CN102643759B - 生物途径制备肉桂酰胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过生物途径合成肉桂酰胺的方法。具体地，本发明提供了一种新的生产肉桂酰胺或其盐的微生物及使用该微生物生产肉桂酰胺的方法。本发明的微生物链霉菌(Streptomyces sp.)CGMCC NO.4487是从土壤中筛选所得的一株放线菌链霉菌属菌种。该菌株通过发酵产生的高效地产生肉桂酰胺。本发明还提供了高效、简便的制备和分离提取肉桂酰胺的方法，从而实现了通过生物途径生产肉桂酰胺。

Description

生物途径制备肉桂酰胺的方法

技术领域

本发明涉及化工领域，具体地涉及生物途径制备肉桂酰胺的方法。本发明提供了新的生产肉桂酰胺的微生物及使用该微生物生产肉桂酰胺或其盐或衍生物的方法。

背景技术

肉桂酰胺是一种重要的化学原料。作为有机合成中间体，肉桂酰胺广泛应用于医药合成及精细化工等领域。

肉桂酰胺是白色结晶物质，不溶于冷水，微溶于热水，溶于乙醚和二硫化碳。肉桂酰胺还可以作为脊椎、非脊椎害物的趋避剂，并对线虫有一定的抑制作用，从而减少害物对植作物的危害。肉桂酰胺可抑制肿瘤的生长和转移，是一个具有开发前景的抗肿瘤化合物。肉桂酰胺的衍生物可作为脑神经保护剂、受体拮抗剂等。

目前，肉桂酰胺是通过化学合成的方法得到的。工业上，大都通过肉桂酸和二氯亚砜加热反应生成肉桂酰氯，再通过浓氨水和肉桂酰氯反应经处理而生成。肉桂酰胺传统生成工艺存在安全性较低、对设备要求高、能耗高、污染大、分离困难等缺点。另外，肉桂酰胺的生产很大程度上受制于原料肉桂酸的供应。

通过生物法合成肉桂酰胺可以改善化学法合成的种种弊端，这些弊端包括原料来源限制、试剂环境污染、副产物较多、分离提纯困难等。生物发酵法的原料具有可再生性，不受季节和自然环境的影响、价格低廉、可批量生产，具有安全、清洁、无污染、低能耗等优点，因而生物合成法已经成为国内外的研究热点。

肉桂酰胺在生物合成方面的研究很少。1969年，G.S.BEZAN等发现利用轮丝链霉菌(Streptomyces vorticillatus)ATCC 13495可生成少量肉桂酰胺，并采用¹⁴C标记L-苯丙氨酸上的羰基碳进行其代谢途径的研究(J Microb，1970，16：147-52.)。结果表明，在该ATCC 13495菌种的代谢途径中，L-苯丙氨酸部分生成肉桂酸，然后得到肉桂酰胺。

2004年，Mara Brunati等发现链霉菌可以生物催化肉桂酸生成肉桂酰胺。但这些过程的产物得率较低(10-40mg/L)，副产物比较多，制约了生物途径制备肉桂酰胺的产业化进程，应用前景有限。

另外，有报道对羟基肉桂酸可通过生物或化学途径生成生物燃料对羟基苯乙烯。这提示，从肉桂酰胺转化生成肉桂酸进而生成苯乙烯是可行的，因此生物合成的肉桂酰胺还可能在生物燃料领域具有潜在的应用价值。

因此，大规模工业化生产迫切需求开发高效率生产肉桂酰胺的微生物和相应的生产工艺。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效生产肉桂酰胺的微生物和方法。

在本发明的第一方面，提供了一种放线菌链霉菌属的微生物，所述的微生物的保藏号是CGMCC NO.4487。

在另一优选例中，所述的微生物是链霉菌(Streptomyces turgidiscabies)

