CN102631683B - 功能化纳米硒在抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了功能化纳米硒在抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤药物中的应用。本发明人发现功能化纳米硒不仅具有抗肿瘤的作用，而且具有抑制肿瘤血管生成的作用。因此，功能化纳米硒能作为活性成分在抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤药物进行应用。本发明制备的功能化纳米硒，如杂多酸-转铁蛋白修饰的纳米硒或没食子酸-转铁蛋白修饰的纳米硒，直接以过量的杂多酸或没食子酸与单质纳米硒耦合，制备过程无需添加其它辅助试剂、产物体系简单，产品可直接保存和使用。本发明采用的修饰剂提高了功能化纳米硒的靶向性以及在细胞中的转运和跨膜吸收，能够增加细胞的药物摄取量，减少外排，从而保证细胞内药物维持在较高水平。

Description

功能化纳米硒在抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及功能化纳米硒的应用，特别涉及功能化纳米硒在抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

癌症已经成为威胁人类生命健康的头号杀手，世界各国高度重视癌症的预防与治疗，开发高效、低毒、广谱、高选择性的抗癌药物成为长期的战略目标。

肿瘤的生长、恶化、浸润和转移与新血管生成密切相关，新血管生成与肿瘤的生长两者之间存在着相互促进的关系。一方面，肿瘤细胞通过分泌某些特异性促血管生成因子，诱发新的毛细血管从周围组织内的宿主血管壁长出，并朝向肿瘤生长，进一步深入到肿瘤组织内部；另一方面，新形成的血管为肿瘤的生长、转移和恶化提供必需的营养、氧气以及代谢产物排除的通道，同时也为肿瘤转移提供通路，起到了促进肿瘤生长、转移的作用。因此，新血管生成与肿瘤生长是互为依赖、互为因果的关系，两者结合使肿瘤组织不断向前发展。

近年来，抑制肿瘤血管形成的药物得到了广泛的关注和高度重视，人们希望寻找到高效的治疗肿瘤药物，即在抑制肿瘤的同时阻断肿瘤血管的形成，从而切断肿瘤的来源，发挥最有效的抗肿瘤效果。肿瘤血管靶向治疗成为肿瘤治疗的主攻方向之一，并为临床提供了新的治疗途径和有效药物，是肿瘤治疗研究上的一个重大突破。

纳米药物作为抗肿瘤药物和基因输运载体，由于其缓释作用从而延长药物作用时间，可达到靶向输送药物的目的，进而增强药物效应，减轻不良反应，提高药物稳定性，纳米药物还可采取一些新的给药途径等，因而在医药领域得到广泛应用。

硒具有提高人体免疫力、抗氧化、延缓衰老和防癌、抗癌的作用，功能化纳米硒在生物活性方面具有更多的优势，我们通过对纳米硒进行功能上的修饰，发挥了纳米硒的抗肿瘤活性和抑制肿瘤血管形成的双重功能。

最近已有研究报道了金纳米粒子通过占据VEGF165与肝素结合区域的位点而抑制VEGF165诱导HUVEC细胞的增殖，银纳米粒子能够靶向激活PI3K/Akt信号通路，进而抑制VEGF介导的血管生成。

至今未发现有关纳米硒用于制备抑制肿瘤和肿瘤血管生成药物的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供功能化纳米硒在抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：功能化纳米硒在抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤药物中的应用，其中功能化纳米硒为活性成分，其具有抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤药物的作用；

所述的功能化纳米硒优选为Y-转铁蛋白修饰的纳米硒，Y为杂多酸(杂多蓝)、没食子酸、葡萄糖、蔗糖、维生素C或半胱氨酸；

所述的杂多酸的结构式为HXM₁₂O₄₀或HX₂M₁₈O₆₂；其中，X＝Si、P或B；M＝Mo、W或V；

所述的Y为杂多酸时，所述的功能化纳米硒，即杂多酸-转铁蛋白修饰的纳米硒，优选通过如下方法制备得到：

(1)将杂多酸溶于水配制成1mol/L的溶液，用浓度为1mol/L的HAc-NaAc缓冲溶液调节溶液pH为3.5～5.5，在惰性气体保护下进行电解还原，当电解达到两电子还原时，停止电解，将电解液置于真空干燥环境中，使其晶体析出，对析出的晶体进行2～3次重结晶，得到杂多蓝化合物；

