CN102634611A - 一种快速检测核酸病毒的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速检测核酸病毒的试剂盒，属于生物技术领域。该试剂盒用夹心杂交法检测核酸病毒，包括探针（报告探针和捕获探针）的设计、脂质体上报告探针的标记、捕获探针的固定、报告探针与靶序列的杂交、靶序列与捕获探针的杂交、荧光信号的检测等过程。本发明的试剂盒能够实现定性定量快速检测人体血液中的病毒，具有检测快速、操作简便、灵敏度高、低成本、准确度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速检测核酸病毒的试剂盒。
技术背景
中国有1亿3千万乙肝病毒（HBV）携带者，4千万丙肝病毒（HCV）携带者，专家预测2010年我国将有1000~1500万人艾滋病毒（HIV）携带者，这三种疾病为全球性疾患。血液是艾滋病,乙肝及丙肝的主要传播途径，保证输血安全是控制这些疾病血液传播的最有效的环节之一。纵观现代采血、输血发展历程，各种血液安全政策的实施或是重大革新技术的应用，都能明显降低因输血造成传染性疾病的传播风险。虽然第3代的酶联免疫检测技术（ELISA）的应用已经能够降低这一风险，但是感染HBV、HCV、HIV后，产生抗HBV、抗HCV、抗HIV的“窗口期”较长，在窗口期内用ELISA技术很有可能产生漏检，所以国外从上世纪末开始就采用了核酸检测（nucleic acid test, NAT）的方式来筛查血液，确保检测的准确性。
目前NAT技术主要是提高核酸探针的敏感性，从而提高检测水平。主要分为两种主要方法：1）模板扩增技术主要有聚合酶链式反应（PCR）、核酸序列依赖性扩增（NASBA）、自主序列复制系统、连接酶链式反应等；2）信号放大系统，主要有分支DNA探针、3D DNA探针等。第一种模板扩增技术，需要用到相应的PCR仪或是荧光定量PCR仪，扩增所用的试剂基本依赖于国外几个大公司的试剂盒产品，价格昂贵，先期投资较大，同时检测时间长。与第二种方法比较，第一种模板扩增的方法还存在技术上的局限：1）不论是Tag酶或是逆转录AMV酶都没有3’-5’核酸外切酶的活性，容易发生碱基的错配；2）引物3’端部分配对可导致非特异性的扩增，造成假阳性；3）外源性污染也容易导致假阳性。而第二种方法核酸检测信号放大方式则是通过增加标记探针的数量或增强标记物的信号强度来提高灵敏性，不存在扩增靶序列的问题，所以其反应迅速，重复性好，依托相应的检测仪器，升级其检测功能，其临床应用潜力巨大。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供一种快速检测核酸病毒的试剂盒，其原理是利用核酸检测信号放大技术，依托相应的检测仪器，利用同时标记有罗丹明染料和报告探针的脂质体，与经分离的血液样本混匀，这样脂质体和病毒核酸靶序列通过报告探针结合。然后混合血液样本点滴于带正电荷的尼龙膜上，根据毛细作用原理，血液样本在膜上迁移，当移动至事先固定于尼龙膜上的捕获探针时，脂质体-病毒核酸复合物通过与捕获探针之间的碱基互补作用，富集于捕获探针区域，形成可分辨的红色荧光斑点，通过测定吸光值大小，根据标准曲线获得病毒核酸靶序列的含量。
一种快速检测核酸病毒的试剂盒，该试剂盒包括带正电荷的尼龙膜、报告探针、捕获探针、预杂交液和杂交液；所述的报告探针是标记在包裹有磺酰罗丹明B的脂质体上。
所述的包裹有磺酰罗丹明B脂质体的制备方法是：精密称取20.0mg蛋黄卵磷脂、5.0mg磷脂酰乙醇胺、25.0mg胆固醇溶于20mL氯仿，加入4mL 125μg/mL磺酰罗丹明B溶液，混合后水浴超声5min，制成均匀的白色乳剂，40°C水浴中减压蒸发至凝胶态，然后加入6mL水溶液，放置30min使其充分水合即得磺酰罗丹明B脂质体混悬液，储存于4°C冰箱中。
报告探针标记包裹有磺酰罗丹明B的脂质体的方法是：取合成的羧基修饰的DNA探针，加入EDC水溶液和S-NHS水溶液，室温静置。加入1 mL制备的脂质体溶液，混合，4℃下孵育。透析除去过量EDC，S-NHS和副产物脲。反应结束后4℃下离心，重复洗涤离心2次分离出游离探针，收集沉淀脂质体重悬于HEPES缓冲液中备用。
所述预杂交液配方为： 50%的去离子甲酰胺，5×SSC，0.1% SDS，0.1%BSA，0.1% PVP，用pH7的PB调终体积；并加入鲑鱼精 DNA50μg/mL。
使用时预杂交液放入沸水中10min后放入-20℃冰箱中迅速冷却10min，备用。
所述的杂交液配方为：50%的去离子甲酰胺，5×SSC，0.1%SDS，5×Denhardt,s，1%葡聚糖，用蒸馏水调终体积，现用现配。
