CN102645531B - 碱性磷酸酶标记抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种碱性磷酸酶标记抗体的方法，采用如下步骤：包括碱性磷酸酶的溶解过程，碱性磷酸酶的氧化过程以及碱性磷酸酶与待标记的抗体溶液的反应过程，本发明同现有技术相比对酶氧化的试剂，缓冲液，氧化时间进行了优化，对操作过程中涉及到的透析繁琐操作进行了方法改进，简化了操作，缩短了时间。从而进一步提高了标记效果。
Description
[技术领域]
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种碱性磷酸酶标记抗体的方法。
[背景技术]
随着酶联免疫检测技术的发展，寻求一种简捷高效的酶标记抗体技术越来越重要。碱性磷酸酶(简称AP)作为一种免疫诊断试剂应用广泛的酶，将其偶联至抗体上，是诊断试剂开发中至关重要的一步。将标记抗体的方法基本上分为两类。一类用双功能基团的化合物使酶与抗体随机偶联，如戊二醛一步法。由于酶分子上游离氨基极少，而抗体分子上氨基则相对较多，为了弥补这一缺陷，往往采用8-12个酶分子与1个抗体分子的比值进行调整。戊二醛二步法的原理，主要是AP的氨基极少，而加入的戊二醛分子数相对较多，当戊二醛中的一个醛基与酶分子上的一个氨基结合后，则余下的一个醛基再与另一酶分子上的氨基作用的可能性极少，故很少产生酶与酶间的偶联。当除去未作用的戊二醛后，己醛化的酶与抗体作用而成为结合物，但这一方法标记效果也并不理想。另一类用过碘酸钠氧化酶分子中的含糖部分使酶本身产生多个醛基，酶的活性中心未受影响或影响不大，而醛化了的酶再与待标记的抗体作用即可获得结合物。这一方法由Nakane等首创，其特点是标记效果高而所得的结合物分子量较大。上述方法除标记效果较差的戊二醛一步法外，操作均较为复杂。
本发明结合以上标记方法，对酶氧化的试剂，缓冲液，氧化时间进行了优化，对操作过程中涉及到的透析繁琐操作进行了方法改进，简化了操作，缩短了时间。在此基础上实现了进一步提高标记效果，操作简便，稳定的碱性磷酸酶标记抗体的方法。
[发明内容]
本发明为了克服现有技术的不足，提供了一种标记效果好、操作简单的碱性磷酸酶标记抗体的方法。
为了实现上述目的，本发明设计了一种碱性磷酸酶标记抗体的方法，采用如下步骤：
A)将5mg碱性磷酸酶溶解在含量为0.5ml浓度为0.05M，PH值为3.6-6.6的NaAc溶液中，使碱性磷酸酶的浓度为3-10mg/ml；
B)向步骤A中的酶溶液内加入等体积的过碘酸钠溶液，并在室温为4摄氏度的条件下进行氧化，氧化时间为20min；
C)向氧化后的酶溶液内，加入与步骤A所得溶液等体积的乙二醇-NaCl溶液；
D)向步骤C中的溶液内，加入含量为1.5ml的冰冷无水乙醇，混匀，并在室温为-20℃的条件下静置1小时，4000g离心10min，得到氧化好的酶；
E)用含量为0.5ml浓度为0.05M，pH值为8-10的碳酸盐缓冲液溶解沉淀步骤D中得到的酶，并加戊二醛0.1ml，混匀；
F)按质量比，酶∶抗体的比例范围为1∶1至1∶4的比例，加入待标记的抗体溶液进行反应，反应时间为1-3小时；
G)按质量比，NaBH4∶酶的比例范围为0.1∶1至0.2∶1的比例，加入NaBH4溶液，室温放置1-3小时；
H)加入0.6ml的冰冷无水乙醇，并在-20℃的室温下静置1小时，4000g离心10分钟；
I)按所需酶标抗体浓度用PBS溶解或冻干保存。
所述乙二醇-NaCl溶液的配方为NaCl，乙二醇和水。
所述的NaCl的含量为22g，乙二醇的含量为2.3ml，水的含量100ml。
所述待标记的抗体溶液为HbcAb的PBS溶液。
本发明同现有技术相比，对酶氧化的试剂，缓冲液，氧化时间进行了优化，对操作过程中涉及到的透析繁琐操作进行了方法改进，简化了操作，缩短了时间。从而进一步提高了标记效果。
[附图说明]
图1为本发明实施例一中表1的线形图。
图2为本发明实施例二中表2的线形图。
图3为本发明实施例三中表3的线形图。
图4为本发明实施例四中表4的线形图。
[具体实施方式]
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例一：
A)将5mg碱性磷酸酶溶解在含量为0.5ml浓度为0.05M，PH值为5.6的NaAc溶液中。
B)向步骤A中的酶溶液内加入0.5ml浓度为0.06M过碘酸钠溶液，并在室温为4摄氏度的条件下进行氧化，氧化时间为20min。
C)向氧化后的酶溶液内，加入0.5ml乙二醇-NaCl溶液。乙二醇-NaCl溶液的配方为，称取22g NaCl，加2.3ml乙二醇，再加水至100ml制得该溶液，室温可长期保存。
D)向步骤C中的溶液内，加入含量为1.5ml的冰冷无水乙醇，混匀，并在室温为-20℃的条件下静置1小时，4000g离心10min，得到氧化好的酶。
E)用含量为0.5ml浓度为0.5M，pH值为9.6的碳酸盐缓冲液溶解沉淀步骤D中得到的酶，并加戊二醛0.1ml，混匀。
F)加待标记的10mg/ml的HbcAb的PBS溶液0.05ml，反应2小时。
G)加4mg/ml的NaBH4溶液0.25ml，室温放置2小时。
H)加入0.6ml的冰冷无水乙醇，并在-20℃的室温下静置1小时，4000g离心10分钟。
I)加0.5mlPBS溶解。
在ELISA板上包被HbcAg抗原，进行直接法ELISA进行酶标记效率的检查，结果如下表和图1所示。
