收、內飲作用、轉染、F-匹配或電穿孔引入外源聚核苷酸來轉型細胞。引入後，外源聚核苷酸可以未整合載體(諸如質體)形式維持在細胞內或整合於宿主細胞基因組中。如此擴增之聚核苷酸可藉由此項技術中熟知之方法與宿主細胞分離。例如參看Sambrook等人,(1989)。
或者，PCR使DNA序列複製。PCR技術在此項技術中熟知且描述於美國專利第4,683,195號；第4,800,159號；第4,754,065號；及第4,683,202號，以及PCR: The Polymerase Chain Reaction,Mullis等人編,Birkauswer Press,Boston(1994)中。
可藉由使用在適當載體中之經分離DNA且將其插入適合宿主細胞中來獲得RNA。當細胞複製且DNA轉錄於RNA中時，則可使用熟習此項技術者所熟知之方法(例如Sambrook等人,(1989)所闡述)分離RNA。
適合選殖載體可根據標準技術來建構，或可選自大量在此項技術中可得之選殖載體。儘管所選選殖載體可根據意欲使用之宿主細胞而變化，但適用選殖載體一般將具有自我複製之能力，可具有特定限制性核酸內切酶之單一標靶，及/或可攜有可用於選擇含有載體之純系之標誌的基因。適合實例包括質體及細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA、及穿梭載體(諸如pSA3及pAT28)。此等及許多其他選殖載體可獲自供應商，諸如BioRad、Stratagene及Invitrogen。
表現載體一般為含有本發明之聚核苷酸的可複製聚核苷酸構築體。意味表現載體必須在宿主細胞中作為游離基因體，或作為染色體DNA之主要部分可複製。適合表現載體包括(但不限於)例如質體、病毒載體(包括腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒)、黏質體，及WO 87/04462中揭示之表現載體。載體組分一般可包括(但不限於)以下一或多者：信號序列；複製起點；一或多個標誌基因；適合轉錄控制元件(諸如啟動子、強化子及終止子)。為了表現(亦即轉譯)，通常亦需要一或多個轉譯控制元件，諸如核糖體結合位點、轉譯起始位點及終止密碼子。
可藉由許多適當手段中任一者，包括電穿孔、採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-聚葡萄糖或其他物質進行轉染；微彈轟擊；脂質體轉染；及感染(例如其中載體為諸如牛痘病毒之感染物)將含有相關聚核苷酸之載體引入宿主細胞中。引入載體或聚核苷酸之選擇常視宿主細胞之特徵而定。
本發明亦提供包含任何本文所述之聚核苷酸的宿主細胞。任何能夠過度表現異源DNA之宿主細胞均可用於分離編碼相關抗體、多肽或蛋白質之基因的目的。哺乳動物宿主細胞之非限制性實例包括(但不限於)COS、海拉細胞及CHO細胞。亦參看例如WO 87/04462。適合非哺乳動物宿主細胞包括原核細胞(諸如大腸桿菌或枯草桿菌(B. subtillis ))及酵母(諸如釀酒酵母(S. cerevisae )、粟酒裂殖酵母(S. pombe )或乳酸刻魯維酵母(K. lactis ))。宿主細胞之cDNA表現量較佳為宿主細胞中相應相關內源性抗體或蛋白質(若存在)之約5倍、更佳10倍、甚至更佳20倍。藉由例如免疫檢定或FACS實現專一性結合於A1-40 之宿主細胞的篩選。可鑑別過度表現相關抗體或蛋白質之細胞。
以下實例進一步說明本發明，而不應被視為進一步限制。貫穿本發明全文所引用之所有圖、表及所有參考文獻、專利及公開專利申請案之內容均以全文引用的方式明確併入本文中。
實例 實例1：muMabJC18之產生 製備 A.免疫原
使用Pierce Imject Immunogen EDC套組，用mcKLH(目錄號77622)使獲自R&D systems之重組人類Dkk-1(rhuDkk-1)(目錄號1096-DK/CF，對應於C端與10X His標籤融合之人類Dkk-1之aas2-266)結合至KLH。KLH結合蛋白係藉由Genovac GmbH製備且用作產生次純系JC9H3(JC18)之融合的免疫原。
SEQ ID NO: 1人類Dkk1-(10His) aa序列
(呈 粗斜體 字體之胺基酸表示經純化蛋白質之實際N端)
MALGAAGATRVFVAMVAAALGGHPLLGVSATLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICVSSDQNHFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRHHHHHHHHHH
SEQ ID NO: 2人類Dkk1-(10His) nt序列
(核苷酸序列，其中呈 粗斜體 字體之核苷酸僅為當R&D不提供序列資訊時對序列之評估)
ATGGCTCTGGGCGCAGCGGGAGCTACCCGGGTCTTTGTCGCGATGGTAGCGGCGGCTCTCGGCGGCCACCCTCTGCTGGGAGTGAGCGCCACCTTGAACTCGGTTCTCAATTCCAACGCTATCAAGAACCTGCCCCCACCGCTGGGCGGCGCTGCGGGGCACCCAGGCTCTGCAGTCAGCGCCGCGCCGGGAATCCTGTACCCGGGCGGGAATAAGTACCAGACCATTGACAACTACCAGCCGTACCCGTGCGCAGAGGACGAGGAGTGCGGCACTGATGAGTACTGCGCTAGTCCCACCCGCGGAGGGGACGCAGGCGTGCAAATCTGTCTCGCCTGCAGGAAGCGCCGAAAACGCTGCATGCGTCACGCTATGTGCTGCCCCGGGAATTACTGCAAAAATGGAATATGTGTGTCTTCTGATCAAAATCATTTCCGAGGAGAAATTGAGGAAACCATCACTGAAAGCTTTGGTAATGATCATAGCACCTTGGATGGGTATTCCAGAAGAACCACCTTGTCTTCAAAAATGTATCACACCAAAGGACAAGAAGGTTCTGTTTGTCTCCGGTCATCAGACTGTGCCTCAGGATTGTGTTGTGCTAGACACTTCTGGTCCAAGATCTGTAAACCTGTCCTGAAAGAAGGTCAAGTGTGTACCAAGCATAGGAGAAAAGGCTCTCATGGACTAGAAATATTCCAGCGTTGTTACTGTGGAGAAGGTCTGTCTTGCCGGATACAGAAAGATCACCATCAAGCCAGTAATTCTTCTAGGCTTCACACTTGTCAGAGACAC CACC A TCACCACCATCACCATCATCAC
B.免疫及融合瘤產生
以50微克/劑/小鼠之KLH結合rhuDkk-1蛋白使Balb/c小鼠腹膜內免疫。重複此劑量3次歷經4週時段。在融合前2天及1天，使小鼠接受50 μg蛋白質之最終免疫增強物(final boost)。將脾臟淋巴細胞與非分泌型sp2/0骨髓瘤細胞株融合且進行HAT選擇，如先前所述(Galfre及Milstein,Methods Enzymol 73 3-46(1981))。回收分泌Dkk1專一性IgG之融合瘤，次選殖且使用下述檢定來偵測。
Dkk-1專一性(ELISA檢定)
A.偵測
使用以下基於ELISA之方法偵測Dkk-1專一性抗體。將rhuDkk-1蛋白(R＆D systems目錄號1096 DK/CF)於塗佈緩衝液(Sigma碳酸鹽/碳酸氫鹽塗佈緩衝液(pH 9.6)，目錄號C-3041，根據製造商說明書構成)稀釋至1 μg/ml。向Nunc Maxisorp 96孔盤中每孔添加100 μl Dkk-1，且在4℃下培育隔夜。在室溫下，以250微升/孔之洗滌緩衝液(含0.05%(v/v)Tween-20(Sigma目錄號P2287)、無Ca/Mg++之dPBS(Sigma目錄號D8537))洗滌各孔4次，接著以200微升/孔之阻斷緩衝液(含1% PVA(Sigma目錄號363170)(重量/體積)之dPBS(Sigma目錄號D8537))阻斷2小時。接著藉由快速傾析移除阻斷緩衝液。藉由連續2倍連續稀釋於阻斷緩衝液中來稀釋抗體且以每孔100 μl塗覆於各盤。在室溫下培育各盤1小時且接著如上所述進行洗滌。
藉由添加對抗體物質具有專一性之二次抗體來測定測試抗體與Dkk之結合。當測試鼠類抗體時，使用100微升/孔之HRP結合山羊抗小鼠IgG(H＆L)，其以1比4000稀釋於阻斷緩衝液(Jackson ImmunoResearch目錄號115-035-146)中。當測試人類化抗體時，使用100微升/孔之HRP結合山羊抗人類IgG F(ab')2，其以1比4000稀釋於阻斷緩衝液(Jackson ImmunoResearch目錄號109-035-097)中。在室溫下培育該等盤30分鐘，接著如上所述洗滌2次。每孔添加100 μl新鮮製備之底物(KPL ABTS過氧化酶底物，2組分，目錄號50-62-00，根據製造商說明書製備)，且使其顯色。顯色後，量測在405 nm及490 nm下之盤吸光率。以在兩種波長下吸光率之差的形式呈現吸光率值。JC18顯示結合於rhuDkk-1，達5 μg/ml。
B.結合於其他人類Dkk同系物之專一性
使用上述ELISA方案，但亦以重組人類Dkk3(R&D systems目錄號1118-DK/CF)及Dkk4(R&D systems目錄號1269-DK/CF)塗佈各盤來評估JC18結合於其他人類Dkk蛋白之能力。JC18顯示與人類Dkk-4之弱結合且不結合於人類Dkk-3，達5 μg/ml。
C.物種交叉反應性
使用上述ELISA方案，但亦以重組大鼠Dkk-1(R&D systems目錄號4010-DK/CF)、小鼠Dkk-1(R&D systems目錄號1765-DK/CF)、小鼠Dkk-2(R&D systems目錄號2435-DK/CF)及小鼠Dkk-4(R&D systems目錄號3105-DK/CF)塗佈各盤來評估JC18結合於其他物種Dkk蛋白之能力。JC18顯示：(1)與小鼠及大鼠Dkk-1之結合類似於與人類Dkk-1之結合，達5 μg/m1；(2)不結合於小鼠Dkk-2，達5 μg/ml；及(3)與小鼠Dkk-4之弱結合，達5 μg/ml。
選殖及定序
使用QIAshredder離心柱使一百萬個融合瘤細胞均質化且根據來自QIAGEN之RNAeasy Mini套組提取全部RNA。使用來自Invitrogen之SuperScript III RT套組合成cDNA。使用來自Novagen之小鼠IgG引子組(IgG-Primer Sets)(其由用於選殖小鼠IgG重鏈基因及小鼠κ或λ輕鏈之簡併引子組成)選殖Dkk-1抗體之可變區。PCR循環條件如下：在94℃下歷時2分鐘，1個循環；在94℃下歷時30秒，五個循環，在44℃下歷時30秒及在68℃下歷時60秒；隨後在94℃下歷時30秒，25個循環；在54℃下歷時30秒及在68℃下歷時60秒。將所得PCR產物選殖於來自Invitrogen之Topo-TA選殖載體中且加以定序。藉由對所選殖抗體序列及自腹水產生之初始抗體進行質譜(MS)分析進行直接比較來確認所選殖之抗體序列。
下文提供JC18野生型(小鼠)單株抗體之可變區之輕鏈及重鏈的核苷酸序列及預測胺基酸序列。
SEQ ID NO: 3 JC18輕鏈可變區nt序列
GACATTGTGTTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTGATGACTTTGGCTTAGTTTTATGAACTGGTTCCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAAGCAGGGATCCGGGGTCCCTGCCAGGTTTAGGGGCAGTGGGTCTGGGTCAGACTTCAGCCTCACCATCCATCCTGTGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGAGGTTCCTCCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
SEQ ID NO: 4 JC18輕鏈可變區aa序列
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDDFGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASKQGSGVPARFRGSGSGSDFSLTIHPVEEDDTAMYFCQQSKEVPPTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO： 5 JC18輕鏈可變區CDR1 nt序列
