CN102526107A - 一种熊胆提取物、制备方法及其在制备治疗烫伤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从中药熊胆粉中得到的熊胆提取物、其制备方法及其在制备治疗烫伤药物中的应用。本发明的熊胆提取物采用提取溶剂对熊胆粉进行提取,提取溶液干燥后进行大孔树脂柱分离;小鼠创面愈合试验结果表明本发明制备的熊胆提取物的烫伤性创面愈合率高,愈合时间短,病理检查表明治疗小鼠新生皮肤结构比较完整,排列紧密,无明显疤痕产生。本发明熊胆提取物制备方法简单,成本低廉,为治疗烧烫伤提供了一种新的药物来源。
Description
技术领域
本发明涉及一种胆酸类成分的组合物、其制备方法及其在制备预防和治疗烫伤药物中的应用,特别涉及一种熊胆的提取物、制备方法及其在制备预防、治疗烫伤药物中的应用,属于医药技术领域。
背景技术
烧烫伤是由于物理、化学、放射线等诸多因素作用于机体所引起的组织损害,主要是针对皮肤和(或)黏膜,严重的情况下也会伤及皮下组织,是一种极其复杂的外伤性疾患,存在着创面疼痛、进行性坏死、易感染、瘢痕愈合四大难题。
针对烧烫伤治疗的相关药物分为西药和中药,其各自在烧烫伤的治疗上均已有一定的进展。西药对烧烫伤的治疗作用在于消炎,抗感染,生肌,促进作品愈合,促进上皮生长等。预防治疗烧伤创面感染、消炎、抗菌,目前应用较多的是抗生素类药物,如青霉素、头孢、磺胺嘧啶等。虽然在严重烧伤后早期短程使用高效抗生素能够有效预防烧伤后感染并降低内脏并发症的发生率,但由于烧伤感染的常见菌不断变迁,病原菌对抗生素类药物的耐受性增强,这些都使抗生素的应用存在一定的隐患。
中医中的许多方剂在治疗烧烫伤方面应用广泛,如大黄,泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经,外治水火烫伤;黄连和黄芩,清热燥湿、泻火解毒;黄柏,清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮;四黄,抗菌、消炎,为控制创面的感染奠定了良好的基础。中医及中药制剂治疗烧烫伤有着悠久的历史和丰富的经验,而使中药在治疗烫伤过程中占有重要地位。目前市场上的烧烫伤药物品种较少,难以满足患者需求,因此开发疗效显著的新型烫伤外用制剂具有重要的临床意义。
熊胆为熊科动物黑熊Selenaretosthibetanus Cuvier或棕熊Ursusarctoslinnaeus的胆囊,囊内有干燥胆汁。熊胆粉是采用导管活体引流熊胆汁干燥而成,其化学成分与天然熊胆基本一致,主要含有结合型熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、胆酸、去氧胆酸、蛋白质、肽、微量游离氨基酸、微量胆色素、胆固醇、脂肪酸和无机元素,其胆汁酸通常与牛磺酸、甘氨酸结合,并形成钠或钙盐。熊胆是我国传统珍贵中药,作为中国四大动物药材之首,入药已有几千年历史,素有“药中黄金”之美誉。据文献记载熊胆具有抗菌、消炎、保肝、利胆排石、抗惊厥、镇痛、抗肿瘤、解热、镇静和降血脂等广泛的药理作用。
目前,虽然有将熊胆用于伤烫伤的治疗,但是都是与其他药物组合应用的复方药剂,这些中药组合物对治疗烫伤具有一定的疗效,但其疗效不确切,作用不可靠,烫伤创面愈合后新生皮肤结构不完整,皮肤表面粗糙,都具有明显的疤痕;而且还需要使用多种名贵中药材,药物价格昂贵。