CN102614505A - 一种包括酵母细胞中表达的hpv16型l1和e7靶抗原的嵌合蛋白疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种L1衣壳蛋白和E7多肽组成的L1E7嵌合蛋白疫苗及其制备方法。本发明采用优化的诱导表达条件，用酵母细胞进行大规模发酵来表达嵌合蛋白，能够大大降低成本；而且，采用的纯化工艺相对简单、成本低、适于大规模生产HPV16L1/E7蛋白。含晚期结构基因和早期基因的HPV16L1/E7蛋白，除能使机体产生中和抗体外，还能诱导机体产生较强的E7特异性C TL反应和抗肿瘤活性，被认为是最有前景的宫颈癌预防、治疗性疫苗，能用于已有HPV16感染的、有或没有临床症状的病人。

Description

一种包括酵母细胞中表达的HPV16型L1和E7靶抗原的嵌合蛋白疫苗及其制备方法

技术领域：

本发明属于生物医学技术领域，特别是生物疫苗技术领域，涉及利用HPV16L1、HPV16E7的嵌合型蛋白为靶抗原，适当比例配伍，制备HPV疫苗，用于预防HPV引起的部分疾病。 

背景技术：

子宫颈癌是妇女常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌，位居女性恶性肿瘤第二。据世界范围内统计，每年约有50万宫颈癌新发病例，每天有600名妇女死于宫颈癌，其中80％在发展中国家。我国每年约新发病例13.15万，占世界新发病例的1/3。大量研究资料表明高危险人乳头瘤状病毒(HPV)感染是引发宫颈癌的重要原因之一。HPV是一种嗜黏膜和皮肤上皮DNA病毒，20世纪70年代发现宫颈癌的发生与HPV有关，20世纪80年代宫颈癌活组织检查发现HPV16。HPV感染大多数由低危型的如HPV-6和HPV-11感染，造成良性生殖器疣；而高危型HPV与肛门及生殖器区域的癌前病变及恶性病变有关。对多数患者来说，生殖道HPV存留可达年，直到出现另一新型别的HPV感染才自然消退研究显示，HPV16和HPV18会存留更长时间周期持续HPV感染是宫颈上皮。近年来宫颈癌发病出现年轻化趋势，这主要与HPV感染增多有关。因此，研发安全、有效、经济的宫颈癌疫苗迫在眉睫，具有重大的经济学价值和社会意义。研究证明90％左右的宫颈癌的组织可以检测到HPV16亚型，HPV16型与鳞癌有着密切关系，而90％的宫颈癌为鳞癌，所以HPV16是女性宫颈癌发病的主要原因。巴斯德毕赤酵母表达系统是现目前广泛应用的异源蛋白真核表达系统，其具有稳定性好、表达高效、分泌量大、规模化容易和成本低廉等优点，且具有糖基化等翻译后修饰功能。 

HPV晚期基因编码的主要结构蛋白L1及次要蛋白L2构成了病毒衣壳，二者比例约5∶1。单独的L1蛋白可以自发组装成直径与HPV成熟病毒大小相近(约55nm)的VLPs，VLPs和天然HPV病毒的形态相似，都是二十面体结构，只是VLP内部无病毒核酸。L1、L2蛋白既是病毒的主要抗原成分，也是与细胞受体结合的位点所在。E7蛋白是HPV16的一种重要的肿瘤排斥抗原，E7蛋白的表位主要集中于第1～60个氨基酸之间。病毒样颗粒(VLPs)是不含核酸的空壳蛋白，形态上天然的病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性。人类乳头状瘤病毒(HPV)16型早期蛋白E7被证实不仅对细胞恶性转化和维持恶性过程起着关键作用，而且还是肿瘤排斥抗原。因此，阻止肿瘤形成的E7疫苗已成为近年研究热点。 