应用本发明试剂盒快速检测核酸病毒的时间可以在10分钟内完成。
具体实施方式
本发明所提到的百分比都是质量体积比，即w/v（mg//mL）
SSC：柠檬酸缓冲液
SDS：十二烷基磺酸钠
BSA：牛血清白蛋白
PB： 磷酸盐缓冲液。
实施例一 试剂盒的使用方法
（1） 处理带正电荷的尼龙膜：首先剪成5×2cm大小，然后置于2×SSC中5min后取出，室温干燥。
（2） 用移液枪取200ng的捕获探针，点样于已经干燥的尼龙膜上。
（3） 将尼龙膜放置于紫外交联仪2min，将捕获探针固定在尼龙膜上，然后在室温条件下等待膜干燥，使探针结合得更牢固。
（4） 在培养皿中加入预杂交液2mL，然后将尼龙膜放入，将培养皿放置于脱色摇床上，并将脱色摇床放置于恒温培养箱中，在42℃的条件下反应30min。
（5） 反应结束后，将尼龙膜取出，4℃保存。
（6） 提取血液中的核酸，并与标记上报告探针的内部包裹有磺酰罗丹明B脂质体混合，目的是让病毒靶序列通过碱基互补配对与报告探针结合。
（7） 在混合样品中加入杂交液并点样于固定好捕获探针的尼龙膜上在毛细迁移作用下，探针和靶序列的复合体向前迁移。
（8） 10min后检测固定捕获探针处荧光信号的强度，从而定性定量分析所检测病毒核酸的含量。
实施例二 HBV病毒的快速检测
1.探针的设计
利用BLAST 软件对其序列进行比对并获得特异序列;利用软件Primer Premier 5.0设计特异性高、Tm 值接近、长度均一的寡核苷酸探针。
捕获探针的序列为：5-CTTTCACTTTCTCGCCAACTTACA-3（SEQ ID No.1）
报告探针的序列为：5-CTCTGCCAAGTGTTTGCTGACG-3（SEQ ID No.2）
2.脂质体的制备
精密称取20.0mg蛋黄卵磷脂、5.0mg磷脂酰乙醇胺、25.0mg胆固醇溶于20mL氯仿，加入4mL 125μg/mL磺酰罗丹明B溶液，混合后水浴超声5min，制成均匀的白色乳剂，40°C水浴中减压蒸发至凝胶态，然后加入6mL水溶液，放置30min使其充分水合即得磺酰罗丹明B脂质体混悬液，储存于4°C冰箱中。
3.脂质体上报告探针的标记
在40μL 20μM 5'端羧基修饰的报告探针中加入40 μL EDC水溶液和S-NHS溶液，4℃静置1 h活化，然后加入到1mL脂质体溶液中，4℃孵育4 h后于4℃、20000 rpm下离心30 min，重复洗涤离心2次分离出游离探针，收集沉淀脂质体重悬于HEPES缓冲液中备用。
4.探针的固定
首先将带正电荷的尼龙膜剪成5×2cm大小，然后置于2×SSC中5min后取出，室温干燥，用移液枪取2ul50uM的捕获探针，点样于已经干燥的尼龙膜上，将尼龙膜放置紫外交联仪2min，将捕获探针固定在尼龙膜上。
5探针杂交
在培养皿中加入预杂交液2mL，然后将尼龙膜放入，将培养皿放置于脱色摇床上，并将脱色摇床放置于恒温培养箱中，在42℃的条件下反应30min。提取病毒核酸加入杂交液以及报告探针标记的脂质体，反应10min，然后点样于固定好捕获探针的尼龙膜上在毛细迁移作用下，探针和靶序列的复合体向前迁移。
6.信号检测
10min后检测固定捕获探针点样处荧光信号的强度，从而定性定量分析病毒含量。
实施例三 HCV genotype 1病毒的快速检测
与实施例二基本相同，不同之处在于：
捕获探针的序列为：5- CTGTCTACCACGGGGCCGGA -3（SEQ ID No.3）
报告探针的序列为：5- GGAAATGGGCCGGGGCGAAA -3（SEQ ID No.4）。
实施例四 HCV genotype 2的病毒检测
与实施例二基本相同，不同之处在于：
捕获探针的序列为：5- AGCTACGCCCCCTGGGTCAG-3（SEQ ID No.5）
报告探针的序列为：5- GCCGCGAGCTCGTCACACTT-3（SEQ ID No.6）。
实施例五 HCV genotype 3的病毒检测
与实施例二基本相同，不同之处在于：
捕获探针的序列为：5- CAAGTTCCCGGGTGGCGGAC -3（SEQ ID No.7）
报告探针的序列为：5- TCCGACGCGCCTTGGGGATA -3（SEQ ID No.8）。
实施例六 HCV genotype 4的病毒检测
与实施例二基本相同，不同之处在于：
捕获探针的序列为：5- TTGCGTGCCCTGCGTGAGAG -3（SEQ ID No.9）
报告探针的序列为：5- GGCGCCGTGGTCGGAATGAA -3（SEQ ID No.10）。
实施例七 HCV genotype 5的病毒检测
