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Abstract

一种液相芯片检测金黄色葡萄球菌的方法，属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。本发明的目的是提供一种运用液相芯片技术，提供一种用于检测金黄色葡萄球菌的方法，以便实现对金黄色葡萄球菌的快速检测。本发明制备了液相芯片，然后应用液相芯片检测金黄色葡萄球菌。本发明液相芯片是集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术，其最大的特点是高通量，灵活性好，灵敏度高。运用液相芯片技术检测金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus）的方法，以便实现对金黄色葡萄球菌的快速检测，为食品安全做出贡献。

Description

液相芯片检测金黄色葡萄球菌的方法
技术领域
本发明属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。
背景技术
金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌存在于自然界的空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中。因而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。因此建立一种及时，快速，准确的检测金黄色葡萄球菌的方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种运用液相芯片技术，用于检测金黄色葡萄球菌的方法，以便实现对金黄色葡萄球菌的快速检测。
本发明由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白组成，所述微球为羧基化的31号微球；所述捕获抗体是金黄色葡萄球菌单克隆抗体，所述检测抗体是金黄色葡萄球菌的多克隆抗体，生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与金黄色葡萄球菌结合，以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合金黄色葡萄球菌的数量；
捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声10min，漩涡震荡30s，使微球均匀分布；用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul 的微球原液置于1.5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min，取出后弃上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化缓冲液，混匀后，用铝箔纸包好，置于37℃摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心5min，小心移去上清，加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体，重悬混匀，置于37℃摇床120 rpm，孵育2h，取出后离心弃上清，用500ul的PBS进行洗涤，洗涤后加入500ul 1％BSA的 PBS溶液，重悬微球，37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭，封闭后4℃保存；
液相芯片检测金黄色葡萄球菌
将已偶联的微球混合液室温恢复10min，漩涡振荡器震荡约3min，取约5000个微球，加入108 CFU/ml 的金黄色葡萄球菌10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心弃上清，用200ul PBS-TBN洗两次，加入已稀释的检测抗体10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次，然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床反应1h，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次，再加入SA-PE，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次，重悬于100ul PBS-TBN中，上机进行检测。
本发明液相芯片是集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术，其最大的特点是高通量，灵活性好，灵敏度高。运用液相芯片技术检测金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）的方法，以便实现对金黄色葡萄球菌的快速检测，为食品安全做出贡献。
附图说明
图1是本发明捕获抗体最佳工作浓度；
图2是本发明灵敏度检测结果；
图3是本发明特异性的检测结果；
图4是本发明重复性检测结果；
图5是本发明在进行检测时所显示微球位置以及数量的实时图的点状图；
图6是本发明在进行检测时所显示微球位置以及数量的实时图的柱状图。
具体实施方式
本发明所采用的技术方案是：通过金黄色葡萄球菌的特异抗体，与微球进行偶联后，制备出可以对金黄色葡萄球菌进行检测的液相芯片，在应用时，加入样品增菌液，使增菌液中的金黄色葡萄球菌被微球上的捕获抗体所捕获，检测抗体也与金黄色葡萄球菌结合后，再与生物素标记的抗抗体共同孵育，然后通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白反应，应用Luminex100检测系统实现对金黄色葡萄球菌的特异检测。
本发明涉及的检测金黄色葡萄球菌液相芯片主要由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）组成。所述微球为羧基化的31号微球；所述捕获抗体是金黄色葡萄球菌的单克隆抗体（St.a mAb），所述检测抗体是金黄色葡萄球菌的多克隆抗体（St.a pAb），生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG(biotin-羊抗兔IgG)；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与金黄色葡萄球菌结合。以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合金黄色葡萄球菌的数量。
上述的检测抗体是用于识别金黄色葡萄球菌的另一类抗体，其作用是将与液相芯片上捕获抗体结合的金黄色葡萄球菌与抗抗体结合，而抗抗体能与检测荧光偶联，间接将结合的金黄色葡萄球菌浓度与检测荧光的强度结合起来，从而实现对金黄色葡萄球菌的浓度进行定量测定。生物素标记的抗抗体通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白结合，最后通过Luminex100检测系统对金黄色葡萄球菌进行定性定量检测。