疫苗防治HPV相关疾病是近几年来的研究热点。由于目前无法通过组织培养获得大量的HPV病毒，并且考虑到HPVE6、E7基因的潜在致癌性，因此，不能通过减毒活疫苗或灭活 疫苗等传统疫苗制备方式获得HPV疫苗。伴随分子生物学和基因工程技术的发展，目前HPV疫苗研究主要集中在VLPS疫苗、重组病毒疫苗、亚单位疫苗等。VLPS疫苗主要是以HPV衣壳蛋白L1为首选目的蛋白，HPVLI蛋白分别在原核表达系统、酵母表达系统和杆状病毒表达系统中得以表达，且可自组装成VLPS，其动物实验及部分临床实验结果表明L1蛋白装配成的VLPs具有良好的免疫原性。 

全世界流行病学总体调查研究结果表明，HPV引起恶性肿瘤的型别在世界各地不尽相同。其中HPV16是最主要的致癌因素，其他型别在世界各地与肿瘤发生的相关性不同。HPV16和HPV18型在各大洲的流行型别占65～75％左右，为HPV感染的主要型别，也是目前两种HPV疫苗组份型别，其他型别表现的差异较大。 

发明内容：

要解决的技术问题 

本发明的目的之一是提供一种兼有治疗、预防人乳头瘤病毒引起的疾病的新疫苗；本发明的另一目的是提供制备上述疫苗的方法，以及所述疫苗用于预防和治疗由HPV16引起的感染和疾病的药物中的应用，其中所述的感染和疾病包括子宫颈癌、尖锐湿疣、乳腺癌、支气管肺癌、直肠癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮肤癌及其它与HPV密切相关的疾病。本发明的包含由在毕赤酵母中表达的人乳头瘤病毒16型病毒的重组蛋白L1E7的疫苗，是利用基因工程技术将人乳头瘤病毒16型的主要衣壳蛋白L1的免疫活性部分和早期基因E7的免疫活性部分融合构建为融合基因L1E7，并将该融合基因在毕赤酵母细胞中表达而得到重组蛋白，将获得的重组蛋白与佐剂混合，制备出疫苗，所加佐剂为氢氧化铝。本发明制备疫苗的方法包括设计引物克隆HPV16LI/E7基因及构建真核表达质粒；将构建成功的真核表达质粒转化酵母菌株，筛选稳定高效分泌表达菌株；发酵并诱导表达目的蛋白；纯化目的蛋白；将纯化的重组蛋白制成疫苗的步骤，其中在甲醇浓度为1.0％，pH为6.0条件下诱导酵母菌株表达重组蛋白，所采用的真核表达质粒是pPIC9k-L1/E7，酵母菌株是毕赤酵母菌株，优选为毕赤酵母组氨酸缺陷型GS115菌株，真核表达质粒转化酵母菌株的方法是电转化，所使用的引物是根据GenBank中HPV16的全序列设计的LI上游、LI下游、E7上游、E7下游引物。在pH＝6.0、温度28～30℃振摇培养毕赤酵母组氨酸缺陷型GS115菌株48h，然后每隔24h添加终浓度为1％的甲醇诱导重组蛋白表达，96h后收样。收样后，对样品进行离心，用玻璃珠破碎细胞沉淀，然后14000r/min离心2min，收集上清，接着从上清液中纯化目的蛋白。将纯化的重组蛋白制成疫苗包括向纯化的重组蛋白中加入终浓度约为1mg/ml的佐剂氢氧化铝，充分混合，于4℃保存即得半成品。 

技术方案 

本发明采用基因工程技术，用PCR及基因克隆的方法将HPV16的衣壳蛋白L1活性位点与E7早期基因的主要抗原活性位点融合，再将构建的融合基因插到表达载体pPIC9k中，高效表达L1-E7重组蛋白，纯化后得到的VLPs，将其与佐剂混合，制备出能兼有预防、治疗人乳头瘤病毒感染的疫苗。 