与实施例二基本相同，不同之处在于：
捕获探针的序列为：5- GCCGTCATACCCGCGACAGG -3（SEQ ID No.11）
报告探针的序列为：5- TCCCTGTACGGCCCCTACGC -3（SEQ ID No.12）。
实施例八 HCV genotype 6的病毒检测
与实施例二基本相同，不同之处在于：
捕获探针的序列为：5- CGAGAAGCCAACGGCGTGGT -3（SEQ ID No.13）
报告探针的序列为：5- CCATGCGCACCCCGTGTCAT -3（SEQ ID No.14）。
实施例九 HIV1 的病毒检测
与实施例二基本相同，不同之处在于：
捕获探针的序列为：5- CTAGCAGTGGCGCCCGAACA -3（SEQ ID No.15）
报告探针的序列为：5- AGCCGAGTCCTGCGTCGAGA -3（SEQ ID No.16）。
实施例十 HIV2 的病毒检测
与实施例二基本相同，不同之处在于：
捕获探针的序列为：5- CAGACGGCTCCACGCTTGCT -3（SEQ ID No.17）
报告探针的序列为：5- ACACCGAATGACCAGGCGGC -3（SEQ ID No.18）。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国药科大学
<120> 一种快速检测核酸病毒的试剂盒
<130>
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctttcacttt ctcgccaact taca 24
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctctgccaag tgtttgctga cg 22
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ctgtctacca cggggccgga 20
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agctacgccc cctgggtcag 20
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<213> 人工序列
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gccgcgagct cgtcacactt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caagttcccg ggtggcggac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
acaccgaatg accaggcggc 20
Claims (5)
1.一种快速检测核酸病毒的试剂盒，该试剂盒包括带正电荷的尼龙膜、报告探针、捕获探针、预杂交液和杂交液；其特征在于报告探针是标记在包裹有磺酰罗丹明B的脂质体上。
2. 根据权利1所说的快速检测核酸病毒的试剂盒，其特征在于，包裹有磺酰罗丹明B脂质体的制备方法是：精密称取20.0mg蛋黄卵磷脂、5.0mg磷脂酰乙醇胺、25.0mg胆固醇溶于20mL氯仿，加入4mL 125μg/mL磺酰罗丹明B溶液，混合后水浴超声5min，制成均匀的白色乳剂，40°C水浴中减压蒸发至凝胶态，然后加入6mL水溶液，放置30min使其充分水合即得磺酰罗丹明B脂质体混悬液，储存于4°C冰箱中。
3. 根据权利2所说的快速检测核酸病毒的试剂盒，其特征在于，报告探针标记包裹有磺酰罗丹明B的脂质体的方法是：取合成的羧基修饰的DNA探针，加入EDC水溶液和S-NHS水溶液，室温静置；加入1 mL制备的脂质体溶液，混合，4℃下孵育；透析除去过量EDC，S-NHS和副产物脲；反应结束后4℃下离心，重复洗涤离心2次分离出游离探针，收集沉淀脂质体重悬于HEPES缓冲液中备用。
4. 根据权利1所说的快速检测核酸病毒的试剂盒，其特征在于，预杂交液配方为： 50%的去离子甲酰胺，5×SSC，0.1% SDS，0.1%BSA，0.1% PVP，用pH7的PB调终体积，并加入鲑鱼精 DNA50μg。
5. 根据权利1所说的快速检测核酸病毒的试剂盒，其特征在于，杂交液配方为：50%的去离子甲酰胺，5×SSC，0.1%SDS，5×Denhardts，1%葡聚糖，用蒸馏水调终体积。
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