实施例二：
A)将5mg碱性磷酸酶溶解在含量为0.5ml浓度为0.05M，PH值为3.6的NaAc溶液中。
B)向步骤A中的酶溶液内加入0.5ml浓度为0.06M过碘酸钠溶液，并在室温为4摄氏度的条件下进行氧化，氧化时间为20min。
C)向氧化后的酶溶液内，加入0.5ml乙二醇-NaCl溶液。乙二醇-NaCl溶液的配方为，称取22g NaCl，加2.3ml乙二醇，再加水至100ml制得该溶液，室温可长期保存。
D)向步骤C中的溶液内，加入含量为1.5ml的冰冷无水乙醇，混匀，并在室温为-20℃的条件下静置1小时，4000g离心10min，得到氧化好的酶。
E)用含量为0.5ml浓度为0.5M，pH值为9.6的碳酸盐缓冲液溶解沉淀步骤D中得到的酶，并加戊二醛0.1ml，混匀。
F)加待标记的10mg/ml的HbcAb的PBS溶液0.05ml，反应2小时。
G)加4mg/ml的NaBH4溶液0.25ml，室温放置2小时。
H)加入0.6ml的冰冷无水乙醇，并在-20℃的室温下静置1小时，4000g离心10分钟。
I)加0.5mlPBS溶解。
在ELISA板上包被HbcAg抗原，进行直接法ELISA进行酶标记效率的检查，结果下表和图2所示。
实施例三：
A)将5mg碱性磷酸酶溶解在含量为0.5ml浓度为0.05M，PH值为5.6的NaAc溶液中。
B)向步骤A中的酶溶液内加入0.5ml浓度为0.1M过碘酸钠溶液，并在室温为4摄氏度的条件下进行氧化，氧化时间为20min。
C)向氧化后的酶溶液内，加入0.5ml乙二醇-NaCl溶液。乙二醇-NaCl溶液的配方为，称取22g NaCl，加2.3ml乙二醇，再加水至100ml制得该溶液，室温可长期保存。
D)向步骤C中的溶液内，加入含量为1.5ml的冰冷无水乙醇，混匀，并在室温为-20℃的条件下静置1小时，4000g离心10min，得到氧化好的酶。
E)用含量为0.5ml浓度为0.5M，pH值为9.6的碳酸盐缓冲液溶解沉淀步骤D中得到的酶，并加戊二醛0.1ml，混匀。
F)加待标记的10mg/ml的HbcAb的PBS溶液0.05ml，反应2小时。
G)加4mg/ml的NaBH4溶液0.25ml，室温放置2小时。
H)加入0.6ml的冰冷无水乙醇，并在-20℃的室温下静置1小时，4000g离心10分钟。
I)加0.5mlPBS溶解。
在ELISA板上包被HbcAg抗原，进行直接法ELISA进行酶标记效率的检查，结果下表和图3所示。
实施例四：
A)将5mg碱性磷酸酶溶解在含量为0.5ml浓度为0.05M，PH值为5.6的NaAc溶液中。
B)向步骤A中的酶溶液内加入0.5ml浓度为0.1M过碘酸钠溶液，并在室温为4摄氏度的条件下进行氧化，氧化时间为20min。
C)向氧化后的酶溶液内，加入0.5ml乙二醇-NaCl溶液。乙二醇-NaCl溶液的配方为，称取22g NaCl，加2.3ml乙二醇，再加水至100ml制得该溶液，室温可长期保存。
D)向步骤C中的溶液内，加入含量为1.5ml的冰冷无水乙醇，混匀，并在室温为-20℃的条件下静置1小时，4000g离心10min，得到氧化好的酶。
E)用含量为0.5ml浓度为0.5M，pH值为9.6的碳酸盐缓冲液溶解沉淀步骤D中得到的酶，并加戊二醛0.1ml，混匀。
F)加待标记的10mg/ml的HbcAb的PBS溶液0.1ml，反应2小时。
G)加4mg/ml的NaBH4溶液0.25ml，室温放置2小时。
H)加入0.6ml的冰冷无水乙醇，并在-20℃的室温下静置1小时，4000g离心10分钟。
I)加0.5mlPBS溶解。
在ELISA板上包被HbcAg抗原，进行直接法ELISA进行酶标记效率的检查，结果如表4和图4所示。
表4：
参照本发明中的实施例4，将本发明的方法与Nakane经典法和改良的wilson法的比较，结果如下表所示：
以下不同PH值的醋酸钠缓冲液对NaIO4氧化碱性磷酸酶的影响
将碱性磷酸酶分别溶于pH值为3.6；4.6；5.6；6.0的醋酸钠缓冲液和水中，其余均按照一般标记方法进行，考核各结合物效果如下表所示。
以下为NaIO4氧化的适宜浓度
将10mg/ml的酶的水溶液加等量的浓度分别为0.12M；0.06M；0.03M；0.01M及0.001M的NaIO4溶液进行氧化，其他步骤均按照一般标记方法，显示效价分别为8+，8+，8+，6+及2+。
以下为NaIO4氧化的适宜时间
将酶分别溶于水或浓度为0.05M pH值为5.6的醋酸钠缓冲液，各加等量浓度为0.06M的NaIO4，分别氧化10；15；30分钟及1小时。凡氧化10-30分钟的，除以水作为溶剂的PH值为7+，其余均为8+。氧化1小时结合物效价均相对地降低。
通过以上数据可知，本发明结合以上标记方法，对酶氧化的试剂，缓冲液，氧化时间进行了优化，对操作过程中涉及到的透析繁琐操作进行了方法改进，简化了操作，缩短了时间，并且在此基础上进一步实现了提高标记效果。
Claims (4)
1.一种碱性磷酸酶标记抗体的方法，采用如下步骤：
A）将5mg碱性磷酸酶溶解在含量为0.5mL浓度为0.05M，pH值为3.6-6.6的NaAc溶液中，使碱性磷酸酶的浓度为3-10mg/mL；
B）向步骤A中的酶溶液内加入等体积的过碘酸钠溶液，并在4摄氏度的条件下进行氧化，氧化时间为20min；
C）向氧化后的酶溶液内，加入与步骤A所得溶液等体积的乙二醇-NaCl溶液；