例如:专利号为ZL 96103267.7的中国发明专利公开了一种雪莲烧伤膏,含有雪莲花、西红花、紫草、熊胆、麝香、冰片、芝麻油和白凡士林;专利号为ZL 98112115.2的中国发明专利公开了一种烧烫伤浸液,由汞溴红溶液、香水、75%酒精、麝香、熊胆及犀角组成;专利号为ZL 98106741.7的中国发明专利公开了一种治疗外伤的药膏,由海松脂、血竭、鹿茸、血余炭灰、海蛤、白蜡、黄蜡、熊胆粉、明矾、雄黄和大麻油配制而成;专利号为ZL 00113213.X的中国发明专利公开了一种外伤药及制备方法,由10-20%熊胆粉、2-8%麝香、50-70%大黄及15-30%白芷组成。上述这些复方中药组合物制备工艺复杂,操作方法繁琐。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术中存在的问题提供一种制备方法简单,成本低廉,对皮肤烫伤的预防和治疗具有较好疗效的熊胆提取物、其制备方法及其预防和治疗脂肪肝应用。
为了实现本发明的目的,本发明一方面提供一种熊胆提取物的制备方法,包括如下顺序进行的步骤:
1)采用甲醇或乙醇对熊胆粉进行提取,制得熊胆醇提物;
2)将熊胆醇提物进行大孔树脂柱分离,即得。
其中,所述步骤1)中所述的甲醇或乙醇的体积与熊胆粉的重量之比为5-20∶1,即当熊胆粉的重量(干重)为1kg时,甲醇或乙醇的体积为5-20L;当熊胆粉的重量(干重)为1g时,甲醇或乙醇的体积为5-20ml;优选为6-12∶1,进一步优选为8-10∶1。
特别是,步骤1)中所述对熊胆粉进行提取包括:首先将熊胆粉加入到第一批甲醇或乙醇中,搅拌均匀后过滤,收集滤液;接着用第二批甲醇或乙醇洗涤滤渣,洗涤液与滤液合并;然后将合并后的洗涤液与滤液干燥。
特别是,第一批甲醇或乙醇的体积与熊胆粉的重量之比为5-10∶1,即当熊胆粉的重量(干重)为1kg时,甲醇或乙醇的体积为5-10L;当熊胆粉的重量(干重)为1g时,甲醇或乙醇的体积为5-10ml;优选为6-8∶1。
特别是,第二批甲醇或乙醇的体积与熊胆粉的重量之比为2-5∶1,即当熊胆粉的重量(干重)为1kg时,甲醇或乙醇的体积为2-5L;当熊胆粉的重量(干重)为1g时,甲醇或乙醇的体积为2-5ml;优选为2∶1。
其中,所述步骤2)中所述大孔树脂柱分离包括如下步骤:
A)向熊胆醇提物中加入蒸馏水,溶解,制成熊胆水溶液;
B)将熊胆水溶液上大孔树脂柱,依次采用蒸馏水、质量百分比浓度为20%、40%、70%、95%的乙醇溶液为流动相进行梯度洗脱,收集洗脱液;
C)将洗脱液蒸干,即得。
其中,所述步骤A)中所述蒸馏水与熊胆醇提物的重量之比为2-5∶1。
其中,所述步骤B)中所述大孔树脂为极性或非极性大孔树脂。
特别是,所述的大孔树脂选择D101、HPD-100、D-201、AB-8或HP-20型大孔吸附树脂中的一种。
其中,所述大孔树脂柱内的大孔吸附树脂与熊胆醇提物的重量之比为10-20∶1,优选为14-15∶1。
特别是,步骤B)中所述流动相的体积与熊胆醇提物的重量之比为80-90∶1,即,即当熊胆醇提物重量(干重)为1kg时,流动相的体积为80-90L,当熊胆醇提物重量(干重)为1g时,流动相的体积为80-90ml,优选为85-87∶1。
尤其是,步骤B)中所述收集洗脱液是将每个洗脱梯度的洗脱液分别收集,即将以蒸馏水为流动相的洗脱液收集为一个流份;将以质量百分比浓度为20%的乙醇溶液为流动相的洗脱液收集为一个流份;将以质量百分比浓度为40%的乙醇溶液为流动相的洗脱液收集为一个流份;将以质量百分比浓度为70%的乙醇溶液为流动相的洗脱液收集为一个流份;将以质量百分比浓度为95%的乙醇溶液为流动相的洗脱液收集为一个流份。
本发明另一方面提供一种按照上述方法制备而成的熊胆提取物。
其中,制备的所述熊胆提取物中牛磺熊去氧胆酸的含量≥20%,牛磺鹅去氧胆酸的含量≥60%。
本发明的熊胆提取物可以和药剂学上可接受的辅料按传统或现代生产工艺制备成临床上可以接受的剂型,如膏剂、喷雾剂、散剂、气雾剂,优选的剂型为膏剂、喷雾剂。