AGA GCC AGC GAA AGT GTT GAT GAC TTT GGC ATT AGT TTT ATG AAC
SEQ ID NO: 6 JC18輕鏈可變區CDR1 aa序列
RASESVDDFGISFMN
SEQ ID NO: 7 JC18輕鏈可變區CDR2 nt序列
GCT GCA TCC AAG CAG GGA TCC
SEQ ID NO: 8 JC18輕鏈可變區CDR2 aa序列
AASKQGS
SEQ ID NO: 9 JC18輕鏈可變區CDR3 nt序列
CAG CAA AGT AAG GAG GTT CCT CCC ACG
SEQ ID NO: 10 JC18輕鏈可變區CDR3 aa序列
QQSKEVPPT
SEQ ID NO: 11 JC18重鏈可變區nt序列
GAAGTGAAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAATTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTGGTGGTGGTGACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGTCAGGAACATCCTCTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAACATCCCTTGAGAACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAATCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 12 JC18重鏈可變區aa序列
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVASISGGGDTYYPDSVKGRFTISRDNVRNILYLQMSSLRSEDTAMYYCATSLENYAMDYWGQGTSITVSS
SEQ ID NO: 13 JC18重鏈可變區CDR1 nt序列
AAT TAT GCC ATG TCT
SEQ ID NO: 14 JC18重鏈可變區CDR1 aa序列
NYAMS
SEQ ID NO: 15 JC18重鏈可變區CDR2 nt序列
TCC ATT AGT GGT GGT GGT GAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGC
SEQ ID NO: 16 JC18重鏈可變區CDR2 aa序列
SISGGGDTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 17 JC18重鏈可變區CDR3 nt序列
TCC CTT GAG AAC TAT GCT ATG GAC TAC
SEQ ID NO: 18 JC18重鏈可變區CDR3 aa序列
SLENYAMDY
實例2：產生及測試經由muMabJC18突變獲得之人類化抗Dkk-1單株抗體(huMabJC18) 人類化抗體及其變異體之結合親和力測定
此實例中所用之一般方法：
A.純系表徵中所用之表現載體
抗體之Fab片段的表現係在類似於以下文獻中所述者之IPTG誘導性lacZ啟動子控制下進行：Barbas(2001)Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor,NY,Cold Spring Harbor Laboratory Press pg.2.10. Vector pComb3X，然而修飾包括添加及表現以下額外結構域：IgG2a人類免疫球蛋白之人類K輕鏈恆定域及CHI恆定域。Igγ-2鏈C區，蛋白質寄存編號P01859；免疫球蛋白k輕鏈(智人)，蛋白質寄存編號CAA09181。
B.小規模Fab製備
如下進行96孔盤中Fab之小規模表現。以用Fab文庫轉型之大腸桿菌為起始物，挑選群落以接種母盤(瓊脂LB+安比西林(50 μg/ml)+2%葡萄糖)與運作盤(2毫升/孔，96孔/盤，含有1.5 mL LB+安比西林(50 μg/ml)+2%葡萄糖)。使兩個盤均在30℃下生長8-12小時。在4℃下儲存母盤，且在5000 rpm下集結運作盤之細胞，且用1 mL LB+安比西林(50 μg/ml)+1 mM IPTG再懸浮以誘導Fab表現。
在30℃下表現5小時之時間後藉由離心收集細胞，接著再懸浮於500 μL緩衝液HBS-EP(100 mM HEPES緩衝液(pH 7.4)，150 mM NaCl，0.005% P20)中。藉由一個冷凍(-80℃)接著解凍(37℃)之循環來達成HBS-EP再懸浮細胞之溶解。在5000 rpm下離心細胞溶胞物30分鐘以使細胞碎片與含有Fab之上清液分離。使用96孔Multiscreen HTS濾板(Millipore，目錄號MSFBN6B50)過濾上清液。接著將上清液注入BIAcore電漿共振裝置中以獲得各Fab之親和力資訊。自母盤救援出表現Fab之純系以將DNA定序且用於如下所述之大規模Fab製造及詳細表徵。
C.大規模Fab製備
為獲得詳細動力學參數，使Fab表現且自大培養物純化。以5 mL來自所選Fab表現大腸桿菌純系之隔夜培養物接種含有200 mL LB+安比西林(50 μg/ml)+2%葡萄糖之錐形瓶。在30℃下培育純系直至達成1.0之OD550nm 為止，且接著藉由以200 ml LB+安比西林(50 μg/ml)+1 mM IPTG置換培養基加以誘導。在30℃下表現5小時之時間後，藉由離心使細胞集結，接著再懸浮於10 mL PBS(pH 8)中。藉由兩個冷凍/解凍(分別在-80℃及37℃)循環達成細胞溶解。
將細胞溶胞物之上清液載入以PBS(pH 8)平衡之Ni-NTA超流瓊脂糖(Qiagen,Valencia. CA)柱上，接著以5管柱體積之PBS(pH 8)洗滌。以PBS(pH 8)+300 mM咪唑使個別Fab溶入於今同一離子中。將含有Fab之溶離份彙集且於PBS中透析，接著藉由ELISA定量，隨後進行親和力表徵。
D.全抗體製備
為表現全抗體，將重鏈及輕鏈可變區選殖於哺乳動物表現載體中且使用脂質轉染胺轉染至HEK 293細胞中以便短暫表現。
使用標準方法，用蛋白質A純化抗體。
BIAcore檢定：
藉由使用配備有CM5感測器晶片(BIAcore AB,Uppsala,Swede)之BlAcore3000TM 表面電漿共振(SPR)系統(BIAcore Inc.,Piscataway,NJ)測定huMabJC18對人類、小鼠或大鼠Dkk1之親和力。為進行huMabJC18-人類Dkk1相互作用分析，藉由huMabJC18與三個流槽(Fc2、Fc3及Fc4)之胺偶合產生反應表面。根據供應商說明書以N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化CM5晶片。將huMabJC18 IgG稀釋於10 mM乙酸鈉(pH 4.0)中且以30 μg/ml之濃度注射至活化之晶片上。
使用穿過個別晶片通道之可變流動時間，達成一系列抗體密度：200-800反應單位(RU)。接著用山羊Fab2抗人類Fc(Cappel 55053)使IgG及參考表面飽和以防止Dkk-1非專一性結合於晶片表面。接著以乙醇胺阻斷晶片。在25℃下，用由HBS-EP(0.01 M HEPES(pH 7.4)、0.15 NaCl、3 mM EDTA、0.005%界面活性劑P20)+2 mg/ml BSA+2 mg/ml CM聚葡萄糖構成之BIAcore運作緩衝液執行檢定。以100 μL/min注射以30.9 nM經純化人類Dkk1(R&D Systems)蛋白起始之五成員三倍連續稀釋液歷時1.5分鐘，且監測解離歷時8小時。藉由使用BIAevaluation程式將數據擬合至1:1朗繆爾(Langmuir)結合模型(Karlsson,R. Roos,H. Fagerstam,L. Petersson,B.(1994). Methods Enzymology 6. 99-110)而同時獲得動力學締合速率(kon )及解離速率(koff )。以koff /kon 形式計算平衡解離常數(KD)值。
為進行huMabJC18與小鼠或大鼠Dkk-1之相互作用分析，藉由預固定於CM5晶片表面之山羊Fab2抗人類Fc將低含量huMabJC18(通常100-400個反應單位)捕捉於個別流槽上。不含有人類化抗體之山羊Fab2抗人類Fc飽和流槽充當參考通道。分別使用70.1 nM或30.2 nM作為三倍連續稀釋之上限濃度，在晶片上滴定小鼠或大鼠Dkk-1(R&DSystems)。在100 μL/min下監測締合期及解離期分別歷時90秒及30分鐘。所有實驗之捕捉表面均用兩次30秒之0.75 mM H3 PO4 脈衝來再生，但人類Dkk-1實驗中所用之胺偶合huMabJC18表面除外(其不再生)。
雙參考(double-reference)結合反應且使用BiaEvaluation v.4.0軟體全擬合至簡單模型。由動力學速率常數之商(KD =koff /kon )推斷親和力。
對於測定huMabJC18變異體對人類Dkk1之結合及解離速率的篩選檢定，使用BIAcore或ProteOn XPR36(BioRad,Inc.)系統。對於BIAcore檢定，根據供應商說明書將生物素標記之人類Dkk1捕捉於SA(抗生蛋白鏈菌素)BIAcore晶片上。將生物素標記之人類Dkk-1蛋白稀釋於HBS-EP中，且以5 μg/mL之濃度注射至晶片上。選擇穿過個別晶片通道之流動時間以達成約500-600反應單位(RU)之抗原密度。使用HBS-EP緩衝液作為運作緩衝液。在高溫(37℃)下以30 μl/min注射經過濾之重組大腸桿菌細胞溶胞物歷時1分鐘，允許有1至5分鐘解離期。以8 mM NaOH+8%乙醇使表面再生。在實驗開始時及又在檢定結束時注射陽性對照物Fab(純系24)兩次以評估再現性。
對於ProteOn檢定，注射連續稀釋倍數憑經驗測定之生物素標記之人類Dkk-1歷時1分鐘以在ProteOn NLC Neutravidin感測器晶片之五個通道上產生不同程度之固定(150-3000 RU)。保持第六通道未經改變充當參考表面。在高溫(37℃)下以20 μl/min注射含重組Fab之經過濾大腸桿菌溶菌液歷時50秒。運作緩衝液係由PBS+1 mg/ml BSA+0.005% Tween-20組成。ProteOn經組態使得各注射液在五個Dkk-1通道各者以及參考通道上方流動，且可同時注射六個Fab樣品。監測Fab自Dkk-1表面之解離歷時20分鐘。注射8% EtOH、8 mM NaOH 30秒來再生晶片表面。將純系24Fab用作對照物。不同配位體通道之間各純系在締合期間之結合量，及解離速率極其一致。
huMabJC18及其變異體對Dkk1之結合親和力
hu MabJC18之胺基酸序列係如SEQ ID NO: 40(HC可變區)及SEQ ID NO: 42(LC可變區)所述。使用如上所述之BIAcore測定的huMabJC18 IgG對Dkk-1之結合親和力於下表3中展示。
*締合速率過快以致不能量測
^解離速率過慢以致不能量測
KD =koff /kon
T1/2 (s)=ln2/koff (1/s)
huMabJC18變異體之CDR的胺基酸序列於下表4中展示。表4中所示之所有胺基酸取代均係相對於huMabJC18之序列來描述。huMabJC18及其變異體之hDkk-1結合親和力亦於表4中展示。
在表4中，#表示在彼(彼等)位置之間隙；n.d.，未測定。
CDR為延伸CDR，其包括Kabat與Chothia定義，但CDR H1為Kabat定義。將胺基酸殘基依次編號(參看SEQ ID NO: 28關於H2及H3行中殘基之編號，及SEQ ID NO: 20關於L1、L2及L3行中殘基之編號)。所有純系均具有構架且CDR H1序列與huMabJC18一致。KD =koff /kon 。以篩選模式測定所有koff 值，但加下劃線者係藉由整體分析流經捕捉於BIAcore晶片或ProteOn表面上之IgG的hDkk-1濃度系列來獲得。因此加下劃線之KD 值藉由量測kon 而以實驗方式測定。其他KD 值為基於1×106 (1/Ms)之kon 評估值的理論值。因為所有經分析之純系的締合速率均極快且因此擴散受限(>1×106 ，且過快以致不能精確量測)，所以親和力極可能甚至高於所示值。
huMabJC18與Dkk同系物之相互作用
