DE102006005221B3

DE102006005221B3 - Verwendung von 1-Arylisochromanderivaten als Zellproliferations-Inhibitoren

Info

Publication number: DE102006005221B3
Application number: DE102006005221A
Authority: DE
Inventors: Peter Lorenz
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-02-06
Filing date: 2006-02-06
Publication date: 2007-02-22
Anticipated expiration: 2026-02-07

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist eine neuartige Verwendung von 1-Arylisochromanderivaten der Formel I, worin R¶1¶ bis R¶4¶ für H, OH oder OCH¶3¶ steht, zur Behandlung von Krebserkrankungen. DOLLAR A Durch Nachweis der zellproliferationsinhibierenden und -regulierenden Wirkung von verschiedenen Derivaten der Formel I an einer malignen Ratten-Astrogliazelllinie (Astroglioma- oder C6-Zellen) wird gezeigt, dass diese Stoffklasse zur Wachstumshemmung von Glioblastomen verwendet werden kann. Nach Inkubation von C6-Zellen mit 1-Arylisochromanderivaten (Formel 1) ist eine im Vergleich zu Kontroll-Kulturen verminderte Zellproliferation, sowie eine morphologische Veränderung und Redifferenzierung der Zellen zu beobachten. Eine konzentrationsabhängige Steigerung der Phosphorylierung proteinogener Tyrosinreste von alpha-MHC, nach Behandlung von C6-Zellen mit einem Derivat der Formel I (wobei R¶1¶=R¶2¶=R¶3¶=OH, R¶4¶=OCH¶3¶ ist), wird mit Hilfe des 4G10-Antikörpers (Anti-Phosphotyrosin) nachgewiesen und damit ein Einfluss auf die Zelldifferenzierung gezeigt. Messungen der Lactatdehydrogenase-Freisetzung von C6-Zellen in das Kulturmedium weisen nach, dass die untersuchten 1-Arylisochromanderivate keine cytotoxischen Eigenschaften im Vergleich zu Zellgiften wie Colchicin und Wasserstoffperoxid aufweisen. DOLLAR A DOLLAR F1

