CN102596229A

CN102596229A - 用于治疗自身免疫性病症的胰高血糖素样肽-1受体(glp-1r)激动剂

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Publication number: CN102596229A
Application number: CN2010800481995A
Authority: CN
Inventors: 周靖祖; 林家扬; H·龙
Original assignee: Rinat Neuroscience Corp
Current assignee: Rinat Neuroscience Corp
Priority date: 2009-08-27
Filing date: 2010-08-19
Publication date: 2012-07-18
Also published as: WO2011024110A2; BR112012004043A2; IN2012DN00961A; CA2769835A1; EP2470198A2; IL217967A0; WO2011024110A3; MX2012002463A; RU2012106200A; AU2010288191A1; US20120148586A1; JP2011057670A; KR20120050460A

Abstract

本发明提供胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)激动剂以用于减少诸如多发性硬化的自身免疫性疾病中的中枢神经系统的白细胞侵入。GLP-1R激动剂包括例如天然存在的激动剂(如毒蜥外泌肽-4)以及连接至抗体的GLP-1R激动剂肽。

Description

用于治疗自身免疫性病症的胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)激动剂

本申请要求于2009年8月27日提交的美国临时申请第61/237,654号的权益，其内容整体援引加入本文。

序列表的引用

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技术领域

本发明涉及包括多发性硬化在内的影响中枢神经系统的自身免疫性疾病的治疗。本发明提供用于减少中枢神经系统组织的白细胞侵入的胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)激动剂。

背景技术

多发性硬化(MS)是中枢神经系统(CNS)的脱髓鞘自身免疫性疾病，其特征在于炎症、脱髓鞘和轴突损伤。该疾病在全世界影响超过1×10⁶人，并且在女性中比男性中更普遍2倍。MS的症状通常在20-40岁之间出现。

MS的病因不清楚，虽然已研究该疾病的特征。这类特征包括损伤CNS组织，小胶质细胞的活化，促炎细胞因子产生，T细胞迁移和克隆型扩张的停滞，改变的巨噬细胞效应子功能，MHC的产生、上调，以及浸润T细胞的直接CNS攻击。

实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)被认为是MS的标准模型。小鼠疾病模型已用来研究MS的病因和评价其治疗药物(Aharoni，R.et al.，2005，J.Neurosci.25：8217-28)。EAE的临床特征包括通过大量浸润淋巴细胞和巨噬细胞的CNS的炎症和脱髓鞘。用髓鞘的几种不同蛋白组分(包括髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG))主动免疫小鼠诱导自身免疫性抗体的产生和上行性麻痹的临床症状。该疾病可以是急性或慢性的，取决于小鼠品系和用于免疫的髓鞘蛋白。EAE已用来研究MS的病因和评价其治疗药物(Aharoni，R.et al.)。

MS大部分由T细胞对髓鞘(包括神经组织中丰富的脂质和几种蛋白)的应答导致。脱髓鞘和临床麻痹由CNS组织被具有髓鞘抗原特异性的Th1和Th17表型的T细胞侵入所导致。Th1细胞产生炎性细胞因子，包括TNF-α和IFN-γ。IL-17表达在患有MS的患者以及患有类风湿性关节炎和肠激惹疾病的患者中增加。(Komiyama，Y.et al.，2006，J.Immunol.177，566-573；Matusevicius，D.et al.，1999，Mult.Scler.5，101-104.)这表明Th17细胞在自身免疫性疾病中的致病作用。CNS的损伤还可能由其他免疫应答引起，包括自身免疫性抗体的产生和补体活化。MS和EAE的早期和晚期涉及B-细胞，在所述疾病的整个过程中发现各种同种型的MBP-特异性和MOG-特异性抗体。制备自脑和脊髓组织的切片表现出白细胞侵入(特别是淋巴细胞和巨噬细胞)和神经系统的下层组织的破坏)。

胰高血糖素样肽(7-36)酰胺(GLP-1)在大鼠和人中均为胰高血糖素(glucoincretin)(Dupre and Ebert and Creutzfeld，1987，Diabetes Metab.Rev.3；Mojsov et al.，1986，J.Biol.Chem.261：11880)。除了增加胰岛素分泌和减少胰高血糖素分泌，30-氨基酸GLP-1肽刺激胰岛素原基因转录，减慢胃排空时间，并且减少食物摄入。GLP-1通过结合至胰高血糖素样肽1受体(GLP-1R)来发挥其生理效应。GLP-1R属于B类受体G蛋白偶联受体(GPCR)超家族亚类，其调控许多重要的生理和病理生理过程。GLP-1R是偶联至G-蛋白活化、增加的cAMP生成以及PKA的活化的七跨膜受体。还有通过GLP-1R启动的PKA独立的应答。对GLP-1的作用的其他应答包括例如胰β-细胞增殖和扩张，伴随着β-细胞凋亡的减少。此外，GLP-1活性可以导致胰细胞中葡萄糖转运蛋白-2(GLUT2)和葡糖激酶基因的表达增加。

GLP-1还是孤束核(NTS)的尾区中由神经元合成的神经肽(Jin，S.L.etal.，1988，J Comp Neurol.271：519-532)。GLP-1-免疫反应性纤维和GLP-1R看来在整个脑中广泛表达(Jin，S.L.et al.，1988；Larsen，P.J.et al.，1997，Neuroscience 77：257-270；Merchenthaler，I.et al.，1999，J Comp Neurol403：261-280)。GLP-1R缺陷小鼠在给予红藻氨酸盐之后具有提高的发作严重程度和神经元损伤，Glp1r基因转移入海马体细胞后具有表型校正(During，M.J.et al.，2003，Nat Med.9(9)：1173-9)。

发明概述

在一方面，本发明提供一种减少中枢神经系统组织的白细胞侵入的方法，所述方法包括向需要这样的治疗的哺乳动物给予包含对于活化GLP-1R有效的量的GLP-1R激动剂的组合物，从而减少中枢神经系统组织的白细胞侵入。本发明进一步提供GLP-1R激动剂在制备用于减少哺乳动物的中枢神经系统组织的白细胞侵入的药物中的用途。本发明进一步提供GLP-1R激动剂在制备用于减少哺乳动物中的Th1和Th17细胞数量的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述哺乳动物患有自身免疫性病症。在一实施方案中，所述自身免疫性病症为实验性自身免疫性脑脊髓炎。在另一实施方案中，所述自身免疫性病症为多发性硬化。在其他实施方案中，所述自身免疫性病症与免疫排斥反应、移植物抗宿主疾病、葡萄膜炎、视神经病、视神经炎、横贯性脊髓炎、炎性肠病、类风湿性关节炎、关节强硬性脊椎炎、系统性红斑性狼疮、重症肌无力或突眼性甲状腺肿有关。在优选实施方案中，所述哺乳动物为人。

在一些实施方案中，给予包含GLP-1R激动剂的组合物减少哺乳动物淋巴结中Th1和/或Th17细胞的数量。在一些实施方案中，给予包含GLP-1R激动剂的组合物减少哺乳动物淋巴结中的Ter119+类红细胞。

在优选实施方案中，侵入白细胞包括T细胞和巨噬细胞。在特定实施方案中，侵入白细胞包括CD3表达和CD68表达白细胞。在优选实施方案中，所述中枢神经系统组织为脑组织或脊髓组织。

在一些实施方案中，所述GLP-1R激动剂为OAP-189。在其他实施方案中，所述GLP-1R激动剂为DPP-4抑制剂。在其他实施方案中，所述GLP-1R激动剂为抗GLP-1R激动剂抗体。

在一些实施方案中，所述GLP-1R激动剂是天然存在的GLP-1R激动剂。在一些实施方案中，所述天然存在的GLP-1R激动剂为毒蜥外泌肽-4(exendin-4)。在相关实施方案中，所述天然存在的GLP-1R激动剂包含毒蜥外泌肽-4的片段或衍生物。在一些实施方案中，所述毒蜥外泌肽-4的片段或衍生物结合并活化GLP-1R。

在一些实施方案中，所述GLP-1R激动剂包含GLP-1R激动剂抗体缀合物(“GAC”)，其包含GLP-1R激动剂肽和抗体。在相关实施方案中，所述GAC可以具有以下结构：

其中所述肽具有式：R¹-[H¹ X² E³ G⁴ T⁵ F⁶ T⁷ S⁸ D⁹ X¹⁰ S¹¹ X¹² X¹³ X¹⁴ E¹⁵ X¹⁶X¹⁷ A¹⁸ X¹⁹ X²⁰ X²¹ F²² X²³ X²⁴ X²⁵ X²⁶ X²⁷ X²⁸ X²⁹ X³⁰ X³¹ X³² X³³ X³⁴ X³⁵ X³⁶X³⁷ X³⁸ X³⁹ X⁴⁰(SEQ ID NO：3)]-R²，其中R¹为不存在、CH₃、C(O)CH₃、C(O)CH₂CH₃、C(O)CH₂CH₂CH₃或C(O)CH(CH₃)CH₃；R²为OH、NH₂、NH(CH₃)、NHCH₂CH₃、NHCH₂CH₂CH₃、NHCH(CH₃)CH₃、NHCH₂CH₂CH₂CH₃、NHCH(CH₃)CH₂CH₃、NHC₆H₅、NHCH₂CH₂OCH₃、NHOCH₃、NHOCH₂CH₃、羧基保护基团、脂质脂肪酸基团或糖(carbohydrate)，并且X²为封闭基团，例如Aib、A、S、T、V、L、I、D-Ala；X¹⁰为V、L、I或A；X¹²为S或K；X¹³为Q或Y；X¹⁴为G、C、F、Y、W、M或L；X¹⁶为K、D、E或G；X¹⁷为E或Q；X¹⁹为L、I、V或A；X²⁰为鸟氨酸或诸如K(SH)的衍生化赖氨酸基团、R或K；X²¹为L或E；X²³为I或L；X²⁴为A或E；X²⁵为W或F；X²⁶为L或I；X²⁷为I、K或V；X²⁸为R、鸟氨酸、N或K；X²⁹为Aib或G；X³⁰为任何氨基酸，优选G或R；X³¹为P或不存在；X³²为S或不存在；X³³为S或不存在；X³⁴为G或不存在；X³⁵为A或不存在；X³⁶为P或不存在；X³⁷为P或不存在；X³⁸为P或不存在；X³⁹为S或不存在；并且X⁴⁰为连接残基或不存在；并且其中X¹⁰、S¹¹、X¹²、X¹³、X¹⁴、X¹⁶、X¹⁷、X¹⁹、X²⁰、X²¹、X²⁴、X²⁶、X²⁷、X²⁸、X³²、X³³、X³⁴、X³⁵、X³⁶、X³⁷、X³⁸、X³⁹或X⁴⁰中的一个由连接残基取代，所述连接残基包含通过接头共价连接至所述抗体的结合位点的亲核侧链，其中所述连接残基选自K、R、Y、C、T、S、赖氨酸的同系物(包括K(SH))、高半胱氨酸和高丝氨酸。

在一些实施方案中，所述GAC可以包含以下结构：

在一些实施方案中，所述GAC可以包含以下结构：

在一些实施方案中，所述抗体选自全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dsFv、scFv、V_H、双抗体和微抗体(minibody)。在一些实施方案中，所述抗体包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定结构域。在一些实施方案中，所述抗体为催化抗体。在一些实施方案中，所述抗体为醛缩酶抗体。在一些实施方案中，所述醛缩酶抗体包含轻链和重链，所述轻链包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，所述重链包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。

在其他实施方案中，本发明提供一种用于减少中枢神经系统组织的白细胞侵入的试剂盒，其包含对于活化GLP-1R有效的量的GLP-1R激动剂和使用说明。在相关实施方案中，本发明提供一种用于治疗影响中枢神经系统的自身免疫性病症的试剂盒，其包含对于活化GLP-1R有效的量的GLP-1R激动剂和使用说明。

从下文的描述和实例，本发明的这些和其他方面会变得清楚。

附图说明

图1示出显示MOG免疫之后EAE动物中浸润细胞体、T细胞、单核细胞和小胶质细胞的组织化学。将来自EAE动物(上图)和健康动物(下图)的脊髓切片用甲酚紫染色以染色浸润细胞体(左)，用抗CD3抗体染色已检测浸润T细胞(中)，或者用抗CD68抗体染色以检测单核细胞和小胶质细胞(右)。

图2示出显示MOG免疫之后用1mg/kg GLP-1R激动剂处理的动物中EAE的临床严重程度的图。MOG免疫后第0天至第9天，动物每天接受1mg/kg毒蜥外泌肽-4(EXE4)、2mg/kg神经营养蛋白-4(NT4)或PBS(对照)。根据以下评分系统每天评价小鼠的EAE临床表现：0＝正常；1＝跛行尾(limptail)；2＝中度后肢无力；3＝中重度后肢无力(动物仍然可以艰难行走)；4＝严重后肢无力(动物可以移动其后肢但不可以行走)；5＝完全后肢瘫痪；以及6＝死亡。

图3示出显示MOG免疫之后用1mg/kg GLP-1R激动剂处理的EAE动物中的发病率的图。MOG免疫后第0天至第6天，将动物每天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4(EXE4)或PBS处理，或者每周用GLP-1R激动剂GAC-1(1mg/kg)处理。每天监测临床评分，并且如上文所述进行评价。

图4示出显示MOG免疫之后用变化剂量的GLP-1R激动剂(毒蜥外泌肽-4或GAC-1)处理的EAE动物中的发病率的图。将毒蜥外泌肽-4(EXE4)处理的动物在MOG免疫后第0天至第2天每天用3mg/kg毒蜥外泌肽-4处理，并且在第3天至第8天每天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4处理。将GAC-1处理的动物在第0天用3mg/kg GAC-1处理，然后从免疫后第7天开始每周用1mg/kg GAC-1处理。将对照动物用对照PBS处理。每天监测临床评分。如上文所述评价EAE的临床表现。

图5A-C示出来自(A)PBS对照处理和(B)毒蜥外泌肽-4处理和(C)GAC-1处理的EAE动物的脊髓切片的组织化学染色的结果。将所述切片用罗克沙尔固蓝(Luxol Fast Blue)染色髓鞘。黑色箭头指示白质中的脱髓鞘，其显示减少的罗克沙尔固蓝染色。

图6A-F示出来自PBS对照(A，D)和毒蜥外泌肽-4处理(B，E)和GAC-1处理(C，F)的EAE动物的脊髓切片的免疫组织化学染色的结果。将所述切片用CD3(A-C)或CD68(D-F)特异性抗体染色。切片显示的是脊髓横截面的前角。

图7示出显示来自用MHC II类特异性抗体染色的脑和脊髓的CD11b+CD45^hi细胞(活化的小胶质细胞和浸润巨噬细胞)和CD11b+CD45^lo细胞(静息小胶质细胞)群体的流式细胞术分析的数据的图。在每个图中，来自毒蜥外泌肽-4(EXE4)处理的EAE动物的细胞的MHC II类表达通过没有填充的黑线(□)指示，而来自对照处理的EAE动物的细胞的MHC II类表达通过虚线指示。上图：从发病的动物采集的细胞。下图：从疾病高峰期的动物采集的细胞。

图8示出显示EAE的过继转移模型中脾细胞的致病性的图。左图：PLPp(139-151)免疫后第0天至第4天动物每天接受1mg/kg毒蜥外泌肽-4(EXE4)或PBS(对照)。免疫后第5天将动物处死。右图：将来自毒蜥外泌肽-4处理的供体(三角形)和PBS处理的供体(正方形)的脾细胞转移至幼稚

SJL/J动物。每天监测受体小鼠的临床评分和体重变化。如上文所述评价EAE的临床表现。

图9A-C示出用GLP-1R激动剂处理后的淋巴结重量以及脾重量和大小。MOG免疫后第0天至第5天，将动物每天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4(EAE-EXE4)、PBS(EAE-媒介物)或4mg/kg地塞米松对照(EAE-Dex)处理。幼稚动物不用MOG免疫。(A)腹股沟淋巴结重量。(B)脾重量。(C)来自幼稚动物、用媒介物处理的EAE动物以及用毒蜥外泌肽-4处理的EAE动物的脾。

图10A-F示出显示MOG免疫之后用GLP-1R激动剂处理后EAE动物中的免疫变化的图。MOG免疫后第0天至第6天，将动物每天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4(EXE4)或PBS处理。免疫后第6天将动物与未免疫(幼稚)的小鼠一起处死。从脾(A、D)、淋巴结(B、E)和外周血(C、F)测量淋巴细胞(A-C)和单核细胞(D-F)。y-轴显示为淋巴细胞(A-C)或单核细胞(D-F)的细胞的百分比。

图11A-F示出显示MOG免疫之后用GLP-1R激动剂处理后EAE动物中的免疫变化的图。MOG免疫后第0天至第6天，将动物每天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4(EXE4)或PBS处理。免疫后第6天将动物与未免疫(幼稚)的小鼠一起处死。从脾(A、D)、淋巴结(B、E)和外周血(C、F)测量CD4+细胞(A-C)和CD8+细胞(D-F)。y-轴上显示所示标记阳性染色的细胞的百分比。

图12A-F示出显示MOG免疫之后用GLP-1R激动剂处理后EAE动物中的免疫变化的图。MOG免疫后第0天至第6天，将动物每天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4(EXE4)或PBS处理。免疫后第6天将动物与未免疫(幼稚)的小鼠一起处死。从脾(A、D)、淋巴结(B、E)和外周血(C、F)测量CD19+细胞(A-C)和Ter119+细胞(D-F)。y-轴上显示所示标记阳性染色的细胞的百分比。

图13示出显示MOG免疫之后用GLP-1R激动剂处理后EAE动物中的Ter119+细胞群体变化的图。在第0天至第5天将动物每天用PBS(EAE-PBS)、1mg/kg毒蜥外泌肽-4(EAE-EXE4)或4mg/kg地塞米松(EAE-dex)处理。免疫后第5天将动物与未免疫(幼稚)的小鼠一起处死。将脾细胞表面染色类红细胞系标记Ter119。y-轴上显示Ter119阳性染色的细胞的百分比。

图14示出显示MOG免疫之后用GLP-1R激动剂处理后EAE动物中活化的T细胞群体变化的图。在第0天至第5天将动物每天用PBS(EAE-PBS)、1mg/kg毒蜥外泌肽-4(EAE-EXE4)或4mg/kg地塞米松(EAE-dex)处理。免疫后第5天将动物与未免疫(幼稚)的小鼠一起处死。来自淋巴结的活化的T细胞鉴定为具有高水平的CD44(CD44^hi)的CD4+细胞。y-轴显示各个处理组和幼稚组中具有高水平的CD44的CD4+细胞的百分比。

图15示出显示MOG免疫之后用GLP-1R激动剂处理后EAE动物中的增殖细胞群体变化的图。在第0天至第5天将动物每天用PBS(EAE-PBS)、1mg/kg毒蜥外泌肽-4(EAE-EXE4)或4mg/kg地塞米松(EAE-dex)处理。免疫后第5天将动物与未免疫(幼稚)的小鼠一起处死。将淋巴结细胞与MOG刺激培养，并且用BrdU处理以测量细胞增殖。y-轴显示各个处理组和幼稚组中BrdU阳性的CD4+细胞的百分比。

