CN102621326A - 一种检测食品中呋喃它酮代谢物含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了直接检测食品中呋喃它酮代谢物AMOZ含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)。其特点是合成了三种不同的AMOZ半抗原衍生物，并将衍生物与载体蛋白质交联，合成三种免疫原和包被抗原，运用杂交瘤单抗制备技术制得单克隆抗体。所建立的ELISA可以无需衍生化步骤而直接检测样品中的AMOZ；所制备的单抗与其它硝基呋喃类物质及其代谢物和8种抗生素均没有交叉反应，说明抗体的特异性很高。四种肉样即鱼肉、虾肉、鸡肉和猪肝中加入不同量的AMOZ，并用ELISA直接测定，加标回收率为72.6-102.7％，相对标准偏差为6.1-17.7％；七份加标样品同时用HPLC和ELISA检测并比较测定结果，回归曲线为Y＝0.9742X-7.6001，线性相关系数为0.9889，表明两种方法有较好的相关性。

Description

一种检测食品中呋喃它酮代谢物含量的方法

技术领域

本发明涉及一种直接检测食品中呋喃它酮代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，属于食品安全监督或食品分析的研究领域。

背景技术

呋喃它酮(FTD)属于硝基呋喃类药物，是一种广谱抗生素，曾被广泛应用于家畜、家禽中痢疾、肠炎、球虫病的预防和治疗。但研究表明，该药物具有严重的致癌等毒副作用，因此近十多年来世界各国陆续禁用该药物并限定了残留标准。然而国内外仍不时有呋喃它酮检测超标的报道。呋喃它酮抗生素对光敏感，具有代谢快速的特点，在动物体内的半衰期不过数小时，通常不太可能检出原药残留，而其代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)在体内较稳定，因此可通过检测AMOZ的含量判断是否存在违规使用呋喃它酮。

1990年欧盟颁布条例，规定硝基呋喃类药物及其代谢产物在动物源性食品中的残留检测限为1.0μg/kg，而AMOZ的检测限为300ng/kg。澳大利亚(1993)，菲律宾(2001)，巴西(2002)，泰国(2002)和美国(2002)也相继颁布条例禁止其使用。我国农业部文件农牧发[2002]1号文件也规定动物源性食品中硝基呋喃类药物及其代谢物为不得检出。

AMOZ的检测方法主要是色谱分析法。由于原药化合物半衰期通常只有几小时，而其代谢产物则可与动物组织中的蛋白结合而形成稳定的化合物，稳定期可长达几个星期，因此，目前国内外报道多见于检测其代谢物。由于硝基呋喃代谢产物分子量比较小，为了增加分子量和产生强紫外吸收，使结果更加精确，现有的分析方法多为先让硝基呋喃代谢产物在酸性条件下水解，同时用2-硝基苯甲醛等衍生化试剂进行衍生化，所生成的代谢物的衍生物经提取和进一步净化，再用高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)等仪器进行检测。我国质检总局发布的国家标准(GB/T21311-2007)，将样品在酸性条件下水解，同时用2-硝基苯甲醛进行衍生化，调pH＝7.4后，用乙酸乙酯提取生成的衍生物(NPAMOZ)，正己烷净化，再用液相色谱-串联质谱进行定性检测，采用稳定同位素内标法进行定量测定。尽管色谱分析方法较准确，但色谱法仪器昂贵、样品预处理复杂、费时、检测成本高，而且不能直接测定食品中AMOZ含量。

酶联免疫吸附分析方法(ELISA)具有灵敏度高、特异性强、分析快速的优点，已广泛用于临床、药物、食品和环境等分析领域。国内已有申请以多克隆抗体为基础的ELISA测定食品中AMOZ含量的专利，申请号为200810219298.X。但是其仍然不能直接测定AMOZ，而需要用2-硝基苯甲醛进行衍生化后，再测定AMOZ与2-硝基苯甲醛形成的衍生物NPAMOZ。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种直接检测食品中AMOZ含量的酶联免疫吸附分析方法，其特点是基于抗原与抗体之间特异性反应而建立的分析方法。

