CN102575989B - 图像分析方法及图像分析装置 - Google Patents

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Abstract

S1:取得观察区域的图像。S2:对观察区域的图像设定分析区域。S3:设定比分析区域小的子分析区域。S4~S7:在整个分析区域隔开像素间隔断续地移动子分析区域,并且每次移动时使用子分析区域内的像素数据进行相关分析,估计子分析区域的至少分子数或扩散常数中的任意一项。S8:映射分子数或扩散常数,形成分子数或扩散常数的图像。

Description

图像分析方法及图像分析装置
技术领域
本发明涉及图像分析方法及图像分析装置。
背景技术
以往已知有称为荧光相关分光分析法(FCS)的图像分析方法。FCS例如记载于非专利文献1。FCS中在某程度的时间内(例如10秒)对试样中的一个或多个测定点持续地照射激励光,检测从测定点发出的荧光的强度的波动,进行相关分析,从而进行分子数和扩散常数的估计。
另外,也已知有称为光栅图像相关分光法(RICS:Raster Image CorrelationSpectroscopy)的图像分析方法。RICS例如记载于非专利文献2。RICS中,通过对试样光栅扫描激励光的同时检测发生的荧光而取得荧光图像。荧光图像的各像素数据表示从对应的试样中的点发生的荧光的强度信息。即,像素数据各自的取得时间及取得位置不同。通过采用像素数据进行空间相关分析,求出扩散常数和分子数。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:“New Concept in Correlator Design”,Klaus Sch-tzel,Inst.Phys.Conf.Ser.No.77,P175,1985.
非专利文献2:“Measuring Fast Dynamics in Solutions and Cells with a LaserScanning Microscope”,Michelle A.Digman,Claire M.Brown,Parijat Sengupta,Paul W.Wiseman,Alan R.Horwitz,and Enrico Gratton,Biophysical Journal,Vol.89,P1317-1327,August 2005.
发明内容
发明要解决的课题
为了使从试样的大量测定点取得的信息与试样内的位置关联地进行考察,优选进行映射而图像化。
采用FCS对试样设定大量测定点进行测定并映射测定结果时,最初的测定点和最后的测定点间的时间差较大,映射结果包含时间变化的影响导致的较大误差,欠缺可靠性。例如,对256×256的测定点映射分子数或扩散常数时,若取得一个测定点中的分子数或扩散常数所需的时间为10秒,则需要256×256×10秒的长测定时间。即使映射具有这样长的时间间隔的测定结果,映射结果也没有实际意义。
RICS中虽然从试样中的大量点取得信息,但是一般对一幅图像只不过计算一个信息(例如分子数或扩散常数)。即,不从扫描区域取得多个信息。因而,当然,不考虑映射取得的信息。
本发明的目的是提供从扫描区域计算多个信息并进行映射的新的RICS的图像分析方法。
用于解决课题的手段
本发明的图像分析方法具备:图像取得步骤,取得由多个像素构成的观察区域的图像,该多个像素分别具有按时序取得的多个数据;分析区域设定步骤,对上述观察区域的图像设定分析区域;子分析区域设定步骤,设定比上述分析区域小的子分析区域;移动步骤,在整个上述分析区域隔开像素间隔断续地移动上述子分析区域;相关分析步骤,每次上述移动时使用上述子分析区域内的像素数据进行相关分析,估计上述子分析区域的至少分子数或扩散常数中的任意一项;以及图像形成步骤,映射上述分子数或扩散常数,形成上述分子数或扩散常数的图像。
发明效果
根据本发明,提供映射分子数或扩散常数并显示的RICS的图像分析方法。
附图说明
图1既略地表示本发明实施方式的图像分析装置。
图2表示图1所示的控制部的功能块。
图3表示二维图像的荧光图像的例子。
图4表示三维图像的荧光图像的例子。
图5是本发明实施方式的图像分析的流程图。
图6示意表示对二维的分析区域设定的子分析区域。
图7示意表示对三维的分析区域设定的子分析区域。
图8表示分子数或扩散常数的图像。
图9表示扩展分子数或扩展扩散常数的图像。
图10表示变换前图像和变换后图像之间的座标数据的变换。
图11表示变换前图像和变换后图像。
具体实施方式
以下,参照附图说明本发明的实施方式。
[装置构成]
图1既略地表示本发明实施方式的图像分析装置。该图像分析装置以试样的荧光观察用扫描共焦光学显微镜为基础而构成。
如图1所示,图像分析装置100具有:向试样S照射激励光的光照射部110;检测从试样S内的测定点发出的光的光检测部130;进行图像分析所需要的控制的控制部160;支撑试样S的试样台190。
试样S收容于微板、滑动玻璃等的试样容器,载置于试样台190。试样台190例如以试样S可相对于光照射部110及光检测部130在横向(xy方向)及高度方向(z方向)移动的方式进行支撑。例如,试样台190包含输出轴相互正交的三个步进电机,通过这些步进电机可使试样S在xyz方向移动。