本发明再一方面提供一种按照上述方法制备而成的熊胆提取物在制备治疗烫伤的药物中的应用。
本发明具有以下优点:
1、本发明的熊胆提取物的制备工艺方法简单,操作简便,操作工艺条件容易控制,质量可控性强。
2、本发明方法制备的熊胆提取物中牛磺熊去氧胆酸的含量≥20%,牛磺鹅去氧胆酸的含量≥60%,有效成分含量高,为治疗烫伤提供了一种新的药物来源。
3、本发明方法制备的熊胆提取物能有效促进烫伤的创伤面愈合,创伤面愈合迅速,创伤面愈合率高达99%,愈合时间短,10天左右小鼠创面痂皮脱落,新上皮生成,创面完全上皮化。
4、利用本发明制备的熊胆提取物治疗烫伤,创伤面的新生皮肤结构完整,表皮细胞排列紧密,皮肤表面光滑,无明显疤痕产生,可以显著抑制创面愈合后的疤痕产生,在治疗烫伤和预防疤痕方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为烫伤模型组小鼠病理形态学的显微镜观察图;
图2为阳性药物京万红烫伤膏组小鼠病理形态学的显微镜观察图;
图3为阳性药物熊胆粉组小鼠病理形态学的显微镜观察图;
图4为本发明制备的熊胆提取物组小鼠病理形态学的显微镜观察图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1:
1、制备熊胆粉醇提物
向250g熊胆粉中加入2L甲醇,搅拌溶解后,过滤,滤渣用500ml甲醇洗涤两次,将2次的洗涤液合并到滤液中,制得熊胆甲醇溶液;
蒸干熊胆甲醇溶液,制得241g熊胆醇提物。
2、大孔树脂柱分离
1)用乙醇和蒸馏水交替洗涤D101型大孔树脂,直至洗涤液澄清,然后用蒸馏水洗涤至无乙醇,备用;
2)取230g熊胆醇提物加水溶解,制得熊胆水溶液,其中加入水的重量为1kg,与熊胆醇提物的重量之比为4.35∶1;
3)将熊胆水溶液通过大孔树脂柱,熊胆水溶液通过大孔树脂柱的流速为40ml/min,待熊胆水溶液完全流入树脂后,依次以蒸馏水、质量百分比浓度为20%、40%、70%、95%的乙醇为流动相进行梯度洗脱,将各个梯度的流动相进行洗脱时的洗脱液分别收集,即供收集5个流份,其中,大孔树脂的重量为3400g,与熊胆醇提物的重量之比为14.8∶1,大孔树脂柱的柱直径与柱高之比为1∶2;各个流动相的用量分别为20L,洗脱流速为40ml/min;
4)将流动相为质量百分比浓度为40%的乙醇洗脱的流份蒸干,即得熊胆提取物。
采用HPLC法测定制得的熊胆提取物中牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸的含量:
液相分析条件:岛津ODS柱150*4.6,流动相33%乙腈-15mmol/LNaH2PO4水溶液,柱温30度,流速1ml/min;
HPLC法测得熊胆提取物中牛磺熊去氧胆酸的含量为20.0%;牛磺鹅去氧胆酸的含量为63.6%。
实施例2:
制备熊胆粉醇提物步骤,除了提取溶剂为乙醇,乙醇用量为1.5L,制得230g熊胆醇提物之外,其余与实施例1相同;
大孔树脂分离步骤,除了选用4600g HPD100型树脂,HPD100型树脂与熊胆醇提物的重量之比为20∶1,大孔树脂柱的柱直径与柱高之比为1∶2.5之外,其余与实施例1相同。
采用HPLC法测定制得的熊胆提取物中牛磺熊去氧胆酸的含量为20.5%;牛磺鹅去氧胆酸的含量为62.8%。
实施例3:制备熊胆提取物烫伤膏
处方:共制成1000g,各组分及含量如下:
熊胆提取物 165g
凡士林 785g
羊毛脂 50g
将熊胆提取物粉碎成细粉后,加入凡士林和羊毛脂,加热,滤过,放冷至半凝固状,即制得熊胆提取物烫伤膏。