(2)将步骤(1)制备的杂多蓝化合物配制成0.5mmol/L的溶液，将其滴加至0.5～1mmol/L的含硒溶液中混合均匀，其中杂多酸溶液与含硒溶液的摩尔比在3∶1～8∶1；加热至70～80℃反应24h，得到杂多蓝修饰的纳米硒；

(3)取杂多蓝修饰的纳米硒配制成0.5mmol/mL溶液，取5mL，用0.1mmol/mL的杂多酸溶液调节其pH在2.3～5.0，得到溶液A；将转铁蛋白用三乙醇胺配制成0.2mmol/mL的溶液，在不断搅拌下滴加到溶液A中，过程中始终保持pH值为2.3～5.0；继续搅拌4～24h，4℃下放置12h，离心分离，弃上清液，洗涤，干燥，得到杂多酸(蓝)-转铁蛋白修饰的纳米硒。

步骤(1)中所述的惰性气体优选为氮气；

步骤(1)中所述的电解还原优选为采用恒电位仪进行反应；

步骤(1)中所述的还原的程度通过铜库仑计指示；

步骤(2)中所述的水优选为超纯水或是蒸馏水；

步骤(2)中所述的含硒溶液优选为亚硒酸钠溶液或二氧化硒溶液；

步骤(2)中所述的加热可于带有聚四氟乙烯内衬的反应釜中加热或是通过微波加热；

步骤(3)中所述的洗涤优选为使用PBS缓冲液洗涤；

步骤(3)中所述的干燥的条件优选为于70℃干燥2天；

所述的Y为没食子酸、葡萄糖、蔗糖、维生素C或半胱氨酸时，所述的功能化纳米硒，优选通过如下方法制备得到：

(1)将Y与亚硒酸钠或二氧化硒混合形成均一的水溶液，调水溶液的pH值为2.5～3.0，Y与亚硒酸钠或二氧化硒的摩尔为5∶1～7∶1；于70～80℃水浴中加热至溶剂挥发至干，得到橙红色的Y修饰的纳米硒，将此样品加蒸馏水溶解、定容，得到1mM纳米硒溶胶；

(2)取纳米硒溶胶配制成0.5mmol/mL溶液，取5mL，调节其pH在2.3～5.0，得到溶液A；将转铁蛋白用三乙醇胺配制成0.2mmol/mL的溶液，在不断搅拌下滴加到溶液A中，过程中始终保持pH值为2.3～5.0；继续搅拌4～24h，4℃下放置12h，离心分离，弃上清液，洗涤，干燥，得到功能化纳米硒；

步骤(2)中所述的pH优选通过盐酸调节，更优选通过0.1mol/L盐酸调节；

步骤(2)中所述的洗涤优选为使用超纯水洗涤；

步骤(2)中所述的干燥的条件优选为于70℃干燥2天。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果

(1)本发明提供功能化纳米硒在抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤药物中的应用。本发明人发现纳米硒不仅具有抗肿瘤的作用，而且具有抑制肿瘤血管生成的作用。

(2)本发明制备的杂多酸-转铁蛋白修饰的纳米硒或没食子酸-转铁蛋白修饰的纳米硒，直接以过量的杂多酸或没食子酸与单质纳米硒耦合，制备过程无需添加其它辅助试剂、产物体系简单，产品可直接保存和使用。

(3)本发明采用的修饰剂提高了功能化纳米硒的靶向性以及在细胞中的转运和跨膜吸收，能够增加细胞的药物摄取量，减少外排，从而保证细胞内药物维持在较高水平。

附图说明

图1是十二钨磷酸修饰的纳米硒形貌图。

图2是十二钨磷酸-转铁蛋白修饰的纳米硒形貌图。

图3是没食子酸-转铁蛋白修饰的纳米硒的透视电镜(TEM)图。

图4是功能化纳米硒对血管内皮细胞迁移的影响结果图。

图5是功能化纳米硒对鸡胚尿囊膜血管抑制作用结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明所用原料的纯度只要达到化学纯以上即可，来源均可从市场购得。

