CN102656139B - 制造l-肉毒碱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制造L-肉毒碱的方法，其包括以下步骤：(a)提供在第一溶剂中包含至少5%(w/w)肉毒碱的溶液，其中肉毒碱是D-和L-肉毒碱的混合物，(b)任选地用L-肉毒碱晶体对该溶液进行种晶，(c)添加第二溶剂，L-肉毒碱在所述第二溶剂中不溶或溶解度低，(d)分离包含L-肉毒碱的晶体。

Description

制造L-肉毒碱的方法

发明领域

本发明涉及制造L-肉毒碱的方法。

发明背景

肉毒碱(维生素Bt；3-羟基-4-三甲基铵基-丁酸盐)是由氨基酸(赖氨酸和蛋氨酸)生物合成的季铵化合物。在活细胞中，需要其在分解脂类以产生代谢能量期间将脂肪酸从细胞溶质运输至线粒体。其被用作营养补剂。

肉毒碱以两种立体异构体形式存在。具生物活性的形式是L-肉毒碱，而其对映体D-肉毒碱则不具生物活性。当在工业方法中制造L-肉毒碱时，期望以高纯度制造具生物活性的L-形式。高纯度的L-肉毒碱能够通过微生物法获得。EP 0195944公开了一种微生物法，其中在生物反应器中借助于特定的微生物由巴豆甜菜碱(crotonobetain)和丁酸甜菜碱产生L-肉毒碱。获得光学纯L-肉毒碱与丁酸甜菜碱的混合物。为了除去丁酸甜菜碱，将终产物用甲醇和异丁醇重结晶。

另一种获得基本上纯的L-肉毒碱的微生物法公开于DD 296702中。通过L-肉毒碱的电渗析和重结晶，耗尽培养溶液中的L-肉毒碱。在该微生物法中，基本上不产生D-肉毒碱，因此不需要对映体分离步骤。利用溶剂对L-肉毒碱进行重结晶以除去其它物质。

利用非微生物法或非酶促法来获得高纯度L-肉毒碱更复杂。利用有机合成，通常获得D-和L-肉毒碱的混合物。为了获得纯L-肉毒碱，DE 689 01 889T2教导在立体选择性不对称氢化反应中使用钌膦配合物。该配合物相对复杂且昂贵，因此不适用于在工业方法中大量制备L-肉毒碱。

因此，已开发了从L-和D-肉毒碱的混合物中分离L-肉毒碱的方法。通常这些方法基于利用具光学活性的酸将肉毒碱转化成盐，以及利用L-和D-肉毒碱具有的不同的物理性质(例如溶解度)将L-与D-肉毒碱分离。

在这一方面，DD 93 347公开了一种在樟脑酸、二苯甲酰基酒石酸或其组合的存在下从醇溶液中分离D-和L-肉毒碱的方法。由于盐的不同溶解度，可将D-肉毒碱与L-肉毒碱分离。

DE 35 36 093公开了由外消旋混合物制备L-肉毒碱的方法，其中利用二苯甲酰基-L-酒石酸将D-和L-肉毒碱转化成具光学活性的盐，其后进行分级结晶。

然而，将肉毒碱转化成具光学活性的盐或酸的方法相对复杂，理由是它们包括添加分离剂和将其在分离工序后除去的步骤。这样导致整个方法具有相对的时间效率和劳动效率。

本发明要解决的问题

本发明要解决的问题是提供能够解决上述问题的制造L-肉毒碱的方法。

该方法应适于由包含L-和D-肉毒碱的对映体混合物制造高纯度的L-肉毒碱。光学纯度可藉此而显著增加，且收率也应当高。

该方法应以简易的方式进行。具体而言，应避免使用其后需被除去的其它化合物，例如具光学活性的助剂。此外，工序步骤的数目应相对少，且这些工序应该不需要复杂的装置。总地来说，该方法应具有成本效率和劳动效率。