图16示出显示MOG免疫之后用GLP-1R激动剂处理后EAE动物中的IL-17+细胞群体变化的图。将动物每天用PBS(EAE-PBS)、1mg/kg毒蜥外泌肽-4(EAE-EXE4)或4mg/kg地塞米松(EAE-dex)处理。免疫后第5天(左图)或第7天(右图)将动物与未免疫(幼稚)的小鼠一起处死。将腹股沟淋巴结细胞染色CD4、IL-17和IFN-γ。y-轴上显示IL-17阳性染色的CD4+细胞的百分比。

图17示出显示MOG免疫之后用GLP-1R激动剂处理后EAE动物中的干扰素-γ(IFN-γ)+细胞群体变化的图。在第0天至第5天将动物每天用PBS(EAE-PBS)、1mg/kg毒蜥外泌肽-4(EAE-EXE4)或4mg/kg地塞米松(EAE-dex)处理。免疫后第5天将动物与未免疫(幼稚)的小鼠一起处死。将腹股沟淋巴结细胞染色CD4、IL-17和IFN-γ。y-轴上显示IFN-γ阳性染色的CD4+细胞的百分比。

图18示出显示MOG免疫之后用GLP-1R激动剂(毒蜥外泌肽-4)或DPP-4抑制剂(西格列汀)处理的EAE动物中的发病率的图。将MOG免疫的动物用1mg/kg西格列汀、10mg/kg西格列汀、毒蜥外泌肽-4或甲基纤维素剂量给药。每天监测临床评分。如上文所述评价EAE的临床表现。

图19示出显示用GLP-1R激动剂(毒蜥外泌肽-4)或媒介物处理的EAE动物中的发病率的图。从免疫后第29天开始，将PLP免疫的SJL/J小鼠每天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4或媒介物剂量给药。每天监测临床评分。如下评价EAE的临床表现：0，无瘫痪；1，损失尾音(tail tone)；2，后肢无力；3，后肢瘫痪；4，后肢和前肢瘫痪；5，濒死或死亡。

图20示出显示用毒蜥外泌肽-4或PBS处理的切断迷走神经和未切断迷走神经的EAE动物中的发病率的图。根据以下评分系统每天评价小鼠的EAE临床表现：0＝正常；1＝跛行尾；2＝中度后肢无力；3＝中重度后肢无力(动物仍然可以艰难行走)；4＝严重后肢无力(动物可以移动其后肢但不可以行走)；5＝完全后肢瘫痪；以及6＝死亡。

发明详述

本发明涉及使用GLP-1R激动剂治疗多发性硬化和其他自身免疫性病症的方法。

通用技术

本发明采用用于分子生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学领域的常规技术。这类技术在参考文献中描述，例如，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，second edition(Sambrook，et al.，1989)Cold SpringHarbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Methods inMolecular Biology，Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis，ed.，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths，and D.G.Newell，eds.，1993-8)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Handbook of ExperimentalImmunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.)；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos，eds.，1987)；Current Protocolsin Molecular Biology(F.M.Ausubel，et al.，eds.，1987)；PCR：The PolymeraseChain Reaction，(Mullis，et al.，eds.，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E Coligan et al.，eds.，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wileyand Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.，ed.，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd and C.Dean，eds.，Oxford University Press，2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra，eds.，HarwoodAcademic Publishers，1995).

定义

以下缩写、术语和短语如下文所定义在本文中使用。除非另有定义，连同本文所述发明使用的科学和技术术语应当具有本领域技术人员通常理解的意思。而且，除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。

除非通过“D”前缀另外说明，例如D-Ala或N-Me-D-Ile，本文所述肽中的氨基酸的α-碳和氨酰基残基的立体化学为天然或“L”构型。Cahn-Ingold-Prelog“R”和“S”命名用来详细说明在所述肽的N端的某些酰基取代基中的手性中心的立体化学。命名“R，S”表示两种对映体形式的外消旋混合物。这种命名法按照R.S.Cahn，et al.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，5：385-415(1966)所述的命名法。

D-H指D组氨酸。

如本文所用，2-氨基异丁酸具有以下结构：

“多肽”、“肽”和“蛋白”可交换使用，指氨基酸残基的聚合物。如本文所用，这些术语可以应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。这些术语还可以应用于天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸可以是L或D形式，只要维持所述肽的结合功能。肽可以是环状的，在所述肽内的两个不相邻的氨基酸之间具有分子内键，例如，骨架至骨架、侧链至骨架以及侧链至侧链环化。环肽可以通过本领域公知的方法制备。参见，例如，美国专利第6,013,625号；S.Cheng et al.，J Med.Chem.37：1-8(1994)。

所有肽序列均根据普遍接受的惯例来写，其中α-N端氨基酸残基在左边，而α-C端氨基酸残基在右边。如本文所用，术语“N端”指肽中氨基酸的游离α-氨基，而术语“C端”指肽中氨基酸的游离羧酸末端。用基团N-终止的肽指在N端氨基酸残基的α-氨基氮上包含基团的肽。用基团N-终止的氨基酸指在α-氨基氮上包含基团的氨基酸。

“抗体”是免疫球蛋白分子，其能够通过位于所述免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合靶标，例如糖类、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所用，该术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，而且还涵盖它们的片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv)、单链(ScFv)和结构域抗体(包括，例如，鲨鱼和骆驼抗体)、及包含抗体部分的融合蛋白、以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。抗体包括任何类别的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或它们的亚型)，并且所述抗体不必是任何特殊类别。根据抗体重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别。有五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、gE、IgG和IgM，它们中的一些可进一步分为若干亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。

如本文所用，“侵入白细胞”是作为自身免疫性疾病的结果，优选作为影响CNS的自身免疫性疾病的结果，侵入、浸润或迁移至包括脑和脊髓组织在内的中枢神经系统(CNS)组织的白细胞。侵入白细胞主要是T细胞和单核细胞，虽然其他白细胞可以存在。

如本文所用，“减少白细胞侵入”指减少白细胞迁移(即，侵入或浸润)入CNS组织，包括脑和脊髓组织。减少白细胞侵入还指减少白细胞侵入介导的细胞毒性影响，特别是关于CNS组织的下层神经元细胞和/或其他支持细胞。白细胞侵入包括T细胞和单核细胞侵入。减少白细胞侵入包括保护CNS组织免受自身免疫攻击。白细胞侵入破坏的CNS的细胞包括髓鞘表达细胞和邻近的非髓鞘表达细胞。细胞破坏可以通过凋亡、坏死或它们的组合。减少的白细胞侵入的特征在于如减缓的疾病发展，延迟的发病或发病率严重程度，延长的存活，改善的生活质量，减少或稳定的认知、运动或行为症状这样的临床指征。减少白细胞侵入还包括预防或减少白细胞迁移入中枢神经系统(CNS)组织的风险。白细胞侵入的减少可以是部分或完全的，例如，如本文所述，在比较或实际减少中，所述减少可以是约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、或者甚至约95％。

如本文所用，术语“GLP-1R”指保留GLP-1R的至少部分活性的任何形式的GLP-1R及其变体。除非表明不同，例如具体指明人GLP-1R，GLP-1R包括所有哺乳动物物种的天然序列GLP-1R，例如，人、犬、猫、马和牛。

如本文所用，“GLP-1受体激动剂”或“GLP-1R激动剂”是增加GLP-1R的活化量、产生的效应与天然存在的激动剂GLP-1和毒蜥外泌肽-4所产生的效应相似的分子。GLP-1R激动剂增加GLP-1R的活化，例如，通过结合并活化GLP-1R，通过引起GLP-1R中的构象变化，通过引起偶联至GLP-1R的G蛋白的活化，通过引起GLP-1R保持活化(例如，在活性构象中)条件更长时间(包括无限期地)，通过模拟天然存在的激动剂的结合，通过调节天然存在的激动剂的结合，通过阻断GLP-1的抑制剂或者其他方式调节GLP-1R活化或者启动GLP-1R活化特征的细胞内事件的级联。GLP-1R激动剂的优选特性如本文所述。本发明的GLP-1R激动剂可以增加GLP-1R的活化至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少100％、至少200％或更多。

如本文所用，“天然存在的GLP-1R激动剂”是在自然界中存在并且作为GLP-1R的活化剂发挥功能的分子。已知的天然存在的GLP-1R激动剂为肽激素GLP-1和毒蜥外泌肽-4。天然存在的GLP-1R激动剂包括天然存在的变体分子，例如在具有突变的GLP-1R等位基因的动物中表达的多肽。

当与本发明的GLP-1R激动剂联用时，“生物学活性”一般指具有结合并活化GLP-1R和/或GLP-1R信号功能所介导的下游通路的能力。如本文所用，“生物学活性”涵盖与GLP-1R的天然配体GLP-1对GLP-1R表达细胞的作用所诱导的相同的一种或多种效应子功能。没有限制，生物学活性包括以下活性中的任何一种或多种：结合并活化GLP-1R的能力；结合并活化GLP-1R，引起GLP-1R中的构象变化的能力，引起偶联至GLP-1R的G蛋白活化的能力，引起GLP-1R保持活化(例如，在活性构象中)条件更长时间(包括无限期地)的能力，增加细胞内cAMP的能力，刺激胰岛素释放的能力，以及启动GLP-1R活化特征的细胞内事件的级联的能力。

如本文所用，“完全激动剂”是在有效浓度下基本上完全诱导GLP-1R的可测量的效应的激动剂。例如，GLP-1R的可测量的效应可以是提高的cAMP水平。部分激动剂表示能够部分诱导可测量的效应的激动剂，但是即使在最高浓度下也不是完全激动剂。基本上完全表示诱导可测量的效应的至少约80％，优选至少约90％，更优选至少约95％，并且最优选至少约98％。相关的“可测量的效应”如本文所述。

如本文所用，“片段”多肽是保留较大多肽的至少一些生物学特性(例如活化GLP-1R的能力)的较大多肽的部分。优选的片段包含导致较大多肽的生物学特性的较大多肽的氨基酸残基和/或结构。多肽片段可以称为肽，虽然在本文中多肽和肽之间没有区别。示例性片段如本文所述。如本文所述，片段可以是衍生化的。

如本文所用，“衍生”多肽具有一个或多个共价或非共价修饰，例如添加或去除官能团或部分。衍生物的实例如本文所提供。

如本文所用，特定多肽序列的“变体”定义为利用诸如Clustal V或BLAST的算法(例如，设置在缺省参数的“BLAST 2 Sequences”工具2.0.9版(May 7，1999))在多肽序列中的一个的一定长度与特定多肽序列具有至少40％序列相同性的多肽序列。例如，这样的多肽对可以在多肽中一个的一定限定的长度中表现出至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或者更大的序列相同性。

如本文所用，当应用于多肽序列时，“序列相同性”指利用诸如ClustalV、MEGALIGN或BLAST的标准化算法比对的至少两个多肽序列之间残基匹配的百分比。多肽序列比对的方法是公知的。一些比对方法考虑保守氨基酸取代。这类保守取代如本文所述，并且一般在取代的位点保持电荷和疏水性，因此保持多肽的结构(并因此保持功能)。

术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可交换使用，指任何长度的氨基酸链，优选相对短的(例如，10-100个氨基酸)。所述链可以是线性或支化的，其可以包含修饰的氨基酸，和/或可以被非氨基酸打断。该术语还涵盖天然或通过干预修饰的氨基酸链；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或者任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合。该定义还包括例如包含氨基酸的一个或多个类似物(包括，例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应当理解多肽可以作为单链或相关链存在。

如本领域已知，在本文中可交换使用的“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或者能够通过DNA或RNA聚合酶掺入链的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和它们的类似物。如果存在修饰，那么对核苷酸结构的修饰可以在链组装之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。可以在聚合后进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分缀合。其他类型的修饰包括，例如，“加帽”；用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如具有不带电荷的键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)；含有悬垂(pendant)部分，例如，蛋白(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)；具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)；含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)；含有烷化剂；具有修饰的键(例如，α异头核酸等)；以及未修饰形式的多核苷酸。此外，可以置换糖中正常存在的任何羟基，例如，通过膦酸酯基团、磷酸酯基团、通过标准保护基团保护或活化以便为额外的核苷酸准备额外的键，或者可以缀合至固相支持物。5’端和3’端OH可以被磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团部分取代。还可以将其他羟基衍生化为标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域熟知的类似形式的核糖或脱氧核糖，包括，例如，2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟-或2’-叠氮-核糖，碳环糖类似物(carbocyclic sugar analog)，α-或β-异头糖，差向异构糖例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物和脱碱基核苷类似物如甲基核糖核苷。可以用可选连接基团置换一个或多个磷酸二酯键。这些可选连接基团包括但不限于这样的实施方案，其中将磷酸酯置换为P(O)S(“硫代”)、P(S)S(“二硫代”)、(O)NR₂(“酰胺”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH₂(“甲缩醛(formacetal)”)，其中每个R或R’独立地是H或者取代或非取代的烃基(1-20C)，且任选地含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。多核苷酸中的所有键不必相同。以上描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

如本文所用，“基本上纯的”指材料是至少50％纯的(即，不含污染物)，更优选至少90％纯的，更优选至少95％纯的，更优选至少98％纯的，并且最优选至少99％纯的。

“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或者已经是用于掺入多核苷酸插入物的载体的受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，由于天然、偶然或人为的突变，所述子代可以不必与原始的亲代细胞(在形态学上或在基因组DNA互补上)完全相同。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸体内转染的细胞。

如本文所用，“治疗”是获得有益的或期望的临床结果的方法。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于以下情况中的一种或多种：提高移动性、减少四肢无力、减少CNS的白细胞侵入、以及减少包括MS在内的自身免疫性疾病所导致的脱髓鞘。

“降低发病率”表示任何降低严重程度(这可以包括降低一般用于这种疾病状况的(例如，暴露于)其他药物和/或治疗的需求和/或量)。本领域技术人员应当理解，个体对治疗的反应可以不同，因此，例如，“降低发病率的方法”反映的是基于向该特定个体给予GLP-1R激动剂很可能会引起发病率降低这一合理预期而给予GLP-1R激动剂。

“改善”表示与未给予GLP-1R激动剂相比，一种或多种症状的减轻或改进。“改善”还包括缩短或减少症状的持续时间。

如本文所用，“对于活化GLP-1R有效的量”或者关于GLP-1R激动剂的相似表述指与给予GLP-1R激动剂之前活化的基线水平相比，足以增加GLP-1R活化(如本文所定义和本领域已知)的量。活化的增加可以是至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少100％、至少200％或更多。这个量会考虑给药途径、GLP-1R激动剂在体内的半衰期、溶解性、生物利用度、清除速率、以及GLP-1R激动剂的其他药物动力学特征、动物或患者的体重和代谢等。

如本文所用，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以实现任何一种或多种有益的或期望的结果的量。对于预防性用途，有益的或期望的结果包括消除或降低疾病的风险、减轻疾病的严重程度、或者延迟疾病的发作，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症以及疾病发展中存在的中间病理学表型。对于治疗性用途，有益的或期望的结果包括临床结果，例如减少CMT疾病的一种或多种症状、减少治疗该疾病所需的其他药物的剂量、增强另一药物的效果、和/或延缓患者疾病的发展。有效剂量可以通过一次或多次给药来给予。为了本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接实现预防性或治疗性处理的量。如临床的上下文中所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可以与或不与另一药物、化合物或药物组合物联用而实现。因此，可以根据给予一种或多种治疗剂来考虑“有效剂量”，并且如果与一种或多种其他药物联用，可以考虑以有效量给予单一药物是否可以实现期望的结果。

如本文所用，“需要治疗的动物”或相似表述表示患有或有风险发展包括CNS在内的自身免疫性疾病的动物，优选哺乳动物，包括人。影响CNS的自身免疫性疾病(或病症，没有区别)的实例为小鼠中的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、人中的多发性硬化(MS)以及在其他哺乳动物中发现的相似的自身免疫性疾病。CNS的自身免疫攻击还在例如免疫排斥反应、视神经病、炎性肠病和帕金森病中观察到。

“个体”或“受试者”是哺乳动物，更优选是人。哺乳动物还包括但不限于牲畜、竞赛动物、宠物、灵长类、马、犬、猫、小鼠和大鼠。

如本文所用，“载体(vector)”表示构建体，其能够将一种或多种所关注的基因或序列转运入宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相关的DNA或RNA表达载体、封装于脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。

如本文所用，“表达控制序列”表示指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，例如组成型或诱导型启动子，或者增强子。表达控制序列可操纵地连接至待转录的核酸序列。

如本文所用，“药学可接受的载体(carrier)”或“药学可接受的赋形剂″包括任何这样的材料，当与活性成分组合时，其允许所述成分保持生物学活性，并且不与受试者的免疫系统反应。实例包括但不限于任何标准药学载体，例如磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂(如油/水乳剂)以及各种类型的湿润剂。用于气溶胶或肠胃外给药的优选稀释剂为磷酸缓冲盐水(PBS)或生理盐水(0.9％)。通过公知的常规方法配制包含这类载体的组合物(参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th edition，A.Gennaro，ed.，MackPublishing Co.，Easton，PA，1990；和Remington，The Science and Practice ofPharmacy 20th Ed.Mack Publishing，2000)。

如本文所用，“外周给药”或“外周给予”指在中枢神经系统(CNS)或血脑屏障(BBB)之外将物质引入受试者。外周给药涵盖除直接给予脊柱或脑之外的任何给药途径。外周给药可以是局部或全身性的。

用于治疗影响中枢神经系统(CNS)的自身免疫性病症的GLP-1R激动剂

本发明提供使用GLP-1R激动剂治疗影响中枢神经系统(CNS)的多发性硬化和其他自身免疫性病症的方法。根据本发明的一个特征，GLP-1R激动剂有效减少白细胞侵入CNS组织并减少CNS的下层神经元组织的破坏，并且因此改善这种疾病的临床表现，例如肢体瘫痪。特别地，GLP-1R激动剂减少单核细胞和T细胞的迁移，所述单核细胞和T细胞在呈递髓鞘抗原以及向产生它们的细胞给予细胞毒性效应中是有活性的。

导致本发明的观察是利用广泛接受的MS动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠进行的。EAE是实验性疾病状态，其与人中的MS共享许多临床和病理特征。许多FDA批准的MS治疗最初是基于小鼠和大鼠中的EAE模型发现和开发的(Steinman and Zamvil，2006综述)。用髓鞘的几种不同蛋白组分(包括髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG))主动免疫EAE小鼠诱导自身免疫性抗体的产生和上行性麻痹的临床症状。例如，可以在用MOG肽氨基酸35-55(Aharoni，R.，etal.)或PLP肽氨基酸139-151(PLPp(139-151))免疫之后的C57BL/6小鼠中诱导EAE。用MOG或PLP免疫诱导髓鞘特异性自身免疫反应，这引起与MS相似的脱髓鞘和发病率。EAE的临床特征包括通过大量浸润淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞的CNS的炎症和脱髓鞘(图1)。