实施例1杂多酸-转铁蛋白修饰的纳米硒的制备

(1)称取1.5g十二钨磷酸溶于2mL蒸馏水中配制成0.5mol/L储存液，用1mol/L的HAc-NaAc缓冲溶液调节pH＝3.5～5.5，在N₂气氛围下，采用恒电位仪进行控制电位电解还原，还原程度通过铜库仑计指示，当电解达到两电子还原时，停止电解，将电解液置于真空干燥器内，使其晶体析出，对析出的晶体进行2～3次重结晶，得到处理后的杂多蓝化合物。

(2)将十二钨磷酸杂多蓝配制成0.5mmol/L的溶液，在不断搅拌下，将其滴加至加0.5～1mmol/L的亚硒酸钠溶液中混合均匀，最终十二钨磷酸杂多蓝与亚硒酸钠的摩尔比为2∶1～4∶1，然后将混合溶液放入带有聚四氟乙烯内衬的反应釜中，加热至80～90℃反应4～24小时，或者将混合溶液放入微波反应器中加热至70～80℃反应4～24小时；至形成红色的十二钨磷酸修饰的纳米硒溶胶。通过TEANAI-10型透射电子显微镜(TEM)观察，如图1所示。得到纳米粒子的分散体系，其粒径在20～40nm。该纳米粒子能在室温下稳定存在，容易保存。

(3)取上述纳米硒配制成5mL 0.5mmol/mL溶液，用0.1mmol/mL的杂多酸溶液调节其pH在2.3～5.0之间，将转铁蛋白用三乙醇胺配制成0.2mmol/mL的溶液，在不断搅拌下滴加到上述纳米硒溶液中，过程中始终保持溶液pH在2.3～5.0之间，继续搅拌12～48h，4℃下放置12h，离心分离，弃上清液，用PBS缓冲液洗涤3次，产物于70℃条件下干燥2d，得到杂多酸(蓝)-转铁蛋白修饰的纳米硒。其形貌通过TEANAI-10型透射电子显微镜(TEM)观察，如图2所示。得到纳米粒子的分散体系，其粒径在30～100nm。该纳米粒子能在室温下稳定存在，容易保存。

实施例2没食子酸-转铁蛋白修饰的纳米硒的制备

将Na₂SeO₃用蒸馏水配制成5mmol/L的溶液，没食子酸用蒸馏水配制成5mmol/L的溶液，在不断搅拌下将没食子酸溶液滴加到亚硒酸钠溶液中，用0.1mol/L的盐酸溶液调pH为2.8～3.5，70℃水浴中加热至溶剂挥发至干得橙红色纳米硒样品。

(2)取上述纳米硒配制成0.5mmol/mL溶液，用0.1mmol/mL的盐酸溶液调节其pH在2.3～5.0之间，将转铁蛋白用三乙醇胺配制成0.2mmol/mL的溶液，在不断搅拌下滴加到上述纳米硒溶液中，过程中始终保持溶液pH在2.3～5.0之间，继续搅拌12～24h，4℃下放置12h，离心分离，超纯水洗涤，产物于70℃条件下干燥2d，得到没食子酸-转铁蛋白修饰的纳米硒。其形貌通过TEANAI-10型透射电子显微镜(TEM)观察，如图3所示。其粒径在30～100nm。该纳米粒子能在室温下稳定存在，容易保存。

实施例3作为抗肿瘤药物的体外实验

本实验选择多种购自ATCC公司的肿瘤细胞株，人恶性黑色素瘤细胞(A375)、人肝癌细胞(HepG2)、人结肠癌细胞(SW480)、人前列腺癌(PC-3)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肺腺癌细胞(A549)。所试样品编号为：a(十二钨磷酸-转铁蛋白修饰的纳米硒)、b(十二钨磷酸修饰的纳米硒溶胶)、c(没食子酸-转铁蛋白修饰的纳米硒)、d(没食子酸修饰的纳米硒溶胶)和顺铂。

(1)MTT测试方法

取处于对数生长期的肿瘤细胞，调整活细胞浓度为2×10⁴/ml加于96孔培养板，每孔100μl，在培养箱中培养24h待贴壁后，再分别加入不同浓度受试样品100μl，阴性对照为等体积生理盐水，阳性对照为顺铂，加样组和对照组均设4个复孔，置37℃，5％CO2培养72h，然后加入MTT(5mg/ml)20μl/孔，5h后离心弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)100μl/孔，振荡10min左右，用酶标仪在570nm波长下测定OD值。计算细胞存活率，通过软件计算其半数抑制浓度IC50。