本发明具有如下优点：1)以HPV16L1、HPV16E7为靶抗原，兼有预防、治疗人乳头瘤病毒感染的疾病，如宫颈癌、尖锐湿疣。2)酵母细胞可实现大规模发酵，用毕赤酵母表达系统(P.Pichia)，相比用杆状病毒-昆虫表达系统，操作简单，大大降低成本。3)纯化工艺相对简单、成本低、适于大规模生产。纯化收率高，使此疫苗在发展中国家的应用可能性更高，具有显著的经济效益和社会效益。 

具体实施方式：

例1本发明的目的是这样实现的： 

(1)处理临床样品：刮取宫颈表层细胞，离心，用适宜的缓冲液洗涤离心，沉淀备用。若不立即使用，必须存储于-70℃冰箱或者液氮。 

(2)参考Genbank，从临床样品中分离HPV基因组DNA，确定代表性HPV野生型序列。考虑用酚抽提法：将细胞悬浮于含有EDTA、SDS和RNAase的抽提液中，然后用蛋白酶K与SDS发生协同作用破碎细胞膜，用酚、氯仿使蛋白变性，去杂质。最后用乙醇沉淀基因组DNA。 

(3)克隆HPV16LI/E7基因及构建质粒pPIC9k-L1/E7 

a)引物设计 

根据GenBank中HPV16的全序列设计引物，L1上游引入6*his标签及SnaBI酶切位点，下游引入HindIII酶酶切位点；E7上游引入HindIII酶切位点，下游引入Not I酶切位点。如下： 

LI上游5’CC TACGTA CATCATCATCATCATCAT CAGGTGACTTTTATT3’ 

LI下游5’CCC AAGCTT CAGCTIACGTTTTTTGCGTTTAGC3’ 

E7上游5’CCCAAGCTT ATGCATGGAG ATACACCTAC3’ 

E7下游5’ATAAGAAT GCGGCCGC TTATGGTTTCTGAGAACAGATG3’ 

b)基因扩增： 

①L1的扩增体系与参数 

上PCR仪进行扩增，具体参数为：①94℃ 5min②94℃ 45s，54℃ 45s，72℃ 2min③72℃ 10min。 

②E7的扩增体系与参数 

上PCR仪进行扩增，具体参数为：①94℃ 5min②94℃ 45s，52℃ 45s，72℃ 2min③72℃ 10min。扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，得到正确的条带后，进行胶回收。 

c)扩增产物的回收 

将凝胶中的正确条带用手术刀在紫外灯下切下，移入EP管中，用凝胶回收试剂盒进行回收。 

d)pPIC9k-L1/E7重组子的构建与质粒提取 

①大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 

②L1回收产物经SnaBI和HindIII酶切，E7经HindIII和Not I酶切，跑胶，用HiBindTM凝胶回收试剂盒进行回收，连接。 

16℃水浴5小时。 

pPIC9k经SnaBI和Not I酶切，经Ecor I和Not I酶切，跑胶后回收。 

16℃水浴5小时。 

把连接产物加入做好的DH5α中，冰浴30min，42℃ 90s，冰浴3min，加入500ul的LB液体培养基，37℃震荡培养1小时，室温离心5min吸去500ul的上清，余液混匀，余液均匀涂布于氨苄抗性的LB平板，37“C过夜。 

③碱裂解法大规模提取质粒 

e)质粒的线性化 

pPIC9k-L1/E7经Sall酶切，体系为 

酶切4小时，回收：往酶切体系里加入等体积的酚氯仿抽提，取上清约80ul，加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的pH5.2的醋酸钠，置于-20℃半小时，13000rmp 20min，弃去上清；75％的乙醇300ul洗两遍，13000rmp 5min，弃去上清，干燥后加35ul的ddH₂O溶解。 

(4)将构建成功的真核表达质粒pPIC9k-L1/E7转化毕赤酵母，筛选稳定高效分泌表达菌株 

a)毕赤酵母感受态的制备及电转化 

i、毕赤酵母感受态的制备 

①挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250～300r/min培养过夜； 

②取100～500μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28～30℃、250～300r/min培养过夜，至OD600达到1.3～1.5； 