本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外均为重量份数。直接检测食品中AMOZ含量的酶联免疫吸附分析方法：

一种检测食品中呋喃它酮代谢物含量的方法，包括以下步骤：

步骤一：AMOZ修饰物的制备；

步骤二：免疫原和包被抗原的制备；

步骤三：AMOZ单克隆抗体的制备；

步骤四：建立测定AMOZ的酶联免疫吸附分析方法；

步骤五：ELISA对加标样品中AMOZ含量的测定。

其中，所述步骤一包括：

1)CPAMOZ I的合成

称取3-羧基苯甲醛加入反应瓶，用无水甲醇溶解，再加入AMOZ，溶解完全后，65℃氮气保护下反应5～12小时，取出，将反应液离心，弃去上层清夜，沉淀用冰无水乙醇洗涤后，得白色沉淀，真空抽干，4℃下保存，产物简写为CPAMOZ I，其反应式如下：

2)CPAMOZ II的合成

称取4-羧基苯甲醛加入反应瓶，用无水甲醇溶解，再加入AMOZ，溶解完全后，65℃氮气保护下反应5～12小时，取出，将反应液离心，弃去上层清夜，沉淀用冰无水乙醇洗涤后，得白色沉淀，真空抽干，4℃下保存，产物简写为CPAMOZ II，其反应式如下：

3)CPAMOZ III的合成

称取4-甲酰苯氧基乙酸加入反应瓶，用无水甲醇溶解，再加入AMOZ，溶解完全后，65℃氮气保护下反应5～12小时，取出，将反应液离心，弃去上层清夜，沉淀用冰无水乙醇洗涤后，得白色沉淀，真空抽干，4℃下保存，产物简写为CPAMOZ III，其反应式如下：

4)CPAMOZ I、CPAMOZ II和CPAMOZ III的表征：

¹H-NMR谱：用Bruker AMX-300核磁共振仪测试CPAMOZ I、CPAMOZ II和CPAMOZ III的核磁谱，以氘代二甲亚枫溶液为溶剂，内标为TMS；

CPAMOZ I ¹H-NMR(DMSO，δvs TMS)：13.164(s，1H，-COOH)，7.953(t，4H，C₆H)，8.332(S，1H，CH＝N)；4.930(S，2H，-O-(CH₂)₂)。；

CPAMOZ II ¹HNMR(DMSO，δvs TMS)：13.039(s，1H，-COOH)，7.828(d，4H，C₆H)，7.916(S，1H，CH＝N)，4.931(S，2H，-O-(CH₂)₂)。；

CPAMOZ III ¹HNMR(DMSO，δvs TMS)：12.934(s，1H，-COOH)，6.999-7.666(t，4H，C₆H)，7.796(S，1H，CH＝N)，4.914(S，2H，-O-(CH₂)₂)，4.735(S，2H，-O-CH₂-COOH)。

其中，所述步骤二包括：

分别称取CPAMOZ I或CPAMOZ II，或CPAMOZ III和二环己基碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺，一同溶解于二甲基甲酰胺中，室温下搅拌过夜，将混合液离心5～20分钟，取上层清液，缓慢加入到0.01～0.02％的牛血清白蛋白即BSA和0.01～0.02％卵清白蛋白即OVA，搅拌1～10小时，离心分离，取上层清液，透析数天，溶液冷冻干燥，置冰箱中存放，其中，CPAMOZ I-BSA、CPAMOZ II-BSA和CPAMOZ III-BSA为免疫原；CPAMOZ I-OVA、CPAMOZ II-OVA和CPAMOZ III-OVA为包被抗原。