图像分析装置100是多重光照射多重光检测型的。因而,光照射部110包含n通道的光源系统111,相应地,光检测部130包含n通道的检测系统131。n通道的检测系统131分别检测由从n通道的光源系统111射出的激励光生成的荧光。这里,n通道由通道1、通道2、…通道n构成。通道因激励光的种类而异。
光照射部110的n通道的光源系统111包含:光源112a、…、112n;准直透镜114a、…、114n;分色镜116a、…、116n。光源112a、…、112n发出用于激励试样S所包含的荧光色素而使试样S发光(荧光)的激励光。光源112a、…、112n发出的激励光的波长与试样S所包含的荧光色素的种类对应,相互不同。光源112a、…、112n例如由与试样S中的荧光色素匹配的振荡波长的激光光源构成。准直透镜114a、…、114n分别使光源112a、…、112n发出的激励光平行。分色镜116a、…、116n分别使通过准直透镜114a、…、114n的激励光向相同方向反射。分色镜116a、…、116n分别使从图1的上方入射的激励光透射,使从图1的右方入射的激励光反射。结果,从光源112a、…、112n分别射出的不同波长的激励光在通过分色镜116a后合成为一个光束。分色镜116n不必使激励光透射,因此也可以变更为单纯的反射镜。
光照射部110还包含分色镜122、检流镜124、物镜126、物镜驱动机构128。分色镜122使来自光源系统111的激励光向检流镜124反射,使从试样S发出的荧光透射。检流镜124使激励光向物镜126反射,并且变更其反射方向。物镜126会聚激励光而使其照射到试样S内的测定点,并且输入来自试样S内的测定点的光。为了形成微小的共焦区域(测定点),物镜126使用NA(数值孔径)大的装置。这样取得的共焦区域的大小成为直径0.6μm.左右、长2μm.左右的近似圆筒状。检流镜124构成在xy方向扫描测定点的xy扫描机构。xy扫描机构除了用检流镜构成外,也可以用声光调制元件(AOM)、多棱镜、全息图扫描仪等构成。物镜驱动机构128使物镜126沿光轴移动。从而,测定点在z方向移动。即,物镜驱动机构128构成在z方向扫描测定点的z扫描机构。
光检测部130与光照射部110共用物镜126、检流镜124和分色镜122。光检测部130还包含会聚透镜132、针孔134、准直透镜136。会聚透镜132使透过分色镜122的光会聚。针孔134在会聚透镜132的焦点配置。即,针孔134处于与试样S内的测定点共轭的位置,选择性地仅使来自测定点的光通过。准直透镜136使通过针孔134的光平行。通过准直透镜136的光入射到n通道的检测系统131。
n通道的检测系统131包含分色镜138a、…、138n、荧光滤镜140a、…、140n、光检测器142a、…、142n。
分色镜138a、…、138n分别选择性地反射通过来自光源112a、…、112n的激励光而从试样S生成的荧光的波长区域附近的波长的光。分色镜138n不必使光透射,因此也可以变更为单纯的反射镜。荧光滤镜140a、…、140n分别从由分色镜138a、…、138n反射的光中遮断不期望波长分量的光,选择性地仅透过由来自光源112a、…、112n的激励光生成的荧光。透过荧光滤镜140a、…、140n的荧光分别入射到光检测器142a、…、142n。光检测器142a、…、142n输出与入射光的强度对应的信号。即,光检测器142a、…、142n输出来自试样S内的测定点的荧光强度信号。
控制部160例如由个人计算机构成。控制部160进行试样S的观察区域的荧光图像的取得、存储、显示,分析区域的设定、子分析区域的设定、子分析区域的移动量的设定等的输入等待,图像的分析处理(相关值的计算和分子数、扩散时间的估计等)。控制部160还进行xy扫描机构即检流镜124、z扫描机构即物镜驱动机构128、试样台190等的控制。
图1所示的控制部的功能块如图2所示。控制部160如图2所示,包含扫描控制部162、图像形成部164、存储部166、显示部168、输入部170、分析区域设定部172、子分析区域调整部174、分析处理部176、台控制部180。这里,扫描控制部162、图像形成部164、存储部166、台控制部180、上述检流镜124、物镜驱动机构128、试样台190、光检测器142构成图像取得部。
扫描控制部162在取得试样S的荧光图像时,控制检流镜124,以在激励光的照射位置对试样S进行光栅扫描。另外,如果必要,扫描控制部162控制物镜驱动机构128,以在激励光的照射位置对试样S进行z扫描。图像形成部164根据从扫描控制部162输入的激励光的照射位置的信息和光检测器142a、…、142n的输出信号形成试样S的荧光图像。从而,取得荧光图像。存储部166存储由图像形成部164形成的荧光图像。显示部168显示试样S的荧光图像和分析处理结果。输入部170例如包含鼠标、键盘,与显示部168共同构成GUI。该GUI用于观察区域、分析区域、子分析区域的设定等。台控制部180例如为了设定观察区域,按照来自输入部170的输入信息控制试样台190。分析区域设定部172按照来自输入部170的输入信息设定分析区域。子分析区域调整部174按照来自输入部170的输入信息设定比分析区域小的子分析区域。子分析区域调整部174还在整个分析区域隔开像素间隔使子分析区域断续地移动。分析处理部176在每次移动时,使用子分析区域内的像素数据进行相关分析,估计子分析区域的至少分子数或扩散常数中的任意一项。分析处理部176还映射所估计的分子数或扩散常数,形成分子数或扩散常数的图像。分析处理部176还用具有二维或三维分布的扩展函数对所估计的分子数或扩散常数进行扩展计算,取得扩展分子数或扩展扩散常数,映射扩展分子数或扩展扩散常数,形成扩展分子数或扩展扩散常数的图像。进而,分析处理部176将扩展分子数或扩展扩散常数的位置信息作为加权系数,将扩展分子数或扩展扩散常数的图像变换为与分析区域相同的图像尺寸。分析处理部176的处理的详细情况将后述。