③将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬； 

④按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬； 

⑤按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬； 

⑥按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml；将处理好的酵母菌按每份80ul分装到灭菌的EP管中，-80℃冻藏 

ii、毕赤酵母的电转化 

取新鲜制备的(或-80℃冻存的)感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻 

①将80ul菌体移出至一新的无菌Eppendorf管中，加入5-20ug线性化质粒(5-10ul)，轻弹混匀，尽数吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中； 

②转化杯置于冰浴中5～10分钟，保持低温。 

③电穿孔转化电击条件：电压：1509V；电阻：200Ω；电容：25uF；脉冲时间：10ms；一次电击。 

④电击后，马上在电击转化杯中加入1ml 4℃预冷的IM的山梨醇溶液，用微量移液枪吹打均匀，置于冰浴中； 

⑤取30℃烘至表面半干的含葡萄糖(MD)培养基平板，在超净工作台上无菌操作涂布平板，400uF/板；将涂好的平板置于30℃正面放置至表面半干，然后倒置培养，4天后观察转化子情况。 

b)重组酵母GS 115阳性转化子的高拷贝外源基因整合筛选 

①将阳性转化子在含葡萄糖(MD)平板培养板形成的克隆菌，点种在G418浓度在3g/L的YPD培养板上，30℃培养3-4d，筛选鉴定高拷贝外源基因整合菌株。得到阳性克隆菌株(即GS115高表达菌)，将鉴定结果为阳性的菌株接种在不含G418的YPD培养基进行扩增，并加甘油后放-70℃冰冻保存菌株。 

②鉴定表型： 

筛选出的转化子需鉴定表型，即确定是甲醇利用正表型Mut⁺还是甲醇利用慢表型Mut^s。这两种不同表型在诱导表达的件上有差异。可以把转化子同时点在含葡萄糖(MD)平板和含甲醇(MM)平板上。在MD和MM板上生长差别不大的转化子为Mut⁺(能够快速利用甲醇为碳源)；相反，在MD上生长快，MM上生长很慢的转化子为Mut^s(不能利用甲醇为碳源)。 

(5)目的蛋白的规模化发酵 

a)种子液的制备 

取已保存的GS115高表达菌，YPD板上划线。于28℃培养约72h，看到菌落长至直径2.5mm左右，挑单菌落接种于含5ml BMGY培养液的50ml离心管中，于28℃振荡培养36h左右，至OD600＝2-6。将上述菌液按0.1％(v/v)接种于含IL BMGY培养液5L三角摇瓶中，于28℃振荡培养36h左右至OD600＝2-6。 

b)发酵罐高压灭菌 

往100L发酵罐内加入40L FM21培养液，打开电源、蒸汽及冷却阀门，将控制面板调至灭菌状态，设定好灭菌温度为121℃，时间为30min，Control设为打开状态。在高压灭菌时，转速、pH、溶氧、通气全部为关闭状态。发酵罐以P-I-D闭环控制程序自动升温、高压和降温。 

c)接种 

高温灭菌后发酵罐温度要降至28℃，用氨水调pH值至6.0，加入无菌的40ml PTMI微量元素和18ml Biotin贮备液。用酒精棉将摇瓶的瓶口消毒后，将2L的种子液加入发酵罐，设定转速600rmp/min、温度28℃、pH6.0，通气，压力2km/cm²。 

d)发酵阶段 

i、生长阶段：只加甘油， 

①甘油批式阶段 

②甘油补料阶段 

ii、表达阶段： 

③甲醉补料诱导阶段：每隔24h以7.2ml/h/L的速度添加终浓度为1％的甲醇诱导，96h后收样，离心，细胞沉淀进行玻璃珠破碎后，14000r/min离心2min，取上清。 

(6)目的蛋白的纯化 

上清经纯化：通过离子交换，亲和，蛋白的透析复性及浓缩，等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。 