其中，所述步骤四包括：

(1)溶液配制；

(2)间接竞争ELISA步骤；

(3)ELISA的优化条件和灵敏度；

(4)ELISA的标准曲线；

(5)ELISA的特异性。

其中，所述(1)溶液配制包括：

(a).碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；

(b).磷酸缓冲液；

(c).酪蛋白溶液；

(d).磷酸缓冲液-吐温储备液；

(e).底物溶液；

(f).H₂SO₄溶液；

(g)RPMI-1640培养液。

其中，所述(2)间接竞争ELISA步骤包括；

(a).加入包被抗原于酶标板中，每孔200μL，冰箱4℃过夜；

(b).用PBST缓冲液，PBST储备液，1∶10稀释，350μL/孔，洗板三次；

(c).加入酪蛋白进行封阻，每孔300μL，室温保温保湿放置1小时；

(d).用PBST缓冲液洗板三次；

(e).在酶标板的每孔中依次分别加入100μL标准溶液和100μL一定稀释度的单克隆抗体，室温保温保湿放置1小时；

(f).用PBST缓冲液洗板三次；

(g).加入酶标二抗(羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶，GaMIgG-HRP)，每孔200μL，室温保温保湿放置1小时；

(h).用PBST缓冲液洗板三次；

(i).加入底物溶液，每孔200μL，室温保温保湿避光反应，在微量振荡器上振摇约15～25分钟；

(j).加入5％H₂SO₄溶液，每孔50～100μL，终止酶反应；

(k).用酶标仪测定吸光度，作出标准曲线，进行结果分析与讨论

其中，所述(3)ELISA的优化条件和灵敏度包括：

包被浓度为25ng/mL；细胞上清液稀释度为1∶1500；GaMIgG-HRP为1∶10,000；封阻液为1％ casein；孵育时间为1h；显色时间为15min。

其中，所述(4)ELISA的标准曲线包括：

分别选用NPAMOZ，CPAMOZ，AMOZ和FTD作为目标物，考察了ELISA的灵敏度；

分别以目标物浓度的对数为横坐标，以相对信号B/B₀x100％为纵坐标作出标准曲线；

B₀：标准浓度为0ng/mL所对应的吸光度；B：其它标准浓度所对应的吸光度。

其中，所述(5)ELISA的特异性包括：

ELISA特异性可用交叉反应率的大小来表示；交叉反应率CR％＝NPAMOZ的IC₅₀/测试物质的IC₅₀×100％；交叉反应率越小，ELISA的特异性越高。

其中，所述步骤五包括：

选择四种样品：鱼肉、虾肉、鸡肉和猪肝进行加标反应实验；同一样品取两份，一份加入适量的AMOZ溶液，一份作为空白样品；在样品中分别加入H₂O和盐酸溶液，旋涡，37℃振荡孵育16h后，分别加入K₂HPO₄、NaOH和乙酸乙酯，剧烈振荡30s，室温下5000r/10min离心，再用乙酸乙酯提取，合并乙酸乙酯层，氮气吹至干，用正己烷溶解干燥物，加入pH＝7.2磷酸缓冲液，室温下3000r/10min离心，上清用水稀释后用ELISA直接测定。

本发明的优点：

1.成功制备出抗AMOZ的单克隆抗体，并建立出直接测定样品中AMOZ含量的ELISA方法，而无需样品的衍生化，这在国内、外均属于首次。

2.灵敏度高、特异性强。

3.样品处理简单、测试量大、测试费用低。

4.对样品的测定，ELISA与HPLC有很好的相关性。

附图说明

图1.免疫原的紫外-可见光谱图。

图2.基于单克隆抗体建立的ELISA标准曲线。

图3.为ELISA和HPLC对6个加标样品中AMOZ的检测结果的相关曲线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施只用于对发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例：

1.AMOZ修饰物的制备

AMOZ是小分子化合物，没有免疫原性，不能直接免疫动物产生抗体，必须对AMOZ的分子结构进行合理、有效的化学修饰，使其带有活性基团，才能与载体蛋白交联，制得免疫原和包被抗原。本发明制备了三种AMOZ修饰物：

(1)CPAMOZ I的合成

称取3-羧基苯甲醛(3-CBA)0.055～0.075mmol加入反应瓶，用尽量少的无水甲醇溶解，再加入AMOZ 0.05～0.08mmol，溶解完全后，65℃氮气保护下反应5～12小时，取出，将反应液离心，弃去上层清夜，沉淀用冰无水乙醇洗涤三次后，得白色沉淀，真空抽干，产率73％，4℃下保存，产物简写为CPAMOZ I。