在图1中,光源112a、…、112n发出的激励光经准直透镜114a、…、114n、分色镜116a、…、116n、分色镜122、检流镜124、物镜126,照射试样S内的测定点。激励光照射的测定点通过检流镜124在xy方向光栅扫描,另外如果必要,在光栅扫描的同时,通过物镜驱动机构128进行z扫描。在整个观察区域扫描测定点。接受激励光的试样S从测定点发出荧光。来自试样S的光(除了荧光外还包含不期望的反射光等)经物镜126、检流镜124、分色镜122、会聚透镜132,到达针孔134。针孔134处于与测定点共轭的位置,因此,仅仅来自试样S内的测定点的光通过针孔134。通过针孔134的光即来自试样S内的测定点的光经准直透镜136入射到n通道的检测系统131。入射到n通道的检测系统131的光通过分色镜138a、…、138n按照波长分离(即分光),并且由荧光滤镜140a、…、140n除去不期望的分量。结果,仅仅由来自光源112a、…、112n的激励光生成的荧光分别入射到光检测器142a、…、142n。光检测器142a、…、142n分别输出表示入射光即试样S内的测定点发出的荧光的强度的荧光强度信号。该荧光强度信号输入到图像形成部164。图像形成部164将输入的荧光强度信号与xy方向(及z方向)的位置信息同步处理,形成试样S内的观察区域的荧光图像。所形成的荧光图像在存储部166保存。存储部166保存的荧光图像直接在显示部168显示,或者由分析处理部176处理后,在显示部168显示分析处理结果。
[空间相关计算式]
观察区域的荧光图像由具有按时序取得的多个数据的多个像素构成。测定点实际上在xyz方向具有空间的广度,像素具有与该测定点的空间的广度对应的大小。观察区域为二维的区域时,荧光图像是在xy方向具有大小的像素二维地排列而成的二维图像。另外,观察区域为三维的区域时,荧光图像是在xyz方向具有大小的像素三维地排列而成的三维图像。另外,若采用其他视角,则三维图像由z位置不同的多个帧的二维图像构成。
二维图像的例子如图3所示。图3中,τp是某像素和与其邻接的下一个像素之间的取得时间的偏差(像素时间)。即,像素时间τp是取得1像素数据所需的时间。另外,τl是某行的最初的像素和其下一行的最初的像素之间的取得时间的偏差(行时间)。即,行时间τl是指扫描1行所需的时间。
下式(1)表示对二维图像的RICS的分析中使用的空间自相关计算式。式(1)是通道1的自相关计算式的例子。
【式1】
G sa ( ξ , ψ ) = Σ I 1 ( x , y ) * I 1 ( x + ξ , y + ψ ) / M 11 ( Σ I 1 ( x , y ) / M 1 ) 2 · · · ( 1 )
这里,Gsa是RICS的空间自相关值,I1是通道1的荧光强度数据(像素数据),x、y是测定点的空间座标,ξ、ψ是相比测定点的空间座标变化量,M11是通道1的数据的积和计算的次数,M1是通道1的数据总数。
另外,下式(2)表示对二维图像使用的RICS的分析中使用的空间互相关计算式。式(2)是通道1和通道2的互相关计算式的例子。
【式2】
G sc ( ξ , ψ ) = Σ I 1 ( x , y ) * I 2 ( x + ξ , y + ψ ) / M 12 ( Σ I 1 ( x , y ) / M 1 ) · ( Σ I 2 ( x , y ) / M 2 ) · · · ( 2 )
这里,Gsc是RICS的空间互相关值,I1是通道1的荧光强度数据(像素数据),I2是通道2的荧光强度数据(像素数据),x、y是测定点的空间座标,ξ、ψ是相比测定点的空间座标变化量,M12是通道1和通道2的数据的积和计算的次数,M1是通道1的数据总数,M2是通道2的数据总数。
下式(3)表示对二维图像的RICS的分析中使用的拟合式。
【式3】
Gs(ξ,ψ)=S(ξ,ψ)*G(ξ,ψ)
S ( ξ , ψ ) = exp ( - 1 2 * [ ( 2 ξ δ r W 0 ) 2 + ( 2 ψ δ r W 0 ) 2 ] ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ l ψ ) W 0 2 ) ) · · · ( 3 )
G ( ξ , ψ ) = 1 N ( ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ l ψ ) W 0 2 ) - 1 * ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ l ψ ) W Z 2 ) - 1 / 2 )