利用GLP-1R激动剂的动物实验

在所进行的支持本发明的实验中，据证实直接给予GLP-1R激动剂减少患有CNS特异性自身免疫性疾病的动物中的发病率和CNS组织损伤(图2-4)。将毒蜥外泌肽-4(EXE4)给予MOG免疫之后的EAE动物。用毒蜥外泌肽-4处理的动物表现出与对照动物相比显著降低的发病率。这个结果证实给予GLP-1R激动剂有效减缓慢性EAE的发展。实验显示关于症状的发生，毒蜥外泌肽-4所提供的保护至少与trkB激动剂NT-4所提供的保护(参见，PCT申请第WO 2008/078179号)一样好(即使不是更好)，并且用毒蜥外泌肽-4处理不必在症状发生的时间持续以便有效治疗(图2)。

动物实验显示每周给予GLP-1R激动剂化合物GAC-1提供与对照相比显著的针对EAE发病率的保护(图3和4)。当在每周的基础上给药时，GAC-1是有效的。实验显示每周用GAC-1处理保护至少与每天毒蜥外泌肽-4处理直至症状发生的时间一样好。

组织学分析显示与来自对照EAE动物的切片相比，制备自用GLP-1R激动剂处理的动物的切片中脱髓鞘和白细胞侵入减少(图5A-C和6A-F)。GLP-1R激动剂处理的动物实际上未显示CNS CD3+细胞侵入的证据。侵入细胞的鉴定是通过染色CD3表达T细胞和CD68表达巨噬细胞来进行的。当与对照动物相比时，来自GLP-1R激动剂处理的动物的脊髓组织表现出明显减少的T细胞和单核细胞侵入(图6A-F)。CNS组织切片的组织化学染色的结果证实GLP-1R激动剂处理减少CNS的淋巴细胞和单核细胞侵入。

EAE小鼠的小胶质细胞上活化标记MHC II类表达的分析显示用毒蜥外泌肽-4处理降低脑和脊髓中CD11b+CD45^hi(活化的小胶质细胞和浸润巨噬细胞)和CD11b+CD45^lo(静息小胶质细胞)细胞群体上MHC II类的表达水平。来自接受毒蜥外泌肽-4的EAE小鼠的静息小胶质细胞、活化的小胶质细胞和浸润巨噬细胞在症状发生和疾病高峰期均表现出与来自媒介物处理的对照动物的细胞相比减少的MHC II类表达。

动物实验显示来自毒蜥外泌肽-4处理的小鼠的脾细胞在EAE的过继转移模型中致病性较低(图8)。接受分离自毒蜥外泌肽-4处理的PLP诱导小鼠的脾细胞的小鼠发展的疾病与接受分离自对照(PBS处理)PLP诱导小鼠的脾细胞的小鼠相比严重程度明显更低。

GLP-1R激动剂处理的EAE小鼠的腹股沟淋巴结轻于媒介物处理的对照EAE动物的淋巴结(图9A)。对照处理的EAE动物的淋巴结明显较重。GLP-1R激动剂处理的EAE小鼠的脾与幼稚动物的脾在重量和大小相当，相比之下媒介物处理的对照EAE动物的脾明显较重和较大(图9B-C)。

进行动物实验以分析GLP-1R激动剂处理EAE动物所导致的免疫变化(图10A-F、11A-F和12A-F)。GLP-1R激动剂处理导致MOG诱导动物中Ter119+细胞数量大量减少至接近幼稚动物的Ter119+细胞数量(图12D-F和13)。相比之下，PBS处理的对照EAE动物具有增加的Ter119+细胞数量。此外，与PBS处理的对照EAE动物相比，GLP-1R激动剂处理减少EAE动物中的IL-17+和IFN-γ+细胞数量，PBS处理的对照EAE动物具有与幼稚动物相比增加的IL-17+和IFN-γ+细胞数量(图16和17)。免疫分析的结果表明GLP-1R激动剂处理降低EAE动物中的辅助性T细胞水平。

上文所述的结果证实GLP-1R激动剂有效减少CNS的脱髓鞘和白细胞侵入，并且减缓广泛接受的MS动物模型EAE的发展。天然存在的GLP-1R激动剂毒蜥外泌肽-4和GLP-1R激动剂GAC-1在减缓疾病发展中均有效。组织化学实验显示GLP-1R激动剂减少T细胞和单核细胞侵入CNS组织。

用于CNS自身免疫性病症的GLP-1R激动剂

不受限于理论，认为GLP-1R激动剂主要通过调节白细胞的迁移和/或降低Th1和Th17细胞水平来发挥功能。本发明的方法可以联合目前的免疫抑制剂治疗以产生额外的治疗效果。

本发明的GLP-1R激动剂可以用来减少许多自身免疫性或相关疾病中CNS组织的白细胞侵入。本发明的GLP-1R激动剂还可以用来降低许多自身免疫性或相关疾病中的Th1和Th17细胞水平。除了是MS的模型，EAE小鼠还用来研究视神经炎。预期GLP-1R激动剂缓解白细胞侵入和/或Th1和Th17细胞所介导的所有这些疾病和其他自身免疫性病症中的CNS免疫侵入。注意到术语疾病和病症无区别地使用。

本发明的特征是将GLP-1R激动剂直接给予患有自身免疫性疾病的动物。虽然本发明的优选实施方案是在多肽方面描述，但是本发明涵盖给予编码这类GLP-1R激动剂多肽的多核苷酸，这会指导体内表达所编码的GLP-1R激动剂。直接DNA注射和基因治疗递送的方法是本领域已知的。相对于通过给予药物来诱导，将GLP-1R激动剂多肽或编码它们的多核苷酸直接给予动物。本发明还涵盖以与天然存在的GLP-1R激动剂和/或激动剂抗体一致的方式结合并活化GLP-1R的类肽(peptidomimetic)分子。

根据本文所述的方法使用的特定GLP-1R激动剂在下文进一步详述。不背离本发明的范围，额外的GLP-1R激动剂对于本领域技术人员是显而易见的。

天然存在的GLP-1R激动剂和它们的衍生物

GLP-1R激动剂包括天然存在的激动剂多肽、其片段、变体和衍生物，包括但不限于GLP-1、毒蜥外泌肽-4、原毒蜥外泌肽(proexendin)(参见，例如，美国专利第6,723,530号)、毒蜥外泌肽-3(参见，例如，美国专利第5,424,286号)、OAP-189(参见，例如，美国专利申请公开第US 20090181885号，其整体援引加入本文)和泌酸调节肽。如本文所用，GLP-1和/或毒蜥外泌肽-4多肽序列可以来自与相应GLP-1R相同的物种，或者来自不同物种，只要所得的多肽结合至GLP-1R并且作为激动剂发挥功能。

GLP-1R激动剂包括天然存在的和变异的GLP-1。已在许多哺乳动物中鉴定GLP-1多肽。HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ IDNO：1)是通过二肽基肽酶IV(DPP-4)在位置2丙氨酸处切割GLP-1所产生的30个氨基酸的GLP-1(7-36)肽。D.J.Drucker(2001)Endocrinology142：521-527.GLP-1(7-36)作为GLP-1R激动剂发挥功能，导致增加的葡萄糖依赖性胰岛素分泌。然而，GLP-1(7-36)的半衰期仅几分钟。可以去除蛋白酶切割位点以延长GLP-1多肽的半衰期，或者添加蛋白酶切割位点以允许调控它们的活性。GLP-1R激动剂可以缀合或融合至半衰期延长部分，例如PEG，IgG Fc区，白蛋白，或者诸如Myc、HA(血凝素)、His-6或FLAG的肽或表位。其他示例性GLP-1多肽包括GLP-1(7-37)haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr(SEQ ID NO：42)和GLP-1(1-45)(参见，例如，美国专利申请公开第2003/0232754号)。

GLP-1R激动剂进一步包括天然存在的和变异的毒蜥外泌肽-4。已在希拉毒蜥的唾液中鉴定毒蜥外泌肽-4。毒蜥外泌肽-4是39个氨基酸的肽，其与GLP-1约53％同源。希拉毒蜥毒蜥外泌肽-4的序列为HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (SEQ ID NO：2)。与GLP-1(7-36)一样，毒蜥外泌肽-4作为GLP-1R激动剂发挥功能，并且刺激葡萄糖依赖性胰岛素分泌。然而，不像GLP-1(7-36)，毒蜥外泌肽-4表现出增加的对DPP-4切割的抗性。GLP-1(7-36)和毒蜥外泌肽-4的N端区几乎相同，显著差异是第二个氨基酸残基。这个残基在GLP-1(7-36)为丙氨酸，但是在毒蜥外泌肽-4中为甘氨酸。N端区中的这个单一氨基酸负责增加的毒蜥外泌肽-4对DPP-4消化的抗性。毒蜥外泌肽-4和DLP-1(7-36)之间的另一显著差异是在毒蜥外泌肽-4的C端存在9个额外的氨基酸残基，其形成Trp-笼。

本发明的天然存在的和变异的GLP-1和毒蜥外泌肽-4多肽包括它们的嵌合体、变体、片段(包括肽)和/或衍生物。优选片段包括天然存在的多肽的GLP-1R结合部分，或者嵌合、共有或突变的等价结合部分。片段包括合成的肽。变体包括具有保守和非保守氨基酸取代的天然存在的氨基酸序列变体。示例性变体包括但不限于GLP-1-Tf(美国专利申请公开第20060205037号)、OAP-189、毒蜥外泌肽-4-Tf(WO2008012629)以及美国专利申请公开第20040242853号所公开的GLP-1和毒蜥外泌肽-4肽类似物。

OAP-189的序列为

HAQGTFTSDYSKYLEQELVKYFIQWLKNAGPSKNNIA(SEQ ID NO：43)。

保守取代包括相似大小、电荷或疏水性的氨基酸残基。例如，Ala可以被Val、Leu或Ile取代。Arg可以被Lys、Gln或Asn取代。Asn可以被Gln、His、Lys或Arg取代。Asp可以被Glu取代。Cys可以被Ser取代。Gln可以被Asn取代。Glu可以被Asp取代。Gly可以被Pro取代。His可以被Asn、Gln、Lys或Arg取代。Ile可以被Leu、Val、Met、Ala、Phe或正亮氨酸取代。Leu可以被正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala或Phe取代。Lys可以被Arg、Gln或Asn取代。Met可以被Leu、Phe或Ile取代。Phe可以被Leu、Val、Ile或Ala取代。Pro可以被Gly取代。Ser可以被Thr取代。Thr可以被Ser取代。Trp可以被Tyr取代。Tyr可以被Trp、Phe、Thr或Ser取代。Val可以被Ile、Leu、Met、Phe、Ala或正亮氨酸取代。

功能的本质改变可以通过选择在它们的效应上显著不同的取代来完成，所述效应维持(a)所述取代的区域中多肽骨架的结构，例如折叠或螺旋构象，(b)在靶位点的分子的电荷或疏水性，或者(c)大部分侧链。基于共同的侧链特性将天然存在的残基分组(这些残基中的一些可以落入几个官能团)：

(1)疏水：Met、Ala、Val、Leu、Ile、正亮氨酸；

(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；

(5)芳香：Trp、Tyr、Phe；以及

(6)引起弯曲的残基：Gly和Pro。

非保守取代用一个类别的成员交换另一类别的成员，或者包括在前面的段落中未鉴定为保守的取代。

不参与维持激动剂的正确构象的任何半胱氨酸一般还可以用丝氨酸取代以提高分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反地，可以将半胱氨酸键加入激动剂以提高其稳定性。

氨基酸修饰的范围可以从改变或修饰一个或多个氨基酸至完全重新设计区域，例如可变区。可变区中的变化可以改变结合亲和性和/或特异性。

变体包括天然存在的氨基酸序列变体和工程化的变体，只要所得的多肽或衍生物结合至GLP-1R并作为激动剂发挥功能。测量GLP-1R活化的测定如本文和引用的参考文献所述。

衍生物包括共价和非共价修饰的肽和多肽(例如，酰化、聚乙二醇化、法尼基化、糖基化或磷酸化)多肽。所述多肽可以包括额外的官能团以调节结合和/或活性，允许体内成像，调节半衰期，调节运输跨越血脑屏障，或者辅助多肽靶向特定细胞类型或组织。所述多肽可以包含氨基酸取代以促进修饰(例如添加聚乙二醇化、糖基化或其他位点)，只要所述取代基本上不影响所述多肽结合至GLP-1R或激动剂活性。

常见修饰为聚乙二醇化以减少全身清除，并且具有最小的生物学活性损失。可以利用本领域已知的方法将聚乙二醇聚合物(PEG)连接至GLP-1和毒蜥外泌肽-4多肽(以及GLP-1R激动剂抗体)的各种官能团(参见，例如，Roberts et al.(2002)，Advanced Drug Delivery Reviews 54：459-476；Sakane etal.(1997)Pharm.Res.14：1085-91)。可以将PEG连接至例如氨基、羧基、修饰的或天然的N端、胺基以及硫醇基。在一些实施方案中，将一个或多个表面氨基酸残基用PEG分子修饰。PEG分子可以是各种大小的(例如，范围为约2-40kDa)。连接至GLP-1、毒蜥外泌肽-4或其他多肽的PEG分子可以具有约2000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000Da的任何分子量。PEG分子可以是单链或支化链。为了将PEG连接至GLP-1R激动剂多肽，可以使用在一端或两端具有官能团的PEG的衍生物。基于所述多肽上可用的反应基团的类型选择所述官能团。将衍生物连接至多肽的方法是本领域已知的。N端特异性连接PEG的一个实例是将位置1处的残基突变为丝氨酸或苏氨酸以促进聚乙二醇化。

可以将多肽或它们的衍生物直接或通过合成接头连接至其他分子。优选GLP-1R激动剂多肽、其片段或衍生物与值已报道的天然存在的GLP-1R激动剂相比，表现出相似或更好的结合亲和性、选择性和活化。小部分所述激动剂多肽可以称为“肽”，虽然这个术语不应当理解为限制。

在本文所述的许多实验和测定中，包括EAE动物模型，优选GLP-1R激动剂表现出与毒蜥外泌肽-4和GAC-1相比相似的生物学特性。

GLP-1R激动剂-抗体缀合物

衍生物进一步包括将GLP-1R激动剂肽共价连接至抗体以延长半衰期和/或增强效力。例如，直接或通过干预接头连接至抗体的结合位点的包含GLP-1R激动剂肽物质的GLP-1R激动剂化合物例如美国专利申请公开第20090098130号和PCT申请公开第WO 2008/081418号所述，这些文献整体援引加入本文。这类GLP-1R激动剂化合物在本文中称为“GLP-1R激动剂-抗体缀合物”或“GAC”。GAC包括直接或通过接头连接至抗体的GLP-1R激动剂肽，例如，GLP-1或毒蜥外泌肽-4片段或衍生物。在使用接头的一些实施方案中，所述接头可以使所述GLP-1R激动剂肽与所述抗体保持距离以避免所述抗体限制所述GLP-1R激动剂肽与GLP-1R之间的结合。

如本文所公开的GAC可以包括任何GLP-1R激动剂，即增加GLP-1R的活化量、产生与天然存在的激动剂GLP-1和毒蜥外泌肽-4所产生的相似的效应的肽。在一些实施方案中，GLP-1R肽两侧可以是一个或多个R基团。例如，在一些实施方案中，GAC的GLP-1R激动剂肽可以具有以下结构：R¹-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO：1)-R²，其中：R¹为不存在、CH₃、C(O)CH₃、C(O)CH₂CH₃、C(O)CH₂CH₂CH₃或C(O)CH(CH₃)CH₃；并且R²为OH、NH₂、NH(CH₃)、NHCH₂CH₃、NHCH₂CH₂CH₃、NHCH(CH₃)CH₃、NHCH₂CH₂CH₂CH₃、NHCH(CH₃)CH₂CH₃、NHC₆H₅、NHCH₂CH₂OCH₃、NHOCH₃、NHOCH₂CH₃、羧基保护基团、脂质脂肪酸基团或糖。在其他实施方案中，所述GLP-1R激动剂肽可以具有以下结构：

R¹-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：2)-R²(SEQ ID NO：4)；其中R¹为不存在、CH₃、C(O)CH3、C(O)CH₂CH₃、C(O)CH₂CH₂CH₃或C(O)CH(CH₃)CH₃；并且R²为OH、NH₂、NH(CH₃)、NHCH₂CH₃、NHCH₂CH₂CH₃、NHCH(CH₃)CH₃、NHCH₂CH₂CH₂CH₃、NHCH(CH₃)CH₂CH₃、NHC₆H₅、NHCH₂CH₂OCH₃、NHOCH₃、NHOCH₂CH₃、羧基保护基团、脂质脂肪酸基团或糖。GLP-1R激动剂肽进一步包括SEQ IDNO：1和2的类似物。这样的类似物可以具有额外的有利特征，例如，提高的生物利用度、提高的稳定性、改善的EAE治疗谱、改善的Th17细胞数量减少谱、改善的食欲控制、改善的体重控制和/或降低的宿主免疫识别。如本文所用，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的肽的类似物是基本上具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列的肽，但是具有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失或者它们的组合。在某些实施方案中，如本文所提供的GLP-1R激动剂肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。合适的示例性SEQID NO：1和SEQ ID NO：2类似物例如2008年1月4日提交的美国专利申请第11/969,850号(公开为美国专利申请公开第20090098130号)的表II所示，其整体援引加入本文。可以利用本领域公知的技术制备GLP-1R激动剂肽。例如，制备GLP-1R激动剂抗体缀合化合物的方法如美国专利申请公开第20090098130号所述。通常，所述GLP-1R激动剂肽的合成是第一步，并且如美国专利申请公开第20090098130号所述进行。为了连接至连接组分(接头)，然后将所述GLP-1R激动剂肽衍生化，然后使其与所述抗体结合。本领域技术人员会很容易理解所用的具体合成步骤取决于这3种组分的确切性质。因此，本文所述的GLP-1R激动剂肽-接头缀合物和GAC可以很容易合成。

如本文所用，“抗体”包括B细胞的产物免疫球蛋白及其变体，以及T细胞的产物T细胞受体(TcR)及其变体。结合位点指参与抗原结合的抗体分子的部分。

可以将如本文所述的GLP-1R激动剂肽直接或通过接头共价连接至抗体中的结合位点。可以选择适当的接头以提供足够的靶物质与所述抗体之间的距离。其他接头考虑包括对所得的GAC或GLP-1R激动剂肽-接头的物理或药物动力学特性的影响、溶解性、亲脂性、亲水性、疏水性、稳定性(或多或少稳定以及计划降解)、刚性、柔性、免疫原性、抗体结合的调节、掺入微团或脂质体的能力等。已发现即使对肽组成、接头组成和连接残基位置的最小改变可以对所得分子的不同特征(例如，稳定性、溶解性、半衰期、生物利用度、靶结合能力、激动剂或拮抗剂活性、药物动力学等)具有不可预测和令人惊讶的影响。