(2)CPAMOZ II的合成

称取4-羧基苯甲醛(4-CBA)0.055～0.075mmol加入反应瓶，用无水甲醇溶解，再加入AMOZ 0.05～0.08mmol，溶解完全后，65℃氮气保护下反应5～12小时，取出，将反应液离心，弃去上层清夜，沉淀用冰无水乙醇洗涤三次后，得白色沉淀，真空抽干，产率73％，4℃下保存，产物简写为CPAMOZ II。

(3)CPAMOZIII的合成

称取4-甲酰苯氧基乙酸(4-FPA)0.055～0.075mmol加入反应瓶，用无水甲醇溶解，再加入AMOZ 0.05～0.08mmol，溶解完全后，65℃氮气保护下反应5～12小时，取出，将反应液离心，弃去上层清夜，沉淀用冰无水乙醇洗涤三次后，得白色沉淀，真空抽干，产率75％，4℃下保存，产物简写为CPAMOZIII。

(4)CPAMOZ I、CPAMOZ II和CPAMOZ III的表征

¹H-NMR谱：用Bruker AMX-300核磁共振仪测试CPAMOZ I、CPAMOZ II和CPAMOZ III的核磁谱，以氘代二甲亚枫溶液为溶剂，内标为TMS。

CPAMOZ I ¹H-NMR(DMSO，δvs TMS)：13.164(s，1H，-COOH)，7.953(t，4H，C₆H)，8.332(S，1H，CH＝N)；4.930(S，2H，-O-(CH₂)₂)。

CPAMOZ II ¹HNMR(DMSO，δvs TMS)：13.039(s，1H，-COOH)，7.828(d，4H，C₆H)，7.916(S，1H，CH＝N)，4.931(S，2H，-O-(CH₂)₂)。

CPAMOZ III ¹HNMR(DMSO，δvs TMS)：12.934(s，1H，-COOH)，6.999-7.666(t，4H，C₆H)，7.796(S，1H，CH＝N)，4.914(S，2H，-O-(CH₂)₂)，4.735(S，2H，-O-CH₂-COOH).

2.免疫原和包被抗原的制备

分别称取0.10～0.45mmol的CPAMOZ I(或CPAMOZ II，或CPAMOZ III)，二环己基碳二亚胺0.10～0.80mmol，N-羟基琥珀酰亚胺0.10～0.80mmol，一同溶解于100～600μL的二甲基甲酰胺中，室温下搅拌过夜，将混合液离心5～20分钟，取上层清液，缓慢加入到0.01～0.02％的牛血清白蛋白即BSA和0.01～0.02％卵清白蛋白即OVA，搅拌1～10小时，离心分离，取上层清液，透析数天，溶液冷冻干燥，置冰箱中存放，其中，CPAMOZI-BSA、CPAMOZ II-BSA和CPAMOZ III-BSA为免疫原；CPAMOZ I-OVA、CPAMOZII-OVA和CPAMOZ III-OVA为包被抗原；

图1为BSA、AMOZ和CPAMOZ III-BSA的紫外-可见光谱图，a.BSA；b.CPAMOZ III；c.CPAMOZ III-BSA。由图1可知，在280nm出现了蛋白质的特征吸收峰，而在288nm附近出现了CPAMOZIII的特征吸收峰。与前两者相区别的是CPAMOZIII-BSA的吸收峰为282nm。紫外图谱证明，CPAMOZIII成功地与载体蛋白结合。其他免疫原与包被抗原的紫外图谱与之类似。

3.AMOZ单克隆抗体的制备

免疫：将免疫原溶于生理盐水中，再与等体积的完全福氏佐剂混合，皮下多点免疫BALB/C小鼠，每只小鼠免疫原剂量在50～100μg，第一次免疫后，每隔两周再次免疫，将完全福氏佐剂换成不完全福氏佐剂，第三次免疫后一周，尾部取血检测抗血清效价，最后一次腹腔加强免疫，不加佐剂。