針對結合於其他可得Dkk同系物(包括人類Dkk-3、人類Dkk-4、小鼠Dkk-2及小鼠Dkk-4(R&D Systems))來分析HuMabJC18。結果於表5中概述。
*締合速率過快以致不能量測
^解離速率過慢以致不能量測
如上所述使用山羊Fab2抗人類Fc作為預固定捕捉試劑進行對huMabJC18與Dkk-1同系物之相互作用分析。在五倍連續稀釋中，分別使用76.3 nM、88.8 nM或32.3 nM作為上限濃度，在晶片上滴定人類Dkk-4、小鼠Dkk-2或小鼠Dkk-4。人類Dkk-3顯示無專一性結合反應。
JC18 Dkk-1結合抗體
如在25℃下藉由BIAcore分析所測定之小鼠抗體JC18與人類、小鼠或大鼠Dkk1(R＆D System)之結合親和力於下表6中展示。對於此檢定，使多株抗小鼠IgG與BIAcore晶片胺偶合。抗Dkk-1抗體JC18為6.53 μg/mL，且在5 μl/min下經捕捉1分鐘。以50-100 μl/min注射人類、小鼠或大鼠Dkk-1之五倍連續稀釋液(R＆D Systems；0.4-250 nM)歷時1分鐘。監測解離歷時3-5分鐘。用兩次30秒之100 mM H3 PO4 脈衝使晶片再生。
h uMabJC18之序列
SEQ ID NO: 19huMabJC18輕鏈可變區nt序列
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAGCGGGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACGACTTCGGCATCAGCTTCATCAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTCATCTACGCCGGCAGCAAGCAGGGCAGCGGCATCCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTCGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCTGAAAGAGGTGCCCCCCACCTTCGGCGGTGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
SEQ ID NO: 20 huMabJC18輕鏈可變區aa序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDDFGISFINWYQQKPGQAPRLLIYAGSKQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQLKEVPPTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 21 huMabJC18輕鏈可變區CDR1 nt序列
CGGGCCAGCGAGAGCGTGGACGACTTCGGCATCAGCTTCATCAAC
SEQ ID NO: 22 huMabJC18輕鏈可變區CDR1 aa序列
RASESVDDFGISFIN
SEQ ID NO: 23 huMabJC18輕鏈可變區CDR2 nt序列
GCCGGCAGCAAGCAGGGCAGC
SEQ ID NO: 24 huMabJC18輕鏈可變區CDR2 aa序列
AGSKQGS
SEQ ID NO: 25 huMabJC18輕鏈可變區CDR3 nt序列
CAGCAGCTGAAAGAGGTGCCCCCCACC
SEQ ID NO: 26 huMabJC18輕鏈可變區CDR3 aa序列
QQLKEVPPT
SEQ ID NO: 27 huMabJC18重鏈可變區nt序列
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATCAGCTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCAGCGTGAGCGGCACCGGCCTGGGCTTCCAGACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCTCCCTGGAAAACTACGCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 28 huMabJC18重鏈可變區aa序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAISWVRQAPGKGLEWVASVSGTGLGFQTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATSLENYAFDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 29 huMabJC18重鏈可變區CDR1 nt序列
AGCAGCTACGCCATCAGC
SEQ ID NO: 30 huMabJC18重鏈可變區CDR1 aa序列
SSYAIS
SEQ ID NO: 49 huMabJC18重鏈可變區CDR1 aa序列(Kabat)
SYAIS
SEQ ID NO: 50 huMabJC18重鏈可變區CDR1 aa序列(Chothia)
GFTFSSY
SEQ ID NO: 31 huMabJC18重鏈可變區CDR2 nt序列
AGCGTGAGCGGCACCGGCCTGGGCTTCCAGACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGC
SEQ ID NO: 32 huMabJC18重鏈可變區CDR2 aa序列
SVSGTGLGFQTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 51 huMabJC18重鏈可變區CDR2 aa序列(Chothia)
SVSGTGLGFQTY
SEQ ID NO: 33 huMabJC18重鏈可變區CDR3 nt序列
TCCCTGGAAAACTACGCCTTCGACTAC
SEQ ID NO: 34 huMabJC18重鏈可變區CDR3 aa序列
TSLENYAFDY
SEQ ID NO: 52 huMabJC18重鏈可變區CDR3 aa序列(短)
SLENYAFDY
有前導序列 之SEQ ID NO: 35 huMabJC18重鏈nt序列
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATCAGCTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCAGCGTGAGCGGCACCGGCCTGGGCTTCCAGACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCTCCCTGGAAAACTACGCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGCTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCATCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
有前導序列 之SEQ ID NO: 36 huMabJC18重鏈aa序列(*Δa突變(A329S、P330S)以 粗斜體 展示)
MEWSWVFLFFLSVTTGVHS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAISWVRQAPGKGLEWVASVSGTGLGFQTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATSLENYAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP SS IEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
糖基化位點：HC、N296。
有前導序列 之SEQ ID NO: 37 huMabJC18輕鏈nt序列
ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGATGCCAGATGT GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAGCGGGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACGACTTCGGCATCAGCTTCATCAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTCATCTACGCCGGCAGCAAGCAGGGCAGCGGCATCCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTCGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCTGAAAGAGGTGCCCCCCACCTTCGGCGGTGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
有前導序列 之SEQ ID NO: 38 huMabJC18 κ輕鏈aa序列
MSVPTQVLGLLLLWLTDARC EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDDFGISFINWYQQKPGQAPRLLIYAGSKQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQLKEVPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
huMabJC18之同型：IgG2(Δa)*、κ
huMabJC18之異型：G2(n-)、Km3
無前導序列之SEQ ID NO: 39 huMabJC18重鏈nt序列
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATCAGCTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCAGCGTGAGCGGCACCGGCCTGGGCTTCCAGACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCTCCCTGGAAAACTACGCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGCTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCATCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
無前導序列之SEQ ID NO: 40 huMabJC18重鏈aa序列(*Δa突變(A329S、P330S)以 粗斜體 展示)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAISWVRQAPGKGLEWVASVSGTGLGFQTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATSLENYAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
糖基化位點：HC、N296。
無前導序列之SEQ ID NO: 41 huMabJC18輕鏈nt序列
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAGCGGGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACGACTTCGGCATCAGCTTCATCAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTCATCTACGCCGGCAGCAAGCAGGGCAGCGGCATCCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTCGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCTGAAAGAGGTGCCCCCCACCTTCGGCGGTGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
