CN102649841A

CN102649841A - 苯胺基喹唑啉为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物及制法

Info

Publication number: CN102649841A
Application number: CN2012100985733A
Authority: CN
Inventors: 蔡进; 吉民
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2012-04-06
Filing date: 2012-04-06
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2032-04-06
Also published as: CN102649841B

Abstract

本发明提供了一种以4-取代苯胺基喹唑啉基团为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物及其制法，以聚乙二醇PEG为起始原料，经过与对甲基苯磺酰氯缩合、邻苯二甲酰亚胺钾盐取代以及水合肼水解步骤得到双胺基的PEG，再分别与靶向配体N-(3-氯-4-氟)-6-（3-氯丙基）-7-甲氧基喹唑啉-4-胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE反应，即得到4-取代苯胺基喹唑啉基团-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺4-Anilino-quinazolineGroup-PEG-DSPE。本发明的4-Anilino-quinazolineGroup-PEG-DSPE的脂质体制剂可以实现肿瘤细胞靶向给药，降低肿瘤药物的毒副作用，且吉非替尼的药效结构可以与该脂质体包覆的其它抗肿瘤药物发挥双重药效，极大的提高肿瘤治疗效果。

Description

苯胺基喹唑啉为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物及制法

技术领域

本发明涉及药用高分子辅料和药剂领域，具体涉及一类以4-取代苯胺基喹唑啉基团为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物，另外还涉及这类新型材料在抗肿瘤药物制剂中的应用。

背景技术

脂质体是由磷脂依靠疏水缔合作用在水中自发形成的一种分子有序组合体，为多层囊泡结构，每层均为类脂双分子层，层间和脂质体核内为水相，双分子膜间为油相。其性质与细胞膜相似，因此具有很好的生物相容性。然而当脂质体进入血液循环系统后，很容易被网状内皮系统（Reticulo-endothelial Systems,RES）识别而快速离开血流。因此，“长循环”是脂质体作为给药系统必须具备的基本性质。大量研究表明，在载体表面用亲水性的聚合物如聚乙二醇（PEG）进行化学修饰是达到这一特性的最佳方法，在体外，起立体屏障作用的聚合物可以保护脂质体不与各种溶剂产生作用；在生物学水平，用PEG修饰的脂质体不容易被血浆蛋白吸附，减少与调理素的相互作用，稳定性提高，同时可以有效地避免网状内皮系统的识别，从而大大延长在血液循环系统的停留时间，为其进入组织创造有利条件。

脂质体对肿瘤组织的靶向一般通过被动靶向和主动靶向的设计来实现，其中被动靶向的设计主要通过调控脂质体粒径的大小。肿瘤组织等病变部位的毛细血管壁内含亚微米孔道，其对亚微米粒子的截流尺寸大约在380nm到780nm之间。因此与正常组织（其毛细血管壁的通道仅为几纳米）相比，尺寸在100－200nm之间的纳米粒子透过肿瘤组织的毛细血管壁要相对容易。另一方面，与正常组织相比，由于肿瘤的淋巴毛细管也要少许多，因此通过淋巴系统排除纳米粒子的可能性也要小得多。这两方面的作用，使粒径在100nm左右的纳米粒子更容易进入并保留在肿瘤组织中，这一现象被称为“增强渗透与滞留效应”。因此，粒径在100nm左右的脂质体药物粒子对肿瘤有被动靶向的作用。1995年美国FDA批准阿霉素长循环脂质体(Doxil)上市用于治疗AIDS相关的卡波济肉瘤和卵巢癌，其成功上市即得益于脂质体表面的PEG外套和脂质体粒径的控制（100nm）。STEALTH是Doxil的脂质体载体，使其具有长循环特性的成分为甲氧基聚乙二醇－二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（MPEG-DSPE），结构如下式所示：

甲氧基聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺MPEG-DSPE

其结构是甲氧基聚乙二醇（MPEG，分子量约为2000）与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）通过羰基相联的产物（图2）。研究表明，与普通的阿霉素相比，该阿霉素长循环脂质体对肿瘤细胞的靶向性好，心脏毒性大大减少，抗肿瘤疗效增强。