在一些实施方案中，用于本发明的肽可以具有式I：R¹-[H¹ X² E³ G⁴ T⁵ F⁶T⁷ S⁸ D⁹ X¹⁰ S¹¹ X¹² X¹³ X¹⁴ E¹⁵ X¹⁶ X¹⁷ A¹⁸ X¹⁹ X²⁰ X²¹ F²² X²³ X²⁴ X²⁵ X²⁶ X²⁷X²⁸ X²⁹ X³⁰ X³¹ X³² X³³ X³⁴ X³⁵ X³⁶ X³⁷ X³⁸ X³⁹ X⁴⁰(SEQ ID NO：3)]-R²，其中：X²为封闭基团，例如Aib、A、S、T、V、L、I、D-Ala；X¹⁰为V、L、I或A；X¹²为S或K；X¹³为Q或Y；X¹⁴为G、C、F、Y、W、M或L；X¹⁶为K、D、E或G；X¹⁷为E或Q；X¹⁹为L、I、V或A；X²⁰为鸟氨酸或诸如K(SH)的衍生化赖氨酸基团、R或K；X²¹为L或E；X²³为I或L；X²⁴为A或E；X²⁵为W或F；X²⁶为L或I；X²⁷为I、K或V；X²⁸为R、鸟氨酸、N或K；X²⁹为Aib或G；X³⁰为任何氨基酸，优选G或R；X³¹为P或不存在；X³²为S或不存在；X³³为S或不存在；X³⁴为G或不存在；X³⁵为A或不存在；X³⁶为P或不存在；X³⁷为P或不存在；X³⁸为P或不存在；X³⁹为S或不存在；并且X⁴⁰为连接残基或不存在；并且其中X¹⁰、S¹¹、X¹²、X¹³、X¹⁴、X¹⁶、X¹⁷、X¹⁹、X²⁰、X²¹、X²⁴、X²⁶、X²⁷、X²⁸、X³²、X³³、X³⁴、X³⁵、X³⁶、X³⁷、X³⁸、X³⁹或X⁴⁰中的一个由连接残基(-[LR]-)取代，所述连接残基包含可直接或通过中间接头共价连接至抗体的结合位点的亲核侧链，并且所述连接残基可以选自K、R、Y、C、T、S、赖氨酸的同系物(包括K(SH))、高半胱氨酸和高丝氨酸。

在一些实施方案中，用于本发明的肽包含式II的序列：R¹-[H¹-(Aib)²-E³-G⁴-T⁵-F⁶-T⁷-S⁸-D⁹-V¹⁰-S¹¹-S¹²-Y¹³-L¹⁴-E¹⁵-G¹⁶-Q¹⁷-A¹⁸-A¹⁹-K² ⁰-E²¹-F²²-I²³-A²⁴-W²⁵-L²⁶-V²⁷-K²⁸-G²⁹-R³⁰(SEQ ID NO：4)]-R²。在一些实施方案中，残基中的一个可以由连接残基取代。在一些实施方案中，G¹⁶或A²⁴中的一个可以由连接残基取代，所述连接残基包含可直接或通过中间接头共价连接至抗体的结合位点的亲核侧链，并且所述连接残基可以选自K、R、Y、C、T、S、赖氨酸的同系物(包括K(SH))、高半胱氨酸和高丝氨酸。在其他实施方案中，所述接头可以共价连接至R³⁰基团的C端或者位置31处的额外的残基的C端。

在一些实施方案中，用于本发明的肽可以包含式III的序列：R¹-[H¹-(Aib)²-E³-G⁴-T⁵-F⁶-T⁷-S⁸-D⁹-L¹⁰-S¹¹-K¹²-Q¹³-M¹⁴-E¹⁵-E¹⁶-E¹⁷-A¹⁸-V¹⁹-R²⁰-L²¹-F²²-I²³-E²⁴-W²⁵-L²⁶-K²⁷-N²⁸-G²⁹-G³⁰-P³¹-S³²-S³³-G³⁴-A³⁵-P³⁶-P³⁷-P³⁸-S³⁹-X⁴⁰(SEQ ID NO：5)]-R²，其中X⁴⁰为连接残基或不存在，并且其中L¹⁰、S¹¹、K¹²、Q¹³、M¹⁴、E¹⁶、E¹⁷、A¹⁹、R²⁰、L²¹、E²⁴、L²⁶、K²⁷、N²⁸、G³²、S³³、G³⁴、A³⁵、P³⁶、P³⁷、P³⁸、S³⁹或X⁴⁰中的一个由连接残基(-[LR]-)取代，所述连接残基包含可直接或通过中间接头共价连接至抗体的结合位点的亲核侧链，其中所述连接残基可以选自K、R、Y、C、T、S、赖氨酸的同系物(包括K(SH))、高半胱氨酸和高丝氨酸。

对于式I、II和III，X²可以是封闭残基，例如Aib，或者可以是丙氨酸(例如在GLP1中发现)、或甘氨酸(例如在毒蜥外泌肽-4中发现)、或另一残基。

对于式I、II和III，R¹可以为不存在、CH₃、C(O)CH3、C(O)CH₂CH₃、C(O)CH₂CH₂CH₃或C(O)CH(CH₃)CH₃；并且R²可以为不存在、OH、NH₂、NH(CH₃)、NHCH₂CH₃、NHCH₂CH₂CH₃、NHCH(CH₃)CH₃、NHCH₂CH₂CH₂CH₃、NHCH(CH₃)CH₂CH₃、NHC₆H₅、NHCH₂CH₂OCH₃、NHOCH₃、NHOCH₂CH₃、羧基保护基团、脂质脂肪酸基团或糖。

对于式I、II和III；R¹可以不存在。对于式I、II和III；R²可以为NH₂。

对于式I、II和III，所述连接残基可以为赖氨酸(K)。所述连接残基可以为C。对于式I、II和III，所述连接残基可以为K(SH)：

当所述连接残基为K、K(SH)或C时，所述连接残基可以进一步共价连接至以下接头：

接头A

所述接头可以如下通过β-内酰胺基团共价连接至抗体：

在一些实施方案中，所述接头的β-内酰胺基团可以如下共价连接至抗体的两个结合位点中的至少一个：

在一些实施方案中，所述连接残基和接头可以具有以下结构：

在一些实施方案中，所述接头和连接残基可以共价连接至GLP-1R激动剂肽，例如式I、II和III所示例的，如下：

在一些实施方案中，所述肽-接头复合物可以共价连接至抗体：

在一些实施方案中，所述肽-接头复合物连接至抗体的结合位点中的至少一个：

在某些实施方案中，所述GLP-1R激动剂肽可以包含序列：H¹-(Aib)²-E³-G⁴-T⁵-F⁶-T⁷-S⁸-D⁹-L¹⁰-S¹¹-K¹²-Q¹³-M¹⁴-E¹⁵-E¹⁶-E¹⁷-A¹⁸-V¹⁹-R²⁰-L²¹-F²²-I²³-E²⁴-W²⁵-L²⁶-K²⁷-N²⁸-G²⁹-G³⁰-P³¹-S³²-S³³-G³⁴-A³⁵-P³⁶-P³⁷-P³⁸-S³⁹-X⁴⁰(SEQ ID NO：6)，其中M¹⁴或X⁴⁰中的一个由所述连接残基取代。在一些实施方案中，所述GLP-1R激动剂肽-接头包含如下所示通过K⁴⁰(连接残基)连接至接头A的肽

NH₂-[H-(Aib)-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K(SEQ ID NO：7)]-NH₂：

在化合物GAC-1中，肽

NH₂-[H-(Aib)-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K(SEQ ID NO：7)]-NH₂如下所示通过K⁴⁰(连接残基)连接至接头A并且结合至抗体的结合位点：

因此，GAC-1具有以下结构：

GAC-1

在其他实施方案中，所述GLP-1R激动剂肽-接头包含如下所示通过K¹⁴(连接残基)连接至接头A的肽

NH₂-[H-(Aib)-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S(SEQ ID NO：8)]-NH₂。

在化合物GAC-2中，肽

NH₂-[H-(Aib)-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S(SEQ ID NO：8)]-NH₂如下所示通过K¹⁴(连接残基)连接至接头A并且结合至抗体的结合位点：

因此，GAC-2具有以下结构：

GAC-2

示例性GAC包括但不限于具有下文表1所提供的任何肽序列的GAC。在一些实施方案中，所述GLP-1R激动剂化合物是来自表1的任何GAC。表1所示的数据是利用美国专利申请公开第20090098130号所述的方法获得的。表1所提供的EC₅₀值是利用如美国专利申请公开第20090098130号的实施例30所述的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)测定来确定的。在表1中，EC₅₀列中的(P)表示肽拴至抗体时的EC₅₀。

表1

如上文所讨论，用于本发明的化合物可以共价结合至抗体。其整体援引加入本文的美国专利申请公开第20090098130号描述抗体，其可用的片段和变体和修饰，结合位点和CDR，抗体制备、表达、人源化、氨基酸修饰、糖基化、ADCC、CDC，增加抗体的血清半衰期，表达载体，哺乳动物宿主系统，和折叠，以及抗体技术的其他元件。

在一些实施方案中，可以与本发明的化合物联用的一些抗体可以在抗体结合位点中具有反应侧链。反应侧链可以天然存在或者可以通过突变置于抗体中。抗体结合位点的反应残基可以与所述抗体有关，例如当所述残基由存在于最初鉴定为产生所述抗体的淋巴样细胞中的核酸编码时。或者，所述氨基酸残基可以通过特意突变DNA以编码特定残基来产生(参见，例如，Meares等人的WO 01/22922)。所述反应残基可以是例如利用如本文所讨论的独特密码子、tRNA和氨酰基-tRNA通过生物合成掺入所产生的非天然残基。在另一方法中，所述氨基酸残基或其反应官能团(例如，亲核氨基或巯基)可以连接至抗体结合位点中的氨基酸残基。因此，如本文所用，“通过抗体的结合位点中的氨基酸残基”发生的与抗体的共价连接表示连接可以直接连至抗体结合位点的氨基酸残基或者通过连接至抗体结合位点的氨基酸残基的侧链的化学部分。在一些实施方案中，所述氨基酸为半胱氨酸，并且所述侧链的反应基团为巯基。在其他实施方案中，所述氨基酸为赖氨酸，并且所述侧链的反应基团为ε-氨基。

催化抗体是具有合适的包含一个或多个反应氨基酸侧链的结合位点的抗体的一种来源。这类抗体包括醛缩酶抗体、β内酰胺酶抗体、酯酶抗体、酰胺酶抗体等。

一个实施方案包含醛缩酶抗体，例如小鼠单克隆抗体mAb 33F12和mAb 38C2，以及这类抗体的适当嵌合和人源化的版本(例如，h38C2、SEQID NO：11和12)。

h38C2轻链序列(219个氨基酸)：

ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLLHTYGSPYLNWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYFCSQGTHLPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：11)

h38C2h链序列(448个氨基酸)：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMSWVRQSPEKGLEWVSEIRLRSDNYATHYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTGIYYCKTYFYSFSYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：12)

小鼠mAb 38C2(和h38C2)在靠近HCDR3但是其外具有反应赖氨酸，并且是通过反应性免疫所产生并机械模拟天然醛缩酶的一类新催化抗体的原型。参见C.F.Barbas 3^rd et al.，Science 278：2085-2092，1997)。可以使用的其他醛缩酶催化抗体包括由以下杂交瘤所产生的抗体：杂交瘤85A2，其ATCC登录号为PTA-1015；杂交瘤85C7，其ATCC登录号为PTA-1014；杂交瘤92F9，其ATCC登录号为PTA-1017；杂交瘤93F3，其ATCC登录号为PTA-823；杂交瘤84G3，其ATCC登录号为PTA-824；杂交瘤84G11，其ATCC登录号为PTA-1018；杂交瘤84H9，其ATCC登录号为PTA-1019；杂交瘤85H6，其ATCC登录号为PTA-825；杂交瘤90G8，其ATCC登录号为PTA-1016。通过反应赖氨酸，这些抗体利用天然醛缩酶的烯胺机制催化羟醛和反羟醛反应。参见，例如，J.Wagner et al.，Science 270：1797-1800，1995；C.F.Barbas 3^rd et al.，Science 278：2085-2092，1997；G.Zhong et al.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.38：3738-3741，1999；A.Karlstrom et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97：3878-3883，2000。醛缩酶抗体以及产生醛缩酶抗体的方法如美国专利号6,210,938、6,368,839、6,326,176、6,589,766、5,985,626和5,733,75所公开，这些文献援引加入本文。

本发明的化合物可以通过将本发明的化合物连接至反应半胱氨酸来形成，例如在硫酯酶和酯酶催化抗体的结合位点中发现的反应半胱氨酸。合适的硫酯酶催化抗体如K.D.Janda et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：2532-2536(1994)所述。合适的酯酶抗体如P.Wirsching et al.，Science270：1775-1782(1995)所述。含有反应氨基酸的抗体可以通过本领域公知的方法制备，包括将抗体结合位点残基突变为编码所述反应氨基酸或者用含有所述反应基团的接头化学衍生化抗体结合位点中的氨基酸侧链。

在一些实施方案中，所述抗体可以是人源化抗体。优选地，所述人源化抗体保留对能够形成结合位点中的共价键的β-内酰胺基团或其他化学基团的高连接亲和性。考虑各种形式的人源化小鼠醛缩酶抗体。在一些实施方案中，所述抗体为人源化醛缩酶催化抗体，例如h38c2 IgG1或者具有人恒定结构域C_κ和C_γ11的h38c2 Fab。C.Rader et al.，2003，J.Mol.Bio.332：889-899公开可以用来产生h38c2 Fab和h38c2 IgG1的基因序列和载体。人种系V_k基因DPK-9和人J_k基因JK4用作m38c2的κ轻链可变结构域人源化的框架，并且人种系基因DP-47和人J_H基因JH4用作m38c2的重链可变结构域人源化的框架。在包含具有G1m(f)同种异型的抗体h38c2 IgG1的本发明的化合物的某些实施方案中，接头的β-内酰胺基团可以结合至重链位置99处的赖氨酸残基的侧链。其他实施方案可以使用包含h38c2的可变结构域(V_L和V_H)以及来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定结构域的嵌合抗体。抗体可以是包含来自h38c2的V_H和V_L结构域的全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)₂、F_v、dsF_v、scF_v、V_H、V_L，、双抗体或微抗体。抗体还可以是包含来自h38c2的V_H和V_L结构域以及选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定结构域的抗体。在一些实施方案中，抗体可以是h38C2 IgG1。在一些实施方案中，抗体可以是包含来自人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的恒定区的小鼠醛缩酶抗体的人源化版本。在其他实施方案中，所述抗体可以是包含来自小鼠醛缩酶抗体的可变区以及来自人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的恒定区的嵌合抗体。在其他实施方案中，所述抗体可以是包含来自天然或自然人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的多肽序列的小鼠醛缩酶抗体的全人版本。

还考虑各种形式的人源化醛缩酶抗体片段。一个实施方案使用h38c2F(ab’)₂。h38c2 F(ab’)₂可以通过蛋白酶消化h38c2 IgG1产生。另一实施方案使用h38c2 scFv，其包含任选通过干预接头(Gly₄Ser)₃连接的来自h38c2的V_L和V_H结构域。作为人源化的可选形式，可以产生人抗体。

其他GLP-1R激动剂

GLP-1R激动剂还包括，例如但不限于抗GLP-1R激动剂抗体、艾塞那肽(BYETTA)、阿必鲁泰(albiglutide)、R1583、利拉糖肽、AVE-0010、S4P和Boc5(参见，Chen et al.(2007)Proc Natl Acad Sci USA.104：943-948)。

GLP-1R激动剂还包括DPP-4抑制剂，例如但不限于西格列汀、维格列汀、沙格列汀、利拉利汀(linagliptin)、dutogliptin、gemigliptin、阿格列汀(alogliptin)和小檗碱。

在一些实施方案中，所述GLP-1R激动剂为单克隆抗GLP-1R激动剂抗体。单克隆抗GLP-1R抗体可以由本领域技术人员很容易制备。通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法现在是本领域公知的。参见，例如，M.Schreier et al.，Hybridoma Techniques(Cold Spring Harbor Laboratory 1980)；Hammerling et al.，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(ElsevierBiomedical Press 1981)；Kennett et al.，Monoclonal Antibodies(Plenum Press1980)。永生的抗体分泌细胞系还可以通过除融合之外的技术产生，例如用致癌DNA或EBV直接转化B-淋巴细胞。如果期望，几种抗原来源可以用来攻击后来转换为永生细胞系的正常B-淋巴细胞群体。

多核苷酸

在一些实施方案中，本发明提供编码本文所述任何多肽的多核苷酸。多核苷酸可以通过本领域已知的方法制备和表达。

在一些实施方案中，本发明提供包含本发明的任何多核苷酸的组合物(例如药物组合物)。在一些实施方案中，所述组合物包含表达载体，所述表达载体包含编码如本文所述的多肽的多核苷酸。在其他实施方案中，所述组合物包含表达载体，所述表达载体包含编码本文所述任何多肽的多核苷酸。表达载体以及多核苷酸组合物的给药在本文中进一步描述。

在一些实施方案中，本发明提供制备本文所述任何多核苷酸的方法。

本发明还涵盖与任何这样的序列互补的多核苷酸。多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链，并且可以是DNA(基因组、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，其含有内含子并且以一对一的方式与DNA分子对应；以及mRNA分子，其不含内含子。额外的编码或非编码序列可以但不是必须存在于本发明的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不是必须连接至其他分子和/或支持物质。

多核苷酸可以包含天然序列(即，编码抗体或其部分的内源序列)或者可以包含这样的序列的变体。多核苷酸变体含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，从而相对于天然免疫反应分子，所编码的多肽的免疫反应性未减少。对所编码的多肽的免疫反应性的影响一般可以如本文所述进行评价。变体优选表现出与编码天然抗体或其部分的多核苷酸序列的至少约70％相同性，更优选至少约80％相同性，更优选至少约90％相同性，并且最优选至少约95％相同性。

如果在如下文所述比对最大对应时两个序列中的核苷酸或氨基酸序列相同，则说两个多核苷酸或多肽序列“相同”。两个序列之间的比较通常通过在比较窗口上比较所述序列以鉴定和比较序列局部区域相似性来进行。如本文所用，“比较窗口”指至少约20个连续位置的片段，通常30至约75个，或者40至约50个，其中在两个序列最佳比对之后可以将序列与相同数目连续位置的参考序列比较。

用于比较的序列的最佳比对可以使用生物信息学软件Lasergene套件中的Megalign程序(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)利用缺省参数进行。这个程序包括以下参考文献所述的几个比对方案：Dayhoff，M.O.，1978，A modelof evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff，M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure，NationalBiomedical Research Foundation，Washington DC Vol.5，Suppl.3，pp.345-358；Hein J.，1990，Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645Methods in Enzymology vol.183，Academic Press，Inc.，San Diego，CA；Higgins，D.G.and Sharp，P.M.，1989，CABIOS 5：151-153；Myers，E.W.andMuller W.，1988，CABIOS 4：11-17；Robinson，E.D.，1971，Comb.Theor.11：105；Santou，N.，Nes，M.，1987，Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath，P.H.A.andSokal，R.R.，1973，Numerical Taxonomy the Principles and Practice ofNumerical Taxonomy，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.andLipman，D.J.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730.