無前導序列之SEQ ID NO: 42 huMabJC18 κ輕鏈aa序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDDFGISFINWYQQKPGQAPRLLIYAGSKQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQLKEVPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
實例3：huMabJC18之活體外功能活性：在基於細胞之功能檢定中測定JC18在Wnt活性中之作用
選擇含有在具有TCF結合位點之TK啟動子控制下之螢光素酶報導基因的穩定U2OS細胞株(U2OS TF)用於基於細胞之功能檢定。當以Wnt3a條件培養基處理細胞時，經由Wnt信號傳導路徑活化啟動子。此活化由Dkk-1拮抗。Wnt信號傳導之Dkk-1介導抑制又可藉由添加Dkk-1中和mAb來逆轉。
特定言之，JC18為以高親和力結合於小鼠及人類Dkk-1之單株抗體。在U2OS TOPFlash細胞中檢驗其逆轉Dkk-1抑制Wnt 3a信號傳導之能力。U2OS細胞獲自ATCC且以TOPFlash質體(Upstate)、TCF-螢光素酶報導構築體穩定轉染。將細胞在37℃、5% CO2 下維持於補充有10%胎牛血清、1% Pen Strep及2 mM麩醯胺酸之McCoys 5A培養基中。將U2OS TOPFlash細胞以每平方公分31,250個細胞之密度接種於常規生長培養基中，且培育隔夜。以含0.25 μg/ml rhDkk-1蛋白或媒劑(PBS、Gibco)及不同濃度之Dkk-1 mAb之Optimem(Gibco)處理細胞。在隔夜培育之後，以報導基因溶解緩衝液(Promega)溶解細胞且使用螢光素酶試劑(Promega)定量螢光素酶表現。
HuMabJC18，即完全人類化抗Dkk-1 mAb在功能檢定中以1.3 nM之IC50顯示良好功效(表7)。
實 例4：活體內評價muMabJC18及小鼠嵌合體之骨骼功效
使用雌性成年C57BL/6小鼠評價測試Dkk-1抗體之活體內骨骼作用。在24℃下，以12小時光/12小時暗循環來圈養動物，且允許其自由獲取水及商業膳食(Purina laboratory Rodent Chow 5001,Purina-Mills,St. Louis,MO)。根據Pfizer動物管理許可方案來進行實驗，且根據實驗動物管理及使用ILAR(實驗動物研究院(Institute of Laboratory Animal Research))指南來供養動物。以媒劑或抗體藉由每週一或兩次經口管飼歷時數週來處理小鼠。在研究結束時，對小鼠施以安樂死且收集血清以便量測游離抗體及游離Dkk-1含量。另外，收集骨骼樣品以便藉由周邊定量電腦斷層攝影術(pQCT)、微CT及組織形態測定法(histomorphometry)來評估骨質及骨形成之變化。
由pQCT(Stratec XCT Research M；Norland Medical Systems,Fort Atkison,WI,USA)用5.40版軟體掃描右股骨。在遠端附近2.5 mm處(距生長板(疏鬆骨富集部位)約1.5 mm)取各遠端股骨(distal femur)幹骺端之1 mm厚之橫截面，且在遠端附近8 mm處(皮質骨富集部位)取各股骨骨幹之1 mm厚之橫截面，體元尺寸為0.10 mm。測定全部骨骼、骨小樑且皮質骨之以體積計含骨量、密度及面積。
由微CT機(Micro-CT40,Scanco Medical,Auenring 6-8,Bassersdorf,Switzerland)，用3.1版軟體掃描右股骨。在遠端附近2.3至3.1 mm處(距生長板約1.3至2.1 mm)取遠端股骨幹骺端橫截面(總共50片，厚度各自為16 μm，總厚度=0.8 mm)以便測定骨小樑體積。
處理左股骨以便對疏鬆骨進行組織形態評估(histomorphometric assessment)。簡言之，使左股骨在梯度濃度之乙醇中脫水且未脫鈣便包埋於甲基丙烯酸甲酯中。使用Reichert-Jung Polycut S切片機(Leica Corp.,Heidelberg,Germany)將遠端股骨之縱向額切面切為4 μm及10 μm厚。以經改良之馬森三色染劑(modified Masson's Trichrome stain)將4 μm切片染色且10 μm切片保持不染色。所有組織形態量測均使用影像分析系統(Osteomeasure,Inc.,Altanta,GA)在遠端股骨幹骺端之疏鬆骨組織中、在生長板-骨骺接合點附近0.375 mm與0.875 mm之間的區域中進行。以4 μm厚經染色切片以骨組織面積之百分比量測疏鬆骨體積及以全部疏鬆骨周長之百分比量測蝕骨細胞表面。計算小樑數目、厚度及間隔。在10 μm厚之未染色切片中獲得基於螢光染料之骨形成指數，包括含雙螢光染料標記之疏鬆骨表面(礦化表面)之百分比、礦物質沈積率、骨形成速率(骨表面及組織體積指示物)。
完整小鼠模型中之研究方案及結果
A.抗小鼠Dkk-1單株抗體(JC18)在完整小鼠模型中之作用
對雌性成年C57BL/6小鼠每週一次經口給予媒劑或小鼠IgG1或JC18(10、30及60 mg/kg)歷時6週。在屍體解剖時自各小鼠收集右股骨與左股骨。使用pQCT分析右股骨且使用組織形態量測法分析左股骨。遠端股骨之總BMD在所有劑量之JC18處理下均顯著提高(圖1A)。JC18在小鼠中在60 mg/kg劑量下亦顯著提高骨形成速率(圖1B)。
B.Dkk-1單株抗體之小鼠嵌合體(小鼠嵌合體-嵌合人類-小鼠抗體)在完整小鼠模型中之作用
以0、0.001、0.01、0.1、1、3、10及30 mg/kg小鼠嵌合體每週處理4個月之完整雌性C57BL/6小鼠歷時6週。以5 mg/kg小鼠嵌合體每週處理一組小鼠兩次歷時6週。使用pQCT分析各動物之右遠端股骨。如圖2中所示，相較於媒劑處理，小鼠嵌合體在1至30 mg/kg之劑量下提高總BMD。
SEQ ID NO: 43嵌合抗體(hu-mu)：嵌合huMabJC18Lvar-小鼠κ aa序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDDFGISFINWYQQKPGQAPRLLIYAGSKQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQLKEVPPTFGGGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO: 44嵌合抗體(hu-mu)：嵌合huMabJC18Hvar-小鼠IgG1恆定aa序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAISWVRQAPGKGLEWVASVSGTGLGFQTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATSLENYAFDYWGQGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO: 45嵌合抗體(hu-mu)：huMabJC18Lvar nt序列
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAGCGGGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACGACTTCGGCATCAGCTTCATCAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTCATCTACGCCGGCAGCAAGCAGGGCAGCGGCATCCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTCGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCTGAAAGAGGTGCCCCCCACCTTCGGCGGTGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
SEQ ID NO: 46嵌合抗體(hu-mu)：小鼠κ nt序列
GCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG
SEQ ID NO: 47嵌合抗體(hu-mu)：huMabJC18Hvar nt序列
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATCAGCTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCAGCGTGAGCGGCACCGGCCTGGGCTTCCAGACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCTCCCTGGAAAACTACGCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 48嵌合抗體(hu-mu)：小鼠IgG1 CH1-CH2-CH3 nt序列
GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGAACACGAATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA
C.卵巢切除之小鼠模型
對雌性成年C57BL/6小鼠進行假手術或卵巢切除(OVX)手術以便評價測試Dkk-1抗體在模擬停經後骨質流失之雌激素缺乏情況中之骨骼作用。在24℃下，以12小時光/12小時暗循環來圈養動物，且允許其自由獲取水及商業膳食(Purina laboratory Rodent Chow 5001,Purina-Mills,St. Louis,MO)。根據Pfizer動物管理許可方案來進行實驗，且根據實驗動物管理及使用ILAR(實驗動物研究院)指南來供養動物。以媒劑或抗體藉由每週一或兩次經口管飼歷時數週來處理小鼠。在研究結束時，對小鼠施以安樂死且收集骨頭樣品以便藉由周邊定量電腦斷層攝影術(pQCT)、微CT及組織形態測定法評估骨質變化。此等量測之方法已於先前章節中描述。
研究方案及結果
在OVX小鼠模型中，抗小鼠Dkk-1單株抗體(JC18)預防雌激素缺乏所誘導之骨質流失。
對4個月大之雌性C57BL/6小鼠進行假手術或卵巢切除(OVX)手術且手術次日開始以媒劑或JC18(0.3、1、3、10及30 mg/kg，每週)或JC18(15 mg/kg，每週兩次)處理8週。如所預期，經媒劑處理之小鼠在OVX後8週如由總BMD顯著降低所證明展現骨質減少(圖3)。如由pQCT在遠端股骨處所量測，相較於對OVX小鼠之媒劑處理，JC18劑量回應地使總BMD提高7%至20%。在每週兩次用15 mg/kg JC18處理之小鼠中，總BMD不僅高於以媒劑處理之OVX小鼠，而且亦維持在假控制級，表明在此劑量及給藥方案下，JC18完全預防OVX小鼠骨質減少之發展(圖3)。
實例5：huMabJC18在完整大鼠模型中提高骨質
使成年雌性大鼠每週一次接受靜脈內投與0、0.1、1、10或100 mg/kg huMabJC18歷時6週。在處理後2週，在以1、10及100 mg/kg huMabJC18處理之大鼠中，血清骨鈣化素(骨形成生物標誌)分別提高30%、26%及25%，且其與處理後4週之對照值無差別。血清CTX(骨吸收標誌)在處理之後不顯示一致變化。血清生物標誌之此等變化支持huMabJC18對骨骼之同化作用。在以10 mg/kg及100 mg/kg劑量之huMabJC18處理的大鼠中，遠端股骨BMD及股骨幹BMC(骨礦物質含量(bone mineral content))分別顯著提高11%及16%或7%及8%，表明此等動物疏鬆骨及皮質骨質增加。
實例6：瞭解與靶向可溶抗原Dkk-1(Wnt信號傳導路徑之拮抗劑)的單株抗體療法有關之系統動力學的方法：應用機構性臨床前藥物動力學/藥效學(PK/PD)模型選擇人類首次使用(FIH)IgG2抗體之起始劑量。
骨質疏鬆症為特徵在於低骨密度之骨疾病，其使得骨骼易碎且隨後引起骨折。大多數骨質疏鬆症藥物療法(包括雙膦酸鹽、抑鈣素、HRT及選擇性雌激素受體調節劑(SERM))藉由降低骨吸收來預防骨質流失。使罹患骨質疏鬆症之患者的骨質恢復為醫學需要未達成的領域。