包封于长循环脂质体中的抗癌药通过被动靶向可以显著地增加抗癌药物的治疗效果，但选择性地靶向到体内作用部位将比被动靶向进一步增加药物的治疗指数。实现脂质体药物对肿瘤器官、肿瘤或肿瘤细胞的主动靶向性能的常用方法有以下几种：(1)阳离子脂质体，靶向肿瘤细胞质膜上的负电荷；(2)磁性脂质体，在足够的体外磁场引导下，随血流运行，选择性地到达并定位于肿瘤靶区；(3)细胞渗透性多肽，用于增强肿瘤细胞对脂质体的内摄作用；(4)生物对，靶向在肿瘤细胞表面过表达的特异性分子；（5）配体-受体作用，靶向肿瘤细胞外或细胞内的特异性受体；（6）免疫脂质体，在脂质体外层连接肿瘤细胞特应性的抗体或抗体片段。

这些方法中研究最多的是将相应的靶向配体（抗体、叶酸、多肽、多糖片段等）连接到脂质体表面，为同时保留脂质体的长循环特性，这些配体通常与脂质体PEG外套的远端相连。

虽然针对脂质体肿瘤靶向作用的研究很多，也设计出多种肿瘤靶向的药物脂质体，但是到目前为止，还没有研究者尝试使用对肿瘤有高特异性的小分子药物或其片段作为脂质体的靶向配体来实现脂质体的肿瘤靶向。

随着肿瘤发病机制的进一步阐明，人们发现酪氨酸激酶在一系列恶性肿瘤的发生、发展中起重要的作用，以酪氨酸激酶为靶点进行药物研究成为国际上抗肿瘤药物研究的热点。研究表明靶向酪氨酸激酶的小分子抑制剂只作用于过度表达和激活激酶的肿瘤细胞，对正常细胞没有影响，不产生全身性毒副作用，因此其酶结合部分是很有潜力的肿瘤靶向配体。2003年第一个选择性作用于EGFR的酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼(Gefitinib)成功上市，单用于治疗既往接受过化学治疗或不适于化疗的局部晚期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC)，它是第一个用于实体瘤治疗的针对特定靶点的小分子抑制剂，分子靶点是高表达的上皮来源的实体瘤的表皮生长因子受体(EGFR)，结构如下式所示：

如果将吉非替尼的酶结合药效结构4-取代苯胺基喹唑啉基团作为靶向配体，通过PEG链偶联在脂质体上制备长循环脂质体，有望成为一种对肿瘤细胞具有主动靶向功能的新型抗肿瘤药物的载体。

发明内容

技术问题：本发明目的在于提供一种苯胺基喹唑啉为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物及制法，利用肿瘤有高特异性的小分子药物吉非替尼的4-取代苯胺基喹唑啉基团作为脂质体的靶向配体来实现脂质体的肿瘤靶向，填补了现有技术的空白，提供了一种对肿瘤细胞具有主动靶向功能的新型抗肿瘤药物的载体。

技术方案：本发明的目的通过以下技术方案得以实现。

本发明提供了一种4-取代苯胺基喹唑啉基团为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物或其药用酸加成盐，由下述通式（Ⅰ）表示，

（Ⅰ）

其中，该化合物结构中x为3~20的整数，y为3~20的整数，n为10-150的整数，P为磷原子，优选x=16，y=16，n=45。

本发明还提供了上述以4-取代苯胺基喹唑啉基团为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物或其药用酸加成盐的制备方法，以聚乙二醇（PEG）为起始原料，经过与对甲基苯磺酰氯缩合、邻苯二甲酰亚胺钾盐取代以及水合肼水解步骤得到双胺基的PEG，再分别与靶向配体N-(3-氯-4-氟)-6-（3-氯丙基）-7-甲氧基喹唑啉-4-胺（4-Anilino-quinazoline Group）和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）反应，即得到4-取代苯胺基喹唑啉基团-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（4-Anilino-quinazoline Group-PEG-DSPE），反应式如下：