融合：最后一次对小鼠加强免疫，三天后取小鼠脾脏，将脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)按5∶1～10∶1的比例混合，在50％聚乙二醇4000的作用下融合，杂交瘤细胞用HAT培养液混悬，加入预先含有饲养细胞的96孔培养板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

筛选：融合后2周左右，用间接ELISA法筛选，将阴性孔无色或接近无色，而阳性孔明确显色的细胞用有限稀释法进行亚克隆2-3次，及时进行检测。

单克隆抗体的大量生产：先腹腔注射液体石蜡于BALB/C小鼠，7-10天后腹腔接种杂交瘤细胞，观察小鼠腹水情况，待腹水尽可能多，濒于死亡之前，收集腹水。用硫酸铵沉淀法纯化腹水中的单克隆抗体，纯化抗体与等体积甘油1∶1混合并置于-20℃保存。

4.建立测定AMOZ的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)

优化实验条件，对所制得的抗体进行性能表征，在实验条件优化的基础上，建立以单克隆抗体为基础的测定食品中AMOZ含量的酶联免疫吸附分析方法。

(1)溶液配制

(a).碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液

称取2.606g Na₂CO₃·10H₂O，3.434g NaHCO₃，用800mL超纯水混匀溶解后，调节pH值，加水至1L，配成0.05mol/L，pH＝9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；

(b).磷酸缓冲液(储备液，PBSx10)

称取21.961g Na₂HPO₄·12H₂O，6.031g NaH₂PO₄·2H₂O，87.666g NaCl，加800mL超纯水混合，加热溶解；用1mol/L的NaOH调节pH＝7.4；加超纯水至1L，配成含0.15mol/L NaCl，pH＝7.4的0.1mol/L磷酸缓冲液(储备液)；

(c).酪蛋白溶液

称取酪蛋白加热溶解于0.01mol/L的PBS中，配成0.5～2％酪蛋白溶液；

(d).磷酸缓冲液-吐温储备液(含1％Tween20的0.1mol/L磷酸缓冲储备液，PBSTx10，pH＝7.4)。

(e).底物溶液(20mL纯水；1mL醋酸钠缓冲液；200μl四甲基联苯胺(TMB)(1％)；20μl过氧化氢(5％))

①.醋酸钠缓冲液

称取3.450g CH₃COONa·3H₂O，用100mL超纯水溶解，再用1mol/L柠檬酸(称取21.031g C₆H₈O₇·H₂O溶解于100mL水中)调节pH＝5.8后，再加水到250mL容量瓶中，配成0.1mol/L醋酸钠缓冲液；

②.TMB：称取0.0717g TMB，用7.17mL二甲基亚砜溶解，混匀，配成1％，v/v；

③.过氧化氢：取20μL30％的过氧化氢加入100μL超纯水中，混匀，配成5％；

(f).H₂SO₄溶液：移取25mL浓H₂SO₄，溶解于475mL的超纯水中，配成5％H₂SO₄溶液；

(g)RPMI-1640培养液：RPMI-1640固体粉末10.4g溶于800ml超纯水中，加入HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)4.67g，并按终体积1L计算加入200mmol/L L-谷氨酸、100mmol/L 2-巯基乙醇及1mmol/L(即0.1g/L)丙酮酸钠，再加入10^万IU青霉素以及10^万IU链霉素，补加超纯水使终体积达1000ml，磁力搅拌3～4小时，充分溶解后再加入NaHCO₃约2g调节培养液pH至7.2～7.4，0.22μm滤器过滤除菌，无菌分装，-20℃密封保存。

(2)主要仪器

洗板机：A5082，Tecan，Austria；酶标仪：A2082，Tecan，Austria；高效液相色谱仪：Alltech-1001

(3)间接竞争ELISA步骤

(a).加入一定浓度的包被抗原于酶标板中，每孔200μL，冰箱4℃过夜；

(b).用PBST缓冲液(PBST储备液，1∶10稀释，350μL/孔)洗板三次；

(c).加入酪蛋白进行封阻，每孔300μL，室温保温保湿放置1小时；

(d).用PBST缓冲液洗板三次；

(e).在酶标板的每孔中依次分别加入100μL标准溶液和100μL一定稀释度的单克隆抗体，室温保温保湿放置1小时；

(f).用PBST缓冲液洗板三次；

(g).加入酶标二抗(羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶，GaMIgG-HRP)，每孔200μL，室温保温保湿放置1小时；