Dkk-1結合於LRP5/6受體及Kremen-1/2輔受體促進受體複合物內化，使得Wnt信號衰減(Diarra等人，(2007) NatMed 13:156-163)。
關於Wnt路徑在維持骨質中之重要作用的遺傳證據來自對Wnt受體LRP5中活化與失活突變之鑑別。LRP5失活使得骨質降低且引起體染色體隱性基因病症：人類之骨質疏鬆症假神經膠質瘤(OPPG)症候群(Gong等人,(2001) Cell 107:513-523)及LRP5剔除小鼠之類似表型(Holmen等人,(2004) J Bone Miner Res 19:2033-2040)。
具有HBM之個體之骨折風險顯著降低。
預期中和Dkk-1抗體因由骨胚細胞之骨形成增加而增加骨質，且因此預防骨質疏鬆性骨折。HuMabJC18為用於治療骨質疏鬆症以及其他病症之人類化原型抗Dkk-1單株抗體。其以高親和力(Kd<100 pM)活體外結合人類、小鼠、大鼠及獼猴Dkk-1。其增加完整小鼠之骨質且使卵巢切除之小鼠(停經後骨質流失之模型)的骨質減少骨骼恢復骨質(Li等人,2009；準備中之手稿)。
儘管大量抗體處於開發中，但僅有少數使用臨床前資料來預測抗體之臨床藥物動力學或有效劑量之報導公開(Lobo等人,(2004) J Pharm Sci 93:2645-2668；Agoram,(2009) Br J Clin Pharmacol 67:153-160)。當預期線性PK時，異速生長動力模型常用於抗體藥物動力學(PK)之種間類推(interspecies scaling)(Wang等人,(2008) Clin Pharmacol Ther 84:548-558)。然而，不同於小分子，抗體與其標靶之相互作用常影響抗體之PK。藥物動力學(PK)與藥效學(PD)緊密關聯且瞭解PK/PD需要關於抗體、標靶及抗體-標靶相互作用之知識。最高值來自使PK與PD反應關聯以預測既定劑量後之藥物暴露及作用(Agoram等人,(2007) Drug Discov Today 12:1018-1024)。機構性PK/PD模型化因此提供預測抗體之人類PK及臨床上有效劑量的合理及有效手段。
在此研究中，在大鼠與猴中同時表徵抗體huMabJC18標靶(Dkk-1)使能夠深刻瞭解反應之藥物動力學及藥效學。其伴隨關於以下之知識:用於在臨床中機構性預測PK/PD之健康個體相對於患病個體中之標靶含量、標靶轉換率及抗體-標靶締合/解離速率。
研究目的在於比較及對比藉由以下計算獲得之抗Dkk-1 IgG2 抗體(huMabJC18)之預測臨床起始劑量：(1)毒物學物種中無不利作用量(NOAEL)，(2)使用經典達夫方程式(Duff equation)，最小之預期生物作用量(MABEL)，及(3)使用標靶介導藥物處置(TMDD)模型之MABEL。
使用大鼠及猴中之臨床前安全性研究來測定NOAEL。將100倍安全因數應用於NOAEL以產生推薦之起始劑量。使用經典達夫方程式來計算受體佔用率且MABEL係定義為產生10%受體佔用率之劑量。在大鼠及猴研究中使用TMDD模型擬合游離Dkk-1及抗體隨時間變化之濃度。將模型外推至人類且MABEL估計為得到Dkk-1降低10%之劑量。
測試物質
在Genovac(Germany)藉由以全長重組人類Dkk-1蛋白(R&D Systems,Minneapolis,MN)使Balb/C小鼠免疫來製得單株抗Dkk-1抗體。使用文庫掃描突變誘發策略(Pons等人,2009；準備中之手稿)使單一小鼠IgG1 /κ同型抗體(JC18)人類化及親和力成熟。相較於親本小鼠抗體，人類化抗體(huMabJC18)對於人類與小鼠Dkk-1均展現>100倍之親和力提高。
內部(in-house)選殖及表現Dkk-1動力學研究中所用之HDkk-1-V5-6His(人類)及rDkk-1-TEV-V5-6His(大鼠)，且藉由TOPFLASH檢定定性為功能性(Ai等人,2005)。
BIAcore實驗
使用配備有CM5感測器晶片之BIAcore 3000TM系統(BIAcore AB,Uppsala,Sweden)來分析huMabJC18與人類或小鼠或大鼠或獼猴Dkk-1之間的相互作用。在相互作用分析期間監測締合期及解離期。雙參考結合反應且使用BiaEvaluation v.4.0軟體全擬合至簡單模型。由動力學速率常數之商(K d =k off /k on )推斷親和力。
動物研究
所有動物研究係根據實驗動物管理及使用委員會(IACUC)批准之動物管理及使用方案進行。
大鼠中之Dkk-1動力學研究
以靜脈內單次劑量形式向雄性史泊格多利(Sprague Dawley)大鼠(n=3隻/劑)投與1、5、10及100 μg/kg之hDkk-1-V5-6His。在給藥前，及在給藥後0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8及24小時收集系列血液樣品。以靜脈內單次劑量形式向雄性史泊格多利大鼠(n=3隻/劑)投與100 μg/kg rDkk-1-TEV-V5-6His。在給藥前，及在給藥後0.083、0.17、0.33、0.5、1、2、4及6小時收集系列血液樣品(300 μl)。藉由離心獲得血清且儲存在-20℃下直至分析。
大鼠中之藥物動力學/藥效學研究
在雌性史泊格多利大鼠(n=40，在研究持續之過程中體重為250-350 g，Charles River Laboratories,Wilmington,MA)中進行實驗。每週一次藉由靜脈內途徑向雌性史泊格多利大鼠(n=8隻/劑)投與0.1、1、10及100 mg/kg之HuMabJC18歷時連續六週。向一組大鼠(n=8)投與媒劑對照物(20 mM組胺酸(pH 6.5)，含140 mM NaCl)。
在給藥前，及在第一次給藥後1、3、8、24、48、72、168、240、336、408、504、576、672、744、840、912及1008小時自各治療組收集系列血液樣品。藉由離心獲得血清且儲存在-20℃下直至分析Dkk-1及huMabJC18濃度。
大鼠中之骨密度測定
為評估抗Dkk-1 mAb治療對骨質之作用，由周邊定量電腦斷層攝影術(pQCT,Stratec XCT Research M,Norland Medical Systems,Fort Atkinson,WI)用5.40版軟體掃描切離之右股骨。在遠端附近2.5 mm處(疏鬆骨富集部位)掃描各遠端股骨幹骺端之1 mm厚之橫截面，體元尺寸為0.10 mm。以體積計之總骨密度(BMD)係如先前所述(Ke等人,2001年)來測定。
獼猴中之藥物動力學/藥效學研究
遵照美國動物福利法案(U.S. Animal Welfare Act)，及實驗動物管理及使用指南(實驗動物研究院，1996)中規定之條件進行此研究之動物管理及實驗程序。
在此研究中使用2至5歲大、重量在3.2 kg與5.2 kg之間的五隻雄性及五隻雌性獼猴(食蟹獼猴(Macaca fascicularis ))(Charles River Primates,BioResearch Facility,Houston,Texas)。將動物(n=1隻/性別/組)歸入5組。以單次劑量形式藉由緩慢靜脈內注射向4組(1隻雄性猴及1隻雌性猴)投與0.1、1、10或100 mg/kg劑量之HuMabJC18。以相同方式向其餘組投與媒劑對照物。
在治療前，及在給藥後0.1、0.5、1、3、8、24、48、72、168、240、336、408、504、576及672小時經由股骨靜脈穿刺自各治療組收集全血樣品(約2 ml)。藉由離心自全血分離血清，之後在-80℃下儲存樣品直至分析。稍後分析樣品之Dkk-1及huMabJC18濃度。
游離Dkk-1檢定
根據製造商說明書驗證Assay Designs(Ann Arbor,Michigan)人類Dkk-1 ELISA系統(目錄號900-151)以量測人類血清中之總Dkk-1，但具有以下微小改變：使用R&D Systems(Minneapolis,MN)重組人類Dkk-1(目錄號1096-dk-10/cf)作為檢定標準物。
為檢定大鼠及猴血清中之游離Dkk-1(未結合於治療抗體)，使用抗Dkk-1抗體捕捉未結合之血清Dkk-1，且根據套組說明書使用來自Assay Designs人類Dkk-1 ELISA系統(目錄號900-151)之試劑進行其餘步驟，但具有以下改變：分別使用R&D Systems(Minneapolis,MN)重組大鼠Dkk-1(目錄號4010-dk-10/cf)及人類Dkk-1(目錄號1096-dk-10/cf)作為大鼠及猴檢定之檢定標準物。
來自健康個體及患病個體之人類血清樣品係購自Bioreclamation Inc.(Nassau,NY)。
V5標記之Dkk-1檢定
藉由ELISA方法測定V5標記之Dkk-1的血清濃度。將樣品於PBS緩衝液(含有3% BSA及0.05% Tween-20)中稀釋至1/4至1/40之最終最小所需稀釋度(MRD)範圍，用以減小背景且使濃度能夠處於線性檢定範圍內(檢定盤上約0.195-25 ng/ml)。將hDkk-1-V5-6His或rDkk-1-TEV-V5-6His校正及品質控制標準物稀釋於與樣品相同之基質組合物中。在4℃下以50 μl 2 μg/ml抗V5抗體(Invitrogen,Carlsbad,CA)隔夜塗佈96孔免疫吸附檢定盤(Nalgene Nunc,Rochester,NY)，接著以含有0.05% Tween-20之PBS緩衝液洗滌，接著用含有3% BSA及0.05% Tween-20之PBS緩衝液阻斷。將經稀釋樣品及標準物添加至盤(50微升/孔)中且在震盪下在室溫下培育1小時。接著以兩個洗滌循環洗滌該等盤，隨後與辣根過氧化酶結合之抗Dkk-1二次抗體(來自Assay Designs套組,Ann Arbor,MI)一起培育1小時。在洗滌後，藉由以3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)受質(KPL,Gaithersburg,MD)進行呈色反應約10分鐘使盤顯色，接著用2 M H2 SO4 終止。在450 nm之波長下測定吸光率OD讀數之後，減去背景空白基質OD值(減去650 nm)。在SoftMax Pro 4.8中使用V5標記之Dkk-1校正標準物，使用4參數擬合，以均勻加權來建構標準曲線。據此標準曲線插入V5標記之Dkk-1於未知樣品中之血清濃度。
骨鈣化素檢定
藉由使用大鼠-MIDTM骨鈣化素ELISA套組(Rat-MIDTM Osteocalcin ELISA Kit)(Nordic Bioscience Diagnostics A/S,Herlev,Denmark)量測血清骨鈣化素濃度。
大鼠PK/PD樣品之游離/部分游離huMabJC18抗體檢定
藉由電致化學發光(ECL)方法，使用Meso Scale Discovery(MSD)系統(Gaithersburg,MD)來測定huMabJC18之血清濃度。將樣品於含有1% BSA之PBS緩衝液中稀釋至1/2至1/150之最終最小所需稀釋度(MRD)，隨後額外10-4000倍稀釋以減小背景干擾且處於線性檢定範圍內(檢定盤上約5-1300 ng/ml)。將HuMabJC18校正及品質控制標準物稀釋於與樣品相同之基質組合物中。在4℃下以5 μg/ml hDkk-1-V5-6His(內部產生)隔夜塗佈96孔MSD高結合盤(目錄號L11XB-3)。在倒置該盤以移除塗料之後，以含1%BSA之PBS阻斷各盤。將經稀釋樣品及標準物添加至盤(25微升/孔)中且在震盪下在室溫下培育2小時。接著以三個洗滌循環用含有0.05% Tween-20之PBS緩衝液洗滌各盤，隨後與MSD標記釕(ruthinylated)之山羊抗人類IgG抗體(目錄號R32AJ-1)一起培育1小時。在洗滌後，將含界面活性劑之MSD讀取緩衝液T(4x)(目錄號R92TC-1)添加至各孔中，且立即在MSD Sector成像器6000上讀取。自樣品值減去背景空白基質值。在MSD Discovery Workbench 3.0版軟體中使用抗Dkk-1人類化抗體校正標準物，使用4參數擬合，以1/y2 加權來建構標準曲線。據此標準曲線插入抗Dkk-1人類化抗體於未知樣品中之血清濃度。
猴樣品之游離/部分游離huMabJC18抗體檢定