优选的制备方法如下：

（1）聚乙二醇双对甲苯磺酸酯（TsO-PEG-TsO）的制备：将PEG与过量的对甲苯磺酰氯，在三乙胺的催化下常温反应10个小时，蒸干溶剂，无水乙醚洗涤，得到的产物使用二氯甲烷和乙醚混合溶剂重结晶，得到纯品，反应式如下：

（2）聚乙二醇双邻苯二甲酰胺（phthalimide-PEG-phthalimide）的制备：将步骤（1）制得的聚乙二醇双对甲苯磺酸酯（TsO-PEG-TsO）与过量的邻苯二甲酰钾盐在DMF中回流反应6小时，蒸干溶剂，得到油状物加入二氯甲烷，过滤，滤液蒸干得到的粗品使用二氯甲烷和乙醚混合溶剂重结晶，得到纯品，反应式如下：

（3）聚乙二醇双乙胺（H₂N-PEG-NH₂）的制备：将步骤（2）制得的聚乙二醇双邻苯二甲酰胺（phthalimide-PEG-phthalimide）溶于乙醇中，加入过量的水合肼回流反应3个小时，蒸干得到的粗品使用二氯甲烷和乙醚混合溶剂重结晶，得到纯品，反应式如下：

（4）4-取代苯胺基喹唑啉基团-聚乙二醇-单乙胺(4-Anilino-quinazoline Group-PEG-NH₂)的制备：将步骤（3）制得的聚乙二醇双乙胺（H₂N-PEG-NH₂）和碘化钾加入到DMF中，缓慢滴加N-(3-氯-4-氟)-6-（3-氯丙基）-7-甲氧基喹唑啉-4-胺的DMF溶液，70℃反应2个小时，减压蒸干，加入二氯甲烷溶解，以水萃取三次，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩得到的粗品用二氯甲烷/乙醚/三乙胺混合溶剂重结晶得到纯品，反应式如下：

（5）4-取代苯胺基喹唑啉基团-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（4-Anilino-quinazoline Group-PEG-DSPE）的制备：将步骤（4）制得的4-取代苯胺基喹唑啉基团-聚乙二醇-单乙胺(4-Anilino-quinazoline Group-PEG-NH₂)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）和羰基二咪唑加入到氯仿中，在三乙胺的催化下50℃反应3个小时，然后加入乙酸和乙腈，搅拌过滤，滤液浓缩至干，溶于碳酸氢钠水溶液，超滤，冻干得到最终产物，反应式如下：

上述制备方法中步骤（1）所述PEG为PEG₂₀₀₀、PEG₄₀₀₀或者PEG₆₀₀₀。

本发明中所用的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）为磷脂的一种，也可用二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）替代，反应条件与使用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）相似。

本发明还提供了一种上述以4-取代苯胺基喹唑啉基团为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物或其药用酸加成盐的脂质体药物制剂，含有脂质体基质、4-取代苯胺基喹唑啉基团-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（4-Anilino-quinazoline Group-PEG-DSPE）和药物。

上述药物为抗肿瘤药物，优选紫杉醇、表阿霉素、藤黄酸、多西紫杉醇、环孢素A、长春酰胺、柔红霉素中的任意一种或几种的组合。

所述脂质体基质为蛋黄卵磷脂（EPC）、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）或二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、胆固醇（Chol）的任意一种或几种的组合，其中DPPC和DSPC均为饱和卵磷脂脂质体基质。

本发明还提供了一种上述4-取代苯胺基喹唑啉基团为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物或其药用酸加成盐脂质体药物制剂，所述脂质体基质为蛋黄卵磷脂（EPC）和胆固醇，所述药物为阿霉素，各组分比例为蛋黄卵磷脂（EPC）:胆固醇（Chol）:4-取代苯胺基喹唑啉基团-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（4-Anilino-quinazoline Group-PEG-DSPE）:阿霉素=20:2:1:2（摩尔比）。

