CN102503826A

CN102503826A - 化合物Blapsins A和B，含其的药物组合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102503826A
Application number: CN2011102960736A
Authority: CN
Inventors: 程永现; 晏永明; 吕青
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2011-10-06
Filing date: 2011-10-06
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2031-10-06
Also published as: CN102503826B

Abstract

如下结构式所示的化合物1和2，以其为有效成分的药物组合物，它们的制备方法，及其在制备14-3-3小分子化学探针，在制备抗过表达14-3-3的癌症或神经退行性疾病的药物中的应用。本发明化合物1和2具有显著的抑制14-3-3蛋白作用。

Description

化合物Blapsins A和B,含其的药物组合物及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于药物化合物领域，具体地，涉及从日本琵琶甲虫体分离提取的天然化合物Blapsins A和B，其在制备小分子化学探针或在制备抗癌或抗神经退行性疾病的药物中的应用，含其的药物组合物及其制备方法。

背景技术：

14-3-3是一类在真核生物中广泛表达的酸性蛋白家族。最早于1967年从牛脑提取物中被发现，之后引起了科学界的兴趣，至上世纪九十年代中期，有关14-3-3研究的科研论文开始大量出现，目前14-3-3蛋白领域已经成为一个国际研究热点。迄今发现哺乳动物中14-3-3共有七种亚型，且不同种属的14-3-3或其每个亚型在氨基酸序列上呈高度保守性。这一高度保守的特性及其在真核生物中广泛分布的特点表明14-3-3在真核生物中具有重要的功能。14-3-3是一个调节蛋白家族，目前发现的靶蛋白有200多个，14-3-3通过依赖性和非依赖性磷酸化丝/苏氨酸与200多个靶蛋白发生相互作用，从而调控了各种各样的生理和病理过程，尤其是癌症和神经退行性疾病。例如，研究证实14-3-3通过与癌基因和抑癌基因如Raf，Bcr，Bcr-Abl，Bad，Bax，ASK-1，p53，TSC2，p27，Cdc25A，B and C，Wee1，Chk1等结合后调节它们的功能，从而在癌症发生和发展中发挥重要作用。简而言之，14-3-3已被认为是寻找抗癌和治疗神经退行性疾病药物的重要和具有前景的靶点。

癌症和神经退行性疾病严重危害人类健康。至今人们对于癌症的基础研究较为活跃与深入，但有效的干预药物还很有限，致使癌症的治疗还未取得实质性突破。神经退行性疾病包括老年痴呆等多种疾病，社会老龄化使得这一疾病呈现多发、高发，但目前有效的治疗药物相对缺乏。为什么癌症基础研究越来越深入，但治疗进展并不理想，因为癌症领域的主要矛盾还没有被认识。在生命体系复杂的生理病理过程中，如何从众多环节中寻找具有重要作用的“开关”，从主要矛盾下手，遏制疾病的进展并促进其转归应该成为医药界关注的主要问题。14-3-3与200多个靶蛋白相互作用，显示其在生理和疾病过程中扮演着类似“开关”的重要角色。因此以14-3-3为靶点可能寻找到相对理想的治疗药物。

14-3-3的重要性已经被认识，但14-3-3更为复杂的网络调控关系，其亚型特异性，及14-3-3蛋白的结合位点等许多基础科学问题仍待深入研究。14-3-3虽然与癌症和神经退行性疾病密切相关，但市场上还缺乏针对该蛋白为靶点的药物。因此无论从生命科学领域的基础研究还是从新药研发角度来看，寻找调节14-3-3蛋白的小分子化合物具有重要意义。但之前还未发现有效的14-3-3小分子调节剂。

既然14-3-3与癌症和神经退行性疾病密切相关，因此从具有治疗肿瘤和神经系统疾病的传统中药或民族药中有可能寻找到14-3-3配体分子，其作为小分子化学探针或工具药将为进一步揭开14-3-3的重要功能，及寻找与14-3-3调节相关的疾病药物提供直接帮助。