在本发明的第二方面，提供了本发明第一方面中所述的微生物的用途，它被用于生产肉桂酰胺或其盐或其衍生物。

在本发明的第三方面，提供了一种生产肉桂酰胺或其盐的方法，包括以下步骤：

(a)在20-55℃，pH5.0-9.0条件下，培养保藏号CGMCC NO.4487的链霉菌(Streptomyces sp.)，从而产生肉桂酰胺或其盐；

(b)从发酵产物中分离出肉桂酰胺或其盐。

在另一优选例中，还包括步骤：将步骤(b)中获得的肉桂酰胺进行成盐反应，形成肉桂酰胺盐。

在另一优选例中，步骤(a)中用液体培养基进行发酵。

在另一优选例中，步骤(a)的发酵时间为1-20天。

在另一优选例中，所述的发酵时间为1.5-10天。

在另一优选例中，步骤(b)中所述的分离包括：从发酵液中分离肉桂酰胺和/或从菌体分离肉桂酰胺。

在另一优选例中，所述的分离包括：以发酵液为原料，经硅藻土吸附抽滤，二氯甲烷萃取，重结晶，从而获得肉桂酰胺。

在另一优选例中，步骤(a)的发酵条件包括：采用含碳源和氮源的液态基础培养基，初始pH控制在5.0-9.0之间，并在20-45℃下摇床培养。

在另一优选例中，发酵条件还包括：将摇床转速控制在180-250rpm，温度控制在25-35℃，pH控制在7.0-7.5。

在另一优选例中，在步骤(a)中还包括用NaOH或HCl溶液调节pH值至6.5-8。

在本发明的第四方面，提供了通过上述生物途径制备的放线菌次级代谢产物肉桂酰胺。

在另一优选例中，所述的肉桂酰胺是以液体培养基对放线菌链霉菌属进行发酵，取发酵液为原料，经硅藻土吸附抽滤，二氯甲烷萃取，蒸除溶剂，重结晶等分离提取步骤而得到的提取物，为白色固体。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了根据16S rDNA全序列的相似性原理，构建的放线菌菌株CGMCC 4487的系统发育树。

图2显示了对本发明方法制备的肉桂酰胺的HPLC检测的谱图，其中横坐标为时间；纵坐标为峰面积响应值。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过传统的微生物筛选方法获得了一株新的微生物，它可高效地产生肉桂酰胺，这一菌株被命名为链霉菌(Streptomyces sp.)。在此菌株的基础上完成了本发明。

菌株

本发明的菌株于2010年12月17日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国，北京)，编号为CGMCC NO.4487。

如本文所用，术语“本发明菌株”或“本发明微生物”指编号为CGMCC NO.4487的链霉菌。

该菌株为从土壤中分离筛选出的放线菌链霉菌属，经过对菌株进行形态观察和生理生化特征的研究，以及16S rDNA的核苷酸全序列进行分析测序，进而构建的生物进化树暂时将该菌株归属为Streptomyces turgidiscabies。

本发明菌株的部分生理生化特征如下：可以产生蛋白酶，使牛奶胨化；能产生淀粉酶；能够利用明胶；对硝酸盐具有还原能力。但不能产生酪氨酸激酶和纤维素酶；生长过程中不能产生H₂S。

应理解，本发明菌株不仅包括CGMCC NO.4487，还包括其衍生菌株。

发酵生产肉桂酰胺

本发明的菌株CGMCC NO.4487可用于通过生物法制备肉桂酰胺或其盐或其衍生物。其中，所述的盐包括(但并不限于)：盐酸盐，硫酸盐，磷酸盐、醋酸盐，柠檬酸盐、其他有机羧酸盐等。一方面，发酵会产生肉桂酰胺及其盐或衍生物，此外对于获得的肉桂酰胺可进行成盐反应或衍生反应，从而形成肉桂酰胺盐或衍生物。

本发明的生产方法，除了生产菌不同之外，其他条件与现有技术中发酵生产的方法基本相同，例如对肉桂酰胺粗品的重结晶工艺。

本发明菌株的发酵条件与一般的链霉菌相近，即在含碳源、氮源和微量元素的培养基中，在pH5.0-9.0(较佳地pH7.0-7.5)和20-45℃(较佳地25-40℃)发酵。

在本发明中，“菌丝体”、“发酵液”或“培养液”可通过在适合生长的条件下培养本发明菌株，使其生长至一定的菌丝体浓度来获得。

用于培养本发明菌株的培养基中的营养源没有特别的限制。本领域技术人员可以根据公知的技术来选择合适的碳源、氮源和其他营养源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、肌醇、甘露醇等。氮源可以是胨、大豆粉、黄豆饼粉、肉膏、蛋白粉、麦皮、米糖、酵母粉、玉米浆、铵盐以及其他有机物或无机含氮化合物。另外，培养基中还可适当加入一些无机盐类，如氯化钠、磷酸盐(如磷酸二氢钾和磷酸氢二钾等)、硫酸锰、硫酸铵、硫酸镁、碳酸钙等金属盐。通常可采用各种已知的常规培养基，如LB琼脂培养基、营养琼脂培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基和牛肉浸汁琼脂培养基等对本菌株进行斜面固体培养并4℃环境下进行初步保藏。