上述以4-取代苯胺基喹唑啉基团为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物或其药用酸加成盐脂质体药物制剂，所述脂质体平均粒径为70-160纳米，能使抗肿瘤药物在肿瘤部位主动靶向浓集。

有益效果：本发明以薄膜水化-超声法制备了阿霉素长循环脂质体，脂质体膜材由蛋黄卵磷脂(EPC)、胆固醇(Chol)和4-Anilino-quinazoline Group-PEG-DSPE组成。

通过考察Chol含量、EPC浓度以及药脂比对阿霉素包封率的影响，本发明确定了最佳处方为EPC:Chol:4-Anilino-quinazoline Group-PEG-DSPE:阿霉素=20:2:1:2（摩尔比），其中EPC浓度为20mM。包封率是指包封在脂质体内的药物量占总药量的百分比，更准确的说法是插入脂质双分子层的阿霉素占脂质体混悬液中阿霉素总量的百分比。根据该处方制备的长循环脂质体，阿霉素包封率高达95%以上。

粒度及分布是评价脂质体的另一重要指标，按照最佳处方制备的空白长循环脂质体和阿霉素长循环脂质体的平均粒度分别为80.05±0.63nm(n=3)和93.68±1.23nm (n=3)，分布均匀，范围窄。阿霉素脂质体因磷脂双分子层中镶嵌了阿霉素，粒度稍大于空白脂质体，符合规律。因粒度小于100nm，阿霉素脂质体在体内可以发挥其对肿瘤组织的被动靶向性。同时因粒度小于1μm，可安全用于静脉给药，符合制剂的要求。

目前唯一已用于临床的长循环脂质体抗肿瘤药物Doxil（甲氧基聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺（MPEG-DSPE）包覆阿霉素），存在血液循环时间过长在高剂量使用时引起皮肤毒性的缺陷，且在中国的售价非常昂贵，大大限制了中国肿瘤患者的使用。本发明的4-Anilino-quinazoline Group-PEG-DSPE的脂质体制剂可以实现肿瘤细胞靶向给药，降低肿瘤药物的毒副作用，提高药效。此外，吉非替尼本身就是实体瘤治疗的针对特定靶点的酪氨酸激酶抑制剂，可以与脂质体包覆的其它抗肿瘤药物发挥双重药效，极大的提高肿瘤治疗效果。本发明药理实验结果表明，用4-Anilino-quinazoline Group-PEG-DSPE修饰的脂质体制剂，可以明显提高所包载药物进入EGFR受体高表达细胞的能力（如人胰腺癌细胞Miapaca2,Panc1，人前列腺癌细胞DU145,PC3，人肺癌细胞A549,NCI-H661，以及人乳腺癌细胞MDA-MB-231），并对肿瘤细胞的抑制能力较普通脂质体明显增强。如图1和图2所示，阿霉素普通脂质体(Lip-doxorubicin)对七种人肿瘤细胞的IC50值在1.897-5.082μM范围内，而本发明的靶向长循环脂质体（4-Anilino-quinazoline Group-Lip-adriamycin）对七种人肿瘤细胞的IC50值在0.886-2.363μM范围内，本发明的靶向脂质体对于肿瘤细胞的抑制能力要明显强于普通脂质体。而本发明的靶向脂质体对正常细胞的IC₅₀值是对肿瘤细胞的IC₅₀值的10倍以上，这些结果表明本发明的靶向脂质体对肿瘤细胞的选择性更强，安全性更高。

采用PH敏感荧光探针BCECF-AM用于研究人胰腺癌细胞Panc1，人肺癌细胞A549和人前列腺癌细胞DU145与普通阿霉素脂质体和本发明的靶向长循环脂质体之间的粘附。结果显示，本发明的靶向长循环脂质体对三种人肿瘤细胞的粘附率要明显高于阿霉素普通脂质体，如表1所示。