①离子交换层析 

将上清加入已用缓冲液平衡的离子交换柱上，用加了100mM氯化钠缓冲液以1ml/min的流速洗脱。 

②亲和层析 

将从离子交换得到的样品调PH至8.0，然后加入用缓冲液平衡过的Ni-NTA亲和层析柱，用含咪唑的缓冲液以1ml/min的流速洗脱，收集目的蛋白。 

③蛋白的透析复性及浓缩 

i、蛋白的透析 

将最后洗脱的蛋白置于处理好的透析袋中密封，放入100倍体积的含有尿素的透析液中，每6小时更换透析液，经4、2、1、0M的尿素梯度进行透析，最后透析到磷酸缓冲盐溶液中。 

ii、蛋白的浓缩： 

将透析好的蛋白取出离心(12000rmp 20分钟，4℃)取上清重新用透析袋密封好，埋于聚乙二醇(PEG 8000)颗粒中，待其浓度至初体积的1/3时取出，将蛋白离心(12000rmp 20分钟，4℃)取上清，分装储存。 

(7)将纯化的重组蛋白按制成疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。 

本发明疫苗制备工艺的重组蛋白生产收率：开启1支工作种子按每100L大罐培养量计可制造出粗制多糖：5mg。 

实施例2 PCR鉴定重组子 

用L1上游引物和E7下游引物以提取的酵母基因组为模板扩增，得到结果，说明重组酵母菌GS 115币pPIC9k-L1/E7构建成功。 

实施例3 重组酵母GS 115阳性转化子的高拷贝外源基因整合筛选鉴定： 

挑选单个阳性菌落，按试剂盒说明提取酵母GS 115菌转化的基因组DNA作为模板，用pPIC9k-L1/E7构建引物及条件进行PCR扩增筛选，PCR产物经加核酸染料的琼脂糖凝胶电泳分析。 

实施例4 重组蛋白HPV16LI/E7的表达优化 

试验中分别从诱导时间、甲醇诱导浓度、培养基pH值三方面优化表达。首先分别在6、12、24、36、48、60和72h七个时间点取样跑SDS-PAGE电泳检测表达量，结果显示48小时时外源蛋白表达量最高；然后取七个摇瓶分别按0、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％和1.2％的终浓度添加甲醇，SDS-PAGE电泳检测表达量，结果显示甲醇浓度在1.0％的时候外源蛋白的表达量最高；分别在培养基pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0条件下诱导表达目的蛋白，SDS电泳检测，结果是外源蛋白在pH为6.0的时候表达量最大。因此得出将阳性转化菌于pH＝6.0、温度28～30℃振摇培养48h，然后每隔24h添加终浓度为1％的甲醇诱导，96h后收样，离心，细胞沉淀进行玻璃珠破碎后，14000r/min离心2min，取上清的方式最优。 

实施例5 SDS-PAGE和Western-blot电泳检测表达产物及表达量的检测 

将最初在MD(含G4180.5mg/ml)培养基上长出的转化子，通过G418浓度梯度0.5、1、2mg/ml的筛选，最后得到G418抗性菌株1个。经甲醇诱导的重组菌离心后取上清跑SDS-PAGE电泳，在64KD左右出现蛋白条带，与推导的蛋白条带大小一致。Westem-blot结果显示，HPV16型pPlC9k-LI/E7融合蛋白得到成功表达并在64KD处出现特异的条带，与推导的蛋白条带大小一致，说明在毕赤酵母表达系统中成功的表达了pPlcgk-L1/E7蛋白。经Tanon4100分析仪检测化学光密度，重组疫苗中HPV16LI/E7蛋白表达量为50ng/ul。 