细胞存活率(％)＝加药孔的实际OD值/阴性对照孔的OD值；

细胞抑制率(％)＝100％-细胞存活率；

实验结果见表1。可见，本发明提供的十二钨磷酸-转铁蛋白修饰的纳米硒或是没食子酸-转铁蛋白修饰的纳米硒具有一定的脂溶性和水溶性，易为人体吸收，在体外试验中对肿瘤细胞具有很强的抑制作用，比顺铂的疗效要好，且具有广谱的抗肿瘤作用。显示良好的应用价值，特别适合制备成抗肿瘤药物。

表1.纳米硒体外抗肿瘤活性

a.十二钨磷酸-转铁蛋白修饰的纳米硒；b.十二钨磷酸修饰的纳米硒

c.没食子酸-转铁蛋白修饰的纳米硒；  d.没食子酸修饰的纳米硒

实施例4：纳米硒对血管内皮细胞的抑制作用

(1)纳米硒对人脐静脉血管内皮细胞HUVEC增殖的抑制

实验方法见实施例3，实验结果见表2。

表2.纳米硒体外抑制血管内皮细胞的增殖作用

a.十二钨磷酸-转铁蛋白修饰的纳米硒；b.十二钨磷酸修饰的纳米硒c.没食子酸-转铁蛋白修饰的纳米硒；d.没食子酸修饰的纳米硒；苏拉明.抗肿瘤血管的阳性对照药

(2)纳米硒对HUVEC迁移的影响

取对数生长期的HUVEC细胞用0.1％胰蛋白酶溶液消化制成细胞悬浮液，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，接种于12孔培养板中，每孔1mL，置培养箱中培养。待细胞长满底面后，用灭菌自制橡皮小铲划出宽度和长度控制2×5cm的无细胞区，PBS液(0.01M，pH 7.2)冲洗3次，显微镜下观察刮痕内无细胞。抑制实验分别加入功能化的纳米硒十二钨磷酸-转铁蛋白修饰的纳米硒(a)；十二钨磷酸修饰的纳米硒(b)；没食子酸-转铁蛋白修饰的纳米硒(c)；没食子酸修饰的纳米硒(d)；使纳米硒的浓度为5μg/mL。同时设置正常对照组，在37℃，5％CO₂条件下培养。24小时后每条刮痕上随机选取3个视野，200倍镜下重复观察拍照。每组实验重复3次。实验结果如图4所示。从图中可以看出，对照组中HUVEC细胞随着时间的变化，迁移数目增多，迁移距离和迁移面积均增加，划痕区面积减小；加入纳米硒的实验组中，对HUVEC细胞的迁移具有明显的抑制作用，表现为划痕区域内没有或很少有HUVEC细胞，说明纳米硒明显抑制HUVEC细胞迁移。该实验结果表明，本发明所述的纳米硒能够抑制血管内皮细胞迁移，证明本发明的纳米硒能够抑制肿瘤血管生成。

(3)纳米硒对鸡胚尿囊膜血管形成的影响

在无菌条件下，取孵化7d的鸡胚，剥去直径为1cm大小的蛋壳造成一个人工气室，小心去除壳膜，暴露CAM。取1cm×1cm无菌滤纸条，上面滴加10μL溶液，分为空白对照组(PBS缓冲液)，样品组(Se-NPs)(直径为5mm)，每组5个鸡胚，轻轻置于CAM膜上血管较少的部位，然后用封口膜封口，放入39℃、湿度70％恒温箱内培养。72小时后取出鸡胚，观察覆盖处及周围鸡胚绒毛尿囊膜血管新生情况，置于解剖镜下观察并拍照。样品分别为十二钨磷酸-转铁蛋白修饰的纳米硒(a)；十二钨磷酸修饰的纳米硒(b)；没食子酸-转铁蛋白修饰的纳米硒(c)；没食子酸修饰的纳米硒(d)，结果见图5。