在一个具体实施方案中，用于培养本发明菌株的培养基具有以下组成(％表示质量/体积)：葡萄糖0.1％～3％、可溶性淀粉0.1％～3％、蛋白胨0～3％、黄豆饼粉0.1％～3％、酵母粉0.01％～1％、牛肉膏0.01％～0.5％、NaCl 0.1％～3％、K₂HPO₄0.01％～0.5％、pH 6.8～7.4。然而，本领域技术人员应当理解，本发明并不局限于本文中列举的这些具体培养基配方。

培养本发明中的菌株的温度、pH、气液比、罐压、转速等条件没有特别严格的限制，只要该条件适合该菌的生长即可。

在培养时可采用豆油等消泡剂进行消泡。在一些较佳的实施方案中，pH宜控制在6.5～8.0之间，培养温度宜在25～40℃之间。

应理解，本发明的发酵可以是连续发酵，也可以是间歇式发酵。

在本发明的一个较佳的实施方案中，通过以下方法培养所述放线菌来得到发酵液和菌丝体：在含有碳源、氮源、无机盐的基础培养基中，发酵温度在20～35℃之间、转速在100rpm或以上，其中所述碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉和大米粉中的1种或几种，所述氮源选自牛肉膏、蛋白胨、蛋白粉、酵母粉、花生饼粉和黄豆饼粉中的1种或几种，所述无机盐包括常规的无机盐，如NaCl、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、MgCl₂、KCl、KH₂PO₄、K₂HPO₄和CaCO₃。

分离纯化

本发明还提供了从发酵产物中分离纯化放线菌次级代谢产物肉桂酰胺的方法，以及所得到的肉桂酰胺。

在一个优选例中，将本发明菌株在液态培养基中进行发酵，取发酵液为原料，经硅藻土吸附抽滤，二氯甲烷萃取，旋蒸除溶剂，重结晶的分离提取步骤而得到的提取物，经结构鉴定为肉桂酰胺。

在另一优选例中，肉桂酰胺的制备方法包括以下步骤：

(1)采用固态或液态培养基(优选液态培养基)对该放线菌CGMCC No.4487进行发酵培养；

(2)发酵后，将发酵液中添加硅藻土(以50ml发酵液添加2-20g硅藻土的比例)，混合均匀，真空抽滤，得滤液；或者

对发酵液用离心机离心处理，转速4000-8000rpm，离心时间10-30min，离心后获得上清液；

(3)将滤液或上清液，用二氯甲烷萃取，萃取3-5次；

(4)取有机相，添加无水硫酸镁除水，过滤，取滤液，蒸除溶剂，得到肉桂酰胺粗品。

(5)采用乙醚和乙醇溶剂将肉桂酰胺粗品进行重结晶，即得到白色肉桂酰胺纯品。

分离提取所得到的肉桂酰胺采用常规的HPLC等检测方法对其含量进行分析。

产业应用和优点

本发明不仅提供了合适的微生物菌株，还通过培养基的优化以及发酵过程的调控，进一步提高微生物发酵生产肉桂酰胺的效率。本发明实现了通过放线菌发酵制备高产量的次级代谢产物肉桂酰胺，具有重要的研究意义和实用价值，经济效益可观。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明菌株可高效地生产肉桂酰胺，产量可高达约560ppm/L。

(b)在可基础培养基中进行发酵生产，不必添加昂贵的原料，从而大幅降低生产成本。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

肉桂酰胺生产菌株的获得和鉴定

1.微生物的分离筛选

从中国各地采集得到的土壤样本以10^-2-10^-6稀释然后铺于平板上，平板于28℃恒温培养7-10天。共约1,500个菌株被分离出来用于摇瓶筛选。其中有1株从土壤分离所得的放线菌菌株显示能高效产生肉桂酰胺。