这里,Gs是RICS的空间相关值(空间自相关值Gsa或空间互相关值Gsc),S是RICS的分析中的扫描的影响,G是RICS的分析中的时间迟延的影响,D是扩散常数,δr是像素尺寸,N是分子数,ξ、ψ是相比测定点的空间座标变化量,W0是激励激光束的横向的半径,Wz是激励激光束的纵向的半径,τp是像素时间,τl是行时间。
三维图像的例子如图4所示。图4中,τp是像素时间,τl是行时间,τf是某帧的最初的像素和其下一帧的最初的像素之间的取得时间的偏差(帧时间)。即,帧时间τf是扫描1帧所需的时间。
下式(4)表示对三维图像的RICS的分析中使用的空间自相关计算式。式(4)是通道1的自相关计算式的例子。
【式4】
G sa ( ξ , ψ , η ) = Σ I 1 ( x , y , z ) * I 1 ( x + ξ , y + ψ , z + η ) / M 11 ( Σ I 1 ( x , y , z ) / M 1 ) 2 · · · ( 4 )
这里,Gsa是RICS的空间自相关值,I1是通道1的荧光强度数据(像素数据),x、y、z是测定点的空间座标,ξ、ψ、η是相比测定点的空间座标变化量,M11是通道1的数据的积和计算的次数,M1是通道1的数据总数。
另外,下式(5)表示对三维图像的RICS的分析中使用的空间互相关计算式。式(5)是通道1和通道2的互相关计算式的例子。
【式5】
G sc ( ξ , ψ , η ) = Σ I 1 ( x , y , z ) * I 2 ( x + ξ , y + ψ , z + η ) / M 12 ( Σ I 1 ( x , y , z ) / M 1 ) · ( Σ I 2 ( x , y , z ) / M 2 ) · · · ( 5 )
这里,Gsc是RICS的空间互相关值,I1是通道1的荧光强度数据(像素数据),I2是通道2的荧光强度数据(像素数据),x、y、z是测定点的空间座标,ξ、ψ、η是相比测定点的空间座标变化量,M12是通道1和通道2中的数据的积和计算的次数,M1是通道1的数据总数,M2是通道2的数据总数。
下式(6)表示对三维图像的RICS的分析中使用的拟合式。
【式6】
Gs(ξ,ψ,η)=S(ξ,ψ,η)*G(ξ,ψ,η)
S ( ξ , ψ , η ) = exp ( - 1 2 * [ ( 2 ξ δ r W 0 ) 2 + ( 2 ψ δ r W 0 ) 2 + ( 2 η δ r W 0 ) 2 ] ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ l ψ + τ f η ) W 0 2 ) ) · · · ( 6 )
G ( ξ , ψ , η ) = 1 N ( ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ l ψ + τ f η ) W 0 2 ) - 1
* ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ 1 ψ + τ f η ) W Z 2 ) - 1 / 2 )
这里,Gs是RICS的空间相关值(空间自相关值Gsa或空间互相关值Gsc),S是RICS的分析中的扫描的影响,G是RICS的分析中的时间迟延的影响,D是扩散常数,δr是像素尺寸,N是分子数,ξ、ψ、η是空间座标变化量,W0是激励激光束的横向的半径,Wz是激励激光束的纵向的半径,τp是像素时间,τl是行时间,τf是帧时间。
[测定顺序]
以下,参照图5说明图像分析的顺序。另外,适当参照图6~图11说明各步骤。
(步骤S1)
取得试样S的观察区域的荧光图像。观察区域是二维的区域或三维的区域,相应地,荧光图像是二维图像或三维图像。荧光图像的各像素数据是例如对应的测定点发出的荧光的强度。
(步骤S2)
对观察区域的荧光图像设定分析区域。分析区域对于二维的观察区域是二维的区域,对于三维的观察区域通常是三维的区域,但是也可以是二维的区域。分析区域可以是观察区域的一部分,也可以与观察区域一致。例如,分析区域通过应用程序缺省设定成观察区域。
(步骤S3)
在分析区域内设定比分析区域小的子分析区域。例如图6所示,对于二维的分析区域Ra,子分析区域Rs是二维的区域。另外如图7所示,对于三维的分析区域Ra,区域的子分析区域Rs是三维的分析区域。
(步骤S4)
设定子分析区域的移动量。关于子分析区域,在整个分析区域隔开像素间隔使子分析区域断续地移动。子分析区域作为移动的初始位置,设定在分析区域的端部。子分析区域在分析区域的范围内移动。另外,子分析区域按1像素以上的移动量移动。
例如在图6的例中,子分析区域的移动以左上的位置作为初始位置如下那样进行。首先,使子分析区域Rs在x方向从初始位置断续地移动dx的移动量。该x方向的移动持续到子分析区域Rs的右端到达分析区域Ra的端部为止。在x方向结束1行的移动后,使子分析区域Rs移动到相对于该行的最初位置在y方向偏移了dy的位置。然后,再次同样使子分析区域Rs在x方向移动1行。以下,每次在子分析区域Rs的x方向的1行的移动结束时,使子分析区域Rs在y方向移动。y方向的移动持续到子分析区域Rs的下端到达分析区域Ra的端部为止。最后,使子分析区域Rs在x方向移动1行后结束。
另外,图7的例子中,子分析区域Rs的移动在每次上述xy方向的移动结束时,使子分析区域Rs在z方向移动dz后,反复进行上述xy方向的移动。z方向的移动持续到子分析区域Rs的端部到达分析区域Ra的端部为止。最后,使子分析区域Rs在xy方向移动1帧后结束。