藉由ELISA方法測定huMabJC18之血清濃度。將樣品於PBS緩衝液(含有3% BSA及0.05% Tween-20)中稀釋至1/4至1/100之最終最小所需稀釋度(MRD)，接著額外10-500倍稀釋以減小背景干擾且處於線性檢定範圍內(檢定盤上約8-100 ng/ml)。將HuMabJC18校正及品質控制標準物稀釋於與樣品相同之基質組合物中。在4℃下以1.5 μg/ml hDkk-1-V5-6His(內部產生)隔夜塗佈96孔免疫吸附檢定盤，且接著在以含有0.05% Tween-20之PBS緩衝液洗滌之後以PBS(含有3% BSA及0.05% Tween-20)阻斷。將經稀釋樣品及標準物添加至盤(100微升/孔)中且在震盪下在室溫下培育1小時。接著以三個洗滌循環洗滌該等盤，隨後與生物素標記之小鼠抗人類IgG2 (Invitrogen,Carlsbad,CA)一起培育1小時，之後添加辣根過氧化酶結合之抗生蛋白鏈菌素(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)，且將盤再培育30分鐘。在洗滌後，藉由以3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)受質進行呈色反應約10分鐘使盤顯色，接著用2 M H2 SO4 終止。在450 nm之波長下測定吸光率OD讀數之後，減去背景空白基質OD值(減去650 nm)。在SoftMax Pro 4.8 中使用抗Dkk-1人類化抗體校正標準物，使用4參數擬合，以均勻加權來建構標準曲線。據此標準曲線插入抗Dkk-1人類化抗體於未知樣品中之血清濃度。
抗藥物抗體(ADA)檢定
以橋聯配位體結合檢定(LBA)，使用Meso Scale Discovery(MSD)平台(Gaithersburg,MD)量測大鼠及猴中針對huMabJC18之抗藥物抗體(ADA)之存在。將以檢定稀釋劑(3% BSA，0.05% Tween 20，PBS)1:10稀釋之血清樣品(25 μl)添加至塗有含1 μg/ml huMabJC18之pH 9.6碳酸鹽緩衝液的96孔MSD高結合盤中。在室溫下培育1小時之後，將盤洗滌且將25 μl標記釕之huMabJC18以1 μg/ml添加至各孔中，且在室溫下再培育1小時。將盤洗滌且在添加150 μl MSD讀取緩衝液(2×)之後，在MSD Sector成像器6000上讀取盤。
非房室模型藥物動力學分析
使用WinNonLin企業版電腦軟體5.2版(Pharsight Corp.,Cary,NC)進行藥物動力學分析。藉由對數血漿濃度時間概況之線性回歸來測定終末階段速率常數(k el )。由0.693/k el 計算終末消除半衰期(t 1/2 )。C max 、T max 及C min 值直接獲自所記錄之資料。使用線性梯形法則計算血清-濃度時間曲線下面積(AUC0-tlast )且使用k el 外推至無限(AUC0-inf. )。使用關係劑量/AUC0-inf 計算清除率(CL)。使用關係CL/k el 計算分佈容積(Vc)。Cave經計算為AUC(第1給藥時間間隔) /第1給藥時間間隔之tlast。
在大鼠之Dkk-1動力學研究中，針對h-Dkk-1提出之消除半衰期值為在5、10及100 μg/kg劑量下測定之半衰期值的平均值。可得之數據點不足以計算在1 μg/kg劑量下之消除半衰期值。對於r-Dkk-1，由在100 μg/kg(所投與之唯一劑量)下對3隻大鼠之未處理合併分析(nave pool analysis)來計算消除半衰期。
藥物動力學/藥效學分析
進行個別大鼠及猴抗體濃度相對於時間資料之初步非房室分析(Jusko,1992)，其揭示抗體之非線性藥物動力學。使用機構性標靶介導藥物處置模型(Mager及Jusko,2001)描述大鼠及猴中huMabJC18之PK/PD概況(圖5)。簡言之，TMDD模型假定抗體(huMabJC18)對標靶(Dkk-1)之可飽和高親和力結合造成可觀察之非線性藥物動力學特性。中心室中之抗體(體積V1)結合於(速率常數，k on )游離Dkk-1以形成抗體-Dkk-1受體複合物。複合物在形成後可解離(速率常數，k off )或抗體-Dkk-1複合物可消除(速率常數，k el,複合物 )。未結合之抗體亦可以一級速率(k el )直接自中心室消除。擴展該模型以解釋非專一性組織部位之抗體分佈，其由速率常數k 12 及k 21 描述。
以以下微分方程組的形式實施模型：
其中C mAb 血清 等於huMabJC18之游離濃度，K d =k off /k on 且[mAb 總 ]=C mAb血清 +C 複合物 且[T arget 總 ]=C 標靶 +C 複合物 。
以在DOS外殼中、在Windows XP下運作之V版NONMEM軟體，利用6.6版Compaq Visual Fortran來求微分方程系統之數值解。將ADVAN 8 TOL=3用於此剛性問題(stiff problem)。用t=0時單位劑量及藉由設置F3(游離Dkk-1)為t=0時估計之游離Dkk-1濃度初始化游離Dkk-1室。使用四級多項式模型表徵媒劑猴中Dkk-1反應之可變性：
Y=A*TIME^4-B*TIME^3+C*TIME^2-D*TIME+DKK0，
其中A、B、C及D為自媒劑資料測定之常數且在模型中固定，且Dkk0等於給藥前(t=0小時)Dkk-1之濃度。此係在NONMEM中之$ERROR區塊中實施，其具有藥物之相加效應。
使用簡單的餘弦函數表徵媒劑大鼠中Dkk-1反應之可變性：F=基線+振幅*Cos((時間-峰值時間)*(2*π/24))(Chakraborty等人,(1999) J Pharmacokinet Biopharm 27:23-43)，其具有藥物之相乘效應。
由以下評估配適度(goodness-of-fit)：NONMEM中$COV次常式提供之參數估計值及參數相關矩陣的精密度、目測加權剩餘針對時間及預測濃度之隨機散佈，以及目測所預測之個別個體相對於實際濃度-時間曲線在任一時點系統偏誤之缺乏。
使用TMDD模型在Berkeley-Madonna(8.3.9版,University of California,Berkeley,CA)中進行骨質疏鬆症患者之Dkk-1及huMabJC18濃度之模擬。人類模擬中所用之參數展示於表14中。經由異速生長原則，使用以下形式之簡單動力模型，自大鼠及猴類推人類PK、標靶及複參數：Y=a BW b ，其中Y為相關參數，BW為體重，a 為異速生長係數且b 為異速生長指數。為類推半衰期，假設b等於0.25，對於消除及吸收速率常數(k el 及k el )，假設b等於-0.25，且對於分佈容積，假設b等於1(Wang等人,2008)。
來源於此三種方法之預測臨床起始劑量之估計值相差5個數量級以上。最高起始劑量來源於NOAEL計算(1 mg/kg)。最低起始劑量來源於採用達夫方程式之MABEL計算(0.00003 mg/kg)。來源於採用TMDD模型之MABEL計算的起始劑量處於此範圍之中值附近(0.03 mg/kg)。
BIAcore資料
表8中展示使用BIAcore表面結合技術測定，huMabJC18相對於人類、小鼠、大鼠及猴Dkk-1之活體外Dkk-1結合動力學的概述。HuMabJC18以高親和力(K d 分別<2 pM、<30 pM及<100 pM)結合人類、小鼠及大鼠Dkk-1。在大多數情況下，締合速率(k on )過快且解離速率(k off )過慢以致BIAcore儀器不能精確量測。HuMabJC18亦結合於獼猴Dkk-1，但由於Dkk-1樣品之雜質，因此無法測定K d 。
a 締合速率過快以致不能精確量測
b 解離速率過慢以致不能精確量測
c 由於質量輸送限制及不純樣品，因此不可測定締合速率
d 未測定
停經前、停經後、骨質減少及骨質疏鬆女性中之Dkk-1表現
表9中展示來自停經前(n =50)、停經後(n =50)、骨質減少(n =50)及骨質疏鬆(n =50)女性之血清樣品中之Dkk-1濃度。在所測試之樣品集中，停經前與停經後女性之間不存在顯著之Dkk-1濃度差異，表明年齡不影響Dkk-1濃度。停經前女性之Dkk-1含量(平均2.2 ng/ml)相較於來自骨質減少女性之樣品(T評分-2.2，平均Dkk-1為9.0 ng/ml)及骨質疏鬆女性之樣品(T評分-3.0，平均Dkk-1為10.5 ng/ml)之間存在顯著差異(p<0.01)。將此等值包括於PK/PD模型中以預測huMabJC18在骨質疏鬆女性中之有效劑量。
a 正常T評分>-1.0，骨質減少係定義為T評分<-1.0且>-2.5，骨質疏鬆症係定義T評分為-2.5或-2.5以下。
大鼠中之Dkk-1標靶動力學：
藉由靜脈內快速投與，將V5-His標記之人類(h-)Dkk-1及大鼠(r-)Dkk-1以1、5、10及100 μg/kg(h-Dkk-1)或100 μg/kg(r-Dkk-1)投與雄性史泊格多利大鼠。在所測試之劑量範圍中h-Dkk-1動力學為線性的。h-Dkk-1之平均消除半衰期為22.3±6.4分鐘(圖6)且r-Dkk-1之平均消除半衰期為34分鐘。
大鼠藥物動力學及藥效學
圖7中展示在每週向雌性史泊格多利大鼠靜脈內投與之後，平均游離/部分游離huMabJC18濃度相對於時間之概況。表10中展示非房室藥物動力學參數。huMabJC18之藥物動力學在劑量範圍中為非線性的，在直達10 mg/kg之劑量下，AUC超比例(supra-proportional)增大。此表明相較於較高劑量(10 mg/kg及100 mg/kg)，在較低劑量(0.1 mg/kg及1 mg/kg)下清除速率較高。在稍後之時點，一些大鼠中之血清huMabJC18濃度低於預期或低於檢定之定量限制。使用定性抗藥物抗體(ADA)檢定來證實此等樣品中之大鼠抗huMabJC18抗體，且自分析及曲線移除來自此等大鼠之資料。
a 以平均值±標準差形式報導之值
b Tmax =每隻大鼠1小時，但100 mg/kg組之Tmax=一隻大鼠3小時
c Cave =AUC(第1給藥時間間隔) /第1給藥時間間隔之tlast(由於稀疏取樣，因此並非對於研究之全部持續時間)。
d Cmin =第1給藥時間間隔(0-168小時)。
在圖8A-8E中將同一研究中之平均游離Dkk-1濃度繪曲線。游離Dkk-1濃度在向大鼠投與huMabJC18之後迅速降低。除最低劑量外，在所有劑量下游離Dkk-1濃度在研究持續時間中均保持受抑制。
獼猴藥物動力學及藥效學
將獼猴中個別游離/部分游離血清huMabJC18濃度相對於時間之概況展示於圖9A及9B中，且將獼猴中huMabJC18之非房室藥物動力學參數展示於表11中。huMabJC18之藥物動力學在所測試之劑量範圍內為非線性的，在較低劑量下觀察到較高清除速率及較短半衰期值。在該劑量範圍內，huMabJC18在獼猴中之半衰期在1-13天之範圍內。
a n=1，由於AUC(0-inf)>120% AUC(0-tlast)。
b 因自不同時間間隔計算而報導之個別t值。
給藥後在1 mg/kg組中在約14天及在10 mg/kg組中一隻猴中在約21天暴露損失可能歸因於形成抗huMabJC18抗體，且自分析及曲線中移除此等資料。然而，此不可使用定性ADA檢定來證實。
同一研究中獼猴中游離Dkk-1之平均血清濃度於圖10A-10E中展示。游離Dkk-1濃度在給予huMabJC18之後迅速降低。Dkk-1抑制之持續時間為劑量依賴性且在較低劑量下恢復至基線。在最高劑量下，Dkk-1在整個給藥時間間隔中保持受抑制。
PK /PD模型化
使用機構性TMDD模型(Mager及Jusko,2001)同時擬合在猴與大鼠中隨時間變化之游離huMabJC18及游離Dkk-1之濃度(圖5)。選擇此模型，因為其解釋抗體非標靶專一性消除、標靶合成及轉換，及複合物形成及消除。將大鼠中huMabJC18及Dkk-1之所觀察到之PK/PD概況相對於所預測之PK/PD概況展示於圖7及圖8A-E中，且將猴中該等概況展示於圖9A-B及圖10A-E中。來自大鼠及猴之TMDD模型的參數估計值展示於表12中。
a 以t 1/2 =0.693/k el 形式計算之二次參數
b k οn 及k οff 係在先前之運作中測定，其中$COV無法在NONMEM中獲得。在最終運作中，將k on 及k off 估計值固定於此等值且獲得$COV。
c 以K d =K off /K on 形式計算之二次參數
來自大鼠及猴中PK/PD模型之分佈容積(V1)及半衰期之估計值與大鼠及猴中IgG2 抗體之藥物動力學一致(Peppard及Orlans,1980;Hinton等人,2004)。大鼠活體內效能之估計值(K d =34.8 pM)與大鼠中活體外獲得之值(K d <100 pM，參看上文BIAcore資料)一致。自Dkk-1k el 測定之Dkk-1半衰期估計值(猴中26分鐘及大鼠中11分鐘)類似於自V5-his標記之h-Dkk-1及r-Dkk-1轉換研究估計之值(分別22.3分鐘及34分鐘，參看上文標靶動力學章節)。複合物之半衰期(自複合物k el 估計)為介於抗體huMabJC18與標靶Dkk-1之估計半衰期之間之中間值。