2.菌株特性

2.1形态特征

在以果糖为碳源的固体培养基上的菌落形态特征为：菌落突起、大致呈圆型、直径小、丝状有褶皱。

2.2培养特征

配制固体斜面培养基，菌株接种过程中应注意只接种孢子或菌种本身，以避免带入其他碳源，干扰试验结果。

其中，基础培养基为无碳源培养基，成分为：(NH)₂SO₄ 2.6g；K₂HPO₄ 5.65g；MgSO₄·7H₂O 1g；CuSO₄·5H₂O 0.0064g；FeSO₄·7H₂O 0.0011g；MnCl₂·4H₂O0.0079g；ZnSO₄·7H₂O 0.0015g；琼脂18g；蒸馏水1L；pH：7.2-7.4。选用的碳源有：阿拉伯糖，葡萄糖，鼠李糖，木糖，果糖，蔗糖，棉子糖，甘露糖，肌醇。每种碳源均按基础培养基的1％加入。

将待测菌株分别接种于空白基础培养基、分别添加9种不同碳源的基础培养基中，其中空白基础培养基作为对照组。培养箱中28℃恒温培养，7-12天后观察，分别纪录生长利用情况。若待测菌株在含碳培养基中的生长情况明显超过空白基础培养基，则试验结果定为阳性。

结果如下表：

2.3生理生化特征：

可以产生蛋白酶，使牛奶胨化；能产生淀粉酶；能够利用明胶；对硝酸盐具有还原能力。但不能产生酪氨酸激酶和纤维素酶；生长过程中不能产生H₂S。

2.4菌种鉴定结果

抽提该菌株的DNA，对16S rDNA的核苷酸全序列进行分析测序和分析。结果如图1所示，基于构建的生物进化树，暂时将该菌株归属为Streptomycesturgidiscabies中的一支。应理解，这种归属是对本发明的保护范围无影响。

本实施例中分离和鉴定的菌株于2010年12月17日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国，北京)，编号为CGMCC NO.4487。

实施例2

肉桂酰胺的制备

本实施例中，从发酵液中分离肉桂酰胺

步骤一、以液体培养基对放线菌CGMCC No.4487进行液体发酵，“2-3菌落个数/50ml液体培养基”的接种量，发酵培养基成分为可溶性淀粉10g，葡萄糖20g，黄豆粉25g，酵母粉4g，牛肉浸膏1g，NaCl 2g，K₂HPO₄ 0.05g，离子水1000ml，pH7.0，摇瓶发酵，装量50ml/250ml三角瓶，温度28-30℃，摇床转速220rpm，培养4天。

步骤二、取发酵液为原料，添加硅藻土(以50ml发酵液添加10g硅藻土的比例)，摇床150rpm，10min混合均匀，将混合液采用真空泵进行抽滤，取得滤液，并对滤饼用适量去离子水冲洗。

步骤三、合并上步骤二中的滤液，用二氯甲烷进行萃取，萃取3-5次。

步骤四、取有机相，添加无水硫酸镁除水，恒压过滤，取滤液上旋转蒸发仪，进而得到肉桂酰胺粗品。

步骤五、采用乙醚和乙醇溶剂将肉桂酰胺粗品进行重结晶，即得到白色肉桂酰胺纯品。

结果，获得了白色肉桂酰胺纯品，胞外产率可达180mg/L。

实施例3

肉桂酰胺的制备

本实施例中，从发酵液和菌丝体中分离肉桂酰胺。

步骤一、如实施例2。

步骤二、取发酵液，4000rpm离心后得到发酵上清液和菌丝体部分。菌丝体部分用80％的丙酮水溶液以体积比1∶1的用量浸提12小时(预处理)，浸提后5000rpm冷冻离心，过滤后除去滤渣，减压浓缩至除去丙酮剩含水混合物。发酵液部分添加硅藻土(以50ml发酵液添加10g硅藻土的比例)，摇床150rpm，10min混合均匀，将混合液采用真空泵进行抽滤，取得滤液，并对滤饼用适量去离子水冲洗。