发明概述

出乎意料地，本发明要解决的问题通过权利要求所述的方法得到解决。整个说明书中公开了本发明进一步的实施方式。

本发明的主题是制造L-肉毒碱的方法，其包括以下步骤：

(a)提供在第一溶剂中包含至少5%(w/w)肉毒碱的溶液，其中所述肉毒碱是D-和L-肉毒碱的混合物，

(b)任选地用L-肉毒碱晶体对该溶液进行种晶，

(c)添加第二溶剂，L-肉毒碱在所述第二溶剂中不溶或溶解度低，

(d)分离包含L-肉毒碱的晶体。

肉毒碱是两性离子，其包含羧酸基和季铵基。步骤(a)中使用的肉毒碱优选为该两性离子性肉毒碱。然而，也可以使用盐，例如氯化物盐、硫酸盐或硝酸盐。步骤(a)中使用的肉毒碱优选不是肉毒碱与具光学活性的阴离子的盐。

通过本发明的方法，以提高了的纯度获得L-肉毒碱。因此，本发明的方法也是纯化L-肉毒碱的方法，或者是获得高纯度L-肉毒碱的方法，或者是提高L-肉毒碱的对映体过量的方法。

根据本发明，由包含D-和L-肉毒碱的溶液获得晶态L-肉毒碱。在优选的实施方式中，步骤(a)中的溶液基本上由溶剂和肉毒碱组成。在本发明的方法中，L-肉毒碱的对映体过量(e.e.)被提高。优选地，对映体过量提高了多于1%或多于2%。对映体过量的增加取决于步骤(a)中初始溶液的对映体过量。对映体过量(e.e.)定义为各对映体的摩尔分数之间以百分率表示的绝对差异值。举例来说，含有90%L-异构体和10%D-异构体的样品的对映体过量为80%L-异构体。

在本发明优选的实施方式中，步骤(a)中的肉毒碱包含大于50%、80%、90%、95%或98%(e.e.)的L-肉毒碱。优选地，步骤(d)中分离所得的L-肉毒碱包含大于90%、98%、99%或99.5%(e.e.)的L-肉毒碱。优选地，当步骤(a)中使用的溶液包含大于95%(e.e.)的L-肉毒碱时，在步骤(d)中，获得包含大于99%(e.e.)的L-肉毒碱的晶体。

在本发明优选的实施方式中，第一溶剂选自由乙醇、甲醇、水、乙腈及其混合物组成的组。所述溶剂是肉毒碱的良溶剂。这意味着肉毒碱在室温下的溶解度为至少5%，优选至少10%或至少20%(w/w)。优选地，第一溶剂为乙醇。在具体实施方式中，第一溶剂可包含不多于0.5%、不多于2%或不多于5%(w/w)的水。因此，溶剂可以是工业级的。

在优选的实施方式中，步骤(a)中的溶液是饱和溶液或过饱和溶液。还优选该溶液接近饱和，这意味着肉毒碱的浓度为饱和浓度的80%以上或90%以上。在本发明优选的实施方式中，第一溶剂中总肉毒碱的浓度为5至75%。在乙醇中，该浓度优选为10至50%或15至40%(w/w)。在甲醇中，该浓度优选为20至70%(w/w)。

优选地，溶解在步骤(a)的溶液中的肉毒碱是纯肉毒碱或高纯的肉毒碱。在该实施方式中，步骤(a)的溶液仅包含少量其它物质。基于溶液中总肉毒碱(D-和L-)的量，其它物质的量可小于0.5、小于1或小于2%(w/w)。在另一实施方式中，溶解在步骤(a)的溶液中的肉毒碱包含一定量的副产物或其它化合物，例如来自制造方法的起始化合物。在该实施方式中，步骤(a)的溶液可包含基于肉毒碱总量为不多于5%、不多于10%或不多于15%(w/w)的其它化合物。例如，合成的肉毒碱可包含小于1%(w/w)的羟基巴豆酸。

在优选的实施方式中，步骤(a)的溶液基本不含水。这意味着肉毒碱和溶剂应该是基本不含水或包含尽可能少的水。已发现本发明的方法在仅存在少量水时更有效。优选地，步骤(a)的溶液的总含水量小于2%、小于1%或小于0.5%(w/w)。