日本琵琶甲虫(Blaps japanensis)系云南彝族地区常用昆虫药物，具有抗菌消炎、消包块、治疗肿瘤、小儿惊痫和夜啼的功效。因此基于民族药理学知识从中寻找发现有效的14-3-3调节物质是可能的。

现有技术中未见有本发明的化合物1和2，其对14-3-3调节作用的报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供具有14-3-3化学探针功能的小分子化合物Blapsins A和B(化合物1和2)；从琵琶甲虫中提取、分离该类化合物的方法；以该类化合物为有效成分的药物组合物；该化合物在制备抗癌或/和抗神经退行性疾病的药物中的应用。

本发明的上述目的是由下述的技术方案得以实现的：

如下结构式所示的化合物1或2，

制备化合物1和2的方法，取干燥或鲜活的琵琶甲虫体，用30％-95％的乙醇或甲醇室温搅拌提取1-3次，每次12-48小时，每次溶媒用量为药材的4-10倍，单位为体积/重量，合并提取液减压浓缩得提取物，提取物用适量水稀释后，以等体积正丁醇萃取3次，减压浓缩正丁醇萃取液，再用200-300目正相硅胶柱进行色谱分离，提取物与吸附剂比例为1∶20，溶剂洗脱系统为梯度氯仿-甲醇，梯度依次为：99∶1，98∶2，96∶4，94∶6，90∶10，88∶12，85∶15，每个梯度溶剂用量为2倍柱床体积，根据薄层色谱、10％硫酸乙醇显色特征，含相同斑点流份合并，得到A-F6个组份；其中氯仿-甲醇94∶6和90∶10的洗脱部分D组份，经MCI gel CHP 20P柱色谱分离，用5％，15％，30％，45％，55％，60％，80％甲醇洗脱，每个梯度溶剂用量为2倍柱床体积，得到11个组份；其中30％-55％洗脱部分，合并液经过反复凝胶Sephadex LH-20柱层析甲醇洗脱，薄层检测合并相同斑点，分别得到含有化合物1和2的组份，分别再经硅胶制备薄层层析，以8∶1∶0.05氯仿-甲醇-醋酸展开，纯化得化合物1和2。

药物组合物，其中含有治疗有效量的化合物1或2和药学上可接受的载体。

化合物1或2在制备治疗过表达14-3-3的癌症的药物中的应用。

化合物1或2在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

化合物1或2在制备14-3-3抑制剂中的应用。

化合物1或2在制备小分子化学探针中的应用。

化合物1和2是首次从自然界发现的具有14-3-3抑制作用的小分子酚性化合物。化合物1是新物质，化合物2是新天然产物，其抑制14-3-3的药理作用也从未见过报道。

本发明化合物可以单独直接应用或组合应用，也可以与其它药物一起使用，可以使用不同的药用辅料，制成多种固体制剂和液体制剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服和注射两种形式给药。使用量可根据给药途径、患者的年龄、体重、所治疗疾病的类型和严重程度等变化进行一次或多次使用。

附图说明：

图1为本发明化合物1和2的结构示意图；

图2为化合物1抑制14-3-3蛋白-蛋白相互作用量效关系(PPJ16＝化合物1，横坐标：摩尔浓度，纵坐标：％活性)；

图3为化合物2抑制14-3-3蛋白-蛋白相互作用量效关系(PPJ22＝化合物2，横坐标：摩尔浓度，纵坐标：％活性)。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都应理解为属于本发明的范围。