D）向步骤C中的溶液内，加入含量为1.5mL的冰冷无水乙醇，混匀，并在-20℃的条件下静置1小时，4000g离心10min，得到氧化好的酶；
E）用含量为0.5mL浓度为0.5M，pH值为8-10的碳酸盐缓冲液溶解沉淀步骤D中得到的酶，并加戊二醛0.1mL，混匀；
F）按质量比，酶:抗体的比例范围为1:1至1:4的比例，加入待标记的抗体溶液进行反应，反应时间为1-3小时；
G）按质量比，NaBH4:酶的比例范围为0.1:1至0.2:1的比例，加入NaBH4溶液，室温放置1-3小时；
H）加入0.6mL的冰冷无水乙醇，并在-20℃下静置1小时，4000g离心10分钟；
I）按所需酶标抗体浓度用PBS溶解或冻干保存。
2.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶标记抗体的方法，其特征在于：所述乙二醇-NaCl溶液的配方为NaCl,乙二醇和水。
3.根据权利要求2所述的碱性磷酸酶标记抗体的方法，其特征在于：所述的NaCl的含量为22g，乙二醇的含量为2.3mL，水的含量100mL。
4.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶标记抗体的方法，其特征在于：所述待标记的抗体溶液为HbcAb的PBS溶液。
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Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110967493B (zh) * | 2018-09-29 | 2022-08-02 | 深圳天辰医疗科技有限公司 | 一种维生素b12测定试剂盒及其制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1123574A (ja) * | 1997-07-01 | 1999-01-29 | Toyobo Co Ltd | 生理活性物質に酵素を結合する方法 |
| CN101368973A (zh) * | 2008-04-29 | 2009-02-18 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 一种检测人生长激素化学发光免疫分析测定试剂盒 |
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Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01123574A (ja) * | 1987-11-07 | 1989-05-16 | Mitsubishi Electric Corp | 左右糸巻きひずみ補正回路 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1123574A (ja) * | 1997-07-01 | 1999-01-29 | Toyobo Co Ltd | 生理活性物質に酵素を結合する方法 |
| CN101368973A (zh) * | 2008-04-29 | 2009-02-18 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 一种检测人生长激素化学发光免疫分析测定试剂盒 |
| CN101839915A (zh) * | 2010-06-17 | 2010-09-22 | 新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心 | 检测动物鼠疫f1抗原的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Efficient labelling of antibodies with horseradish peroxidase using cyanuric chloride;Ramadan A. Abuknesha et al;《Journal of Immunological Methods》;20050921;第306卷;第211－217页 * |
| Ramadan A. Abuknesha et al.Efficient labelling of antibodies with horseradish peroxidase using cyanuric chloride.《Journal of Immunological Methods》.2005,第306卷 |
| 酶联免疫吸附试验及其应用;鲍行豪;《中国生命科学论坛》;20051231;第8－13页 * |
| 骆加里.过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶(HRP)中的若干问题及高效果的标记方法.《生物化学与生物物理学报》.1984,第16卷(第6期), * |
| 鲍行豪.酶联免疫吸附试验及其应用.《中国生命科学论坛》.2005, |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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