在本发明优选的实施方式中，步骤(a)包括将溶液加热，优选直至所有肉毒碱溶解，例如加热至40°C以上或50°C以上的温度。任选地，可以随后例如通过过滤来除去残余固体肉毒碱和/或残余固体。在步骤(a)中，可以将温度调节到40至80°C或50至75°C。该温度的选择取决于溶剂。当使用乙醇时，优选50至75°C的温度，例如约65°C。

在步骤(b)中，来自步骤(a)的溶液可以利用L-肉毒碱晶体进行种晶。优选地，进行种晶的溶液是饱和或过饱和溶液。过饱和溶液可如下获得：在步骤(a)中于升高的温度下制备饱和溶液，并且慢慢地冷却饱和溶液，从而使肉毒碱不发生沉淀或结晶。

通过用L-肉毒碱晶体对溶液进行种晶和培育，可引发晶体的生长。这样，当本发明的方法包括步骤(b)的种晶步骤时，最终获得的晶体的平均尺寸会更高。然而，在步骤(b)的种晶工序中不添加种晶晶体也可以以高收率获得具高纯度的肉毒碱晶体。该肉毒碱晶体基本由L-肉毒碱组成或富含L-肉毒碱。种晶仅需要小量种晶晶体。种晶晶体应具有高纯度且非常细。优选应当在溶液仍然清澈时(即在没有或基本没有晶体或沉淀物自发形成时)添加种晶晶体。这可以通过在提高的温度下种晶而实现。在本发明优选的实施方式中，在种晶步骤(b)中，溶液的温度为约25至50°C，优选为30至45°C。然而，在种晶期间和之后且在添加第二溶剂之前，肉毒碱的溶解度仍然相当高，且基本没有观察到晶体或仅观察到晶体有限的快速形成。

在优选的实施方式中，在用晶体种晶后，溶液的温度被降低。优选地，温度降低至10至30°C，例如至约20°C。

在步骤(c)中，添加第二溶剂，L-肉毒碱在该第二溶剂中不溶或溶解度低。在添加第二溶剂期间和之后，观察到L-肉毒碱结晶。在L-肉毒碱结晶期间，耗尽溶液中的L-肉毒碱，且其变成悬浮液。因此，结晶后，组合物可以被视为溶液或悬浮液。当针对步骤(b)和后续步骤而提及"溶液"时，所指的是该溶液/悬浮液。

在本发明优选的实施方式中，第二溶剂选自丙酮、异丙醇、异丁醇、2-丙醇、1-戊醇、2-丁酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、四氢呋喃、甲苯及其混合物。优选地，第二溶剂为丙酮。

第二溶剂是在其中L-肉毒碱不溶或溶解度低的溶剂。在本发明优选的实施方式中，L-肉毒碱于25°C下在第二溶剂中的溶解度小于3%、小于2%或小于1%(w/w)。在添加第二溶剂时，溶液中肉毒碱的整体溶解度降低，且肉毒碱结晶。因此，在添加第二溶剂时，在溶液中形成固体肉毒碱晶体。

在本发明非常优选的实施方式中，第一溶剂是乙醇且第二溶剂是丙酮。

在本发明优选的实施方式中，在步骤(c)中，第一溶剂与第二溶剂的比例为1:1至1:10(w/w)，更优选为1:1.5至1:6之间或1:2至1:4(w/w)。应调节该比例，使得肉毒碱在溶剂混合物中的溶解度显著降低，从而使总肉毒碱中的大部分结晶。

在本发明优选的实施方式中，在任选的种晶步骤(b)之后，或在步骤(c)之前或期间，或在步骤(c)中添加第二溶剂之后，将溶液的温度调节到10°C至30°C。然而，可以在降低溶液温度之前或之后添加第二溶剂。