步骤三、合并上步骤二中的滤液，用二氯甲烷进行萃取，萃取3-5次。

步骤四、取有机相，添加无水硫酸镁除水，恒压过滤，取滤液上旋转蒸发仪，进而得到肉桂酰胺粗品。

步骤五、采用乙醚和乙醇溶剂将肉桂酰胺粗品进行重结晶，即得到白色肉桂酰胺纯品。

结果，获得了白色肉桂酰胺纯品，产率可达360mg/L。这表明，肉桂酰胺存在于发酵液和菌丝体中。

实施例4

肉桂酰胺的制备

制备方法如下：

步骤一、以液体培养基对放线菌CGMCC No.4487进行发酵，“2-3菌落个数/50ml液体培养基”的接种量，发酵培养基成分为可溶性淀粉10g，酵母粉4g，牛肉浸膏1g，NaCl 2g，K₂HPO₄0.05g，肉桂酸0.25g，离子水1000ml，pH7.0，摇瓶发酵，装量50ml/250ml三角瓶，温度28-30℃，摇床转速220rpm，培养4天。

步骤二至五、如实施例2。

结果，获得了白色肉桂酰胺纯品，胞外产率可达290mg/L。

实施例5

肉桂酰胺的制备

方法如下：

步骤一、以液体培养基对放线菌CGMCC No.4487进行发酵，“2-3菌落个数/50ml液体培养基”的接种量，发酵培养基成分为可溶性淀粉1％，葡萄糖2％，黄豆粉4％，牛肉浸膏0.1％，酵母粉0.6％，NaCl 0.3％，去离子水1000ml，接种pH值6.8。摇瓶发酵，装量50ml/250ml三角瓶，温度28-32℃，摇床转速220rpm，培养4天。

步骤二至五、如实施例3。

结果，获得了白色肉桂酰胺纯品，产率可达560mg/L。

实施例6

肉桂酰胺的HPLC分析检测方法

将实施例1-5中的分离提取所得到的肉桂酰胺采用HPLC的检测方法对其含量进行分析。本实例中采用高效液相色谱仪(HPLC)：安捷伦1200液相色谱仪(MWD检测器)，chemoffice工作站，Agilent Eclipse XDB C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，20μL定量环。

流动相采用一定比例的乙腈和蒸馏水混合溶剂，采用梯度洗脱的方式进行HPLC分析。具体分析条件如表1。

表1.1HPLC的分析条件

采用270nm的紫外吸收下进行检测，制备的肉桂酰胺在此分析条件下出峰时间为9.103分钟，与标准品相同。具体HPLC谱图如图2所示。

实施例7

代谢生成肉桂酰胺途径的研究

重复实施例1，不同点在于，在发酵过程中添加0-656mg/L的L-苯丙氨酸。

结果，肉桂酰胺的最终产量为160-180mg/L，没有显著提高。

此外，对筛选所得的菌株CGMCC 4487代谢生成肉桂酰胺途径的初步研究中，发现在菌株生长和肉桂酰胺的代谢生成过程的跟踪中，没有检测到肉桂酸的存在，提示该菌株可能是通过其他途径合成或产生肉桂酰胺。

菌种保藏

本发明的菌株于2010年12月17日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国，北京)，编号为CGMCC NO.4487。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种放线菌链霉菌属的微生物，其特征在于，所述的微生物是保藏号为CGMCC NO.4487的链霉菌(Streptomyces sp.)。

2.如权利要求1所述的微生物的用途，其特征在于，用于生产肉桂酰胺或其盐或其衍生物。

3.一种生产肉桂酰胺或其盐的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)在20-55℃，pH5.0-9.0条件下，培养保藏号CGMCC NO.4487的链霉菌(Streptomyces sp.)，从而产生肉桂酰胺或其盐；

(b)从发酵产物中分离出肉桂酰胺或其盐。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(a)中用液体培养基进行发酵。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(a)的发酵时间为1-20天。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所述的分离包括：从发酵液中分离肉桂酰胺和/或从菌体分离肉桂酰胺。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的分离包括：以发酵液为原料，经硅藻土吸附抽滤，二氯甲烷萃取，重结晶，从而获得肉桂酰胺。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(a)的发酵条件包括：采用的含碳源和氮源的液态的基础培养基，初始pH控制在5.0-9.0之间，并在20-45℃下摇床培养。

9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵条件还包括：将摇床转速控制在180-250rpm，温度控制在25-35℃，pH控制在7.0-7.5。

10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中还包括用NaOH或HCl溶液调节pH值至6.5-8。