表1三种人肿瘤细胞的粘附结果（%）

附图说明

图1为阿霉素普通脂质体对七种人肿瘤细胞及WI-38生长抑制活性图。

图2为本发明所述的4-Anilino-quinazoline Group-PEG-DSPE靶向长循环脂质体对七种人肿瘤细胞及WI-38生长抑制活性。

具体实施方式

实施例1

聚乙二醇2000双对甲苯磺酸酯（TsO-PEG-TsO）的制备

将1g HO-PEG₂₀₀₀-OH溶于20mL二氯甲烷中，再加入0.35g三乙胺和0.76g对甲苯磺酰氯于室温下搅拌反应10h，待完全反应，减压浓缩至干，加入无水乙醚洗涤，得到的粗品使用二氯甲烷/乙醚（1:5）重结晶，最终得到TsO-PEG₂₀₀₀-TsO 0.89g,产率为90%。

¹H-NMR(500MHZ,CDCl₃)δ(ppm):2.47(s,6H,Ar-CH₃),3.59(m,multi H,back bone–OCH₂CH₂O-),4.19(t,4H,-CH₂OTs),7.28(d,4H,J=7.9Hz,Ar-H),7.76(d, 4H,J=7.9Hz,Ar-H).IR(KBr,cm^-1):2885,1592,1463,1358,1266,1245

实施例2

聚乙二醇2000双邻苯二甲酰胺（phthalimide-PEG2000-phthalimide）的制备

将上步反应得到的TsO-PEG₂₀₀₀-TsO（0.7g）溶于8mL DMF中，加入邻苯二甲酰钾盐0.65g，回流反应6h停止反应，减压浓缩得到浅黄色油状物，加入10mL二氯甲烷，滤去不溶物，滤液减压浓缩得到的粗品用二氯甲烷/乙醚（1:6）重结晶，得到最终产物0.55g，收率85%。

¹H-NMR(500MHZ,CDCl₃)δ(ppm):3.61(m,multi H,back bone–OCH₂CH₂O-),7.65-7.88(m,8H,Ar-H).IR(KBr,cm^-1):2882,1715,1463,1356,1261.

实施例3

聚乙二醇2000双乙胺（H₂N-PEG₂₀₀₀-NH₂）的制备

将上步反应得到的phthalimide-PEG₂₀₀₀-phthalimide(0.6g)溶于10mL无水乙醇中，加入1.5mL水合肼，回流反应3h。减压浓缩得到黄色油状物，用二氯甲烷/乙醚（1:10）重结晶得到最终产物0.52g，收率94%。

¹H-NMR(500MHZ,CDCl₃)δ(ppm):2.92(m,4H,-CH₂NH₂),3.65(m,multi H,back bone–OCH₂CH₂O-).IR(KBr,cm^-1):3356,2879,1465,1357,1266。

实施例4

4-取代苯胺基喹唑啉基团-聚乙二醇2000-单乙胺的制备(4-Anilino-quinazoline Group-PEG₂₀₀₀-NH₂)

将上步反应得到的H₂N-PEG₂₀₀₀-NH₂（0.7g）和碘化钾（0.1g）加入到10mLDMF中，加热到70℃，在搅拌状态下缓慢滴加N-(3-氯-4-氟)-6-（3-氯丙基）-7-甲氧基喹唑啉-4-胺（0.15g溶于3mL DMF）溶液，2h后停止反应，减压浓缩至干，加入二氯甲烷溶解，以水萃取三次，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品，用二氯甲烷/乙醚/三乙胺（1:10：0.5）重结晶得到最终产物0.63g，产率75%。

¹H-NMR(500MHZ,CDCl₃)δ(ppm):2.43(tt,2H,-CH₂CH₂CH₂-),2.73(t,2H,-CH₂),2.95(m,4H,-CH₂NH₂),3.63(m,multi H,back bone-OCH₂CH₂O-),4.02(s, 3H,-OCH₃),4.26(t,2H,-OCH₂),7.13(s,1H,HAr),7.29(s,1H,HAr),7.49(s,1H,HAr),7.61(d,1H,HAr),7.98(d,1H,HAr),8.66(s,1H,HAr),10.44-10.80(b,1H,-NH-).IR(KBr,cm^-1):3345,2869,1453,1369,1258.