优选地，在步骤(c)中，慢慢地添加(例如滴加)第二溶剂。在本发明优选的实施方式中，在步骤(c)中，将第二溶剂在20分钟至8小时或1小时至6小时的时间内添加至溶液中。在添加丙酮和培育期间，L-肉毒碱结晶。通常可以通过低温培育来提高结晶的L-肉毒碱的量。

优选地，添加第二溶剂之后，组合物在降低的温度下进行培育。例如，可将温度降低至5至20°C或低于15°C。组合物可以在该温度下培育10分钟至2天或30分钟至24小时。在本发明优选的实施方式中，在步骤(c)中添加第二溶剂之后，将组合物在低于20°C的温度下培育10分钟至2天。

在步骤(d)中，通过已知的方法(例如过滤或沉淀)来分离固体晶体。任选地，将晶体洗涤，优选用第二溶剂进行洗涤。通过干燥(任选在减压下)除去溶剂。例如，可以通过在55°C下于100bar以下的压力下除去丙酮。

根据本发明，在步骤(d)中分离出来的总固体肉毒碱被称为"晶体"。发现这些固体具有晶态结构。然而，特别是在迅速添加第二溶剂时，固体肉毒碱"晶体"可能还包含(至少部分包含)肉毒碱沉淀物。

基于起始溶液中总L-肉毒碱，L-肉毒碱的总收率优选为80%以上或85%以上。

在本发明优选的实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(a)提供包含至少5%(w/w)肉毒碱的乙醇溶液，其中所述肉毒碱包含至少50%(e.e.)的L-肉毒碱，其中将溶液加热，直至所有肉毒碱溶解，

(a1)将溶液的温度调节到25至50°C，

(b)用L-肉毒碱晶体对溶液进行种晶，

(b 1)任选地将温度调节到10至30°C，

(c)添加丙酮，丙酮的添加量使得乙醇/丙酮的比例为1:1至1:10(w/w)，

(c1)任选地将组合物冷却至低于20°C的温度，

(d)优选通过过滤分离包含L-肉毒碱的晶体。

在上述方法中，步骤(a)至(d)连续地进行。

在本发明的具体实施方式中，利用步骤(d)获得的晶体重复进行本发明的整个方法。在该实施方式中，制备晶体在第一溶剂中的溶液。当重复整个方法两次或更多次时，甚至可以从对映体纯度低的肉毒碱获得高纯的L-肉毒碱。

本发明的方法解决了上述问题。通过本发明的方法，可由D-和L-肉毒碱混合物获得高纯的L-肉毒碱。在分离D-和L-肉毒碱的混合物时，不需要如DE 35 36 093或DD 93 347所公开的那样添加具光学活性的化合物。在本发明的方法中，肉毒碱在中间步骤中没有转化成具光学活性的盐。出乎意料地是，本发明的方法很高效，原因是本领域中通常假定没有具光学活性的添加剂时难以有效分离两性离子(见DD 93 347，第2栏，第8-11行)。因此，难以设想通过本发明相对简易的方法能够获得显著增加的L-对映体形式。

可以以数目小的工序步骤和简易的方式实施本发明的方法。该方法不需要进行L-肉毒碱的具光学活性的盐的沉淀，通过额外的结晶步骤进行的分离和分解。该方法以高的对映体纯度和高的收率提供L-肉毒碱。与本领域已知的方法相比，本发明的方法成本和劳动密集度更少。本发明的方法可用于纯化来自对映体混合物(例如通过工业合成方法获得的对映体混合物)的L-肉毒碱。

实施例

实施例1

向实验室反应器中投入100g肉毒碱和300g乙醇。将反应器加热至65°C，并搅拌直至所有肉毒碱溶解。其后，将反应器的温度设定为37°C。在37°C下，添加纯L-肉毒碱种晶晶体。以-0.2K/min的速率将反应器的温度冷却至20°C。在20°C下，于2小时内添加900g丙酮。其后，将悬浮液冷却至10°C。在10°C下，分离固体，并用丙酮洗涤，在55°C和<100mbar下干燥。

