CN102633932B - 含特征荧光团的金属络合物及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含特征荧光团的金属络合物及用途。所述金属络合物由含氟丙烯酸酯类单体与丙烯酰胺类单体共聚所得的共聚物为前驱体，其再与金属铂或金属铱络合得到。采用现有的荧光光谱仪，测量所述金属络合物膜的探针性能，测量结果表明，该金属络合物膜具有较快的响应时间，淬灭时间可以短至40秒，及具有良好的光、热稳定性能，可作为溶解氧的荧光探针。
Description
技术领域
本发明涉及一种含特征荧光团的金属络合物及用途，具体地说，涉及一种由含氟丙烯酸酯类单体与丙烯酰胺类单体共聚的共聚物、和以所述共聚物与金属铂或金属铱络合得到金属络合及其用途。
背景技术
现代生物技术，特别是上游生物技术在近几十年得到迅猛发展，而一直以来中下游技术发展相对滞后，究其原因，用于发酵和细胞培养的生物反应器装置是主要限制瓶颈。如今以蛋白质表达为前提的功能基因组研究已成为继人类基因组测序完成后又一重大而艰巨的科技工程，这就对以发酵和细胞培养为基础的生物工艺优化(Bioprocess optimization)速度提出了更大的挑战(S.L.Zhang，A Multi-Scale Study of Industrial Fermentation Processes and TheirOptimization，Adv.Biochem.Engin/Biotechnol，2004，87，97-150；D.Titmarsh，et al.，Microbioreactor array for full-factorial analysis of provision of multiple soluble factors in cellularmicroenvironments，Biotechnol.Bioeng.，2009，104，1240-1244)。但当前普遍使用配备多种传感器的实验反应器一般都体积大(1-100L)、价格昂贵，无法满足生物工艺优化研究中菌株筛选、培养基配方建立和确立关键过程参数这三大任务对高通量和平行操作的要求(S.L.Zhang，et al.，Bioreactors and Bioseparation，Adv.Biochem.Engin/Biotechnol，2010，122，105-150；D.Schapper，et al.，Application of microbioreactors in fermentation process development：a review，Anal.Bioanal.Chem.，2009，395，679-695)。虽然基于摇瓶(shake flask)装置能进行大量平行研究，但摇瓶一般不具备条件监控(除温度和搅拌外)功能，获得的过程信息非常有限。生物工艺优化研究仍旧是以寻求最佳培养基配方和最佳的温度、pH、溶解氧(DO)等采用动力学为基础的以最佳工艺控制点为依据的静态操作方法。所以，作为生物微型反应器的这些参数的在线检测功能尤为重要。事实上，发酵和细胞培养过程是以活细胞为对象的生物反应器中基因分子遗传、细胞代谢调节和反应器工程水平上的多尺度问题，因此基于代谢流分析为核心的发酵过程多尺度参数相关研究已成为当前发酵过程优化放大的重要发展趋势(张嗣良，储炬，多尺度微生物过程优化，化学工业出版社，北京，2003)。故在设计微型生物反应器中引入多尺度参数相关研究理论对提升微型生物反应器的发酵工艺参数动态分析和优化功能更具理论和实际意义(欧阳平凯等，发酵过程关键技术及其应用，化学工业出版社，北京，2005；P.R.Patnaik，Design considerations in hybrid neural optimization of fed-batch fermentation for PHBproduction by ralstonia eutropha，Food Bioproc.Technol.，2010，3，213-225)。从而，针对上述问题，开发快速、可靠、价廉且高通量的微型化生物反应器(Micro-or mini-bioreactor)装置已引起国际社会的高度重视，如美国马里兰大学、MIT、德国雷根斯堡大学、英国伦敦大学等都在加紧开发具备高通量特性的微型生物反应器，甚至有些产品已经在不少大型制药公司得到商品化应用。
传统的测量溶解氧的方法是基于电化学分析法，即克拉克氏电极法，其原理是通过在电化学中消耗被分析物中的氧而产生一个微小的电流进而计算氧含量。这些仪器比较灵敏，适用范围广，然而是一种有损检测，只能离线散点分析，受环境影响较大实验数据漂移严重，容易中毒并且很难微型化嵌入微生物反应器中。而光学传感器能够克服上述问题，其基于荧光/磷光淬灭的原理，氧气在基态是三线态的，探针分子在激发态和氧气分子发生碰撞，从而导致荧光/磷光淬灭。传统的制备溶解氧探针膜的方法是将荧光团分子掺杂在聚合物中进行固定，而将荧光团通过共价键共聚的方式固定在基质中能够有效防止荧光团的聚集淬灭，并且避免了传统掺杂方法中致命的荧光团渗透析出的问题(L.J.Shen，et al.，Macromolecules，2011，44，5612-5618)。