优选地，通过在至少20个位置的比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定“序列相同性百分比”，其中当为了两个序列的最佳比对与参考序列(其不含添加或缺失)比较时，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包含20％或更少的添加或缺失(即，缺口)，通常5-15％，或者10-12％。百分比这样计算，确定在两个序列中均存在的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配的位置的数目，匹配的位置的数目除以参考序列中的位置的总数目(即窗口大小)并将结果乘以100以产生序列相同性的百分比。

变体还可以或者可选地基本上与天然基因或者其部分或互补物(complement)同源。这类多核苷酸变体能够在中等严格条件下与编码天然多肽的天然存在的DNA序列(或互补序列)杂交。

合适的“中等严格条件”包括在5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-65℃、5X SSC下杂交过夜；然后在65℃下洗涤2次20分钟，每次用含有0.1％SDS的2X、0.5X和0.2X SSC。

如本文所用，“高度严格条件”或“高严格性条件”是：(1)采用低离子强度和高温洗涤，例如在50℃下0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)杂交期间采用变性剂，如甲酰胺，例如，在42℃下含有750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠的含0.1％牛血清白蛋白/0.1％菲可/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/在pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液的50％(v/v)甲酰胺；或者(3)采用42℃下的50％甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt溶液、超声处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，在42℃下于0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中以及55℃下的50％甲酰胺中洗涤，然后进行由55℃下的含有EDTA的0.1x SSC组成的高严格性洗涤。技术人员会认识到怎样调整温度、离子强度等，必要时调整诸如探针长度等的因素。

本领域技术人员会理解，作为遗传密码简并性的结果，有许多编码如本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。但是，本发明特别考虑由于密码子使用的差异而不同的多核苷酸。而且，包含本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明的范围之内。等位基因是作为一个或多个突变的结果而改变的内源基因，例如核苷酸的缺失、添加和/或取代。所得的mRNA和蛋白可以但不是必须具有改变的结构或功能。等位基因可以利用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)鉴定。

本发明的多核苷酸可以利用化学合成、重组方法或PCR获得。化学多核苷酸合成的方法是本领域公知的，并且不必在本文中详述。本领域技术人员可以使用本文所提供的序列和商业DNA合成仪制备期望的DNA序列。

为了利用重组方法制备多核苷酸，如本文进一步讨论的，可以将包含期望序列的多核苷酸插入合适的载体，然后将所述载体引入合适的宿主细胞用于复制和扩增。可以通过本领域已知的任何方法将多核苷酸插入宿主细胞。通过直接吸收、胞吞、转染、F-接合或电穿孔引入外源多核苷酸来转化细胞。一旦引入，外源多核苷酸可以作为非整合载体(例如质粒)维持在细胞内或者整合入宿主细胞基因组。这样扩增的多核苷酸可以通过本领域公知的方法从宿主细胞分离。参见，例如，上文Sambrook et al.，1989。

或者，PCR允许复制DNA序列。PCR技术是本领域公知的，并且如美国专利号4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202以及PCR：ThePolymerase Chain Reaction，Mullis et al.eds.，Birkauswer Press，Boston(1994)所述。

RNA可以通过使用适当载体中的分离的DNA并将其插入合适的宿主细胞来获得。当细胞复制物和DNA转录为RNA时，然后可以利用本领域技术人员公知的方法分离RNA，例如上文Sambrook et al.，1989所示。

合适的克隆载体可以根据标准技术构建，或者可以选自本领域可用的大量克隆载体。虽然所选的克隆载体可以根据预期使用的宿主细胞变化，但是有用的克隆载体一般具有自我复制的能力，可以具有特定限制性内切核酸酶的单一靶标，和/或可以携带可以用于选择含有所述载体的克隆的标记的基因。合适的实例包括质粒和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如，pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA以及穿梭载体，如pSA3和pAT28。这些和许多其他克隆载体可从商业供应商获得，例如BioRad、Strategene和Invitrogen。

表达载体一般是含有本发明的多核苷酸的可复制的多核苷酸构建体。这意味着表达载体必须作为附加体或者作为染色体DNA的整合部分在宿主细胞中可复制。合适的表达载体包括但不限于质粒，病毒载体，包括腺病毒、腺伴随病毒、反转录病毒，粘粒，以及例如PCT公开第WO 87/04462号所公开的表达载体。载体组件一般可以包括但不限于一种或多种以下组件：信号序列；复制起点；一个或多个标记基因；合适的转录控制元件(例如启动子、增强子和终止子)。为了表达(即，翻译)，一种或多种翻译控制元件是有用的，例如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。

可以通过许多适当方法中的任一种将含有所关注的多核苷酸的载体引入宿主细胞，包括电穿孔，采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质转染；微粒轰击；脂转染；以及感染(例如，当所述载体是感染物质时，如痘苗病毒)。引入载体或多核苷酸的选择通常取决于宿主细胞的特征。

本发明还提供包含本文所述任何多核苷酸的宿主细胞。能够过表达异源DNA的任何宿主细胞可以用于分离编码所关注的多肽或蛋白的基因的目的。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。还参见PCT公开第WO 87/04462号。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(例如大肠杆菌(E.coli)或枯草杆菌(B.subtillis))和酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisae)、裂殖酵母(S.pombe)；或者乳酸克鲁维酵母(K.lactis))。优选地，宿主细胞以比宿主细胞中相应的内源性所关注的抗体或蛋白(如果存在)高约5倍，更优选高10倍，甚至更优选高20倍的水平表达cDNA。通过免疫测定或FACS筛选特异性结合至GLP-1R或GLP-1R结构域的宿主细胞。可以鉴定过表达所关注的蛋白的细胞。

GLP-1R激动剂组合物

GLP-1R激动剂可以用于制备用于治疗诸如多发性硬化的影响中枢神经系统的自身免疫性疾病的药物。这样，如本文所定义，包含GLP-1R激动剂的组合物可以用来治疗哺乳动物(包括人患者)的疾病。

用于本发明的方法的组合物包含有效量的GLP-1R激动剂。应当理解所述组合物可以包含一种以上GLP-1R激动剂。

GLP-1R激动剂组合物可以进一步包含合适的药学可接受的赋形剂。合适的载体、稀释剂和赋形剂是本领域公知的，并且包括例如糖类、蜡、水溶性和/或可膨胀的聚合物、亲水性或疏水性物质、明胶、油、溶剂、水等。所用的特定载体、稀释剂或赋形剂取决于施用本发明的化合物的方法和目的。一般来说，安全的溶剂是无毒的水性溶剂，例如水，以及其他在水中可溶或混溶的无毒溶剂。合适的水性溶剂包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(例如，PEG400、PEG300)等，以及它们的混合物。制剂还可以包括一种或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、湿润剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、乳浊剂(opaquing agent)、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、加香剂、增香剂以及其他已知的添加剂以提供药物(即，本发明的化合物或其药物组合物)的优雅外观或者辅助制备药物产品(即，药物)。一些制剂可以包括载体，例如脂质体。脂质体制剂包括但不限于细胞转染剂、多层脂质体和单层脂质体(unilamellar vesicle)。用于肠胃外和非肠胃外药物递送的赋形剂和制剂如Remington，The Science and Practice of Pharmacy(2000)所示。

通常，将GLP-1R激动剂组合物配制为通过注射(例如腹腔内、静脉内、皮下、肌肉内等)给药，虽然可以采用其他形式给药。GLP-1R激动剂可以通过将其溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂(例如植物油或其他相似的油、合成脂肪族酸甘油酯、高碳脂肪族酸或丙二醇的酯)中来配制为用于注射的制剂；并且如果期望，具有常规添加剂，例如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。

给药和剂量

本文举例说明的给药方案和治疗剂量是基于这样的因素，如动物体重、GLP-1R激动剂在血液中的半衰期以及GLP-1R激动剂的亲和性。优选的给药方案和剂量维持给药之间体内治疗量的GLP-1R激动剂。本文、Davies etal.，1993和其他参考文献中举例说明毒蜥外泌肽-4和GAC-1的有效剂量范围。

如支持本发明所进行的实验所证实的，早期在病程中用毒蜥外泌肽-4“脉冲治疗”看来足以降低动物的发病率。治疗的效力可以不必持续要求给予GLP-1R激动剂。在其他实施方案中，例如用GAC治疗，每周或更低频率治疗对于治疗的效力可以是足够的。

特定剂量方案(即，剂量、时间和重复)取决于待治疗的人或动物的年龄、疾病状况和体重。初始剂量方案可以从动物实验推断。给予GLP-1R激动剂的时间/频率应当取决于当它们施用时特定GLP-1R激动剂的循环半衰期(或者在神经元组织中的半衰期)、通过血脑屏障的激动剂的量、所述激动剂在细胞中的半衰期、毒性以及副作用。

在本研究中，通过腹腔内(i.p.)注射进行GLP-1R激动剂的给药；然而，预期其他给药途径是有效的(例如，静脉内、皮下、肌肉内)。颅内或脊髓内/鞘内给药(或者给予CNS的其他组织)可能是有效的。其他给药途径可以是合适的，这取决于特定GLP-1R激动剂、其包衣、缀合或特定生物学特性(例如，口服、舌下、滑膜内、粘膜、透皮、关节内、阴道、肛门、尿道内、鼻、耳、通过吸入、吹入、通过导管、作为大丸剂(bolus)、在支架或其他可植入的装置上、在栓塞组合物中、在静脉滴注中、在贴剂或溶解膜上等)。

所述GLP-1R激动剂优选通过合适的外周途径给药。虽然如此，应当理解小百分比的激动剂可以通过血脑屏障并递送至中枢神经系统的细胞。在某些情况下，进入CNS的外周给予的GLP-1R激动剂的量很少(甚至少于1％)。

本发明的特征是将GLP-1R激动剂直接给予患有自身免疫性疾病的哺乳动物受试者。“直接”表示将GLP-1R激动剂多肽或者能够指导表达这类多肽的多核苷酸通过接种的标准途径递送至动物。可以将GLP-1R激动剂联合其他药理剂递送至动物，包括免疫抑制剂，例如糖皮质类固醇、细胞生长抑制剂(例如，烷化剂、抗代谢药、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤和巯嘌呤)、细胞毒性抗体(例如，T细胞受体和IL-2受体特异性抗体)、B细胞消除疗法(例如，抗CD20抗体/RITUXAN

、抗BLyS抗体)、影响T细胞迁移的药物(例如，抗整联蛋白α4/β1抗体/TYSABRI

)、作用于抑免蛋白的药物(例如，环胞素、他克莫司、西罗莫司、雷帕霉素(rapamicin))、干扰素(例如，IFN-β)、格拉默/COPAXONE

、阿片样物质、TNF结合蛋白(例如，循环受体)、麦考酚酸酯(mycophenolate)以及用来抑制动物对外源抗体或治疗性抗原的免疫应答的其他生物学性质。

在治疗患有自身免疫性疾病的包括人在内的哺乳动物受试者中，给予治疗有效量的GLP-1R激动剂或药学可接受的衍生物。例如，GLP-1R激动剂可以作为每天静脉输液约0.1mg/kg体重-约15mg/kg体重给药。因此，一实施方案提供约0.5mg/kg体重的剂量。另一实施方案提供约0.75mg/kg体重的剂量。另一实施方案提供约1.0mg/kg体重的剂量。另一实施方案提供约2.5mg/kg体重的剂量。另一实施方案提供约5mg/kg体重的剂量。另一实施方案提供约10.0mg/kg体重的剂量。另一实施方案提供约15.0mg/kg体重的剂量。GLP-1R激动剂或药学可接受的衍生物的剂量应当以约每天1次至每周2次或者每周1次至每月1次的间隔给予。在一实施方案中，给予剂量以达到约.002mg/ml-30mg/ml的本发明的GLP-1R激动剂或药学可接受的衍生物的血浆峰浓度。这可以通过无菌注射适当制剂中的所给予的成分的溶液来达到(可以使用化学领域技术人员已知的任何合适的制剂溶液)。如通过验证的分析方法测量的血浆水平所确定的，理想的血液水平可以通过本发明的GLP-1R激动剂的持续输液来维持。

将GAC给予个体的一种方法包括将GLP-1R激动剂肽-接头缀合物给予所述个体并允许其在体内与适当的抗体的结合位点形成共价化合物。可以将体内形成的GAC的抗体部分在给予所述GLP-1R激动剂肽-接头缀合物之前、同时或之后给予所述个体。GLP-1R肽可以包括接头/反应部分，或者可以将所述抗体结合位点适当修饰以共价连接至靶物质。可选地或此外，用适当的免疫原免疫之后，抗体可以存在于所述个体的循环中。例如，催化抗体可以通过用缀合至载体蛋白的底物的反应中间体免疫来产生。参见R.A.Lerner and C.F.Barbas 3^rd，1996，Acta Chem.Scand.50：672-678。特别地，醛缩酶催化抗体可以如P.Wirsching et al.，1995，Science 270：1775-1782(在J.Wagner et al.，1995，Science 270：1797-1800上评论)所述通过给予连接至二酮部分的匙孔血蓝蛋白来产生。

GAC相对于天然存在的GLP-1R激动剂的优势是与循环蛋白-配体相比，所述GAC倾向于具有相对长的循环半衰期。例如，虽然天然存在的激动剂可能需要每天给药，但是GAC可能仅需要每周给药。

用GLP-1R激动剂治疗可以联合多发性硬化和相关病症的常规治疗。用于治疗和管理多发性硬化的常规药物包括但不限于：ABC(即，Avonex-Betaseron/Betaferon-Copaxone)治疗(例如，干扰素β1a(Avonex，Rebif

)、干扰素β1b(Betaseron

，Betaferon)和醋酸格拉默(Copaxone

)；化疗剂(例如，米托蒽醌(Novantrone)、硫唑嘌呤(Imuran

)、环磷酰胺(Cytoxan，Neosar

)、环胞素(Sandimmune

)、甲氨蝶呤和克拉屈滨(Leustatin

)；皮质类固醇和促肾上腺皮质激素(Acth)(例如，甲泼尼龙(Depo-Medrol，Solu-Medrol

)、泼尼松(Deltasone

)、泼尼松龙(Delta-Cortef

)、地塞米松(Medrol，Decadron

)、促肾上腺皮质激素(Acth

)和促皮质素(Acthar

)；止痛药(pain mediation)(感觉迟钝)(例如，卡马西平(Tegretol

，Epitol，Atretol

，Carbatrol

)、加巴喷丁(Neurontin

)、托吡酯(Topamax

)、唑尼沙胺(Zonegran

)、苯妥英(Dilantin

)、地昔帕明(Norpramin

)、阿米替林(Elavil

)、丙米嗪(Tofranil

，Imavate

，Janimine

)、多塞平(Sinequan

，Adapin

，Triadapin

，Zonalon

)、普罗替林(Vivactil)、大麻和合成大麻素类(Marinol

)、己酮可可碱(Trental

)、布洛芬(Neurofen

)、阿司匹林、对乙酰氨基酚以及羟嗪(Atarax

)；以及其他治疗(例如，那他珠单抗(Antegren

)、阿仑珠单抗(Campath-1H

)、4-氨基吡啶(Fampridine

)、3，4二氨基吡啶、依利罗地、iv免疫球蛋白(immunoglobin)(Gammagard，Gammar-IV

，Gamimune N

，Iveegam

，Panglobulin

，Sandoglobulin

，Venoglobulin

)。

试剂盒

本发明还提供用于实施本发明的方法的试剂盒。本发明的试剂盒包括一个或多个包含本文所述GLP-1R激动剂的容器以及按照本文所述发明的任何方法使用的说明。通常，这些说明包括怎样给予所述GLP-1R激动剂的描述。所述试剂盒可以进一步包括鉴定需要治疗的动物以及监测或测量治疗的有效性的说明。说明一般包括关于剂量、剂量方案(给药频率)和给药途径的信息。所述试剂盒中提供的说明可以是书面或机器/计算机可读取的，作为数据文件或电子数据表形式。所述容器可以是单位剂量、散包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒所提供的说明通常是标签或包装插页(例如，试剂盒中所包含的纸张)上的书面说明，但是也可以接受机器可读的说明(例如，磁或光存储盘上的说明)。

所述试剂盒还可以包含用于给予GLP-1R激动剂的装置，包括注射器、针、导管、吸入器、泵、酒精棉签(alcohol swap)、纱布、CNS活组织检查装置、组织抗体和染色等。如果需要，所述试剂盒的组分是无菌的。试剂盒还可以提供额外的药剂，包括但不限于免疫抑制剂，例如醋酸格拉默(GA)和地塞米松。试剂盒还可以包括日期邮戳、防篡改包装以及射频识别(RFID)标签或其他库存控制特征。

本发明的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。还考虑与特定装置联合使用的包装，例如吸入器、鼻给药装置(例如，喷雾器)或者诸如微型泵的输液装置。试剂盒可以具有无菌接入端口(例如，所述容器可以是具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。所述容器也可以具有无菌接入端口(例如，所述容器可以是具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性物质是GLP-1R激动剂。所述容器可以进一步包含第二药学活性物质。

试剂盒可以任选提供额外的组分，例如缓冲剂和解释性信息。通常，所述试剂盒包含容器以及在所述容器上或与之相关的标签或包装插页。

实施例

提供以下实施例仅用于说明目的，并且不是为了以任何方式限制本发明的范围。实际上，除本文显示和描述的修改之外的本发明的各种修改从前面的描述对本领域技术人员会变得清楚，并且属于所附权利要求的范围。

实施例1：GLP-1R激动剂的鉴定

可以利用领域认可的方法鉴定GLP-1R激动剂，包括以下方法中的一种或多种。例如，可以使用检测细胞内cAMP浓度增加的测定。这种测定适合例如通过测量cAMP反应元件调控下的报道基因的表达来定性或定量测量cAMP，以及鉴定和表征所选GPCR的潜在激动剂或拮抗剂。可以诱导报道基因表达报道分子的化合物鉴定为GLP-1R激动剂。一种这样的测定采用GLP-1R基因的表达载体和cAMP反应元件调控下的萤光素酶报道基因的表达载体稳定转染的人胚胎肾细胞株以检测其对候选化合物的反应(Thorens，1992，Cell Biology 89：8641-8645；Drucker et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.Vol.84：3434-3438)。

所述测定的第一阶段包括GPCR的构象变化，在本案中为GLP-1R，其中所述受体存在于包含cAMP反应元件调控下的报道基因的真核细胞的细胞膜中。所述受体可以是内源受体或编码所述受体的核酸，或者受体构建体，可以转化入细胞。通常，将第一固相(例如，第一测定板的孔)用基本上同质的这类细胞群体(通常为哺乳动物细胞系)包被，从而所述细胞粘附至所述固相。通常，所述细胞是粘附的，从而自然粘附至所述第一固相。然后将分析物(例如候选激动剂)加入具有所述粘附细胞的孔中，从而所述受体(例如GLP-1R)暴露于(或者接触)所述分析物。这种测定使得能够鉴定所关注的GPCR的激动剂配体(例如GLP-1R)。暴露于所述分析物之后，将所述粘附细胞在合适的条件下温育预定的时间以允许表达报道基因(例如，约6小时)。