(h).用PBST缓冲液洗板三次；

(i).加入底物溶液(临用新配)，每孔200μL，室温保温保湿避光反应，在微量振荡器上振摇约15～25分钟；

(j).加入5％H₂SO₄溶液，每孔50～100μL，终止酶反应；

(k).用酶标仪测定吸光度，作出标准曲线，进行结果分析与讨论。

(4)ELISA的优化条件和灵敏度

包被浓度为25ng/mL；细胞上清液稀释度为1∶1500；GaMIgG-HRP为1∶10,000；封阻液为1％ casein；孵育时间为1h；显色时间为15min。

(5)ELISA的标准曲线

：图2是以NPAMOZ，CPAMOZ，AMOZ和FTD为检测对象的ELISA标准曲线，NPAMOZ(■)，CPAMOZ(●)，

and FTD(▲)。表1为IC₅₀和LOD值。

表1：ELISA检测NPAMOZ，CPAMOZ，AMOZ和FID的IC₅₀和LOD值

*为CPAMOZ II

由图2和表1可知，单克隆抗体对NPAMOZ，CPAMOZ，AMOZ和FTD都有特异性的识别，IC₅₀在0.17-1.63ng/ml之间；若以NPAMOZ作为目标物，LOD值为0.02ng/mL，远低于欧盟限定标准，因此，基于单抗的ELISA具有高度特异性和足够的灵敏度来检测样品中的AMOZ(以NPAMOZ的形式)；另外由图2和表1还可以看到，虽然所制备的单克隆抗体对NPAMOZ识别能力更强(IC₅₀为0.17ng/mL，LOD值为0.02ng/mL)，但其对AMOZ的识别能力(IC₅₀为1.15ng/mL，LOD为0.11ng/mL)也能达到欧盟限定标准，在没有衍生化试剂加入的情况下，NPAMOZ和CPAMOZ均不存在，而FTA在动物体内极不稳定，因此，所建立的ELISA可以无需衍生化步骤而直接检测样品中的AMOZ。

(6)ELISA的特异性

ELISA特异性可用交叉反应率的大小来表示。交叉反应率(CR％)＝NPAMOZ的IC₅₀/测试物质的IC₅₀×100％。交叉反应率越小，ELISA的特异性越高。

在本发明选择9种NPAMOZ的结构类似物和其它8种药物进行交叉反应实验，结果如表2所示。

表2.单克隆抗体与硝基呋喃类物质及其它八种药物的交叉反应率

*为CPAMOZ II；

从表2中看出，单克隆抗体与NPAMIOZ，CPAMOZ，AMOZ和FID的交叉反应率分别为100％，61％，14.8％和10.42％，与其他硝基呋喃物质和药物都没有交叉反应。在没有衍生化试剂加入的情况下，NPAMOZ和CPAMOZ均不存在，而FTA在动物体内极不稳定，因此，所建立的ELISA可以无需衍生化步骤而直接检测样品中的AMOZ。

5.ELISA对加标样品中AMOZ含量的测定

选择了四种样品：鱼肉、虾肉、鸡肉和猪肝进行加标反应实验。同一样品取两份，一份加入适量的AMOZ溶液，一份作为空白样品。在样品中分别加入4.0mL H₂O和0.5mL 1.0mol/L盐酸溶液，旋涡，37℃振荡孵育16h后，分别加入5.0ml 0.1mol/LK₂HPO₄、0.4ml 1.0mol/L NaOH和5.0mL乙酸乙酯，剧烈振荡30s，室温下5000r/10min离心，再用乙酸乙酯提取2次，合并乙酸乙酯层，氮气吹至干，用1.0mL正己烷溶解干燥物，加入1.0mL磷酸缓冲液(pH＝7.2)，室温下3000r/10min离心，上清用水稀释后用ELISA直接测定，结果如表3所示，加标回收率为72.6-102.7％，相对标准偏差为6.1-17.7％(n＝4)。