实施例5

4-取代苯胺基喹唑啉基团-聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的制备（4-Anilino-quinazoline Group-PEG₂₀₀₀-DSPE）

取上步反应制得的4-Anilino-quinazoline Group-PEG₂₀₀₀-NH₂（1g），二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（0.25g），羰基二咪唑（CDI，0.5g）和三乙胺2mL加入到15mL氯仿中，控温50℃反应3h，然后加入乙酸1.5mL、乙腈4mL，搅拌过滤、浓缩，溶于碳酸氢钠水溶液，超滤，冻干得4-取代苯胺基喹唑啉基团-聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺1.1g，产率86%。

¹H-NMR(500MHZ,CDCl₃)δ(ppm):0.85(m,6H,-CH3),1.26(m,multi H,back bone,-CH₂-),2.47(m,4H,-CH₂CH₂CH₂-),2.82(m,5H,-CH₂),2.98(m,4H,-CH₂-),3.65(m,multi H,back bone–OCH₂CH₂O-),4.09(s,3H,-OCH₃),4.28(m,4H,-CH₂),7.15(s,1H,HAr),7.26(s,1H,HAr),7.47(s,1H,HAr),7.63(d,1H,HAr),7.95(d,1H,HAr),8.68(s,1H,HAr).IR(KBr,cm^-1):3359,2858,1469,1388,1253.

实施例6

阿霉素靶向长循环脂质体的制备

选择薄膜水化—超声法制备脂质体，具体制备过程如下：

称取适量的干燥卵磷脂、胆固醇、本发明制备的4-Anilino-quinazoline Group-PEG-DSPE以及阿霉素置于圆底烧瓶中，用适量氯仿溶解。制备空白脂质体则不加入阿霉素。旋转蒸发干燥磷脂，温度设为30℃，干燥残留物出现后再继续此干燥操作过程10min。将烧瓶置于干燥器内过夜除去痕量溶剂。加入适量磷酸盐缓冲液，置于空气浴振荡仪中震荡30min-1h，水化干燥脂质膜，所形成的乳状混悬液主要是极不均匀的大多室脂质体。

取MLV分散体置于锥形离心管中，之后放在冰浴中。将超声波细胞破碎仪的探头浸入样品中，超声10-60min，有效时间为50%，直至分散体从乳状转变成乳光状。12000rpm离心15min，除去较大粒子（小于3%）和探头上脱落的金属屑，即制得脂质体。

实施例7

阿霉素靶向长循环脂质体包封率的测定

取阿霉素脂质体混悬液2mL平均分成两份，一份上已用空白脂质体预处理的Spehadex G-50凝胶柱，以pH 7.4的PBS为洗脱液分离脂质体和游离阿霉素。收集脂质体组分，加入1%Triton X-100破乳，于360nm处测定吸光度A_e，计算阿霉素浓度C_e。另一份脂质体样品稀释到与上柱后脂质体组分相同体积，加入1%Triton X-100破乳，于同样条件下测定吸光度A_t，计算阿霉素浓度C_t。以EE%=C_e/C_t×100%计算包封率。

实施例8

空白长循环脂质体和阿霉素长循环脂质体的平均粒度的测定

取新鲜制备的空白长循环脂质体和阿霉素长循环脂质体0.1ml，用去离子水稀释至1.0ml，用Zetasizer Nano-zs90激光粒度仪于室温下测定粒度。

实施例9

阿霉素普通脂质体和本发明的阿霉素靶向长循环脂质体的体外抗肿瘤细胞活性实验

（1）化合物溶液配制

精确称取一定质量的阿霉素普通脂质体和本发明的阿霉素靶向长循环脂质体，用DMSO溶解配制成20mM的储存液，于4℃保存，保存时间不超过一星期，使用时用培养基稀释至所需浓度。

（2）细胞株培养

人胰腺癌细胞株Miapaca2,Panc1，人前列腺癌细胞DU145,PC3，人肺癌细胞A549,NCI-H661，人乳腺癌细胞MDA-MB-23以及正常肺成纤维细胞株WI-38生长在含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中，37℃、5%CO2恒温箱中培养。