实施例1：

化合物1和2的制备及结构确证：

取干燥的日本琵琶甲虫体(5kg)，用30％-95％的乙醇或甲醇室温搅拌提取1-3次，每次48小时，每次溶媒用量为30L。合并提取液减压浓缩得500g提取物。提取物用适量水稀释后，以等体积正丁醇萃取3次，减压浓缩正丁醇萃取液得150g。正丁醇提取物用正相硅胶(200-300目)柱进行色谱分离，提取物与吸附剂比例为1∶20(g/g)，溶剂洗脱系统为梯度氯仿-甲醇，梯度依次为：99∶1，98∶2，96∶4，94∶6，90∶10，88∶12，85∶15，每个梯度溶剂用量为2倍柱床体积。根据薄层色谱、10％硫酸乙醇显色特征，含相同斑点流份合并，得到A-F 6个组份。其中含有化合物1和2的D组份(8g)(氯仿-甲醇94∶6和90∶10的洗脱部分)经MCI gel CHP20P柱(3×25cm，i.d.)色谱分离，用5％，15％，30％，45％，55％，60％，80％甲醇洗脱，每个梯度溶剂用量为2倍柱床体积，得到11个组份。其中30％-55％洗脱部分含有化合物1和2，合并液经过反复凝胶(Sephadex LH-20)柱层析(甲醇洗脱)，薄层检测合并相同斑点，分别得到含有化合物1(90mg)和2(50mg)的组份，其分别经硅胶制备薄层层析，以氯仿-甲醇-醋酸(8∶1∶0.05)展开，纯化得化合物1(7mg)和2(10mg)。

化合物1和2的结构鉴定数据：

Horiba SEPA-300旋光仪；Shimadzu UV-2401PC型紫外光谱仪；VG AUTO Spec-3000及API QSTAR Pulsar 1质谱仪；Bruker AV-400、DRX-500、Avance III 600核磁共振仪，TMS作为内标，δ为ppm，J为Hz。

化合物1(命名为Blapsin A)结构式如下所示：

化合物1：UV(MeOH)λmax(logε)284(3.73)，207(4.37)nm；¹Hand ¹³C NMR data，see Table 1；FABMS(negative)m/z 303[M-H]^-；HRESIMS(negative)m/z 303.0877[M-H]^-(calcd for C₁₆H₁₅O₆，303.0868)。

化合物2(命名为Blapsin B)结构式如下所示：

化合物2：

UV(MeOH)λ_max(logε)286(3.81)，208(4.60)nm；¹H and ¹³C NMR data，see Table 1；FABMS(positive)m/z 275[M+H]⁺。

表1化合物1和2(化合物BlapsinA和B)的结构数据

实施例2：

按实施例1中给出的化合物1和2的结构式和/或分子量，采用LC-MS跟踪方法，从琵琶甲属(Blaps)昆虫中按照常规色谱方法制得化合物1和2。

实施例3：

按实施例1的方法制得化合物1和2，分别将其溶于无菌注射用水中，用无菌漏斗过滤，分装，低温冷冻干燥后无菌熔封即得粉针剂。

实施例4：

按实施例1的方法制得化合物1和2，分别按常规法配以各种药用辅料可制成片剂：

化合物1组合药物剂型-片剂：

使用化合物1或2作为药物活性成分，使用几种赋形剂作为制备组合药物片剂的辅料成分，按照一定比例配比制成每片含有化合物1或2药物成分1-100mg的片剂样品，表2给出普通片剂的配方比例。将一定数量化合物1或2原料与赋形剂辅料制备成不同剂量片剂制剂：将几种赋形剂辅料与原料药均匀混合，加入1％羟甲基纤维素钠溶液适量制成软料，过筛制粒，湿粒烘干并过筛整粒，加入硬脂酸镁和滑石粉混合均匀后压片即得。