(步骤S5~S7)
在整个分析区域隔开像素间隔使子分析区域断续地移动。另外,每次移动时对子分析区域进行相关分析。即,对初始位置及各移动后的子分析区域进行相关分析。
(步骤S5)
使用子分析区域内的像素数据进行相关计算。对二维图像计算空间自相关值时使用式(1)的空间自相关计算式,计算空间互相关值时使用式(2)的空间互相关计算式。另外,对三维图像计算空间自相关值时使用式(4)的空间自相关计算式,计算空间互相关值时使用式(5)的空间互相关计算式。
相关计算所使用的各像素数据可以是该像素数据本身,也可以是包含该像素的多个像素数据的统计值。多个像素例如可以是关注的像素及其邻接的像素。统计值例如可以是像素数据的平均值、最大值、最小值、相对差、绝对差、相对比中的任意一项。使用哪一统计值根据想通过RICS的分析取得哪一信息而确定。
另外,相关计算所使用的数据也可以是像素时间、行时间、帧时间、像素位置关系、像素尺寸或关于以上数据的统计值。
另外,相关计算也可以根据像素数据分别重构图像,对重构的图像进行相关计算。例如,将相邻的像素数据彼此相加,使像素数据的数量减半。或将一个像素数据分割为多个。按道理,一度取得图像后像素数据的数量不增加,但是假定取得的像素数据的强度在该像素数据的周围通过高斯分布而扩展,补偿本来无法取得的像素数据。虽然本质上像素数据的数量并没有增加,但是看起来变好。
(步骤S6)
对步骤S5的相关计算的结果进行拟合,估计子分析区域的至少分子数或扩散时间中的任意一项。对二维图像使用式(3)的拟合式,对三维图像使用式(6)的拟合式。
具体地说,使用式(1)和式(2)或式(3)和式(4),对不同迟延时间分别求出自相关值Gsa或互相关值Gsc。然后,根据自相关值Gsa或互相关值Gsc与迟延时间的关系,使用式(3)或式(6),求出扩散常数和分子数。
式(3)及式(6)中,迟延时间为零时,分别使(ξ=0,ψ=0)及(ξ=0,ψ=0,η=0),S为1,自相关值Gsa或互相关值Gsc用1/N表示。从而,可以求出分子数。通过将其重新代入式(3)及式(6),可以求出与各迟延时间对应的扩散常数。
使作为未知数的扩散常数D和分子数N变动的同时,求出适当的扩散常数D和分子数N,使得作为测定值取得的相关值Gsa或相关值Gsc和作为理论值取得的Gs的差成为最小。这样,基于式(3)或式(6)的拟合是指使扩散常数D和分子数N变动的同时,估计二维或三维的观察区域中的最佳分子数或扩散常数。
扩散常数与扩散时间之间,具有由下式(7)表示的关系。从而,可以根据求出的扩散常数求出扩散时间。
【式7】
τ=W0 2/4D    …(7)
(步骤S7)
判断子分析区域的位置是否为结束位置。子分析区域的位置不是结束位置时,使子分析区域移动到下一个位置,返回步骤S5。子分析区域的位置为结束位置时,进入下一个步骤S8。
在步骤S7结束的时刻,取得子分析区域的各个位置中的多个分子数或扩散常数。
(步骤S8)
映射分子数或扩散常数,形成分子数或扩散常数的图像。分子数或扩散常数的图像如图8所示。
(步骤S9)
用具有二维或三维分布的扩展函数对分子数或扩散常数进行扩展计算,取得扩展分子数或扩展扩散常数。扩展函数不限于此,例如,也可以是高斯函数。扩展分子数或扩展扩散常数是分子数或扩散常数的分布,该分布范围选择为比子分析区域广的范围。另外,映射扩展分子数或扩展扩散常数,形成扩展分子数或扩展扩散常数的图像。扩展分子数或扩展扩散常数的图像如图9所示。这样,通过对分子数或扩散常数进行扩展计算,可取得亮度变化比图8的图像更平滑的图像。
例如,图6的例子中,在将分析区域Ra的图像尺寸设为256像素×256像素,子分析区域Rs的图像尺寸设为64像素×64像素,子分析区域Rs的移动量dx、dy分别设为dx=1像素、dy=1像素的情况下,取得192×192的分子数或扩散常数。结果,扩展分子数或扩展扩散常数的图像Ia的图像尺寸为192像素×192像素,比分析区域Ra的图像尺寸即256像素×256像素小。
若考虑扩展分子数或扩展扩散常数的图像Ia与原来的分析区域Ra的图像比较研究,则期望两者的空间位置信息一致。即,期望扩展分子数或扩展扩散常数的图像Ia的图像尺寸与原来的分析区域Ra的图像一致。
(步骤S10)
将扩展分子数或扩展扩散常数的位置信息作为加权系数,将扩展分子数或扩展扩散常数的图像变换为与分析区域相同的图像尺寸。
例如,图9的例子中,将扩展分子数或扩展扩散常数的图像Ia从192×192的图像尺寸变更为256×256的图像尺寸。后续说明中,将192×192的图像尺寸的图像称为变换前图像,将256×256的图像尺寸的图像称为变换后图像。变换前图像和变换后图像之间的座标数据的变换如图10所示。
首先,如图10所示,将位于变换前图像的座标的单位分量的四角的像素数据a、b、c、d的座标分别设为a(Xa,Ya)、b(Xb,Yb)、c(Xc,Yc)、d(Xd,Yd)。另外,将变换前图像的纵轴和变换后图像的横轴交差的点,即位于a(Xa,Ya)和b(Xb,Yb)之间的点的座标设为e(Xe,Ye),位于c(Xc,Yc)和d(Xd,Yd)之间的点的座标设为f(Xf,Yf)。而且,将由a(Xa,Ya)、b(Xb,Yb)、c(Xc,Yc)、d(Xd,Yd)包围的变换后图像的座标设为g(Xg,Yg)。