大鼠中之骨生物標誌
除標靶Dkk-1之外，亦在大鼠研究中定量其他生物標誌，包括骨鈣化素(已確立之骨形成生物標誌)及骨密度(BMD)(經驗證骨質疏鬆症生物標誌)(例如參看Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism (Rosen CJ編)第152-163頁及第174-179頁,American Society for Bone and Mineral Research,Washington D.C)。在大鼠研究中第一次給藥後1.5及2.5週骨鈣化素濃度相對於劑量之曲線展示於圖11中。在1毫克/公斤/週劑量組中在第一次給藥後2.5週及在10及100毫克/公斤/週劑量組中在給藥後1.5週，骨鈣化素濃度存在統計學上顯著(p<0.05)提高。
如表13中所示，相較於媒劑對照組，在以10及100毫克/公斤/週huMabJC18處理之大鼠中，總骨密度分別顯著提高11%及16%。
a 數據以平均值±SE之形式表述。
*：相對於媒劑p<0.05；**：相對於媒劑p<0.01。
藉由靜脈內注射以不同劑量之huMabJC18每週處理雌性大鼠歷時6週。在研究結束時量測BMD。
人類PKPD模擬
使用基於機構之PK/PD(TMDD)模型(圖5)模擬huMabJC18在人類體內之PK/PD且預測治療骨質疏鬆症以及其他病症之有效劑量。將IgG2 抗體PK參數(非標靶介導)之文獻報導值與獲自猴及大鼠PK/PD模型化(表14)之Dkk-1標靶動力學及huMabJC18-Dkk-1複合物動力學之知識組合以獲得關於人類PK/PD模擬之信息。
OVX小鼠疾病模型中之先前實驗表明骨密度統計學上顯著提高需要Dkk-1降低50%(資料未圖示)。在給藥時間間隔中使Dkk-1降低>50%之huMabJC18的預測有效劑量為每月一次給予3.57 mg/kg。由於關於內源性Dkk-1之動力學及對此參數之Dkk-1抑制(及因此劑量)之高敏感性的不確定性，因此與其相關之預計劑量(projected dose)具有不確定性。預測得到最小預期生物作用(MABEL)之劑量為0.03 mg/kg。預測此劑量使Dkk-1含量短暫降低<20%，接著恢復至基線。預測0.003 mg/kg(MABEL之1/10)之劑量無作用。Dkk-1濃度之此等人類模擬係展示於圖12中且應在臨床中之劑量設置中具有高價值。
預測在涵蓋MABEL(0.03 mg/kg)及預測之有效劑量(3.57 mg/kg)的劑量範圍中huMabJC18具有非線性藥物動力學。此係歸因於TMDD且展示於圖13中。
標靶瞭解
小鼠中之資料表明Dkk-1為骨重塑之主調控劑(Diarra等人,(2007) Nat Med 13:156-163)且疾病病況(卵巢切除，OVX)小鼠中之Dkk-1基線含量為健康小鼠(內部資料)之約5倍。亦已顯示Dkk-1含量在患有骨骼病變之多發性骨髓瘤患者之骨髓血漿及末梢血液中提高(Tian等人,2003)。敏感性分析顯示預測人類劑量之抗Dkk-1單株抗體(huMabJC18)對Dkk-1基線含量高度敏感。基線Dkk-1含量愈高，降低Dkk-1所需之抗體濃度愈大。標靶之基線含量常自先前臨床量測已知，然而缺乏此關於Dkk-1之資訊促使建立健康個體與患者群體(骨質減少及骨質疏鬆患者)中人類Dkk-1含量之參考範圍，其可用於在臨床發展之不同階段進行提供更多資訊之劑量預測。分析顯示在骨質減少及骨質疏鬆女性(T評分<-1)中之Dkk-1含量高於健康女性。
標靶配位體之轉換率可自數分鐘至數天不同，其可對有效劑量及甚至標靶受干擾以達臨床益處之潛力具有顯著影響。一些配位體具有跨物種之類似動力學，但對於其他配位體，轉換並非可預測之先驗。Meno-Tetang等人(Meno-Tetang及Lowe(2005) Basic Clin Pharmacol Toxicol 96:182-192)顯示IgE轉換率在小鼠中5至8小時至人類中2.7天之範圍內，其顯著影響抗IgE抗體之人類作用的預測。對於Dkk-1，敏感性分析證實預測劑量之抗Dkk-1單株抗體(huMabJC18)對Dkk-1半衰期敏感，其中標靶轉換率愈高，需要之抗體之莫耳濃度過量愈高。自文獻無法獲得關於Dkk-1轉換率之資訊，且因此實驗係使用靜脈內給予大鼠之V5-his標記之人類及大鼠Dkk-1內部完成。此等實驗表明Dkk-1具有高轉換率(對於h-Dkk-1半衰期為22.3分鐘且對於r-Dkk-1半衰期為34分鐘)且人類與大鼠形式之Dkk-1在大鼠體內具有類似轉換率。稍後藉由使用PK/PD模型化來估算給予huMabJC18之大鼠及猴體內Dkk-1半衰期來證實Dkk-1之快速轉換率。
大鼠及猴中huMabJC18之PK/PD瞭解
在大鼠及猴研究中，huMabJC18展現非線性藥物動力學，其中在較低劑量下獲得較高清除率及較短消除半衰期值。此表明標靶介導藥物處置(TMDD)，其中抗體與其藥理學標靶之相互作用影響較低劑量下之處置(Tabrizi等人，(2006) Drug Discov Today 11:81-88.；Wang等人，(2008)Clin Pharmacol Ther 84:548-558)。因為標靶之有限表現，所以此路徑在較高劑量下為飽和。在標靶介導路徑飽和後，典型IgG FcRn分解代謝清除機制起主要作用，其給予抗體其特徵性長半衰期。對於針對細胞膜上表現之蛋白質之單株抗體TMDD較為常見，其中受體介導之內飲作用使得藥物消除。然而，亦可關於可溶標靶觀察TMDD：奧馬佐單抗(omalizumab)及狄諾塞麥(denosumab)為可溶標靶之抗體(分別為IgE，及NFkB之受體活化劑)，其展現非線性消除動力學(Hayashi等人,2007；Marathe等人,2008)。
由描述全身性藥物濃度之PK模型(用作描述PD之強制函數)組成的經驗PK/PD模型因為不解釋PK與PD之相依性所以常不適於表徵TMDD。Mager等人(Mager及Jusko(2001) J Pharmacokinet Pharmacodyn 28:507-532)提出描述藥物PK、標靶動力學及其相互作用之單一模型。此模型解釋藥物分子之專一性及非專一性分佈及消除以及提供解釋標靶動力學之靈活性。在同時分析PK及PD之其他情況下，使用此模型來提供劑量、暴露及反應之間的直接聯繫(Meno-Tetang及Lowe(2005) Basic Clin Pharmacol Toxicol 96:182-192)；Ng等人,(2006) Pharm Res 23:95-103.；Wu等人,(2006) J Pharm Sci 95:1258-1268)。在此情況下，使用TMDD模型同時擬合在以若干劑量靜脈內投與huMabJC18之後大鼠及猴體內抗體huMabJC18及標靶Dkk-1濃度。該模型得到huMabJC18之非標靶介導藥物動力學之估計值，其與各物種中典型IgG2 藥物動力學相當一致(Peppard及Orlans(1980) Immunology 40:683-686；Hinton等人,(2004) J Biol Chem 279:6213-6216)。因此，大鼠中消除半衰期為2.5天且猴中消除半衰期為13.6天。分佈容積約等於猴中血漿容量(0.052 L/kg)，但高於大鼠中血漿容量(0.147 L/kg)。
據PK/PD模型化，標靶Dkk-1之消除半衰期經估計在大鼠中為11分鐘及在猴中為26分鐘。此與在大鼠中量測之V5-his標記之h-Dkk1的消除半衰期(半衰期=25分鐘)呈相同數量級。huMabJC18-Dkk-1複合物之半衰期係估計為介於huMabJC18半衰期與Dkk-1半衰期之間之中間值，其可能反映標靶介導清除機制。然而，標靶結合於抗體有可能干擾抗體結合於FcRn，且正內部完成研究以檢驗此假設。
在大鼠中，除標靶生物標誌Dkk-1減少外，亦觀察到骨形成之生物標誌(骨鈣化素及骨密度)增加。此資料對使用huMabJC18來治療骨骼病症(諸如骨質疏鬆症)給予進一步支持。
預測人類有效劑量及計算MABEL
對於單株抗體，正普遍認識到基於PK/PD模型化來合理選擇安全之人類首次使用劑量為必需的(例如參看Publications policy and guidance: Department of Health-Publications 之英國政府網站)。新參數，最小預期生物作用量(MABEL)涉及基於PK/PD模型化方法將所觀察到之臨床前PK/PD資料外推至臨床預測。在最近歐洲管理指南(EMEA(2007) Guideline on strategies to identify and mitigate risks for first-in-human clinical trials with investigational medicinal products.,(EMEA編),London)中，在設計高風險治療劑之人類首次使用劑量中，除無不利作用量(NOAEL)外，亦已提出考慮MABEL。
為預測huMabJC18之有效劑量，用於擬合大鼠及猴中之臨床前資料的機構性TMDD模型經改適用於人類PK/PD模擬。將IgG2 抗體藥物動力學參數(非標靶介導)之文獻報導值與獲自大鼠及猴PK/PD模型化之Dkk-1標靶動力學及huMabJC18-Dkk-1複合物動力學之知識組合。
使用人類Dkk-1之活體外BIAcore值來測定模型中複合物之締合及解離速率(k on 及k off )。對k on 及k off 進行敏感性分析，且由於在人類中關於此抗體所預測之快速締合速率及緩慢解離速率，故Dkk-1抑制及因此劑量對Kd 之相當大之變化不敏感。實際上，Kd 值<10 pM時，預測劑量無變化。此係因為huMabJC18-Dkk-1複合物之轉換率快於自受體之解離速率。在此等情況下，可避免候選物選擇中之親和力成熟步驟。
將在來自骨質疏鬆患者之樣品中量測之平均Dkk-1基線濃度(參看結果章節)用於模擬中。假設Dkk-1在人類中具有慢於猴或大鼠之轉換率。因此，使用猴及大鼠半衰期值之異速生長類推來計算人類Dkk-1半衰期。此得到Dkk-1在人類中之估計半衰期為49分鐘。應注意因為Dkk-1為迅速轉換之抗原，所以Dkk-1之總體抑制，及因此劑量對模擬中所用之Dkk-1半衰期值具高度敏感性。
藉由異速生長類推藉由猴PK/PD模型估計之複合物半衰期，預測人類中huMabJC18-Dkk-1複合物之半衰期為2.3天(kel=0.3天-1 )。人類中較短複合物半衰期藉由異速生長類推藉由大鼠PK/PD模型化估計之複合物半衰期來預測。然而，進行敏感性分析且Dkk-1抑制(及因此劑量)對自大鼠相對於猴預測之複合物半衰期的變化不敏感。
OVX小鼠(即停經後骨質流失模型)中之先前實驗表明Dkk-1含量降低約50%與統計學上顯著之骨密度提高相關(資料未圖示)。因此，基於在給藥時間間隔(1個月)中，需要自基線抑制>50%之Dkk1含量，對huMabJC18進行劑量預測。在此緩解(remit)下且用上述假設，huMabJC18之預測有效劑量為每月一次皮下給予3.57 mg/kg。藉由模擬，預測在人類中得到最小作用(MABEL)(Dkk-1降低<20%)之劑量為0.03 mg/kg。在臨床中預測非線性藥物動力學(圖13)，其中由於TMDD，因此在較低劑量下，huMabJC18展現較高清除率及較短半衰期。
預測人類藥理學之替代性方法使用以下基於平衡-藥物相互作用理論之公式來預測最大受體佔用率(RO)：
(圖14，(Duff(2006) Expert Scientific Group on Phase One Clinical Trials: Final Report,Department of Health,UK,London))。使用此方法估計RO僅依賴於Kd且不考慮標靶或mAb-標靶複合物動力學。Dkk-1已顯示具有高轉換率且huMabJC18結合Dkk-1改變標靶之動力學(TMDD)。在此等條件下，RO藉由藥理學平衡方法常無法預測，且基於簡單K d 之RO計算已顯示對特定劑量下之RO的預測值實質上過量(Agoram(2009) Br J Clin Pharmacol 67:153-160)。對於Dkk-1，使用平衡公式計算之RO估計之ED50 為0.00001 mg/kg，而機構性PK/PD模型估計ED50 為0.01 mg/kg(圖14)。使用平衡計算可使得選擇之劑量在臨床中過低且延遲初次人體研究之進展。另一極端為在大鼠及猴中觀察到之NOAEL(100 mg/kg)超過標靶100%結合於抗體所需，從而無法推薦其用於提供臨床起始劑量估計值。推斷基於PK/PD模型之計算MABEL劑量之方法具有較大可能性預測Dkk-1且確保臨床研究之安全性及效率。