（1）捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声10min，漩涡震荡30s，使微球均匀分布。用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS。然后取200ul 的微球原液置于1.5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min。取出后弃上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化缓冲液。混匀后，用铝箔纸包好，置于37℃摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心5min，小心移去上清。加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体，重悬混匀，置于37℃摇床120 rpm，孵育2h。取出后离心弃上清，用500ul的PBS进行洗涤，洗涤后加入500ul 1％BSA的 PBS溶液，重悬微球，37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭。封闭后4℃保存。
（2）应用液相芯片检测金黄色葡萄球菌的方法
将已偶联的微球混合液室温恢复10min，漩涡振荡器震荡约3min。取约5000个微球，加入108 CFU/ml 的金黄色葡萄球菌10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul。置于37℃摇床120rpm，1h。取出后离心弃上清，用200ul PBS-TBN洗两次。加入已稀释的检测抗体10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul。 置于37℃摇床120rpm，1h。取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次。然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul。 置于37℃摇床反应1h。取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次。再加入SA-PE，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次。重悬于100ul PBS-TBN中，上机进行检测。
1.捕获抗体最佳工作浓度的确定
见图1，当单抗浓度为250ug/ml时，其MFI值达到最大，故单抗最佳的工作浓度为250ug/ml。
2．偶联是否成功的检测
  生物素标记羊抗鼠IgG 生物素标记羊抗兔IgG
MFI 7783.6 17
MFI背景值 10 6
由上述结果可知单抗与微球偶联效果很好，且封闭效果也良好。
3. 正交实验结果—确定反应较优条件
Figure 478771DEST_PATH_IMAGE001
根据上述结果可知实验条件A1B2C2D2为较优实验条件，即多抗工作浓度为1:100，生物素标记的羊抗兔IgG工作浓度为1:1000，SA-PE的工作浓度为2ug/ml,生物素标记的抗体与SA-PE反应时间为40min。
4. 灵敏度检测结果
由图2可以看出，在菌的浓度达到103CFU/ml时仍可被检出。因此本方法的灵敏度较高，可达到103CFU/ml。
5.特异性的检测结果
用已建立的方法检测从图3中可看出此方法特异性良好，与其它的菌无交叉反应。
6. 重复性试验
在1d，5，d，7d用此方法分别检测阳性菌和阴性菌，由图4可见阳性菌，阴性菌MFI值上下浮动都不大，可证明本方法重复性较好。
7. 实际样品添加的检测结果
样品 细菌 MFI
绿豆 金葡 999.5
绿豆 沙门氏菌 150
绿豆 空白 98
绿豆 空白 23（背景值）
兔肉 金葡 603
兔肉 沙门 91
兔肉 空白 151
兔肉 空白 10（背景值）
分别在绿豆和兔肉中添加金葡菌，沙门氏菌，并做空白对照，由上表可见在添加了实际样品后应用本方法仍可将金葡菌检出。
 图5中在空白圆圈内所出现的不同颜色的小点就是所检的目标微球。在下方出现的傻大的点可能是气泡，或是微球的聚集体。
图6中在两条红线即逻辑门边界中间所显示的为所检的目标微球，在两条红线外所出现的是微球的聚集物。

Claims (1)

1.一种液相芯片检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白组成，所述微球为羧基化的31号微球；所述捕获抗体是金黄色葡萄球菌单克隆抗体，所述检测抗体是金黄色葡萄球菌的多克隆抗体，生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与金黄色葡萄球菌结合，以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合金黄色葡萄球菌的数量；
捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声10min，漩涡震荡30s，使微球均匀分布；用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul 的微球原液置于1.5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min，取出后弃上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化缓冲液，混匀后，用铝箔纸包好，置于37℃摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心5min，小心移去上清，加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体，重悬混匀，置于37℃摇床120 rpm，孵育2h，取出后离心弃上清，用500ul的PBS进行洗涤，洗涤后加入500ul 1％BSA的 PBS溶液，重悬微球，37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭，封闭后4℃保存；
液相芯片检测金黄色葡萄球菌
将已偶联的微球混合液室温恢复10min，漩涡振荡器震荡约3min，取约5000个微球，加入108 CFU/ml 的金黄色葡萄球菌10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心弃上清，用200ul PBS-TBN洗两次，加入已稀释的检测抗体10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次，然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床反应1h，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次，再加入SA-PE，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次，重悬于100ul PBS-TBN中，上机进行检测。
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