结果，获得86.1g晶态的白色干燥固体。该固体包含99.036%(w/w)的总肉毒碱。其对映体纯度为99.60%(e.e.)。残余溶剂的含量为349mg/kg乙醇和386mg/kg丙酮。L-肉毒碱的总收率为88.6%。

实施例2

向实验室反应器中投入60.2g肉毒碱和60g甲醇。将反应器加热至50°C，并搅拌直至所有肉毒碱溶解。其后，将反应器的温度设定为25°C。在25°C下，添加0.74g纯L-肉毒碱种晶晶体。以-0.2K/min的速率将反应器的温度冷却至20°C。在20°C下，于1小时内添加180g丙酮。其后，将悬浮液在50分钟内冷却至10°C。在该温度下继续搅拌悬浮液30分钟。之后，通过Nutsch过滤器(Nutsch filter)将固体过滤，用大约60g的丙酮洗涤两次，随后在55°C和250mbar的压力下干燥8小时。

结果，获得45.78g晶态的白色干燥固体。该固体包含98.94%(w/w)的总肉毒碱。其对映体纯度为99.78%(e.e.)。

实施例3

向实验室反应器中投入30.1g肉毒碱和90g乙醇。将反应器加热至65°C，并搅拌直至所有肉毒碱溶解。其后，将反应器的温度设定为37°C。在37°C下，添加0.91g纯L-肉毒碱种晶晶体。以-0.2K/min的速率将反应器的温度冷却至20°C。在20°C下，于1小时内添加270g乙酸乙酯。其后，在50分钟内将悬浮液冷却至10°C。在该温度下继续搅拌悬浮液30分钟。之后，通过Nutsch过滤器将固体过滤，用大约30g的乙酸乙酯洗涤两次，随后在55°C和250mbar的压力下干燥8小时。

结果，获得28.66g晶态的白色干燥固体。该固体包含98.51%(w/w)的总肉毒碱。其对映体纯度为99.46%(e.e.)。

Claims (13)

1.制造L-肉毒碱的方法，其包括如下步骤：

(a)提供在第一溶剂中包含至少5％(w/w)肉毒碱的溶液，其中所述肉毒碱是D-和L-肉毒碱的混合物，

(b)任选地用L-肉毒碱晶体对所述溶液进行种晶，

(c)添加第二溶剂，L-肉毒碱在所述第二溶剂中不溶或溶解度低，

(d)分离包含L-肉毒碱的晶体，

其中所述第一溶剂选自由乙醇、甲醇、水、乙腈及其混合物组成的组，且

其中所述第二溶剂选自丙酮、异丙醇、异丁醇、2-丙醇、1-戊醇、2-丁酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、四氢呋喃、甲苯及其混合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中，总肉毒碱在所述第一溶剂中的浓度为5至75％(w/w)。

3.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中，肉毒碱包含大于80％(e.e.)的L-肉毒碱，且在步骤(d)中，所述晶体包含大于95％(e.e.)的L-肉毒碱。

4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括将溶液加热至40℃以上的温度。

5.如权利要求1所述的方法，其中L-肉毒碱于25℃下在所述第二溶剂中的溶解度小于2％(w/w)。

6.如权利要求1所述的方法，其中在种晶步骤(b)中，所述溶液的温度为25至50℃。

7.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中，所述第一溶剂与所述第二溶剂的比例为1:1至1:10(w/w)。

8.如权利要求1所述的方法，其中在种晶步骤(b)之后、在步骤(c)之前或期间、或在步骤(c)中添加所述第二溶剂之后，将所述溶液的温度调节到10℃至30℃。

9.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中，在20分钟至24个小时的时间跨度内，向所述溶液中添加所述第二溶剂。

10.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中添加所述第二溶剂之后，将组合物在低于20℃的温度下培育10分钟至2天。

11.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(d)中，所述晶体包含大于99％(e.e.)的L-肉毒碱。

12.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(d)中，通过过滤或沉淀来分离所述晶体。

13.如前述权利要求之一所述的方法，其中所述第一溶剂为乙醇，且所述第二溶剂为丙酮。