表3.ELISA直接检测加标样品中AMOZ的回收率和相对标准偏差

^a不能检出

6.ELISA与HPLC的比较

HPLC测定条件为：色谱条件：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈∶异丙醇∶乙酸∶0.05％庚烷磺酸钠(10∶10∶0.1∶80，v/v)；流速为1mL/min；进样量为20μL；紫外检测波长为280nm；NPAMOZ标准溶液浓度为：20，50，100，150，200，250，300ng/mL，样品萃取液用0.25μm的滤膜过滤后直接测定；

四种样品加入不量的AMOZ(鱼肉：加标量分别为150ng/g和300ng/g；虾肉：加标量分别为100ng/g和250ng/g；鸡肉：加标量分别为50ng/g和200ng/g；猪肝：加标量为20ng/g)，加标样品经衍生化步骤处理后用HPLC检测，加标样品不经过衍生化步骤，只是加酸水解，乙酸乙酯萃取，样品中的AMOZ由以AMOZ为对象的ELISA标准曲线定量检测，以HPLC的测定结果为横坐标，ELISA测定结果为纵坐标作图，得两者的相关曲线，如图3所示，回归曲线为Y＝0.9742X-7.6001(r＝0.9889，n＝7)，表明ELISA与HPLC有很好的相关性。

Claims (10)

1.一种检测食品中呋喃它酮代谢物含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤一：AMOZ修饰物的制备；

步骤二：免疫原和包被抗原的制备；

步骤三：AMOZ单克隆抗体的制备；

步骤四：建立测定AMOZ的酶联免疫吸附分析方法；

步骤五：ELISA对加标样品中AMOZ含量的测定。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤一包括：

1)CPAMOZ I的合成

称取3-羧基苯甲醛加入反应瓶，用无水甲醇溶解，再加入AMOZ，溶解完全后，65℃氮气保护下反应5～12小时，取出，将反应液离心，弃去上层清夜，沉淀用冰无水乙醇洗涤后，得白色沉淀，真空抽干，4℃下保存，产物简写为CPAMOZ I，其反应式如下：

2)CPAMOZII的合成

称取4-羧基苯甲醛加入反应瓶，用无水甲醇溶解，再加入AMOZ，溶解完全后，65℃氮气保护下反应5～12小时，取出，将反应液离心，弃去上层清夜，沉淀用冰无水乙醇洗涤后，得白色沉淀，真空抽干，4℃下保存，产物简写为CPAMOZ II，其反应式如下：

3)CPAMOZIII的合成

称取4-甲酰苯氧基乙酸加入反应瓶，用无水甲醇溶解，再加入AMOZ，溶解完全后，65℃氮气保护下反应5～12小时，取出，将反应液离心，弃去上层清夜，沉淀用冰无水 乙醇洗涤后，得白色沉淀，真空抽干，4℃下保存，产物简写为CPAMOZIII，其反应式如下：

4)CPAMOZ I、CPAMOZ II和CPAMOZ III的表征：

¹H-NMR谱：用Bruker AMX-300核磁共振仪测试CPAMOZ I、CPAMOZ II和CPAMOZ III的核磁谱，以氘代二甲亚枫溶液为溶剂，内标为TMS；

CPAMOZ I ¹H-NMR(DMSO，δvs TMS)：13.164(s，1H，-COOH)，7.953(t，4H，C₆H)，8.332(S，1H，CH＝N)；4.930(S，2H，-O-(CH₂)₂)。；

CPAMOZ II ¹HNMR(DMSO，δvs TMS)：13.039(s，1H，-COOH)，7.828(d，4H，C₆H)，7.916(S，1H，CH＝N)，4.931(S，2H，-O-(CH₂)₂)。；

CPAMOZ III ¹HNMR(DMSO，δvs TMS)：12.934(s，1H，-COOH)，6.999-7.666(t，4H，C₆H)，7.796(S，1H，CH＝N)，4.914(S，2H，-O-(CH₂)₂)，4.735(S，2H，-O-CH₂-COOH)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤二包括：