因此，合成低成本、光和热稳定的荧光探针，在线测量溶解氧取代电化学分析法倍受科学家们的关注。鉴于此，本发明需要解决的技术问题是，设计并合成一种长波长、氧渗透性强、光稳定性及热稳定性能好的聚合物氧探针膜。
发明内容
本发明的发明人将含卟啉环单体或含菲啰啉配体单体与含氟甲基丙烯酸酯类化合物进行共聚，得共聚物，再以所得共聚物与金属铂(Pt)或金属铱(Ir)络合，得到相应的金属络合物。采用现有的荧光光谱仪，测量由所述金属络合物成膜膜的探针性能。测量结果表明，该金属络合物膜具有较快的响应时间，淬灭时间可以短至40秒，及具有良好的光、热稳定性能。
本发明的一个目的在于，提供一种共聚物，所述共聚物由式I所示化合物(单体)或式II所示化合物(单体)与式III所示化合物(单体)经自由基聚合后得到，所得到的共聚物的重均分子量大于或等于10,000；
其中，R为C1～C6直链或支链的含氟(F)烷基，A为式IV基团(曲线所标处为取代位)：
本发明另一个目的在于，提供一种金属络合物，所述金属络合物由上述共聚物与金属配体(如二氯化铂、铱配体等)在溶剂(苯甲腈或二氯甲烷)中反应得到，其结构示意式如式V或式VI所示：
本发明再一个目的在于，揭示一种上述金属络合物的用途，即上述金属络合物作为溶解氧的荧光探针的应用。
附图说明
图1为由金属络合物A制备的膜在水中不同氧含量下的发射光谱；
图2为由金属络合物A制备的膜在水中O2/N2循环下的测试；
图3为由金属络合物A制备的膜在水中不同氧含量下的荧光寿命；
图4为金属络合物A与共聚物A的核磁共振氢谱对比图；
图5为金属络合物A与共聚物A的吸收光谱对比图；
图6为为由金属络合物B制备的膜在水中不同氧含量下的发射光谱；
图7为由金属络合物B制备的膜在水中O2/N2循环下的测试；
图8为由金属络合物B制备的膜在水中不同温度下的荧光寿命；
图9为金属络合物B制备的膜在水中持续光照下的稳定性测试；
图10为金属络合物B制备的膜在水中两种温度10秒间歇光照下的稳定性测试；
图11为测试金属络合物A和B的膜性能的设备及连接方式示意图。
具体实施方式
在本发明中，由式I或式II所示化合物与式III所示化合物经自由基聚合的共聚物(前驱体)的重均分子量宜控制在大于或等于10,000。如前驱体的重均分子量太小，则其成膜性会较差。然对所述前驱体的重均分子量并无上限要求，理论上讲只要能找到合适的成膜溶剂体系即可。在使用现有常用的成膜溶剂(如卤代烃等，具体如二氯甲烷等)时，前驱体的重均分子量宜控制为100,000～500,000。
在本发明的另一个优选技术方案中，式I或式II所示化合物(单体)与式III所示化合物(单体)的摩尔比小于或等于1∶500，更优选的摩尔比为1∶(100～200)；
在本发明的另一个优选技术方案中，R为C1～C3直链或支链的含氟(F)烷基，最佳的R为三氟乙基(CF3CH2-)。
一种制备本发明所述含特征荧光团的金属络合物的方法，其包括如下步骤：
(1)在有惰性气体及自由基引发剂(如偶氮二异丁腈等)存在条件下，将式I或式II所示化合物与式III所示化合物进行自由基聚合反应(所述自由基聚合反应的温度为80℃～95℃，所述自由基聚合反应的时间为10小时至24小时)，得到重均分子量大于或等于10,000的共聚物(前驱体)；
(2)在有惰性气体存在条件下，将由步骤(1)所制得的前驱体与金属卤化物(如二氯化铂等)或金属配体(如[Ir(DPQ)2]2Cl2等)在溶剂(如苯甲腈或二氯甲烷等)中，于50℃至回流状态反应4小时～14小时，得到目标物(本发明所述的含特征荧光团的金属络合物)；其合成策略如下所示：
其中，式I所示化合物的制备参见：T.Turgay，et al.，Reactive & Functional Polymers，2007，67，999-1007；式II所示化合物的制备参见：W.Lin，et al.，The Journal of Physical Chemistry C.2009，113，16884-16895；金属配体[Ir(DPQ)2]2Cl2的制备参见：F.Hwang，et al.，InorganicChemistry.2005，44，1344-1353；式III所示化合物及其它试剂均为市售品；R的定义与前文所述相同。
由本发明提供的含特征荧光团的金属络合物经成膜后(成膜的具体步骤，请见实施例)，采用现有的荧光光谱仪，测量其探针性能。测量结果表明，该金属络合物膜具有较快的响应时间，淬灭时间可以短至40秒，及具有良好的光、热稳定性能(O2/N2循环测试稳定)。
下面通过实施例对本发明作进一步的阐述，其目的仅在于更好地理解本发明的内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围：