从图5可以看出，对照组鸡胚尿囊膜血管丰富，血液充沛，分支和形态正常呈叶脉状分布。加入纳米硒的样品组与对照组相比，血管管径较细，血管密度及其分支明显减少，血管模糊。表明纳米硒能抑制鸡胚尿囊膜血管生成。

图5的结果表明，本发明制备的纳米硒具有抑制鸡胚尿囊膜血管形成的作用，说明本发明的纳米硒能够作为抑制血管形成的药物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.功能化纳米硒在制备抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的功能化纳米硒为Y-转铁蛋白修饰的纳米硒，Y为杂多酸或没食子酸；

所述的杂多酸的结构式为HXM₁₂O₄₀或HX₂M₁₈O₆₂；其中，X＝Si、P或B；M＝Mo、W或V；

所述的Y为杂多酸时，所述的功能化纳米硒为杂多酸-转铁蛋白修饰的纳米硒，其通过如下方法制备得到：

(1)将杂多酸溶于水配制成1mol/L的溶液，用浓度为1mol/L的HAc-NaAc缓冲溶液调节溶液pH为3.5～5.5，在惰性气体保护下进行电解还原，当电解达到两电子还原时，停止电解，将电解液置于真空干燥环境中，使其晶体析出，对析出的晶体进行2～3次重结晶，得到杂多蓝化合物；

(2)将步骤(1)制备的杂多蓝化合物配制成0.5mmol/L的溶液，将其滴加至0.5～1mmol/L的含硒溶液中混合均匀，其中杂多蓝与含硒溶液中含硒化合物的摩尔比在3：1～8：1；加热至70～80℃反应24h，得到杂多蓝修饰的纳米硒；

(3)取杂多蓝修饰的纳米硒配制成0.5mmol/mL溶液，取5mL，用0.1mmol/mL的杂多酸溶液调节其pH在2.3～5.0，得到溶液A；将转铁蛋白用三乙醇胺配制成0.2mmol/mL的溶液，在不断搅拌下滴加到溶液A中，过程中始终保持pH值为2.3～5.0；继续搅拌4～24h，4℃下放置12h，离心分离，弃上清液，洗涤，干燥，得到杂多酸-转铁蛋白修饰的纳米硒；

步骤(2)中所述的含硒溶液为亚硒酸钠溶液或二氧化硒溶液；

所述的Y为没食子酸时，所述的功能化纳米硒通过如下方法制备得到：

(Ⅰ)将Y与亚硒酸钠或二氧化硒混合形成均一的水溶液，调水溶液的pH值为2.5～3.0，Y与亚硒酸钠或二氧化硒的摩尔比为5:1～7:1；于70～80℃水浴中加热至溶剂挥发至干，得到橙红色的Y修饰的纳米硒，将此样品加蒸馏水溶解、定容，得到1mM纳米硒溶胶；

(Ⅱ)取纳米硒溶胶配制成0.5mmol/mL溶液，取5mL，调节其pH在2.3～5.0，得到溶液A；将转铁蛋白用三乙醇胺配制成0.2mmol/mL的溶液，在不断搅拌下滴加到溶液A中，过程中始终保持pH值为2.3～5.0；继续搅拌4～24h，4℃下放置12h，离心分离，弃上清液，洗涤，干燥，得到功能化纳米硒。

2.根据权利要求1所述的功能化纳米硒在制备抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：步骤(1)中所述的惰性气体为氮气；

步骤(1)中所述的电解还原为采用恒电位仪进行反应；

步骤(1)中所述的还原的程度通过铜库仑计指示。

3.根据权利要求1所述的功能化纳米硒在制备抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：步骤(1)中所述的水为超纯水或是蒸馏水；

步骤(2)中所述的加热为于带有聚四氟乙烯内衬的反应釜中加热或是通过微波加热。

4.根据权利要求1所述的功能化纳米硒在制备抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：步骤(3)中所述的洗涤为使用PBS缓冲液洗涤；

步骤(3)中所述的干燥的条件为于70℃干燥2天。

5.根据权利要求1所述的功能化纳米硒在制备抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：步骤(Ⅱ)中所述的pH为通过盐酸调节；

步骤(Ⅱ)中所述的洗涤为使用超纯水洗涤；

步骤(Ⅱ)中所述的干燥的条件为于70℃干燥2天。