（3）细胞活力测定实验（WST-8法）

取对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，接种于96孔细胞培养板中，每孔5000细胞/0.1ml。加入化合物浓度3倍梯度稀释的培养基0.1ml，共5个浓度。于37℃、5%CO2恒温箱中培养72-96h小时后，弃原培养液，加入0.1mlWST-8试剂（1：10稀释）于37℃孵育1-2h后，多道酶标仪检测OD450nm和650nm的吸光度值。结果用处理组占对应空白对照组百分率表示，半数抑制浓度（IC₅₀）用GraphPad Prism 5.0软件拟合Sigmoid曲线计算得到。

实施例10

细胞粘附实验

采用PH敏感荧光探针BCECF-AM用于研究肿瘤细胞与普通阿霉素脂质体和本发明的靶向长循环脂质体之间的粘附。人胰腺癌细胞Panc1，人肺癌细胞A549和人前列腺癌细胞DU145（1×10⁶cells/mL）与3μM的BCECF-AM在37℃水浴中孵育0.5h，使用PBS缓冲液洗三次除去游离的BCECF-AM，标记过的细胞混悬在细胞培养液中备用。然后将阿霉素普通脂质体（Lip-doxorubicine）和阿霉素靶向长循环脂质体（4-Anilino-quinazoline Group-Lip-doxorubicine）分别溶于二氯甲烷中，滴加到盖玻片上，铺平，待二氯甲烷挥发后，在盖玻片上形成薄膜。将上述盖玻片分别置于8孔细胞培养板中，用PBS缓冲液冲洗三次，加入含5%BSA的磷酸盐缓冲液于5℃孵育2h封板，加入上述已标记好的肿瘤细胞，将培养板置于二氧化碳培养箱中，37℃孵育15min。孵育结束后，用PBS缓冲液洗去未粘附的细胞，粘附在盖玻片上的细胞用DMSO溶解，荧光分光光度法测定吸收度，计算细胞的吸附百分比。

Claims

1. 一种以4-取代苯胺基喹唑啉基团为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物，其特征在于该衍生物

由下述通式（Ⅰ）表示，

Figure 2012100985733100001DEST_PATH_IMAGE002

（Ⅰ）

其中，该化合物结构中x为3~20的整数，y为3~20的整数，n为10-150的整数，P为磷原子。

2.如权利要求1所述的4-取代苯胺基喹唑啉基团为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物，其特征在于所述通式（Ⅰ）的化合物结构中x = 16，y = 16，n = 45。

3.一种如权利要求1所述的4-取代苯胺基喹唑啉基团为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物的制备方法，其特征在于以聚乙二醇PEG为起始原料，经过与对甲基苯磺酰氯缩合、邻苯二甲酰亚胺钾盐取代以及水合肼水解步骤得到双胺基的PEG，再分别与靶向配体N-(3-氯-4-氟)-6-（3-氯丙基）-7-甲氧基喹唑啉-4-胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE反应，即得到4-取代苯胺基喹唑啉基团-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺4-Anilino-quinazoline Group -PEG-DSPE；具体步骤包括：

1）聚乙二醇双对甲苯磺酸酯TsO-PEG-TsO的制备：将PEG与过量的对甲苯磺酰氯，在三乙胺的催化下常温反应10-15个小时，蒸干溶剂，无水乙醚洗涤，得到的产物使用二氯甲烷和乙醚混合溶剂重结晶，得到纯品，反应式如下：

Figure 2012100985733100001DEST_PATH_IMAGE004

；

2）聚乙二醇双邻苯二甲酰胺 phthalimide-PEG-phthalimide的制备：将步骤1）制得的聚乙二醇双对甲苯磺酸酯TsO-PEG-TsO与过量的邻苯二甲酰钾盐在DMF中回流反应6-8小时，蒸干溶剂，得到油状物加入二氯甲烷，过滤，滤液蒸干得到的粗品使用二氯甲烷和乙醚混合溶剂重结晶，得到纯品，反应式如下：