根据a和b计算e(Xe,Ye)的像素数据e。像素数据e通过e=(b(Yb-Ye)+a(Ye-Ya))/(Yb-Ya)求出。另外,根据c和d计算f(Xf,Yf)的像素数据f。像素数据f通过f=(d(Yd-Yf)+c(Yf-Yc))/(Yd-Yc)求出。
根据e和f计算g(Xg,Yg)的像素数据g。像素数据g通过g=(e(Xe-Xg)+f(Xg-Xf))/(Xe-Xf)求出。
通过对变换前图像的全部的像素数据适用该变换,取得256×256的图像尺寸的变换后图像。变换前图像和变换后图像如图11所示。
(步骤S11)
显示并保存分子数或扩散常数的图像或扩展分子数或扩展扩散常数的图像。
符号说明
100…图像分析装置,110…光照射部,112a、…、112n…光源,114a、…、114n…准直透镜,116a、…、116n…分色镜,122…分色镜,124…检流镜,126…物镜,128…物镜驱动机构,130…光检测部,132…会聚透镜,134…针孔,136…准直透镜,138a、…、138n…分色镜,140a、…、140n…荧光滤镜,142a、…、142n…光检测器,160…控制部,162…扫描控制部,164…图像形成部,166…存储部,168…显示部,170…输入部,172…分析区域设定部,174…子分析区域调整部,176…分析处理部,180…台控制部,190…试样台。

Claims (22)

1.一种图像分析方法,其具备:
图像取得步骤,取得由多个像素构成的观察区域的图像,该多个像素分别具有按时序取得的多个数据;
分析区域设定步骤,对上述观察区域的图像设定分析区域;
子分析区域设定步骤,设定比上述分析区域小的子分析区域;
移动步骤,在整个上述分析区域隔开像素间隔断续地移动上述子分析区域;
相关分析步骤,每次上述移动时使用上述子分析区域内的像素数据进行相关分析,估计上述子分析区域的至少分子数或扩散常数中的任意一项;以及
图像形成步骤,映射上述分子数或扩散常数,形成上述分子数或扩散常数的图像。
2.根据权利要求1所述的图像分析方法,其中,
上述观察区域的图像是二维或三维图像。
3.根据权利要求1所述的图像分析方法,其中,
上述移动步骤使上述子分析区域按1像素以上的移动量移动。
4.根据权利要求1所述的图像分析方法,其中,
上述相关分析步骤使用荧光强度、像素时间、行时间、帧时间、像素位置关系、像素尺寸或关于以上数据的统计值进行上述相关分析。
5.根据权利要求1所述的图像分析方法,其中,
上述相关分析步骤使用上述数据的平均值、最大值、最小值、相对差或绝对差中的任意一项进行上述相关分析。
6.根据权利要求1所述的图像分析方法,其中,
上述相关分析步骤使用重构上述数据而取得的重构数据进行上述相关分析。
7.根据权利要求1所述的图像分析方法,其中,
上述相关分析步骤采用下述的式(1)或式(2)进行相关计算,对上述相关计算的结果采用下述的式(3)进行拟合,估计二维分析区域的上述分子数或扩散常数,
【式1】
G sa ( ξ , ψ ) = Σ I 1 ( x , y ) * I 1 ( x + ξ , y + ψ ) / M 11 ( Σ I 1 ( x , y ) / M 1 ) 2 . . . ( 1 )
这里,Gsa是RICS的空间自相关值,I1是通道1的荧光强度数据,x、y是测定点的空间座标,ξ、ψ是相比测定点的空间座标变化量,M11是通道1的数据的积和计算的次数,M1是通道1的数据总数,
【式2】
G sc ( ξ , ψ ) = Σ I 1 ( x , y ) * I 2 ( x + ξ , y + ψ ) / M 12 ( Σ I 1 ( x , y ) / M 1 ) · ( Σ I 2 ( x , y ) / M 2 ) . . . ( 2 )
这里,Gsc是RICS的空间互相关值,I1是通道1的荧光强度数据,I2是通道2的荧光强度数据,x、y是测定点的空间座标,ξ、ψ是相比测定点的空间座标变化量,M12是通道1和通道2的数据的积和计算的次数,M1是通道1的数据总数,M2是通道2的数据总数,
【式3】
Gs(ξ,ψ)=S(ξ,ψ)*G(ξ,ψ)
S ( ξ , ψ ) = exp ( - 1 2 * [ ( 2 ξ δ r W 0 ) 2 + ( 2 ψ δ r W 0 ) 2 ] ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ l ψ ) W 0 2 ) ) . . . ( 3 )
G ( ξ , ψ ) = 1 N ( ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ l ψ ) W 0 2 ) - 1 * ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ l ψ ) W Z 2 ) - 1 / 2 )
这里,GS是RICS的空间相关值,S是RICS的分析中的扫描的影响,G是RICS的分析中的时间迟延的影响,D是扩散常数,δr是像素尺寸,N是分子数,ξ、ψ是相比测定点的空间座标变化量,W0是激励激光束的横向的半径,Wz是激励激光束的纵向的半径,τp是像素时间,τl是行时间。
8.根据权利要求1所述的图像分析方法,其中,