分别称取CPAMOZ I或CPAMOZ II，或CPAMOZ III和二环己基碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺，一同溶解于二甲基甲酰胺中，室温下搅拌过夜，将混合液离心5～20分钟，取上层清液，缓慢加入到0.01～0.02％的牛血清白蛋白即BSA和0.01～0.02％卵清白蛋白即OVA，搅拌1～10小时，离心分离，取上层清液，透析数天，溶液冷冻干燥，置冰箱中存放，其中，CPAMOZ I-BSA、CPAMOZ II-BSA和CPAMOZ III-BSA为免疫原；CPAMOZ I-OVA、CPAMOZ II-OVA和CPAMOZ III-OVA为包被抗原。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤四包括：

(1)溶液配制；

(2)间接竞争ELISA步骤；

(3)ELISA的优化条件和灵敏度； 

(4)ELISA的标准曲线；

(5)ELISA的特异性。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述(1)溶液配制包括：

(a).碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；

(b).磷酸缓冲液；

(c).酪蛋白溶液；

(d).磷酸缓冲液-吐温储备液；

(e).底物溶液；

(f).H₂SO₄溶液；

(g)RPMI-1640培养液。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述(2)间接竞争ELISA步骤包括；

(a).加入包被抗原于酶标板中，每孔200μL，冰箱4℃过夜；

(b).用PBST缓冲液，PBST储备液，1∶10稀释，350μL/孔，洗板三次；

(c).加入酪蛋白进行封阻，每孔300μL，室温保温保湿放置1小时；

(d).用PBST缓冲液洗板三次；

(e).在酶标板的每孔中依次分别加入100μL标准溶液和100μL一定稀释度的单克隆抗体，室温保温保湿放置1小时；

(f).用PBST缓冲液洗板三次；

(g).加入酶标二抗(羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶，GaMIgG-HRP)，每孔200μL，室温保温保湿放置1小时；

(h).用PBST缓冲液洗板三次；

(i).加入底物溶液，每孔200μL，室温保温保湿避光反应，在微量振荡器上振摇约15～25分钟；

(j).加入5％H₂SO₄溶液，每孔50～100μL，终止酶反应；

(k).用酶标仪测定吸光度，作出标准曲线，进行结果分析与讨论。

7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述(3)ELISA的优化条件和灵敏度包括： 

包被浓度为25ng/mL；细胞上清液稀释度为1∶1500；GaMIgG-HRP为1∶10,000；封阻液为1％ casein；孵育时间为1h；显色时间为15min。

8.根据权利要求4所述的方法，其中，所述(4)ELISA的标准曲线包括：

分别选用NPAMOZ，CPAMOZ，AMOZ和FTD作为目标物，考察了ELISA的灵敏度；

分别以目标物浓度的对数为横坐标，以相对信号B/B₀x100％为纵坐标作出标准曲线；

B₀：标准浓度为0ng/mL所对应的吸光度；B：其它标准浓度所对应的吸光度。

9.根据权利要求4所述的方法，其中，所述(5)ELISA的特异性包括：

ELISA特异性可用交叉反应率的大小来表示；交叉反应率CR％＝NPAMOZ的IC₅₀/测试物质的IC₅₀×100％；交叉反应率越小，ELISA的特异性越高。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤五包括：

选择四种样品：鱼肉、虾肉、鸡肉和猪肝进行加标反应实验；同一样品取两份，一份加入适量的AMOZ溶液，一份作为空白样品；在样品中分别加入H₂O和盐酸溶液，旋涡，37℃振荡孵育16h后，分别加入K₂HPO₄、NaOH和乙酸乙酯，剧烈振荡30s，室温下5000r/10min离心，再用乙酸乙酯提取，合并乙酸乙酯层，氮气吹至干，用正己烷溶解干燥物，加入pH＝7.2磷酸缓冲液，室温下3000r/10min离心，上清用水稀释后用ELISA直接测定。 

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