实施例6重组蛋白的Western-blot鉴定： 

a)通过Western-blot验证目标蛋白正确性。细胞裂解后上清经12％SDS-PAGE后直接进行考马斯亮蓝染色，并转移至NC膜，进行Western blot分析，分别以抗-HPV16L1和E7单抗(1∶3000)为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗(1∶5000)，Dons/TMB工作液显色后终止反应。 

b)重组蛋白结构电镜分析：将L1E7重组蛋白样品放在铜网/碳网上，用2%磷钨酸负染，在电子显微镜下观察到 

重组蛋白均能自动环化成一个50nm的环形颗粒结构，且形态和结构与天然HPVL1完全相同，即为病毒样颗粒。 

实施案例7重组蛋白的动物免疫实验 

（1）重组蛋白免疫小鼠血清抗体检测：重组蛋白与相同体积的佐剂充分混合，呈乳化液，对照组为佐剂和相同体积的PBS，小鼠左侧腹股沟皮下注免疫小鼠，二周后加强一针，再过二周取血清用酶联免疫法分别检测L1E7抗体水平。诱发产生滴度为1：？的L1\E7抗体。表达的重组蛋白能对小鼠能长时间产生体液免疫。 

(2)重组蛋白抗肿瘤移植实验 

a)肿瘤预防免疫实验 

重组蛋白+佐剂和佐剂+PBS接种小鼠，每组20只，注射小鼠腹股沟，每周注射一次，共8周，第8此免疫后对小鼠进行接种肿瘤细胞2×10⁶个。观察肿瘤生长情况三个月，免疫了重组蛋白疫苗的那组，肿瘤生长缓慢质量小，而佐剂对照组生长快、质量大。 

b)肿瘤治疗免疫实验 

小鼠注射2×10⁵细胞，观察肿瘤生长情况三个月，分2组，每组20只，每只小鼠背部皮下注射10ug重组蛋白+佐剂和佐剂+PBS，每周注射一次，共8周。 

可见小鼠免疫了重组蛋白疫苗的一组得到较明显的抑制肿瘤发展的效果，而注射PBS的一组没有抑瘤作用。 

Claims (10)

1.制备包含由在酵母中表达的人乳头瘤病毒16型病毒的重组蛋白L1E7的疫苗的方法，其包括设计引物克隆HPV16LI/E7基因及构建真核表达质粒；将构建成功的真核表达质粒转化酵母菌株，筛选稳定高效分泌表达菌株；发酵并诱导表达目的蛋白；纯化目的蛋白；将纯化的重组蛋白制成疫苗的步骤，其特征在于，在甲醇浓度为1.0％，pH为6.0条件下诱导酵母菌株表达重组蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于克隆HPV16LI/E7基因的引物为：

LI上游5’CC TACGTA CATCATCATCATCATCAT CAGGTGACTTTTATT3’；

LI下游5’CCC AAGCTT CAGCTIACGTTTTTTGCGTTTAGC3’；

E7上游5’CCCAAGCTT ATGCATGGAG ATACACCTAC3’

E7下游5’ATAAGAAT GCGGCCGC TTATGGTTTCTGAGAACAGATG3’。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于其中的真核表达质粒是pPIC9k-L1/E7。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于其中的酵母菌株是毕赤酵母菌株。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于酵母菌为毕赤酵母组氨酸缺陷型GS115菌株。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于真核表达质粒转化酵母菌株的方法是电转化。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在pH＝6.0、温度28～30℃振摇培养毕赤酵母组氨酸缺陷型GS115菌株48h，然后每隔24h添加终浓度为1％的甲醇诱导重组蛋白表达，96h后收样。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，收样后，对样品进行离心，用玻璃珠破碎细胞沉淀，然后14000r/min离心2min，收集上清，接着从上清液中纯化目的蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将纯化的重组蛋白制成疫苗包括向纯化的重组蛋白中加入终浓度约为1mg/ml的佐剂氢氧化铝，充分混合，于4℃保存。

10.权利要求9的方法制备得到的疫苗在制备用于预防和治疗由HPV16引起的感染和疾病的药物中的应用，其中所述的感染和疾病包括子宫颈癌、尖锐湿疣、乳腺癌、支气管肺癌、直肠癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮肤癌及其它与HPV密切相关的疾病。