上述相关分析步骤采用下述的式(4)或式(5)进行相关计算,对上述相关计算的结果采用下述的式(6)进行拟合,估计三维分析区域的上述分子数或扩散常数,
【式4】
G sa ( ξ , ψ , η ) = Σ I 1 ( x , y , z ) * I 1 ( x + ξ , y + ψ , z + η ) / M 11 ( Σ I 1 ( x , y , z ) / M 1 ) 2 . . . ( 4 )
这里,Gsa是RICS的空间自相关值,I1是通道1的荧光强度数据,x、y、z是测定点的空间座标,ξ、ψ、η是相比测定点的空间座标变化量,M11是通道1的数据的积和计算的次数,M1是通道1的数据总数,
【式5】
G sc ( ξ , ψ , η ) = Σ I 1 ( x , y , z ) * I 2 ( x + ξ , y + ψ , z + η ) / M 12 ( Σ I 1 ( x , y , z ) / M 1 ) · ( Σ I 2 ( x , y , z ) / M 2 ) . . . ( 5 )
这里,Gsc是RICS的空间互相关值,I1是通道1的荧光强度数据,I2是通道2的荧光强度数据,x、y、z是测定点的空间座标,ξ、ψ、η是相比测定点的空间座标变化量,M12是通道1和通道2中的数据的积和计算的次数,M1是通道1的数据总数,M2是通道2的数据总数,
【式6】
Gs(ξ,ψ,η)=S(ξ,ψ,η)*G(ξ,ψ,η)
S ( ξ , ψ , η ) = exp ( - 1 2 * [ ( 2 ξ δ r W 0 ) 2 + ( 2 ψ δ r W 0 ) 2 + ( 2 η δ r W 0 ) 2 ] ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ l ψ + τ f η + W 0 2 ) ) G ( ξ , ψ , η ) = 1 N ( ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ l ψ + τ f η ) W 0 2 ) - 1 * ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ l ψ + τ f η W Z 2 ) - 1 / 2 ) . . . ( 6 )
这里,Gs是RICS的空间相关值,S是RICS的分析中的扫描的影响,G是RICS的分析中的时间迟延的影响,D是扩散常数,δr是像素尺寸,N是分子数,ξ、ψ、η是空间座标的变化量,W0是激励激光束的横向的半径,Wz是激励激光束的纵向的半径,τp是像素时间,τl是行时间,τf是帧时间。
9.根据权利要求1所述的图像分析方法,其中,该图像分析方法还具备:
扩展计算步骤,采用具有二维或三维分布的扩展函数,对上述分子数或扩散常数进行扩展计算,取得扩展分子数或扩展扩散常数;
扩展图像形成步骤,映射上述扩展分子数或扩展扩散常数,形成上述扩展分子数或扩展扩散常数的图像。
10.根据权利要求9所述的图像分析方法,其中,该图像分析方法还具备:
图像变换步骤,将上述扩展分子数或扩展扩散常数的位置信息作为加权系数,将上述扩展分子数或扩展扩散常数的图像变换为与上述分析区域相同的图像尺寸。
11.根据权利要求10所述的图像分析方法,其中,该图像分析方法还具备:
显示步骤,显示上述分子数或扩散常数的图像或上述扩展分子数或扩展扩散常数的图像。
12.一种图像分析装置,其具备:
图像取得部,其取得由多个像素构成的观察区域的图像,该多个像素分别具有按时序取得的多个数据;
分析区域设定部,其对上述观察区域的图像设定分析区域;
子分析区域调整部,其设定比上述分析区域小的子分析区域,并且,在整个上述分析区域隔开像素间隔断续地移动上述子分析区域;以及
分析处理部,其在每次上述移动时使用上述子分析区域内的像素数据进行相关分析,估计上述子分析区域的至少分子数或扩散常数中的任意一项,并且,映射上述分子数或扩散常数,形成上述分子数或扩散常数的图像。
13.根据权利要求12所述的图像分析装置,其中,
上述观察区域的图像是二维或三维图像。
14.根据权利要求12所述的图像分析装置,其中,
上述子分析区域调整部按1像素以上的移动量移动上述子分析区域。
15.根据权利要求12所述的图像分析装置,其中,
上述分析处理部使用荧光强度、像素时间、行时间、帧时间、像素位置关系、像素尺寸或关于以上数据的统计值进行上述相关分析。
16.根据权利要求12所述的图像分析装置,其中,
上述分析处理部使用上述数据的平均值、最大值、最小值、相对差或绝对差中的任意一项进行上述相关分析。
17.根据权利要求12所述的图像分析装置,其中,
上述分析处理部使用重构上述数据而取得的重构数据进行上述相关分析。
18.根据权利要求12所述的图像分析装置,其中,
上述分析处理部用下述的式(1)或式(2)进行相关计算,对上述相关计算的结果用下述的式(3)进行拟合,估计二维分析区域的上述分子数或扩散常数,
【式7】
G sa ( ξ , ψ ) = Σ I 1 ( x , y ) * I 1 ( x + ξ , y + ψ ) / M 11 ( Σ I 1 ( x , y ) / M 1 ) 2 . . . ( 1 )
这里,Gsa是RICS的空间自相关值,I1是通道1的荧光强度数据,x、y是测定点的空间座标,ξ、ψ是相比测定点的空间座标变化量,M11是通道1的数据的积和计算的次数,M1是通道1的数据总数,