然后细胞准备好进行所述测定的检测阶段。例如，通过检测萤光素酶活性来测量报道基因的表达。萤光素酶活性的检测可以通过本领域已知的各种合适的方法中的任一种进行。

初步鉴定之后，候选物(例如，抗GLP-1R单克隆抗体)的激动剂活性可以通过测定细胞内cAMP的浓度来进一步证实和完善。通常，将第一固相(例如，第一测定板的孔)用基本上同质的这类细胞群体(通常为哺乳动物细胞系，例如，HEK 293细胞)包被，从而所述细胞粘附至所述固相。将候选物接种入含有所述细胞的测定板，并且在合适的条件下温育例如约1小时。细胞内cAMP的浓度可以通过本领域已知的各种合适的方法中的任一种检测。例如，细胞内cAMP的浓度可以根据cAMP-Screen Direct

系统试剂盒(Applied Biosystems)的说明书来检测。其他cAMP测定试剂盒可商购，例如HitHunter^TM cAMP XS+Assay(DiscoveRX)，基于体外的竞争性免疫测定。简单地说，来自细胞裂解物的游离cAMP与标记的ED-cAMP缀合物β-半乳糖苷酶(β-gal)的小肽片段竞争抗体结合。在游离cAMP不存在的情况下，ED-cAMP缀合物被抗体捕获并且对于互补不可用，导致低信号。在游离cAMP存在的情况下，抗体位点被占据，留下ED-cAMP缀合物游离以与EA互补，形成底物水解的活性β-gal EFC酶以产生化学发光信号。阳性信号的产生与抗体结合的游离cAMP的量成正比。

候选物(例如，抗GLP-1R单克隆抗体)的激动剂活性可以通过已知检测靶生物学活性的生物测定来进一步证实和完善。例如，候选物对抗(agonize)GLP-1R的能力可以在测定胰岛素分泌的测定中检测。候选物刺激胰岛素分泌的能力可以通过向培养的动物细胞(例如RIN-38大鼠胰岛素瘤细胞系)提供候选物并监测免疫反应胰岛素(IRI)释放入培养基来测定。或者，可以将候选物注射入动物并监测免疫反应胰岛素(IRI)的血浆水平。

IRI的存在可以通过使用可以特异性检测胰岛素的放射免疫测定来检测。可以采用能够检测IRI的存在的任何放射免疫测定；一种这样的测定是Albano，J.D.M.，et al.，1972，Acta Endocrinol.，70：487-509的方法的改进。在这种改进中，采用pH 7.4的磷酸盐/白蛋白缓冲液。连续添加500μl磷酸盐缓冲液、50μl灌注液样品或灌注液中的大鼠胰岛素标准品、100μl抗胰岛素抗血清(Wellcome Laboratories；1∶40,000稀释)以及100μl ¹²⁵I胰岛素，给出10x75mm一次性玻璃管中的750μl的总体积，来准备温育。在4℃下温育2-3天后，通过活性炭分离来从抗体结合的胰岛素分离游离的胰岛素。该测定的灵敏度为1-2uU/mL。为了测量组织培养中生长的细胞的IRI释放入细胞培养基，优选将放射性标记掺入胰岛素原。虽然可以使用能够标记多肽的任何放射性标记，但是优选使用³H亮氨酸以获得标记的胰岛素原。

为了确定候选GLP-1R激动剂是否具有促胰岛素特性，还可以通过胰输液来测定。原位分离的灌注大鼠胰测定是Penhos，J.C.，et al.，1969，Diabetes，18：733-738的方法的改进。将重350-600g的禁食雄性CharlesRiver品系白化大鼠用腹腔内注射阿米妥钠(Eli Lilly and Co.：160ng/kg)麻醉。将肾、肾上腺、胃和下结肠血管结扎。将整个肠切除，除了约4cm的十二指肠以及降结肠和直肠。因此，仅将小部分肠灌注，最小化具有胰高血糖素样免疫反应性的肠道物质的可能干扰。灌注液为具有4％葡聚糖T70和0.2％牛血清白蛋白(级分V)的改良的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液，并且用95％O₂和5％CO₂通气。使用非搏动性流、4通道滚子轴承泵(Buchlerpolystatic，Buchler Instruments Division，Nuclear-Chicago Corp.)，并且通过切换3通来完成从一个灌注液来源转换至另一个。进行、监测和分析灌注的方式按照Weir，G.C.，et al.，1974，J.Olin.Inestigat.54：1403-1412的方法，其援引加入本文。

实施例2：大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润患有自身免疫性疾病的小鼠的CNS

本实施例说明炎性细胞浸润CNS。

通过在实验第0天s.c.注射200μg乳化于CFA(Difco)中并补充了4mg/ml结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(Difco)的致脑炎肽MOG(35-55)，然后立即和48小时后再次i.v.注射400ng百日咳毒素来在雌性C57BL/6小鼠中诱导EAE。MOG免疫后18天将动物(EAE和幼稚)处死。将脊髓收获，用4％多聚甲醛固定，并且在20μM冷冻切片。用抗CD3(Chemicon)和CD68(Serotec)的一抗进行免疫组织化学。缀合至Alexa 488的山羊抗大鼠二抗(Invitrogen)用于检测。甲酚紫和罗克沙尔固蓝染色用来染色浸润细胞体和髓鞘。

图1中的染色结果显示与健康小鼠(下图)相比，EAE小鼠的CNS(上图)具有大量浸润T细胞、单核细胞和小胶质细胞。

实施例3：直接给予GLP-1R激动剂降低自身免疫性疾病的发病率

在所进行的支持本发明的实验中，证实直接给予GLP-1R激动剂减少患有CNS特异性自身免疫性疾病的动物中的发病率和CNS组织损伤(图2)。通过在实验第0天s.c.注射200μg乳化于CFA(Difco)中并补充了4mg/ml结核分枝杆菌(Difco)的致脑炎肽MOG(35-55)，然后立即和48小时后再次i.v.注射400ng百日咳毒素来在雌性C57BL/6小鼠中诱导EAE。

MOG免疫后第0天至第9天，将小鼠每天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4(n＝10)、2mg/kg NT4(阳性对照，n＝10)或媒介物(PBS，阴性对照，n＝10)处理。将动物评分发病率如下：0＝正常；1＝跛行尾；2＝中度后肢无力；3＝中重度后肢无力(动物仍然可以艰难行走)；4＝严重后肢无力(动物可以移动其后肢但不可以行走)；5＝完全后肢瘫痪；以及6＝死亡。用毒蜥外泌肽-4处理的动物表现出与对照动物相比显著降低的发病率(图2)。这个结果证实GLP-1R激动剂有效减缓慢性EAE的发展。

实施例4：GLP-1R激动剂化合物有效降低自身免疫性疾病的发病率

动物实验显示GLP-1R激动剂抗体缀合化合物GAC-1提供与对照免疫球蛋白相比显著的针对EAE发病率的保护(图3和4)。

通过在实验第0天s.c.注射200μg乳化于CFA(Difco)中并补充了4mg/ml结核分枝杆菌(Difco)的致脑炎肽MOG(35-55)，然后立即和48小时后再次i.v.注射400ng百日咳毒素来在雌性C57BL/6小鼠中诱导EAE。MOG免疫后第0天至第6天，将小鼠每天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4(n＝10)或媒介物(n＝10)处理。将另一组小鼠在每周的基础上用1mg/kg GAC-1(n＝10)处理。根据以下级别每天评价小鼠的EAE临床表现：0＝正常；1＝跛行尾；2＝中度后肢无力；3＝中重度后肢无力(动物仍然可以行走)；4＝严重后肢无力(动物可以移动其后肢但不可以行走)；5＝完全后肢麻痹；6＝死亡。当MOG免疫之后每周给予时，GAC-1有效降低发病率(图3)。

在另一实验中，如上文所述诱导EAE。将第一组动物在MOG免疫后第0天至第2天用3mg/kg毒蜥外泌肽-4处理(n＝10)，并且在第3天至第8天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4处理。将第二组动物在MOG免疫后第0天用3mg/kg GAC-1处理，然后从免疫后第7天开始每周用1mg/kg GAC-1处理。将第三组动物每天用PBS处理(对照，n＝10)。按照上文所述的标准每天监测临床评分。当以3mg/kg的初始剂量然后1mg/kg的每周剂量给予时，GAC-1看来甚至更有效降低发病率(图4)。该结果证实3mg/kg GAC-1的初始剂量提供比单独1mg/kg的剂量更多的针对发病率的保护(即，更低发病率)。

实施例5：GLP-1R激动剂阻断CNS的炎性细胞侵入并减少自身免疫性疾病中的脱髓鞘

进行组织学分析以更好地理解GLP-1R激动剂介导动物中的保护的机制。脊髓切片制备自对照、毒蜥外泌肽-4处理和GAC-1处理的EAE诱导动物，然后将其用罗克沙尔固蓝染色以染色髓鞘，或者用白细胞标记特异性抗体染色以鉴定侵入细胞。在对照动物中，染色显示在髓鞘表达神经元细胞的背景下的白细胞侵入和细胞破坏的区域(图5A、6A和6D)。在制备自用GLP-1R激动剂处理的动物的切片中观察到减少的白细胞侵入(图6B、6C、6E和6F)。一些GLP-1R激动剂处理的动物实际上没有显示CNS白细胞侵入的证据。

将脊髓切片用罗克沙尔固蓝染色以测量脱髓鞘(图5A-C)。通过在实验第0天s.c.注射200μg乳化于CFA(Difco)中并补充了4mg/ml结核分枝杆菌(Difco)的致脑炎肽MOG(35-55)，然后立即和48小时后再次i.v.注射400ng百日咳毒素来在雌性C57BL/6小鼠中诱导EAE。将动物每天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4或PBS对照处理，或者每周用1mg/kg GAC-1处理。免疫后18天将动物处死。将脊髓收获，用4％多聚甲醛固定，并且在20μM冷冻切片。利用罗克沙尔固蓝进行髓鞘染色。

图5A-C示出来自PBS处理的对照EAE动物(图5A)、毒蜥外泌肽-4处理的EAE动物(图5B)和GAC-1处理的EAE动物(图5C)的脊髓的代表性图像。对照小鼠的脑显示严重脱髓鞘的区域(即，如图5A中的黑色箭头所示，没有罗克沙尔固蓝染色)。在来自GLP-1R激动剂处理的动物的切片中未观察到严重脱髓鞘和/或神经元死亡的区域(图5B和C)。CNS组织切片的组织化学染色的结果证实GLP-1R激动剂处理减少CNS的脱髓鞘。

利用两个白细胞标记，存在于T细胞上的CD3和存在于巨噬细胞上的CD68的特异性抗体进行侵入细胞的鉴定。如上文所述在雌性C57BL/6小鼠中诱导EAE。将动物每天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4或PBS对照处理，或者每周用1mg/kg GAC-1处理。MOG免疫后12天将动物处死。将脊髓收获，用4％多聚甲醛固定，并且在20μM冷冻切片。用抗CD3(Chemicon)或CD68(Serotech)的一抗进行免疫组织化学。缀合至Alexa 488的山羊抗大鼠二抗(Invitrogen)用于检测。图6A-C显示用CD3抗体染色的结果。在对照动物的脊髓中许多明亮染色的圈点区域显而易见，对应脱髓鞘的区域(图6A)。相比之下，获得自毒蜥外泌肽-4或GAC-1处理的小鼠的脊髓切片实际上显示无CD3染色(分别为图6B和6C)，表明T细胞侵入在GLP-1R激动剂处理的动物中明显减少。这类观察表明当与对照动物相比时，来自GLP-1R激动剂处理的动物的脊髓组织表现出明显减少的T细胞侵入。

图6D-F显示用CD68抗体染色的结果。制备自对照小鼠的切片(图6D)比来自毒蜥外泌肽-4或GAC-1处理的小鼠的切片(分别为图6E和6F)染色更强。这类观察表明当与对照动物相比时，来自GLP-1R激动剂处理的动物的脊髓组织表现出明显减少的单核细胞侵入。总而言之，CNS组织切片的免疫组织化学染色的结果证实GLP-1R激动剂处理减少CNS的淋巴细胞和单核细胞侵入。

实施例6：GLP-1R激动剂减少脑和脊髓中小胶质细胞和浸润巨噬细胞中的活化标记

本实施例说明在疾病发生(MOG诱导后第15天)和疾病高峰期(MOG诱导后第28天)脑和脊髓中的小胶质细胞和浸润巨噬细胞中GLP-1R激动剂介导的活化标记MHC-II表达的减少。

为了评价毒蜥外泌肽-4对CNS中的抗原呈递细胞(APC)的影响，在第0天向小鼠给予MOG。第0天至第9天MOG诱导的动物每天接受毒蜥外泌肽-4(1mg/kg)或媒介物对照(每个处理组n＝9)。在第15天(疾病发生)和第28天(疾病高峰期)将3只毒蜥外泌肽-4处理的EAE小鼠和3只媒介物处理的EAE对照小鼠处死。从处死的动物分离小胶质细胞。简单地说，将小鼠用异氟烷麻醉，并且用冷的无菌PBS通过左心室灌注直至流出物变澄清。将脊髓和脑收集于冷汉克斯(Hank)缓冲盐溶液(HBSS)中。迫使脊髓和脑与HBSS通过尼龙细胞滤过器(100um)。将收集的滤过物质通过离心沉淀。将沉淀重悬于1ml HBSS每脊髓或脑中，具有300U/ml每脊髓的IV型梭菌胶原酶。在37℃培养箱中温育60min后，将脊髓或脑匀浆放置于30％Percoll中并位于70％Percoll之上。将梯度离心，并且从30％/70％Percoll界面收集单核的细胞。将来自界面的细胞在cDMEM中以350g洗涤两次5分钟以去除残余的Percoll。

用纯化的α-FcγR(2.4G2)封闭后，将单细胞悬浮液染色用于多色流式细胞术。MHC II类(10-3.6)、B220(CD45R)、CD45和CD11b特异性单克隆抗体购自BD Biosciences。为了排除死细胞，通过流式细胞术分析之前将样品与Hoescht 33342(HO，Calbiochem)在冰上温育5min。染色后立即分析细胞悬浮液以避免成熟和/或固定假象。分析期间排除死细胞(HO^hi)和B220^hi细胞。对于小胶质细胞和CNS-巨噬细胞分析，将样品用LSRII分析并且用flowjo软件(FlowJo，Ashland，Oregon)分析。

基于CD45和CD11b的表达将小胶质细胞亚群分为不同亚群。进一步分析两种不同细胞群体亚群CD11b+CD45^hi(活化的小胶质细胞和浸润巨噬细胞)和CD11b+CD45^lo(静息小胶质细胞)的小胶质细胞/单核细胞活化标记MHC II类的表达谱。

流式细胞术分析的结果显示用毒蜥外泌肽-4处理降低在症状发生(即，诱导后15天)和疾病高峰期(即，诱导后28天)脑和脊髓中CD11b+CD45^hi和CD11b+CD45^lo细胞群体上MHC II类的表达水平(图7)。图7所示图的每个显示在所示荧光强度染色的所有细胞的百分比。荧光强度代表细胞表面上的MHC II类表达量(MHC II类表达与荧光强度正相关)。

该分析的结果证实，与来自媒介物处理的对照EAE动物的细胞相比，GLP-1R激动剂处理在疾病发生和高峰期抑制脑和脊髓小胶质细胞和浸润巨噬细胞上APC活化标记MHC II类的表达。

实施例7：来自毒蜥外泌肽-4处理的小鼠的脾细胞在EAE的过继转移模型中致病性较低

本实施例说明来自毒蜥外泌肽-4处理的EAE小鼠的脾细胞在过继转移模型中降低的致病性。

通过在实验第0天注射500μg乳化于CFA(Difco)中并补充了4mg/ml的结核分枝杆菌(Difco)的PLPp(139-151)来在8-12周龄的SJL/J雌性小鼠(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)中诱导EAE。将免疫的动物每天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4(n＝7)或PBS(n＝7)处理。将处理的动物在免疫后第5天处死，并且收集脾和引流淋巴结。将细胞在体外用20μg/ml PLPp(139-151)培养。48小时后，收集培养的细胞并通过尾静脉注射将其注射入幼稚SJL/J动物。将2×10⁷个细胞注射入每只动物。动物接受来自毒蜥外泌肽-4处理的供体(n＝7)或对照PBS处理的供体(n＝7)的细胞。

每天监测受体小鼠的临床评分和体重变化。根据以下级别评价EAE的临床表现：0＝正常；1＝跛行尾；2＝中度后肢无力；3＝中重度后肢无力(动物仍然可以行走)；4＝严重后肢无力(动物可以移动其后肢但不可以行走)；5＝完全后肢瘫痪；6＝死亡。如图8所示，接受来自毒蜥外泌肽-4处理的动物的供体细胞的小鼠与接受来自PBS处理的对照动物的供体细胞的小鼠相比患有明显不太严重的疾病。这个结果证实GLP-1R激动剂处理降低EAE的过继转移模型中脾细胞的致病性。

实施例8：毒蜥外泌肽-4减小EAE诱导小鼠中次级淋巴器官的大小

本实施例说明毒蜥外泌肽-4对EAE小鼠中次级淋巴器官的大小的影响。

通过在实验第0天s.c.注射200μg乳化于CFA(Difco)中并补充了4mg/ml结核分枝杆菌(Difco)的致脑炎肽MOG(35-55)，然后立即和48小时后再次i.v.注射400ng百日咳毒素来在雌性C57BL/6小鼠中诱导EAE。将MOG诱导动物每天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4(n＝7)、PBS(n＝7)或4mg/kg地塞米松(n＝3)对照处理。还包括一组幼稚动物(n＝3)。在疾病诱导后第5天，将动物安乐死。将脾和腹股沟淋巴结解剖并称重。在用PBS处理的EAE动物中淋巴结重量以及脾重量和大小显著增加(图9A-9C)。然而，毒蜥外泌肽-4处理的EAE动物的淋巴结(图9A)和脾(图9B)显著轻于对照动物的淋巴结和脾。相似地，免疫抑制剂地塞米松也减少EAE动物中淋巴结和脾重量。毒蜥外泌肽-4处理的EAE动物的脾的大小与幼稚动物的脾相当(图9C)。相比之下，对照EAE动物的脾显著增大(图9C)。这些结果证实GLP-1R激动剂处理有效减小EAE中次级淋巴器官的大小。

实施例9：自身免疫性疾病中毒蜥外泌肽-4治疗后的免疫变化

本实施例说明毒蜥外泌肽-4处理后EAE小鼠中的免疫变化。

目前用于治疗MS的药物(包括皮质类固醇和CD20抗体RITUXAN^TM)为免疫调节剂，其表现出免疫抑制、T细胞消除、B细胞消除和/或关于免疫应答的其他效应。为了确定GLP-1R激动剂是否影响EAE中的T细胞和B-细胞群体，毒蜥外泌肽-4处理后评价EAE动物中的免疫变化。为了比较，用PBS处理动物作为阴性对照。