实施例4:制备烫伤喷雾剂
处方:供制成1000ml,各组分及含量如下:
熊胆提取物 150g
乙醇(质量百分比浓度为60%) 1000mL
将熊胆提取物粉碎后置于消毒容器中,加入稀乙醇,即制得烫伤喷雾剂。
试验例:对小鼠皮肤烫伤的治疗作用
1、材料与方法
试验动物:25-30g,雄性,昆明小鼠32只,购自厦门大学实验动物中心。
试验药物:
熊胆粉(XD,阳性对照药,福建归真堂药业股份有限公司,1g/盒);
京万红烫伤膏(JWH,阳性对照药,天津达仁堂京万红药业有限公司,20g/盒);
本发明实施例1制备的熊胆提取物。
试验试剂:
乙醚、脱毛剂(2%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液+10%硫化钠溶液)。
试验仪器:
恒温水浴锅、电子天平、Leica组织包埋机、Leica石蜡切片机、电子显微镜。
2、实验方法
(1)烫伤模型的建立
将小鼠背部的毛剃干净后再用脱毛剂脱毛;次日让小鼠将乙醚吸入体内至麻醉;将直径为2cm的圆形厚玻璃片放入恒温85℃的热水中浸泡加热10min,取出立即贴于小鼠脱毛后的皮肤上,持续15s,使之造成深II度烫伤,烫伤面积为3.14cm2,制得烫伤模型。
(2)给药
分别将熊胆粉及本发明制备的熊胆提取物溶解于2%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液,制得浓度均为300mg/ml的熊胆粉CMC-Na溶液及熊胆提取物CMC-Na溶液;
实验动物随机分为四组,分别为模型组、京万红治疗组(JWH)、熊胆粉治疗组(XD)和本发明熊胆提取物(NXD),每组8只。烫伤后立即涂抹治疗药物,模型组涂抹2%羧甲基纤维素钠溶液(CMC-Na溶液),烫伤治疗组分别涂抹熊胆粉CMC-Na溶液(300mg/ml),本发明熊胆提取物CMC-Na溶液(300mg/ml)和京万红烫伤膏。烫伤治疗组熊胆粉治疗组(XD)和本发明熊胆提取物(NXD)每天上、下午各2次,每次约0.2mL;京万红治疗组每天上、下午各2次,每次约3g/kg。
3、检测方法及结果
(一)创面愈合率:
从给药后第三天开始,每5d用透明硫酸纸描绘皮肤烫伤面积的图形1次,称取烫伤皮肤面积图纸的重量,以该重量变化表示皮肤烫伤面积的变化,并将用药前后透明硫酸纸的重量之差与用药前的透明硫酸纸重量的比值作为烫伤创面愈合率,以此评价受试药物的作用。计算公式如下:
创面愈合率=(原始创面重量-测定日创面重量)/原始创面重量
创面愈合率的计算结果如表1所示,试验所得数据均以x±s表示,采用spss软件进行ANOVA分析。
表1给药后3d、7d和11d各组的创面愈合率
注:相对于模型组,*p<0.05,**p<0.01。
由表1可知:
1)本发明制备的熊胆提取物组的创伤面愈合率显著高于对照组,相对于模型组具有显著性差异,说明本发明的熊胆提取物能够有效地治疗烫伤创面,烫伤创伤面愈合率高,愈合迅速;
2)在给药后第7d及第11d,熊胆提取物治疗组小鼠创伤面愈合率高于阳性药京万红烫伤膏及阳性药熊胆粉组,给药7d后创伤面愈合率达到82%以上;给药11d之后,创伤面愈合率达到99%,说明本发明制备的熊胆提取物具有更好的创伤面愈合治疗效果。
(二)创面愈合时间:
创面愈合判断标准:创面痂皮脱落,新上皮生成,即创面完全上皮化;
观察模型小鼠创面愈合情况,计算小鼠创面达到上述判断标准的时间,计为创面愈合时间,如果如表2所示,试验所得数据均以x±s表示,采用spss软件进行ANOVA分析。
表2各组的创面愈合时间
动物数(n) | 创伤面愈合时间(天) | |
模型组 | 8 | 16.75±3.91 |