觀察到之NOAEL(100 mg/kg)超過Dkk-1 100%結合於抗體所需。另一極端為根據達夫方程式計算之MABEL可能因對Dkk-1之快速轉換欠考慮而為嚴重低估之值。因此，此等方法在此情況下為不可接受之設置起始臨床劑量的方法。相反地，TMDD模型提供臨床前資料之優良表徵，其表明標靶轉換在測定Dkk-1結合%中之作用。因此，來源於TMDD模型之MABEL估計值(0.03 mg/kg)將確保FIH研究之安全性與效率。
總之，huMabJC18為治療骨質疏鬆症以及其他病症之人類化原型抗Dkk-1抗體。使用機構性TMDD模型來表徵大鼠及猴中huMabJC18相對於Dkk-1濃度反應關係。此模型藉由併入關於標靶表現及轉換率之資訊轉譯為人類來預測有效劑量及MABEL。發現此機構之此等參數對劑量反應關係之影響大於對親和力之影響。
寄存資訊
申請者已將本文中命名為huMAbJC18之抗體的重鏈及輕鏈可變區寄存於美國菌種保存中心(ATCC)Manassas,VA 20110-2209 U.S.A。如上文所示，huMabJC18 HC可變區係寄存於2009年3月19日，且指定為ATCC寄存編號PTA-9835，且huMabJC18 LC可變區係寄存於2009年3月19日，且指定為ATCC寄存編號PTA-9836。此等寄存係依據關於出於專利程序目的之微生物寄存之國際認可的布達佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure)及其下(布達佩斯條約)規定的條款進行。此等寄存物將無限制保存於ATCC存放處歷時最近請求後30年或5年之時段或歷時專利有效期(時間較長者)，且若在彼時段期間寄存物變得無活力則經替代。不應將寄存物質之可用性視為許可在違反任何政府當局根據其專利法授予之權利下實踐本發明之任何態樣。前述書面說明書被視為足以使熟習此項技術者能夠實踐本發明之所有態樣。本發明之範疇不應受限於所寄存物質，因為所寄存之實施例僅意欲說明本發明之某些態樣，且功能等效之任何構築體均在本發明之範疇內。本文中物質之寄存並不構成承認以下：本文中之書面說明書不足以使能夠實踐本發明之任何態樣(包括其最佳方式)，亦不將其視為將申請專利範圍之範疇限於其所呈現之特定說明。實際上，除本文所示及所述者外之本發明之各種修改將由前述說明書而為熟習此項技術者顯而易見且屬於隨附申請專利範圍之範疇。
在本文中所用之章節標題僅用於結構目的且不應被視為以任何方式限制所述標的物。應瞭解，在本發明教示中論述之溫度、濃度、時間等之前暗含「約」，使得略微偏離及非實質性偏離在本文之本發明教示之範疇內。在本申請案中，除非另外特定規定，否則使用單數包括複數。又，使用「包含」、「含有」及「包括」並不意欲作限制。應瞭解，前述一般描述與隨後詳細描述均僅為例示性及說明性的且並不限制本發明。
本文中所引用之所有參考文獻，包括專利、專利申請案、論文、教科書及其類似物，及其中所引用之參考文獻均在其尚未併入之程度上以全文引用的方式併入本文中。在一或多種所併入之文獻及類似材料不同於本申請案或與本申請案抵觸之情況下(包括(但不限於)所定義之術語、術語用法、所述技術或其類似者)，以本申請案為準。
<210>　2
<211>　822
<212>　DNA
<213>　智人
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<210>　3
<211>　332
<212>　DNA
<213>　小家鼠
<400>　3
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<212>　PRT
<213>　小家鼠
<400>　4
<210>　5
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<212>　DNA
<213>　小家鼠
<400>　5
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<400>　6
<210>　7
<211>　21
<212>　DNA
<213>　小家鼠
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<213>　小家鼠
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<213>　小家鼠
<400>　9
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<213>　小家鼠
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<213>　小家鼠
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<212>　DNA
<213>　小家鼠
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<223>　huMabJC18 Kabat重鏈CDR1
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<223>　huMabJC18 Chothia重鏈CDR1
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<223>　huMabJC18 Chothia重鏈CDR2
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<223>　huMabJC18 Chothia重鏈CDR3
<400>　52
圖1A及1B展示在完整小鼠模型中抗小鼠Dkk-1單株抗體(JC18)之作用。在所有劑量下藉由JC18處理，遠端股骨之總BMD均顯著提高(圖1A)。60 mg/kg劑量之JC18在小鼠中亦顯著提高骨形成速率(圖1B)。
圖2展示在完整小鼠模型中Dkk-1單株抗體之小鼠嵌合體(小鼠嵌合體-嵌合人類-小鼠抗體)的作用。相較於媒劑，1至30 mg/kg劑量之小鼠嵌合體提高總BMD。
圖3展示JC18在OVX小鼠模型中預防由雌激素缺乏症誘發之骨質流失。如所預期，以媒劑處理之小鼠在OVX後8週展示如由總BMD顯著降低所表明之骨質減少。如在遠端股骨處藉由pQCT量測，相較於OVX小鼠之媒劑處理，JC18劑量回應性地使總BMD提高7%至20%。在每週兩次以15 mg/kg JC18處理之小鼠中，總BMD不僅高於以媒劑處理之OVX小鼠，而且維持在假控制級，表明在此劑量及給藥方案下，JC18完全預防OVX小鼠中骨質減少之發展。
圖4展示JC18結合於人類同系物Dkk-1、Dkk-3及Dkk-4之專一性。JC18展示與人類Dkk-4之弱結合及不結合於人類Dkk-3(至多5 μg/ml)。
圖5展示標靶介導藥物處置(Target Mediated Drug Disposition/TMDD)模型。
圖6展示在以1、5、10及100 μg/kg單次靜脈內投與後大鼠中標記V5-His之h-DKK-1之血清濃度圖。0.001 mg/kg樣品，>0.5小時之時點；0.005 mg/kg樣品，>1小時之時點；及0.01 mg/kg及0.1 mg/kg樣品，>2小時之時點低於檢定法之可定量限度且不包括於曲線中。
圖7展示向史泊格多利大鼠每週靜脈內投與huMabJC18後觀察到及模型預測之游離/部分游離huMabJC18濃度相對於時間的圖。符號表示平均觀察數據(±SD)且線表示由模型預測之概況。
圖8A-E展示向史泊格多利大鼠每週靜脈內投與huMabJC18後觀察到及模型預測之游離Dkk-1濃度相對於時間的圖。符號表示平均觀察數據(±SE)且線表示由模型預測之概況。自分析移除偵測到抗huMabJC18抗體之樣品。
圖9A-B展示向獼猴單次靜脈內投與huMabJC18後觀察到及模型預測之游離/部分游離huMabJC18濃度相對於時間的圖。(A)雄性猴。(B)雌性猴。符號表示觀察到之個別猴數據且線表示由模型預測之概況。
圖10A-E展示向獼猴單次靜脈內投與huMabJC18後觀察到及模型預測之游離Dkk-1濃度相對於時間的圖。符號表示觀察數據且線表示由模型預測之概況。
圖11展示在向史泊格多利大鼠每週靜脈內投與huMabJC18後在第一次給藥後1.5週及2.5週之平均骨鈣化素濃度(±SE)的圖。*表示相對於媒劑p<0.05
圖12展示在每月一次皮下投與huMabJC18歷時6個月後人類體內預測之游離Dkk-1濃度的圖。測試三種不同劑量：0.003 mg/kg，表示1/10之MABEL或無作用劑量；0.03 mg/kg，表示MABEL；及3.57 mg/kg，表示骨質疏鬆症之預測有效劑量。
圖13展示在每月一次皮下投與huMabJC18歷時6個月後人類體內預測之游離huMabJC18濃度的圖。測試三種不同劑量：0.003 mg/kg，表示1/10之MABEL或無作用劑量；0.03 mg/kg，表示MABEL；及3.57 mg/kg，表示骨質疏鬆症之預測有效劑量。展示生物分析檢定之預期定量限度(Anticipated Limit of Quantitation/LOQ)表示低於預測MABEL之給藥無用。
圖14展示基於(1)穩態平衡法(Duff,2006)及(2)機構性PK/PD(TMDD)模型，huMabJC18之受體佔用率計算值相對於預測之人類劑量的圖。
(無元件符號說明)

Claims (14)

  1. 一種分離之抗體或其免疫功能片段，其專一性結合Dickkopf 1(Dkk-1)多肽，包含(a)包含SEQ ID NO：30、49或50所示胺基酸序列之重鏈可變區(VH)互補決定區1(CDR1)、包含SEQ ID NO：32或51所示胺基酸序列的VH CDR2、及/或包含SEQ ID NO：34或52所示胺基酸序列的VH CDR3，或在VH CDR1、VH CDR2及/或VH CDR3中包含一或多個保守性胺基酸取代之其變異體；及(b)包含SEQ ID NO：22所示胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)CDR1、包含SEQ ID NO：24所示胺基酸序列的VL CDR2、及包含SEQ ID NO：26所示胺基酸序列的VL CDR3，或在VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3中包含一或多個保守性胺基酸取代之其變異體。
  2. 如請求項1之抗體，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：28所示之胺基酸序列，及該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：20所示之胺基酸序列。
  3. 如請求項2之抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：42或38所示之胺基酸序列的輕鏈，及包含SEQ ID NO：40或36所示之胺基酸序列、有或無SEQ ID NO：40或36之C端離胺酸的重鏈。
  4. 一種核酸，其包含編碼如請求項1之抗體或免疫活性片段之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3的序列。
  5. 一種核酸，其包含編碼如請求項2之抗體或免疫活性片 段之VH、VL，或該VH與該VL兩者的序列。
  6. 一種核酸，其包含編碼如請求項3之抗體或免疫活性片段之輕鏈、重鏈，或該輕鏈與該重鏈兩者的序列。
  7. 一種表現載體，其包含如請求項4至6中任一項之核酸。
  8. 一種分離之細胞，其包含如請求項7之表現載體。
  9. 一種產生抗體或其免疫活性片段之方法，其包含培養如請求項8之細胞的步驟。
  10. 一種組合物，其包含如請求項1至3中任一項之抗體或片段，及醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
  11. 一種如請求項1至3中任一項之抗體或片段的用途，其係用於製造治療或預防患者之骨質流失的藥物。
  12. 如請求項11之用途，其中該患者係選自罹患骨質疏鬆症、骨質減少、佩吉特氏病(Paget's Disease)、牙周炎、類風濕性關節炎、轉移至骨骼之癌症、多發性骨髓瘤及不活動所致之骨質流失的患者。
  13. 一種如請求項1至3中任一項之抗體或片段的用途，其係用於製造誘導骨質增加之藥物。
  14. 一種如請求項1至3中任一項之抗體或片段的用途，其係用於製造誘導Wnt活性之藥物。
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