通过在实验第0天s.c.注射200μg乳化于CFA(Difco)中并补充了4mg/ml结核分枝杆菌(Difco)的致脑炎肽MOG(35-55)，然后立即和48小时后再次i.v.注射400ng百日咳毒素来在雌性C57BL/6小鼠中诱导EAE。免疫后第0天至第6天，将动物每天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4(n＝3)或PBS(n＝3)处理。免疫后第6天将处理的动物与未免疫的幼稚小鼠(n＝3)一起处死。收集脾、淋巴结和外周血。细胞离散并裂解红细胞之后，将细胞用荧光团缀合的CD4、CD8、CD19(B细胞标记)和Ter119抗体(BD Biosciences)染色。在FACSAria^TM细胞分选仪(BD Biosciences)上利用荧光激活细胞分选术(FACS)分析细胞。

脾、淋巴结和血液中的淋巴细胞水平看来在毒蜥外泌肽-4处理的EAE动物中与PBS处理的EAE动物相比没有变化(图10A-C)。脾中的单核细胞水平在毒蜥外泌肽-4处理的EAE动物的脾中略微降低(图10D)，但是在淋巴结或血液中没有显著变化(图10E和10F)。毒蜥外泌肽-4处理没有显著改变CD4+或CD8+细胞群体(图11A-F)。毒蜥外泌肽-4处理所导致的CD19+群体标记的变化刚刚达到统计显著性(图12A-C)。这些观察表明直接杀死CD4+、CD8+和CD19+细胞的免疫抑制剂(例如皮质类固醇和RITUXAN^TM)与GLP-1R激动剂的作用机制不同。

关于毒蜥外泌肽-4处理EAE动物，观察到脾中Ter119+细胞群体大幅降低回幼稚水平(图12D)。Ter119+细胞在淋巴结中不存在(图12E)，并且在血液中没有显著变化(图12F)。这个结果证实毒蜥外泌肽-4处理高效减少EAE小鼠脾中的Ter119+细胞群体。

在另一实验中，如上文所述在雌性小鼠中诱导EAE。将动物每天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4(n＝7)、PBS(n＝7)或4mg/kg地塞米松(n＝3)对照处理。该实验中还包括一组幼稚动物(n＝3)。在疾病诱导后第5天，将动物安乐死。将脾和腹股沟淋巴结解剖，并且将细胞分离，表面染色类红细胞系标记Ter119以及CD4并通过FACS分析。测定Ter119+细胞的百分比(图13)。虽然患病的动物具有与幼稚动物相比更高的Ter119+细胞百分比，但是毒蜥外泌肽-4处理的EAE动物具有与PBS处理的EAE动物相比降低的Ter119+细胞百分比。用免疫抑制剂地塞米松处理也导致EAE动物中Ter119+细胞的20～25％减少，但是不及毒蜥外泌肽-4处理(50～55％)。这个结果证实用毒蜥外泌肽-4处理有效减少MOG免疫动物的脾中Ter119+细胞的百分比。

实施例10：GLP-1R激动剂处理减少自身免疫性疾病中的T细胞活化

本实施例说明毒蜥外泌肽-4处理EAE小鼠后T细胞活化水平的变化。

如上文所述在雌性C57BL/6小鼠中用MOG(35-55)诱导EAE。将免疫的动物每天用PBS媒介物(n＝7)、1mg/kg毒蜥外泌肽-4(n＝7)或4mg/kg地塞米松(n＝3)处理。免疫后第5天将动物与未免疫的幼稚组的3只小鼠一起处死。收集淋巴结。细胞离散并裂解红细胞之后，将细胞用荧光团缀合的CD4和CD44抗体(BDbiosciences)染色。利用FACSaria^TM细胞分选仪(BDBiosciences)分析细胞。对于分析，FACS图像门控在CD4+细胞上。具有高水平的CD44(CD44^hi)并且CD4阳性染色的细胞鉴定为活化的CD4细胞。分析每个处理组CD4+CD44^hi细胞的百分比。

如图14所示，在幼稚动物中约35％的CD4细胞活化(CD4+CD44^hi)。约60％来自EAE动物的CD4细胞活化(图14)。用毒蜥外泌肽-4和地塞米松处理均将活化的T细胞的百分比降回幼稚水平(图14)。通过单向ANOVA然后用于成对比较的Dunnett后检验来分析数据。两个星号(**)表示对于PBS处理的EAE组与毒蜥外泌肽-4处理的EAE组之间的成对比较，P值小于0.01。

这个结果证实用毒蜥外泌肽-4处理有效抑制EAE诱导后的T细胞活化。

实施例11：GLP-1R激动剂处理抑制自身免疫性疾病中CD4 T细胞增殖

本实施例说明毒蜥外泌肽-4处理EAE小鼠后T细胞增殖的变化。

如上文所述在雌性C57BL/6小鼠中用MOG(35-55)诱导EAE。将免疫的动物每天用PBS媒介物(n＝7)、1mg/kg毒蜥外泌肽-4(n＝7)或4mg/kg地塞米松(n＝3)处理。免疫后第5天将动物与未免疫的幼稚组的3只小鼠一起处死。收集淋巴结细胞，用MOG刺激培养48小时，然后用BrdU处理以鉴定增殖细胞。添加BrdU后18小时，收获细胞。为了测量细胞增殖，与Pacific Blue缀合的CD4抗体一起使用BrdU染色试剂盒(BD Biosciences)。利用FACSaria^TM细胞分选仪(BD Biosciences)分析细胞。CD4+/BrdU+细胞鉴定为增殖CD4 T细胞。

如图15所示，来自幼稚动物的CD4细胞应答MOG刺激几乎不增殖；仅约3％来自幼稚动物的CD4 T细胞为BrdU阳性。相比之下，来自EAE动物的细胞应答MOG刺激增殖至远大于来自幼稚动物的细胞的程度(图15)。用毒蜥外泌肽-4和地塞米松处理显著抑制CD4细胞增殖(图15)。通过单向ANOVA然后用于成对比较的Dunnett后检验来分析数据。三个星号(***)表示对于PBS处理的EAE组与毒蜥外泌肽-4处理的EAE组之间的成对比较，P值小于0.001。

这个结果证实用毒蜥外泌肽-4处理有效减少EAE诱导后的CD4+细胞的增殖。

实施例12：GLP-1R激动剂处理改变自身免疫性疾病中的脾细胞细胞因子水平

本实施例说明毒蜥外泌肽-4处理EAE小鼠后脾细胞细胞因子水平的变化。

为了确定GLP-1R激动剂是否影响EAE中的细胞因子水平，毒蜥外泌肽-4处理后评价EAE动物中脾细胞细胞因子水平的变化。通过在实验第0天s.c.注射200μg乳化于CFA(Difco)中并补充了4mg/ml结核分枝杆菌(Difco)的致脑炎肽MOG(35-55)，然后立即和48小时后再次i.v.注射400ng百日咳毒素来在雌性C57BL/6小鼠中诱导EAE。将诱导的动物每天用对照媒介物(PBS)或毒蜥外泌肽-4(1mg/kg/天)处理。在EAE诱导后第7天，脾细胞(表2第一列中的“SPL”)和淋巴结(表2第一列中的“LN”)细胞分离自处理的细胞，并且还分离自幼稚动物(n＝7)。将细胞在含有20μg/ml MOG的刺激培养基中培养48小时。利用Procarta

细胞因子测定试剂盒(Panomics

)测量培养基中的细胞因子水平。所用的试剂盒包括用于测量32种不同细胞因子和趋化因子的珠缀合的抗体。

表现出PBS处理组(对照，表2的第三列)与毒蜥外泌肽-4处理组(表2的第四列)之间水平显著变化的细胞因子如表2所列。通过单向ANOVA然后用于成对比较的Dunnett后检验来分析数据。对于PBS处理的EAE组与毒蜥外泌肽-4处理的EAE组之间的成对比较，一个星号(*)表示P值小于0.05，而两个星号(**)表示P值小于0.01。

表2

该结果表明毒蜥外泌肽-4处理降低诸如IL-17、IFN-γ、TNF-α的炎性细胞因子的水平，导致减弱的疾病发展。表2中的数据与来自毒蜥外泌肽-4处理的EAE动物的细胞中细胞因子表达的FACS分析一致(参见，例如，实施例13)。

实施例13：毒蜥外泌肽-4处理减少EAE诱导后淋巴结中的IL-17+和IFN-γ细胞

本实施例说明毒蜥外泌肽-4处理EAE小鼠后IL-17+and IFN-γ细胞群体的变化。

为了确定GLP-1R激动剂是否影响EAE中的Th17和Th1细胞群体，毒蜥外泌肽-4处理后评价EAE动物中IL-17+和IFN-γ细胞群体的变化。IL-17存在于Th17细胞上，而IFN-γ存在于Th1细胞上。为了比较，将动物用PBS处理作为阴性对照，并且用地塞米松处理作为阳性对照。通过在实验第0天s.c.注射200μg乳化于CFA(Difco)中并补充了4mg/ml结核分枝杆菌(Difco)的致脑炎肽MOG(35-55)，然后立即和48小时后再次i.v.注射400ng百日咳毒素来在雌性C57BL/6小鼠中诱导EAE。将动物每天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4(n＝7)、PBS(n＝7)或4mg/kg地塞米松(n＝3)对照处理。还包括一组幼稚动物(n＝3)。在疾病诱导后第5天或第7天，将动物安乐死。将腹股沟淋巴结解剖，将细胞分离并通过FACS分析。将细胞表面染色CD4，并且细胞内染色IL-17和IFN-γ。通过FACS分析CD4和IL-17或者CD4和IFN-γ双阳性的细胞。

虽然患病的动物具有与幼稚动物相比更高的IL-17+细胞百分比，但是MOG免疫后5天和7天，毒蜥外泌肽-4处理的EAE动物均具有与PBS处理的EAE动物相比降低的IL-17+细胞百分比(图16)。用免疫抑制剂地塞米松处理也导致EAE动物中IL-17+细胞的50％减少，但是不及毒蜥外泌肽-4处理(80-90％)。这个结果证实用毒蜥外泌肽-4处理有效减少淋巴结中Ter119+细胞的百分比。

关于毒蜥外泌肽-4处理EAE动物，观察到淋巴结中IFN-γ+细胞群体大量减少(图17)。如预期的，免疫抑制剂地塞米松也导致EAE动物中IFN-γ+细胞的减少。这个结果证实毒蜥外泌肽-4处理有效减少EAE小鼠淋巴结中的IFN-γ+细胞群体。这些结果支持GLP-1R激动剂在减少MOG免疫动物中的Th17和Th1细胞中的作用。

天然存在的GLP-1R激动剂和GLP-1R激动剂CovX体均有效减缓EAE发展。天然存在的激动剂毒蜥外泌肽-4和GAC-1均有效减缓疾病发展。当在EAE症状发生之前给予时，毒蜥外泌肽-4是有效的。当在每周的基础上于EAE症状发生之前和之后给予时，GAC-1是有效的。增加的GLP-1R激动剂的初始剂量与降低的发病率相关，这显示剂量依赖性。组织化学实验显示GLP-1R激动剂减少T-细胞和单核细胞侵入CNS组织。髓鞘染色显示对GLP-1R激动剂处理的动物中的神经细胞的损伤减少。GLP-1R激动剂处理在EAE发生和高峰期均抑制脑和脊髓小胶质细胞和浸润巨噬细胞上APC活化标记MHC II类的表达。

将毒蜥外泌肽-4用于进一步研究GLP-1R激动剂影响EAE发展的机制。直接杀死CD4+、CD8+和CD19+细胞的免疫抑制剂(例如皮质类固醇和RITUXAN^TM)与GLP-1R激动剂的作用机制看来不同。这在GLP-1R激动剂并不显著改变EAE诱导动物中的CD4+或CD8+细胞群体的观察中证实。然而，GLP-1R激动剂的确减少MOG免疫动物淋巴结中的IL-17+和IFN-γ+细胞群体。这些结果证实GLP-1R激动剂处理减少淋巴结中的Th17和Th1群体。

实施例14：二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂有效降低自身免疫性疾病的发病率

本实施例说明通过用DPP-4抑制剂处理而上升的GLP-1水平可以减弱EAE发展。动物实验显示DPP-4抑制剂西格列汀提供与甲基纤维素阴性对照相比显著的针对EAE发病率的保护(图18)。

GLP-1在体内被二肽基肽酶-4(DPP-4)降解。DPP-4抑制剂包括，例如但不限于西格列汀、维格列汀、沙格列汀、利拉利汀、dutogliptin、gemigliptin、阿格列汀和小檗碱。为了检测DPP-4抑制剂西格列汀是否可以防止葡萄糖水平提高和上升的GLP-1水平，将4组12月龄的雄性C57Bl/6小鼠(n＝4-5)禁食过夜并且在第二天早上使其进行口服葡萄糖耐量测试。口服葡萄糖负荷之前1小时，向测试动物口服剂量给药1mg/kg或10mg/kg西格列汀。向阴性对照组的动物剂量给药甲基纤维素，并且向阳性对照组剂量给药毒蜥外泌肽-4(1mg/kg IP)。口服葡萄糖负荷之后，在20、40、60和120分钟测试葡萄糖水平。在葡萄糖负荷后20分钟还采集血样以检测葡萄糖和GLP-1水平。毒蜥外泌肽-4处理几乎完全阻断葡萄糖升高。用任一浓度的西格列汀处理表现出与甲基纤维素对照相比倾向于较低葡萄糖水平的趋势，虽然通过双向ANOVA均未达到统计显著。口服葡萄糖负荷后20分钟，与甲基纤维素对照相比，任一剂量的西格列汀显著提高血液GLP-1水平。

为了检测DPP-4抑制剂在自身免疫性疾病中的效应，通过在实验第0天s.c.注射200μg乳化于CFA(Difco)中并补充了4mg/ml结核分枝杆菌(Difco)的致脑炎肽MOG(35-55)，然后立即和48小时后再次i.v.注射400ng百日咳毒素来在雌性C57BL/6小鼠(8周龄)中诱导EAE。免疫后第0天至第28天向小鼠每天一次剂量给药1mg/kg毒蜥外泌肽-4、10mg/kg西格列汀、1mg/kg西格列汀或甲基纤维素(阴性对照)。在免疫后第5天，采集血样用于测量GLP1水平。与甲基纤维素处理的动物相比，用10mg/kg西格列汀处理的动物具有明显更高的GLP-1水平。为了监测疾病发展，将动物每天评分发病率如下：0＝正常；1＝跛行尾；2＝中度后肢无力；3＝中重度后肢无力(动物仍然可以艰难行走)；4＝严重后肢无力(动物可以移动其后肢但不可以行走)；5＝完全后肢瘫痪；以及6＝死亡。用毒蜥外泌肽-4或西格列汀处理的动物表现出与对照动物相比显著降低的发病率(图18)。如图18中的图所示，用毒蜥外泌肽-4处理至第25天大大减弱EAE发展，并且用1mg/kg或10mg/kg西格列汀处理表现出倾向于减弱疾病症状的趋势。第18天至第20天10mg/kg西格列汀处理组中的疾病评分与甲基纤维素处理的动物相比显著较低(图18)。这个结果证实毒蜥外泌肽-4和西格列汀均有效减缓慢性EAE的发展。

实施例15：外周免疫细胞不是毒蜥外泌肽-4的靶标

本实施例说明外周免疫细胞不是毒蜥外泌肽-4的靶标。

将GLP-1R激动剂-抗体缀合物GAC-2(上文所述)用作染色试剂以检测毒蜥外泌肽-4/GLP-1受体的表达。将GAC-2用荧光团Alexa488标记。在这个实施例中，将GLP-1R表达CHO细胞用作阳性对照。将GLP-1R表达CHO细胞或幼稚CHO细胞用1％FBS封闭，然后用GAC-2-Alexa488染色并通过荧光激活细胞分选术(FACS)分析。虽然幼稚CHO细胞中的所有细胞是GAC-2染色阴性的，但是34％GLP-1R表达CHO细胞是GAC-2阳性的，表明GAC-2-Alexa488可以识别活细胞上的GLP-1R表达。

检测来自幼稚动物和EAE动物的脾、淋巴结和血液的白细胞的GLP-1R或其他可能的毒蜥外泌肽-4受体的表达。利用GAC-2分析淋巴细胞和单核细胞巨噬细胞区室的毒蜥外泌肽-4/GLP-1受体表达。在任何区室中均未检测到阳性信号，表明毒蜥外泌肽-4/GLP-1受体不在外周淋巴器官中表达，或者它们的表达非常低并且低于检测阈值。

为了检测毒蜥外泌肽-4是否直接作用于外周免疫细胞，将淋巴样细胞在体外于毒蜥外泌肽-4(10μg/ml)或媒介物(阴性对照)存在的情况下用MOG处理。PBS代替MOG用作活化的阴性对照。通过分析CD44表达(T-细胞活化)和MHCII表达(APC活化)来测量MOG处理的淋巴样细胞的活化。当MOG处理的细胞接受毒蜥外泌肽-4时，未观察到活化抑制。这些结果显示外周免疫细胞不是毒蜥外泌肽-4的靶标。

实施例16：毒蜥外泌肽-4处理降低患有正在进行的EAE的小鼠中的发病率

本实施例说明毒蜥外泌肽-4治疗小鼠中正在进行的EAE的效力。

在所进行的支持本发明的实验中，证实直接给予GLP-1R激动剂降低患有正在进行的EAE的小鼠中的发病率(图19)。通过用200μg溶解于含有4mg/ml热灭活的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra(DifcoLaboratories)的完全弗氏佐剂(CFA)中的PLP(p139-151)免疫来在SJL/J小鼠(8-12周龄，the Jackson Laboratory)中诱导EAE(参见，Youssef et al.，Nature(2002)420：78-84)。每天检测免疫的小鼠的体重测量和EAE的临床表现并评分。在SJL/J小鼠中建立急性EAE后，基于临床评分和体重将小鼠随机分为两组(n＝28)。

在开始复发时开始毒蜥外泌肽-4处理(免疫后第29天)。每天一次给予(i.p.)毒蜥外泌肽-4(1mg/kg)或媒介物(PBS；用于对照)。随机化后第29天至第63天每天处理小鼠。将动物评分发病率如下：0，无瘫痪；1，损失尾音；2，后肢无力；3，后肢瘫痪；4，后肢和前肢瘫痪；5，濒死或死亡。用毒蜥外泌肽-4处理的动物表现出与对照动物相比显著降低的发病率(图19)。这个结果证实GLP-1R激动剂有效降低患有正在进行的EAE的小鼠中的发病率。

实施例17：体内毒蜥外泌肽-4处理细胞阻断抗原特异性CD4+T细胞增殖

本实施例说明在体内用毒蜥外泌肽-4处理后抑制抗原特异性CD4+T细胞增殖。

在所进行的支持本发明的实验中，证实在体内用GLP-1R激动剂处理细胞抑制抗原特异性CD4+T细胞增殖(图19)。来自SJL/J EAE动物和C57BL/6 EAE动物的抗原特异性CD4+T细胞的增殖均被阻断。在SJL/J雌性小鼠(8-12周龄，the Jackson Laboratory)中，通过用200μg溶解于含有4mg/ml热灭活的结核分枝杆菌H37Ra(Difco Laboratories)的完全弗氏佐剂(CFA)中的PLP(p139-151)免疫来诱导EAE(参见，Youssef et al.，Nature(2002)420：78-84)。在C57BL/6雌性小鼠中，通过在实验第0天s.c.注射200μg乳化于CFA(Difco)中并补充了4mg/ml结核分枝杆菌(Difco)的致脑炎肽MOG(35-55)，然后立即和48小时后再次i.v.注射400ng百日咳毒素来诱导EAE。将小鼠每天用毒蜥外泌肽-4(1mg/kg)或仅媒介物(PBS；用于对照)处理。