阳性药物组(JWH) | 8 | 12.25±3.88* |
阳性药物组(XD) | 8 | 12±1.77** |
熊胆提取物 | 8 | 9.88±1.46**▲▲ |
注:相对于模型组,*p<0.05,**p<0.01;相对于阳性药物组(JWH)组,▲p<0.05,▲▲p<0.01由表2可知:
1)阳性药物京万红烫伤膏(JWH)组、阳性药物熊胆粉组以及本发明的熊胆提取物均能够更快地使模型小鼠的创伤面愈合,且相对于模型组具有显著性差异;
2)本发明的熊胆提取物治疗组小鼠创伤面愈合时间小于阳性药京万红烫伤膏及阳性药熊胆粉组,且相对阳性药物京万红组具有显著性差异,小鼠烫伤创伤面愈合时间为9.88天,显著低于模型组和阳性药物组,说明本发明制备的熊胆提取物具有更好的创伤面愈合治疗效果。
(三)病理形态学观察:
末次用药后次日,小鼠脱颈臼处死,剪取烫伤部位组织完整、能反映皮损全貌及深层结构的皮肤,固定于4%甲醛溶液中,石蜡包埋切片,伊红(HE)染色(具体操作方法详见《皮肤组织病理切片制作流程》),显微镜下观察比较各组小鼠的烫伤皮肤的愈合程度,结果如图1-4所示。
病理形态学观察检查结果表明:
1、模型组皮肤组织破坏严重,表皮细胞大部分极度变形,破裂(如图1)。治疗组的阳性药物京万红组(JWH)和熊胆粉(XD)组,都可以不同程度地修复皮肤细胞的形态,并在一定程度上恢复皮肤细胞的排列状态,但是皮肤组织表皮细胞排列松散,不规则,有明显的疤痕产生(如图2、3)。
2、本发明的熊胆提取物治疗组的新生皮肤结构完整,表皮细胞排列紧密,皮肤组织得到了非常完善的修复,新生成的皮肤表面光滑,无明显疤痕产生,如图4所示。
综上所述,本发明制备的熊胆提取物,治疗烫伤的愈合时间短,仅为9.88天即可完全愈合;创伤面愈合率高,给药7d后创伤面愈合率达到82%以上;给药11d之后,创伤面愈合率达到99%;而且愈合后的皮肤结果完整,细胞排列紧密,可以明显改善皮肤损伤后的愈合疤痕,说明本发明制备的熊胆提取物在治疗烫伤和预防疤痕方面具有良好的应用前景。
Claims (9)
1.一种熊胆提取物的制备方法,其特征是包括如下顺序进行的步骤:
1)采用甲醇或乙醇对熊胆粉进行提取,制得熊胆醇提物;
2)将熊胆醇提物进行大孔树脂柱分离,即得。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征是步骤1)中所述的甲醇或乙醇的体积与熊胆粉的重量之比为5-20∶1。
3.如权利要求1或2所述的制备方法,其特征是步骤1)中所述对熊胆粉进行提取包括:首先将熊胆粉加入到第一批甲醇或乙醇中,搅拌均匀后过滤,收集滤液;接着用第二批甲醇或乙醇洗涤滤渣,合并洗涤液与滤液;然后将合并后的洗涤液与滤液干燥。
4.如权利要求1或2所述的制备方法,其特征是步骤2)中所述大孔树脂柱分离包括如下步骤:
A)向熊胆醇提物中加入蒸馏水,溶解,制成熊胆水溶液;
B)将熊胆水溶液上大孔树脂柱,依次采用蒸馏水、质量百分比浓度为20%、40%、70%、95%的乙醇溶液为流动相进行梯度洗脱,收集洗脱液;
C)将洗脱液蒸干,即得。
5.如权利要求4所述的制备方法,其特征是步骤A)中所述蒸馏水与熊胆醇提物的重量之比为2-5∶1。
6.如权利要求4所述的制备方法,其特征是步骤B)中所述大孔树脂为极性或非极性大孔树脂。
7.如权利要求4所述的制备方法,其特征是步骤B)中所述大孔树脂与熊胆醇提物的重量之比为10-20∶1。
8.一种熊胆提取物,其特征是按照如权利要求1-7任一所述方法制备而成。
9.如权利要求8所述的熊胆提取物在制备治疗烫伤的药物中的应用。
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