表2化合物1或2组合药物片剂的原料药和辅料配方

实施例5：

本发明化合物1或/和2抑制14-3-3蛋白作用试验：

基于荧光偏振原理(FP)的筛选试验：

该实验测试是在384孔黑色板上进行的，其中反应量为50μL。反应缓冲液的组成为：HEPES(10mM，pH 7.4)，NaCl(150mM)，Tween-20(0.05％)，1μM GST-14-3-3，2nM TMR-pS259-Raf肽，及DTT(0.5mM)。1μL的被测试化合物(2mM的DMSO原液)加入到49μL的反应缓冲液中，室温孵育30分钟后使用PE公司的Envision多标记酶标仪，进行高通量筛选，测定F P(Fluorescence Polarization)值，以mP(millipolarization)为单位表示。空白对照不加14-3-3和化合物，其余与反应体系相同。阴性对照为1μL DMSO代替化合物，阳性对照为1μL R18。积分时间：100ms，Z高度：2.15mm；激发偏振波长：545nm；发射偏振波长：610-75nm；二向色镜：565nm。与阴性对照相比，mP值小于3SD的被认为是活性化合物，量效关系及IC₅₀值用GraphPad软件获得。

ELISA检测：

主要是针对重组GST标记的14-3-3蛋白与内在蛋白的相互作用，如PRAS40在COS-7细胞匀浆中一样。具体地，1μM的GST固定在抗GST板上，在与被测试化合物共同孵育后，加入COS-7细胞匀浆(1％的NP40裂解液)。在孵育和洗涤之后，加入含有过氧化物酶标示的抗兔IgG(50μL；1∶1000稀释)和PRAS40特异性抗体。洗涤后，加入100μL TMB，用硫酸终止反应，测试其在450nm的发光，用GraphPad软件计算其IC₅₀值。

结果计算及结论：GraphPad软件计算其IC₅₀值，FP实验中，化合物1和2的IC₅₀值分别为2.0和2.5μM；ELISA实验中，化合物1和2的IC₅₀值分别为9.2和10.0μM。

以上结果说明化合物1和2能显著抑制14-3-3蛋白(图2、图3)，鉴于14-3-3蛋白家族对其靶蛋白复杂的网络调控关系及其在癌症和神经退行性疾病中的重要作用，因此本发明的化合物1和2可作为重要的14-3-3小分子化学探针，也可作为抗癌和抗神经退行性疾病的药物。

Claims

1.如下结构式所示的化合物1或2，

2.制备权利要求1化合物1和2的方法，取干燥或鲜活的琵琶甲虫体，用30％-95％的乙醇或甲醇室温搅拌提取1-3次，每次12-48小时，每次溶媒用量为药材的4-10倍，单位为体积/重量，合并提取液减压浓缩得提取物，提取物用适量水稀释后，以等体积正丁醇萃取3次，减压浓缩正丁醇萃取液，再用200-300目正相硅胶柱进行色谱分离，提取物与吸附剂比例为1∶20，溶剂洗脱系统为梯度氯仿-甲醇，梯度依次为：99∶1，98∶2，96∶4，94∶6，90∶10，88∶12，85∶15，每个梯度溶剂用量为2倍柱床体积，根据薄层色谱、10％硫酸乙醇显色特征，含相同斑点流份合并，得到A-F 6个组份；其中氯仿-甲醇94∶6和90∶10的洗脱部分D组份，经MCI gel CHP 20P柱色谱分离，用5％，15％，30％，45％，55％，60％，80％甲醇洗脱，每个梯度溶剂用量为2倍柱床体积，得到11个组份；其中30％-55％洗脱部分，合并液经过反复凝胶Sephadex LH-20柱层析甲醇洗脱，薄层检测合并相同斑点，分别得到含有化合物1和2的组份，分别再经硅胶制备薄层层析，以8∶1∶0.05氯仿-甲醇-醋酸展开，纯化得化合物1和2。

3.药物组合物，含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物1或2和药学上可接受的载体。

4.权利要求1所述的化合物1或2在制备治疗过表达14-3-3的癌症的药物中的应用。

5.权利要求1所述的化合物1或2在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

6.权利要求1所述的化合物1或2在制备14-3-3抑制剂中的应用。

7.权利要求1所述的化合物1或2在制备小分子化学探针中的应用。