在免疫后第5天，从处理的动物分离引流淋巴结和脾。将来自淋巴结和脾的细胞洗涤并以1×106个细胞/ml的终浓度重悬于预热的PBS/0.1％BSA中。为了监测细胞增殖，将细胞用CFSE标记，然后使其在PLP或MOG肽存在的情况下生长。添加CFSE溶液(Invitrogen，目录#C34554)至1μM的终浓度。将细胞与染料在37℃下温育10min，然后通过添加5体积的冰冷培养基并在冰上温育5分钟来猝灭。将细胞通过离心沉淀并在新鲜培养基中洗涤，总计3次洗涤。将细胞计数并与0、10和50μg/ml的PLPp139-151(来自SJL/J小鼠的细胞)或MOGp35-55(来自C57BL/6小鼠的细胞)肽温育72h。利用流式细胞术分析细胞。缺少CFSA染色的细胞鉴定为增殖T细胞。数据如表3所总结。

表3

表3中的数据显示毒蜥外泌肽-4处理SJL/J-EAE和C57BL/6-EAE小鼠导致与对照动物相比增殖性抗原特异性CD4+T细胞减少。这个结果证实当在体内用GLP-1R激动剂处理细胞时，来自EAE动物的抗原特异性CD4+T细胞的增殖被阻断。

与上文所述来自体内毒蜥外泌肽-4处理的结果相反，当在体外给予脾细胞时，毒蜥外泌肽-4不影响CD4+T细胞增殖。简单地说，CD4+T细胞分离自幼稚C57BL/6J脾细胞。为了监测细胞增殖，如上文所述将细胞用CFSE标记，随后用板结合的抗CD3(1μg/ml)和抗CD28(0.5μg/ml)活化。将毒蜥外泌肽-4(0ng/ml、10ng/ml、300ng/ml和10μg/ml)或媒介物(PBS)加入细胞培养物，并且将细胞处理72h。通过流式细胞术分析细胞。缺少CFSA染色的细胞鉴定为增殖T细胞。在体外用毒蜥外泌肽-4处理的CD4+T细胞与对照细胞相当地增殖。这个结果证实当在体内用GLP-1R激动剂处理细胞时，抗原特异性CD4+T细胞的增殖不受影响。

实施例18：在外周免疫细胞上未检测到表面GLP-1R

本实施例说明在外周免疫细胞中不存在毒蜥外泌肽-4染色。

将GLP-1R表达CHO细胞和亲代CHO细胞与FITC标记的GAC-2温育，不固定或透化。将细胞与一抗(10μg/ml，总计50μl)在室温下温育30分钟。利用流式细胞术分析细胞。在GLP-1R表达CHO细胞上检测到FITC信号，但是在亲代CHO细胞上未检测到。因此，GAC-2可以检测细胞表面上的GLP-1R。

用MOGp35-55免疫后5天，从幼稚动物和EAE动物分离来自脾、淋巴结和血液的外周免疫细胞。将分离的细胞用FITC标记的GAC-2染色并通过流式细胞术分析，门控淋巴细胞以及单核细胞。在任何这些细胞群体中未检测到GLP-1R染色。这个结果表明这些外周淋巴器官细胞在它们的表面上不表达GLP-1R，或者表面GLP-1R表达低于检测水平。

实施例19：在2D2小鼠模型中毒蜥外泌肽-4在体外不影响免疫细胞的MOG活化

本实施例说明毒蜥外泌肽-4在体外不阻断免疫细胞的MOG活化。

从7周龄的2D2小鼠分离脾和淋巴结细胞，并且将其在有或无MOG刺激的情况下培养48小时。将毒蜥外泌肽-4(10ug/ml)或媒介物(PBS)加入MOG刺激的2D2细胞培养物的溶液。培养中MOG刺激48小时后，收集细胞，将其用抗CD44抗体和抗MHC II类抗体染色，并且通过流式细胞术分析。将抗CD44抗体用作T细胞活化的标记。将抗MHC II类抗体用作APC活化的标记。

用MOG刺激的脾细胞和淋巴结细胞对于活化的T细胞的存在阳性染色。毒蜥外泌肽-4处理不阻断T细胞活化。在MOG刺激不存在的情况下培养的细胞缺少显著的活化T细胞染色。这个结果表明2D2脾细胞和淋巴结T细胞可以通过MOG刺激离体活化，并且毒蜥外泌肽-4处理不直接离体阻断该活化。

用MOG刺激的脾细胞和淋巴结细胞对于活化的APC细胞的存在阳性染色。毒蜥外泌肽-4处理不阻断APC细胞活化。在MOG刺激不存在的情况下培养的细胞缺少显著的活化APC细胞染色。这个结果表明2D2脾细胞和淋巴结抗原呈递细胞可以通过MOG刺激离体活化，但是毒蜥外泌肽-4处理看来不直接离体阻断该活化。

实施例20：毒蜥外泌肽-4处理的效应抑制促炎细胞因子产生

本实施例说明GLP-1R激动剂对促炎细胞因子产生的影响。

SJL/J EAE小鼠模型用来研究体内毒蜥外泌肽-4处理对促炎细胞因子产生的影响。通过PLP(p139-151)免疫在8周龄的SJL/J动物中诱导复发-缓解EAE。将一组动物每天用1mg/kg毒蜥外泌肽-4处理，并且将第二组动物用PBS(对照)处理。在免疫后第5天，从两组动物分离脾细胞，并且将其在体外用MOG刺激培养。用MOG刺激培养48小时后，收集培养基并利用IFN-γ和IL-17的LUMINEX

细胞因子测定分析细胞因子产生水平。

与来自对照EAE动物的脾细胞相比，来自毒蜥外泌肽-4处理的EAE动物的脾细胞产生显著较少量的IFN-γ和IL-17。这表明PLP(p139-151)免疫后毒蜥外泌肽-4有效正常化Th1和Th17细胞。

将2D2脾细胞培养物用来分析离体系统中毒蜥外泌肽-4对促炎细胞因子产生的影响。分离来自7周龄的2D2动物的脾细胞，并且将其在有或无MOG刺激的情况下培养。在具有MOG刺激的脾细胞培养物中，添加各种浓度的毒蜥外泌肽-4(10ng/ml、300ng/ml和10ug/ml)以测试毒蜥外泌肽-4是否离体减少Th1或Th17细胞。将PBS用作阴性对照。添加毒蜥外泌肽-4或PBS 48小时后，收集培养基并测量细胞因子水平。来自用MOG刺激的细胞的培养基具有高水平的IFN-γ和IL-17。相比之下，来自未用MOG刺激的细胞的培养基含有最低水平的IFN-γ和IL-17。培养物中毒蜥外泌肽-4的存在看来对IFN-γ的产生没有影响。而且，用10ug/ml毒蜥外泌肽-4处理的细胞所产生的IL-17的水平与未用毒蜥外泌肽-4处理的细胞所产生的水平没有不同。然而，来自用10ng/ml或300ng/ml毒蜥外泌肽-4处理的细胞的培养基看来具有略微降低的IL-17水平，虽然该差异不是统计显著的。

这些结果证实毒蜥外泌肽-4减少体内EAE小鼠模型中的促炎细胞因子产生。然而，相比之下，毒蜥外泌肽-4不减少2D2离体模型中的促炎细胞因子产生。这些结果证实毒蜥外泌肽-4看来不直接靶向脾或淋巴结。

实施例21：毒蜥外泌肽-4处理减少EAE动物胸腺中的CD4、CD8双阳性细胞

本实例说明EAE动物胸腺中的CD4、CD8双阳性细胞的减少。

为了诱导EAE，将8周龄的C57Bl/6小鼠用MOG/CFA皮下免疫，然后免疫后立即和48小时后i.p.注射百日咳毒素。将一组动物每天用毒蜥外泌肽-4(1mg/kg；n＝3)处理，并且将另一组用对照PBS(n＝4)处理。在免疫后第4天，收获毒蜥外泌肽-4处理和对照动物的胸腺。同时收获4只幼稚动物的胸腺。测量胸腺，并且将胸腺细胞分离、计数、染色并通过流式细胞术分析。数据如下文表4所总结。

表4

如表4所示，对照EAE动物的胸腺与幼稚动物的胸腺相比明显较小(p＝0.007)。毒蜥外泌肽-4处理的EAE动物的胸腺比对照EAE动物的胸腺甚至更小(p＝0.002)。分离来自对照EAE动物、毒蜥外泌肽-4处理的EAE动物和幼稚动物的胸腺的胸腺细胞。与上文所述的胸腺测量一致，来自对照EAE动物的总胸腺细胞计数明显少于幼稚动物的总胸腺细胞计数。来自毒蜥外泌肽-4处理的EAE动物的总胸腺细胞计数明显少于对照EAE动物的总胸腺细胞计数。

将胸腺细胞用抗CD4和抗CD8抗体染色并通过流式细胞术分析。84.6±0.3％来自幼稚动物的总胸腺细胞群体为CD4、CD8双阳性。30.3±11.9％来自对照EAE动物的总胸腺细胞群体为CD4、CD8双阳性。这个数据反映对MOG刺激应答的胸腺中双阳性T细胞的分化和成熟。在用毒蜥外泌肽-4处理的EAE动物中，CD4、CD8双阳性T细胞群体几乎被完全消灭-仅2.3±0.3％来自毒蜥外泌肽-4处理的EAE动物的总胸腺细胞群体为CD4、CD8双阳性。进一步研究证实在毒蜥外泌肽-4处理的动物中，脾和淋巴结细胞计数没有增加。这些结果表明毒蜥外泌肽-4可以通过细胞死亡引起CD4、CD8双阳性细胞减少。

在另一研究中，研究毒蜥外泌肽-4对幼稚动物以及EAE动物的T细胞成熟的影响。通过皮下注射MOG/CFA然后i.p.注射百日咳毒素来在8周龄的C57Bl/6小鼠中诱导EAE。将幼稚和EAE动物分为3组(n＝3)，并且分别用PBS(对照)、毒蜥外泌肽-4(1mg/kg)或地塞米松(4mg/kg)处理。已知地塞米松引起T细胞死亡。在免疫后第6天，收获胸腺。将胸腺细胞分离、用抗CD4和抗CD8抗体染色并通过流式细胞术分析。数据如表5所总结。

表5

在EAE对照动物的胸腺细胞中，CD4、CD8双阳性细胞群体(21.7±6.3％)与幼稚对照动物(86.3±1.1％)相比减少。毒蜥外泌肽-4处理和地塞米松处理均急剧减少EAE动物中的CD4、CD8双阳性群体(分别为5.6±2.6％和1.5±0.5％)。

86.3±1.1％来自幼稚动物的总胸腺细胞群体为CD4、CD8双阳性。地塞米松处理引起CD4、CD8双阳性群体的显著减少-仅12.4±3.3％来自地塞米松处理的幼稚动物的总胸腺细胞群体为CD4、CD8双阳性。然而，毒蜥外泌肽-4处理不影响幼稚动物胸腺中的CD4、CD8双阳性细胞群体。81.5±2.0％来自毒蜥外泌肽-4处理的幼稚动物的总胸腺细胞群体为CD4、CD8双阳性。

这些结果证实毒蜥外泌肽-4处理导致EAE动物但不是幼稚动物的胸腺中CD4、CD8双阳性细胞减少。

实施例22：迷走神经切断术消除毒蜥外泌肽-4对体重减轻的影响但是不影响毒蜥外泌肽-4对EAE发展的效力

本实施例说明迷走神经切断术对毒蜥外泌肽-4处理的影响。

为了研究毒蜥外泌肽-4对EAE发展的影响是否通过迷走神经介导，在8周龄的切断迷走神经的C57Bl/6动物(The Jackson Laboratory)中诱导EAE。在切断迷走神经和未切断迷走神经的小鼠中通过MOG/CFA皮下免疫然后立即和48小时后i.p.注射百日咳毒素来诱导EAE。将免疫的动物分为两组(n＝7-8)。一组每天用毒蜥外泌肽-4(1mg/kg)处理，而另一组用PBS(对照)处理。每天监测体重和EAE临床评分。在第20天实验结束时，将动物安乐死。胃测量证实切断迷走神经的动物的迷走神经被正确切断。

MOG免疫的第一个4天内，毒蜥外泌肽-4处理的未切断迷走神经的EAE小鼠与对照未切断迷走神经的EAE小鼠相比体重减轻10％。在切断迷走神经的小鼠中，在毒蜥外泌肽-4处理的EAE小鼠与对照EAE小鼠之间未观察到体重的差异。因此，迷走神经切断术消除毒蜥外泌肽-4对体重减轻的影响。这个结果表明毒蜥外泌肽-4对体重变化的影响依赖于完整的迷走神经。

EAE疾病发展不受迷走神经切断术影响。在切断迷走神经和未切断迷走神经的小鼠中，与PBS处理的动物相比，毒蜥外泌肽-4处理均显著延迟EAE发展(图20)。因此，迷走神经切断术的确影响毒蜥外泌肽-4介导的EAE疾病发展的延迟。这个结果表明毒蜥外泌肽-4对EAE的影响不是由迷走神经介导的。

虽然已参考各种应用、方法、试剂盒和组合物描述所公开的教导，但是应当理解可以在不背离本文的教导和所要求保护的发明的情况下进行各种变化和修改。提供以上实施例以更好地说明所公开的教导，并且不是为了限制本文所提供的教导的范围。虽然已根据这些示例性实施方案描述本文的教导，但是技术人员会很容易理解这些示例性实施方案的许多变化和修改是可能的，无需过多实验。全部这类变化和修改在本文的教导的范围内。

本文所用的段落标题仅用于组织目的，而不应当理解为以任何方式限制所述主题。应当理解本文的教导所讨论的温度、浓度、时间等之前隐含有“约”，使得轻微和非实质性的偏差在本文的教导的范围内。在本申请中，除非另有说明，单数的使用包括复数。而且，“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(contain)”、“含有(containing)”、“含有(containing)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”的使用不是为了限制。应当理解之前的一般描述和随后的详细描述仅是示例性和说明性的，而不是限制本发明。

本文所引用的全部文献，包括专利、专利申请、文章、教科书等以及本文所引用的参考文献整体援引加入本文。在一篇或多篇加入的文献和相似材料(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所述技术等)与本申请不同或相冲突的情况下，以本申请为准。

上文的描述和实施例详述本发明的某些具体实施方案并描述发明人预期的最佳模式。然而，应当理解无论在文中出现多么详细的描述，本发明可以许多方式实施，且本发明应当根据所附权利要求及其任何等价方式来理解。

Claims

1.一种减少中枢神经系统组织的白细胞侵入的方法，所述方法包括向需要这样的治疗的哺乳动物给予包含对于活化GLP-1R有效的量的胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)激动剂的组合物，从而减少中枢神经系统组织的白细胞侵入。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物患有自身免疫性病症。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述自身免疫性病症为多发性硬化。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述自身免疫性病症与免疫排斥反应、移植物抗宿主疾病、葡萄膜炎、视神经病、视神经炎、横贯性脊髓炎、炎性肠病、类风湿性关节炎、关节强硬性脊椎炎、系统性红斑性狼疮、重症肌无力或突眼性甲状腺肿有关。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物为人。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述GLP-1R激动剂为OAP-189。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述GLP-1R激动剂为DPP-4抑制剂。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述GLP-1R激动剂为抗GLP-1R激动剂抗体。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述GLP-1R激动剂包含毒蜥外泌肽-4的片段或衍生物，其中所述毒蜥外泌肽-4的片段或衍生物结合并活化GLP-1R。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述GLP激动剂为GLP-1R激动剂-抗体缀合物(GAC)，其包含GLP-1R激动剂肽和抗体。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述GAC具有以下结构：

其中所述肽具有式：R¹-[H¹ X² E³ G⁴ T⁵ F⁶ T⁷ S⁸ D⁹ X¹⁰ S¹¹ X¹² X¹³ X¹⁴ E¹⁵ X¹⁶X¹⁷ A¹⁸ X¹⁹ X²⁰ X²¹ F²² X²³ X²⁴ X²⁵ X²⁶ X²⁷ X²⁸ X²⁹ X³⁰ X³¹ X³² X³³ X³⁴ X³⁵ X³⁶X³⁷ X³⁸ X³⁹ X⁴⁰(SEQ ID NO：3)]-R²，其中

R¹为不存在、CH₃、C(O)CH₃、C(O)CH₂CH₃、C(O)CH₂CH₂CH₃或C(O)CH(CH₃)CH₃；

R²为OH、NH₂、NH(CH₃)、NHCH₂CH₃、NHCH₂CH₂CH₃、NHCH(CH₃)CH₃、NHCH₂CH₂CH₂CH₃、NHCH(CH₃)CH₂CH₃、NHC₆H₅、NHCH₂CH₂OCH₃、NHOCH₃、NHOCH₂CH₃、羧基保护基团、脂质脂肪酸基团或糖，并且X²为封闭基团，例如Aib、A、S、T、V、L、I、D-Ala；

X¹⁰为V、L、I或A；X¹²为S或K；

X¹³为Q或Y；

X¹⁴为G、C、F、Y、W、M或L；

X¹⁶为K、D、E或G；

X¹⁷为E或Q；

X¹⁹为L、I、V或A；

X²⁰为鸟氨酸或诸如K(SH)的衍生化赖氨酸基团、R或K；

X²¹为L或E；

X²³为I或L；

X²⁴为A或E；

X²⁵为W或F；

X²⁶为L或I；

X²⁷为I、K或V；

X²⁸为R、鸟氨酸、N或K；

X²⁹为Aib或G；

X³⁰为任何氨基酸，优选G或R；

X³¹为P或不存在；

X³²为S或不存在；

X³³为S或不存在；

X³⁴为G或不存在；

X³⁵为A或不存在；

X³⁶为P或不存在；

X³⁷为P或不存在；

X³⁸为P或不存在；

X³⁹为S或不存在；并且

X⁴⁰为连接残基或不存在；

并且其中X¹⁰、S¹¹、X¹²、X¹³、X¹⁴、X¹⁶、X¹⁷、X¹⁹、X²⁰、X²¹、X²⁴、X²⁶、X²⁷、X²⁸、X³²、X³³、X³⁴、X³⁵、X³⁶、X³⁷、X³⁸、X³⁹或X⁴⁰中的一个由连接残基取代，所述连接残基包含通过接头共价连接至所述抗体的结合位点的亲核侧链，其中所述连接残基选自K、R、Y、C、T、S、赖氨酸的同系物(包括K(SH))、高半胱氨酸和高丝氨酸。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述GAC包含以下结构：

13.如权利要求11所述的方法，其中所述GAC包含以下结构：

14.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述抗体选自全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dsFv、scFv、V_H、双抗体和微抗体。

15.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述抗体包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定结构域。