【式8】
G sc ( ξ , ψ ) = Σ I 1 ( x , y ) * I 2 ( x + ξ , y + ψ ) / M 12 ( Σ I 1 ( x , y ) / M 1 ) · ( Σ I 2 ( x , y ) / M 2 ) . . . ( 2 )
这里,Gsc是RICS的空间互相关值,I1是通道1的荧光强度数据,I2是通道2的荧光强度数据,x、y是测定点的空间座标,ξ、ψ是相比测定点的空间座标变化量,M12是通道1和通道2的数据的积和计算的次数,M1是通道1的数据总数,M2是通道2的数据总数,
【式9】
Gs(ξ,ψ)=S(ξ,ψ)*G(ξ,ψ)
S ( ξ , ψ ) = exp ( - 1 2 * [ ( 2 ξ δ r W 0 ) 2 + ( 2 ψ δ r W 0 ) 2 ] ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ l ψ ) W 0 2 ) ) . . . ( 3 )
G ( ξ , ψ ) = 1 N ( ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ l ψ ) W 0 2 ) - 1 * ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ l ψ ) W Z 2 ) - 1 / 2 )
这里,Gs是RICS的空间相关值,S是RICS的分析中的扫描的影响,G是RICS的分析中的时间迟延的影响,D是扩散常数,δr是像素尺寸,N是分子数,ξ、ψ是相比测定点的空间座标变化量,W0是激励激光束的横向的半径,Wz是激励激光束的纵向的半径,τp是像素时间,τl是行时间。
19.根据权利要求12所述的图像分析装置,其中,
上述分析处理部用下述的式(4)或式(5)进行相关计算,对上述相关计算的结果用下述的式(6)进行拟合,估计三维分析区域的上述分子数或扩散常数,
【式10】
G sa ( ξ , ψ , η ) = Σ I 1 ( x , y , z ) * I 1 ( x + ξ , y + ψ , z + η ) / M 11 ( Σ I 1 ( x , y , z ) / M 1 ) 2 . . . ( 4 )
这里,Gsa是RICS的空间自相关值,I1是通道1的荧光强度数据,x、y、z是测定点的空间座标,ξ、ψ、η是相比测定点的空间座标变化量,M11是通道1的数据的积和计算的次数,M1是通道1的数据总数,
【式11】
G sc ( ξ , ψ , η ) = Σ I 1 ( x , y , z ) * I 2 ( x + ξ , y + ψ , z + η ) / M 12 ( Σ I 1 ( x , y , z ) / M 1 ) · ( Σ I 2 ( x , y , z ) / M 2 ) . . . ( 5 )
这里,Gsc是RICS的空间互相关值,I1是通道1的荧光强度数据,I2是通道2的荧光强度数据,x、y、z是测定点的空间座标,ξ、ψ、η是相比测定点的空间座标变化量,M12是通道1和通道2中的数据的积和计算的次数,M1是通道1的数据总数,M2是通道2的数据总数,
【式12】
Gs(ξ,ψ,η)=S(ξ,ψ,η)*G(ξ,ψ,η)
S ( ξ , ψ , η ) = exp ( - 1 2 * [ ( 2 ξ δ r W 0 ) 2 + ( 2 ψ δ r W 0 ) 2 + ( 2 η δ r W 0 ) 2 ] ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ l ψ + τ f η + W 0 2 ) ) G ( ξ , ψ , η ) = 1 N ( ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ l ψ + τ f η ) W 0 2 ) - 1 * ( 1 + 4 D ( τ p ξ + τ l ψ + τ f η W Z 2 ) - 1 / 2 ) . . . ( 6 )
这里,Gs是RICS的空间相关值,S是RICS的分析中的扫描的影响,G是RICS的分析中的时间迟延的影响,D是扩散常数,δr是像素尺寸,N是分子数,ξ、ψ、η是空间座标的变化量,W0是激励激光束的横向的半径,Wz是激励激光束的纵向的半径,τp是像素时间,τl是行时间,τf是帧时间。
20.根据权利要求12所述的图像分析装置,其中,
上述分析处理部还采用具有二维或三维分布的扩展函数,对上述分子数或扩散常数进行扩展计算,取得扩展分子数或扩展扩散常数,并且,映射上述扩展分子数或扩展扩散常数,形成上述扩展分子数或扩展扩散常数的图像。
21.根据权利要求20所述的图像分析装置,其中,
上述分析处理部还将上述扩展分子数或扩展扩散常数的位置信息作为加权系数,将上述扩展分子数或扩展扩散常数的图像变换为与上述分析区域相同的图像尺寸。
22.根据权利要求21所述的图像分析装置,其中,
该图像分析装置还具备显示部,该显示部显示上述分子数或扩散常数的图像或上述扩展分子数或扩展扩散常数的图像。
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