实施例1
在Schleck管中，将卟啉单体(式I所示化合物)(80mg，0.12mmol)、偶氮二异丁腈(4mg，0.024mmol)和甲基丙烯酸三氟乙酯(1.9g，11.5mmol，市售)溶于5mLN-甲基吡咯烷酮，降温至-78℃，氮气交换三次，升温至80℃反应10h，得到紫色溶液，用二氯甲烷溶解(50mL)、甲醇(500mL)析出得紫色固体(共聚物A)。凝胶渗透色谱表征：其重均分子量为407,897，分散度为1.8。
在100mL三口瓶中，加入二氯化铂(53.2mg，0.20mmol)和苯甲腈(50mL)，80℃反应4小时，氩气保护下，加入共聚物A(0.1g)，回流10小时。冷却，倒入石油醚(100mL)中析出橘红色固体(金属络合物A)。核磁共振氢谱(见图4)和紫外吸收(见图5)均证明铂成功配位。
实施例2-6
除偶氮二异丁腈(引发剂)的用量不同外，其它条件均与实施例1相同，实验结果见表1
表1
实施例7
在Schleck管中，加入甲基丙烯酸三氟乙酯(1.63g，12.5mmol)、5-菲啰啉甲基丙烯酰胺(式II所示化合物，)(32mg，0.122mmol)、AIBN(8mg)和NMP(1.5mL)，低温下充分排除空气，在氩气保护下，90～95℃反应24h。用二氯甲烷(50mL)溶解、甲醇(500mL)析出，溶剂自然挥发得后得粉红色固体，再次用二氯甲烷溶解、甲醇析出，反复四次，得粉红色固体0.38g(共聚物B)。凝胶渗透色谱表征：其重均分子量为252804，分散度为1.6。
在50mL单口瓶中加入共聚物B(0.53g)、金属配体[Ir(DPQ)2]2Cl2(35.8mg，0.022mmol)和二氯甲烷(10mL)，50-60℃反应24h。冷却至室温。加入六氟磷酸铵(56.2mg，0.34mmol)，常温搅拌过夜，溶液变为红色，在荧光灯下呈较强的红色荧光。过滤，旋蒸除去溶剂，DCM溶解甲醇析出，反复两次，得到聚合物0.19g(金属络合物B)。
实施例8-12
除偶氮二异丁腈(引发剂)的用量不同外，其它条件均与实施例7相同，实验结果见表2.
表2
实施例13
金属络合物A的成膜：
将石英玻璃依次用氢氧化钠水溶液、二氯甲烷、甲醇、去离子水浸泡充分洗涤，干燥。将金属络合物A(50mg)溶于二氯甲烷(10mL)中，超声溶解，旋涂仪旋涂在石英玻璃上，旋涂参数为500r/min(低转速)6秒，1000r/min(高转速)60秒。膜静置过夜干燥，再用50℃烘箱干燥2小时。用刀片裁去多余部分，制成目标物(金属络合物A的膜)。平均膜厚为770nm左右(膜厚通过原子力显微镜测量)。
实施例14～18
除低转速和高转速不同外，其它条件均与实施例13相同，实验结果见表3.
表3
实施例19
金属络合物B的成膜：
将石英玻璃依次用氢氧化钠水溶液、二氯甲烷、甲醇、去离子水浸泡充分洗涤，干燥。将金属络合物B(60mg)溶于二氯甲烷(10mL)中，超声溶解，旋涂仪旋涂在石英玻璃上，旋涂参数为500r/min(低转速)5秒，1000r/min(高转速)50秒。膜静置过夜干燥，再用45℃烘箱干燥3小时。用刀片裁去多余部分，制成目标物(金属络合物B的膜)。平均膜厚为490nm左右(膜厚通过原子力显微镜测量)。
实施例20
以金属络合物A的膜(平均膜厚770nm)和金属络合物B的膜(平均膜厚490nm)进行生物样品(例如头孢霉菌发酵液)的溶解氧在线测量。在线测量的设备及连接方式见图11所示。光源经过转换器选定特定激发波长，激发光通过光纤有一定角度(20-40度)地导入微反应器内的金属络合物氧传感膜上，接收的反射光信号经过光纤传入检测器，传出的标准信号导入检测控制系统通过计算机在线记录、处理数据和控制。结果见图1-3(金属络合物A的膜)和图6-10(金属络合物B的膜)。
Claims (6)
1.一种金属络合物，其特征在于，所述金属络合物由下列方法制得：
在有惰性气体存在条件下，将共聚物与铂的卤化物或[Ir(DPQ)2]2Cl2在苯甲腈或二氯甲烷中，于50℃至回流状态反应4小时～14小时，得到目标物；
其中，所述共聚物由式I所示化合物或式II所示化合物与式III所示化合物经自由基聚合后得到，所得到的共聚物的重均分子量大于或等于10,000；
其中，R为C1～C6直链或支链的含氟烷基，A为式IV基团：
式I所示化合物或式II所示化合物与式III所示化合物的摩尔比为1∶(100～200)。
2.如权利要求1所述的金属络合物，其特征在于，其中所述共聚物的重均分子量为100,000～500,000。
3.如权利要求1或2所述的金属络合物，其特征在于，其中R为C1～C3直链或支链的含氟烷基。
4.如权利要求3所述的金属络合物，其特征在于，其中R为三氟乙基。
5.如权利要求1或2所述的金属络合物作为溶解氧的荧光探针的应用。
6.如权利要求4所述的金属络合物作为溶解氧的荧光探针的应用。
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