Figure 2012100985733100001DEST_PATH_IMAGE006

；

3）聚乙二醇双乙胺 H₂N-PEG-NH₂的制备：将步骤2）制得的聚乙二醇双邻苯二甲酰胺 phthalimide-PEG-phthalimide溶于乙醇中，加入过量的水合肼回流反应3-5个小时，蒸干得到的粗品使用二氯甲烷和乙醚混合溶剂重结晶，得到纯品，反应式如下：

Figure 2012100985733100001DEST_PATH_IMAGE008

；

4）4-取代苯胺基喹唑啉基团-聚乙二醇-单乙胺4-Anilino-quinazoline Group -PEG-NH₂的制备：将步骤3）制得的聚乙二醇双乙胺 H₂N-PEG-NH₂和碘化钾加入到DMF中，缓慢滴加N-(3-氯-4-氟)-6-（3-氯丙基）-7-甲氧基喹唑啉-4-胺的DMF溶液，60-80℃反应2-5个小时，减压蒸干，加入二氯甲烷溶解，以水萃取三次，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩得到的粗品用二氯甲烷/乙醚/三乙胺混合溶剂重结晶得到纯品，反应式如下：

Figure 2012100985733100001DEST_PATH_IMAGE010

；

5）4-取代苯胺基喹唑啉基团-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺4-Anilino-quinazoline Group -PEG-DSPE的制备：将步骤4）制得的4-取代苯胺基喹唑啉基团-聚乙二醇-单乙胺4-Anilino-quinazoline Group -PEG-NH₂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE和羰基二咪唑加入到氯仿中，在三乙胺的催化下40-60℃反应3-6个小时，然后加入乙酸和乙腈，搅拌过滤，滤液浓缩至干，溶于碳酸氢钠水溶液，超滤，冻干制得最终产物，反应式如下：

Figure 2012100985733100001DEST_PATH_IMAGE012

。

4.如权利要求3所述的4-取代苯胺基喹唑啉基团为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物的制备方法，其特征在于所述步骤1）所述PEG为PEG₂₀₀₀、PEG₄₀₀₀或者PEG₆₀₀₀。

5.一种如权利要求1所述的4-取代苯胺基喹唑啉基团为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物的脂质体药物制剂，其特征在于该脂质体药物制剂含有脂质体基质、4-取代苯胺基喹唑啉基团-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（4-Anilino-quinazoline Group - PEG-DSPE）和药物。

6.如权利要求5所述的4-取代苯胺基喹唑啉基团为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物的脂质体药物制剂，其特征在于所述药物为抗肿瘤药物。

7.如权利要求6所述的4-取代苯胺基喹唑啉基团为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物的脂质体药物制剂，其特征在于所述抗肿瘤药物为紫杉醇、表阿霉素、藤黄酸、多西紫杉醇、环孢素A、长春酰胺或柔红霉素中的任意一种或几种的组合。

8.如权利要求5所述的4-取代苯胺基喹唑啉基团为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物的脂质体药物制剂，其特征在于所述脂质体基质为蛋黄卵磷脂EPC、二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC或胆固醇Chol中的一种或几种的组合，其中DPPC和DSPC均为饱和卵磷脂脂质体基质。

9.如权利要求8所述的4-取代苯胺基喹唑啉基团为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物的脂质体药物制剂，其特征在于所述脂质体基质为蛋黄卵磷脂EPC和胆固醇，所述药物为阿霉素；按摩尔比计，蛋黄卵磷脂EPC: 胆固醇Chol: 4-取代苯胺基喹唑啉基团-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（4-Anilino-quinazoline Group- PEG-DSPE）: 阿霉素 = 20: 2: 1: 2。

10.如权利要求5、6、7、8或9所述的4-取代苯胺基喹唑啉基团为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物的脂质体药物制剂，其特征在于所述脂质体平均粒径为70-160纳米，能使抗肿瘤药物在肿瘤部位主动靶向浓集。