Description

Die Erfindung betrifft eine neuartige Verwendung von 1-Arylisochromanderivaten der Formel I zur Behandlung von Krebs.
Durch den hier erstmals geführten Nachweis einer cytostatischen und zelldifferenzierenden Wirkung der 1-Arylisochromanederivate auf maligne C6-Ratten-Gliomzellen in vitro wird für diese Stoffklasse eine neue Verwendungsmöglichkeit zur Prävention, Behandlung oder Nachbehandlung von Gliomen bzw. Glioblastomen aufgezeigt. Darüberhinaus wird die proliferationsregulierende und redifferenzierende Wirkung der 1-Arylisochromanderivate anhand des Nachweises eines Differenzierungsmarkers bzw. Markerproteins, der verstärkten Phosporylierung von Tyrosinresten des alpha-MHC-Proteins, demonstriert.
Vitales Wachstum von Zellen in Geweben kann sich für einen gesunden Organismus durchaus negativ auswirken. Andererseits erweist sich der Tod auf zellulärer Ebene, bedingt durch Zellselbstmord, in gewissen Situationen als lebensrettend. Eine ausgewogene Balance von Proliferation und Wachstumsstop, zwischen Leben und Tod von Zellen, in einem Verband von Zellen mit unterschiedlichen physiologischen Aufgaben ist für das Funktionieren eines multizellulären Organismus essentiell und ermöglicht ihm erst das Leben. Eine Störung dieser Balance und somit eine Fehlregulation kann sich für einen solchen Organismus als fatal erweisen. Sowohl das Zuviel an Proliferationssignalen als auch ein Mangel an Proliferationshemmung stören das Gleichgewicht und können sich in verschiedenen Erkrankungen, wie auch als Ursache der Entstehung von Krebs äußern.
Zelluläres Sterben, was mit dem griechischen Wort "Apoptose" (= Fallen der Blätter im Herbst) beschrieben wird, ist gewissermaßen ein progammiertes altruistisches Absterben einzelner Zellen zum Wohle des Gesamtorganismus.
So werden von den rund 100 Billionen Zellen unseres Körpers mehrere Milliarden täglich neu gebildet, um verbrauchte und beschädigte zu ersetzen.
Das invasive Wachstum von Zellen kann gutartig, wie z.B. bei bestimmten Hyperprolifertions-Erscheinungen der Haut, beispielsweise bei Psoriasis, oder bösartig wie z.B. bei malignen Tumorzellen sein. Letztere besitzen eine unphysiologisch gesteigerte Proliferation und missachten andere Gewebegrenzen. So modifizieren Tumore ihre Oberflächenstrukturen, sind für Immunzellen nicht mehr erkennbar bzw. angreifbar und können dann leicht in andere Gewebe hineinwachsen.
Ein vielzelliger Organismus reguliert seine Entwicklung und funktionelle Integrität durch das komplexe Zusammenspiel unterschiedlich differenzierter Zellen, die auf extrazelluläre Signale durch Aktivierung spezifischer biochemischer Kaskaden reagieren. Entscheidende Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung, Migration und Apoptose werden durch verschiedene Signalmoleküle wie z.B. Hormone, Wachstumsfaktoren oder Neurotransmitter gesteuert, welche an Zelloberflächenrezeptoren binden und diese aktivieren können. Die Aktivierung von Rezeptoren, ausgelöst durch extrazelluläre Bindung von Liganden an spezifische Transmembranproteine, reguliert Genexpression und damit verschiedenste physiologische Vorgänge. Wird eine solches fein abgestimmtes Netzwerk durch Überexpression, Genamplifikation oder Genmutation wichtiger Signalmoleküle gestört, so kann das zu pathophysiologischen Veränderungen wie z.B. Krebs führen. Vielfältige chemische Wirkstoff-Leitstrukturen werden weltweit getestet um Zellproliferationsprozesse zu beeinflussen.
Ein großes Problem beim Einsatz von zellproliferations-hemmenden Substanzen (Cytostatika) ist ihre oftmals toxische Wirkung, die nicht nur Tumorzellen sondern in hohem Maße auch gesunde Zellen schädigt und zu einer Schwächung des Gesamtorganismus führt.
Viele Chemotherapeutika besitzen keine selektive Toxizität und ihre Selektivität, die eigentlich nur die Tumorzellen betreffen sollte, ist hauptsächlich auf Proliferations-Charakteristika beschränkt, d.h. diejenigen Zellen welche sich am schnellsten teilen, werden am effizientesten geschädigt. Tumorzellen zeigen zwar eine unkontrollierte Proliferation, dennoch muß ihre Proliferationsrate nicht unbedingt sehr hoch liegen. So gibt es durchaus langsam proliferierende Tumore, wie z.B. Plasmazelltumore. Letztere sind schwer durch Chemotherapeutika zu behandeln, da diese eher schnell- als langsam-proliferierende Tumore in ihrem Wachstum stoppen können.
Eine typische Fehlfunktion die Tumorzellen charakterisiert ist ihr falscher Differenzierungsstatus, der sich in der Regel in Form einer Entdifferenzierung manifestiert. Ausgehend von bestimmten Stammzellen durchlaufen alle Zellen ein bestimmtes Differenzierungsprogramm, das durch intra- wie extrazelluläre Faktoren beeinflusst wird. Kann ein solcher Differenzierungsprozess aufgrund unterschiedlicher Defekte nicht bis zum Ende ausgeführt werden, arretieren die Zellen in einem Zustand der häufig pathologisch relevant wird. Beispielsweise zeigen diese Zellen für das betroffene Gewebe unphysiologische Wachstumscharakteristika. Allgemein kann man sagen, dass ein Tumor um so aggressiver ist je weiter seine Zellen vom physiologischen Differenzierungsstatus entfernt sind.
Fast alle derzeit zu Verfügung stehenden Antitumor-Medikamente wirken antiprolifertiv. Sie beeinflussen weder die invasiven Eigenschaften, wie z.B. die Tendenz zur Metastasenbildung, noch den entgleisten Differenzierungsstatus.
Eine künftige Strategie im Einsatz von Chemotherapeutika sollte es daher sein, neben der weiteren Vervollkommnung der Tumor-cytotoxischen und -cytostatischen Selektivität, eine erhöhte Redifferenzierung entarteter Körperzellen zu bewirken, um durch Verringerung der Proliferation und Metastasierung maligner Zellen den Krebs besser bekämpfen zu können. Die Induktion der zellulären Differenzierung ist deshalb ein attraktiver therapeutischer Ansatz.

Von der Klasse der Isochromane, die hier erfindungsmäßig behandelt wird, sind bisher nur wenige Derivate beschrieben worden, welche cytotoxisch für Krebszellen sind, die Krebszell-Proliferation inhibieren bzw. eine Differenzierung maligner Zellen bewirken. So zeigte z.B. das von Ogawa et al. (2004) aus dem marine Schimmelpilz Aspergillus pseudodeflectus isolierte Isochroman Pseudodeflectusin eine Cytotoxizität gegen verschiedene menschliche Krebszelllinien. Die in der WO 002004093809 (US 020050038098) beschriebenen synthetischen Isochroman-Derivate, mit heterocyclischen Seitenketten, können z.B. zur Behandlung unkontrollierter Proliferation, einschließlich Krebs, verwendet werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sollte es sein eine Stoffklasse zu finden, die cytostatische und die Zellproliferation regulierende bzw. modulierende Eigenschaften hat, mit dem Ziel einer verstärkten Ausdifferenzierung maligner Zellen. Diese Stoffklasse sollte dabei nicht bzw. nur gering toxisch für proliferierende Zellen und möglichst einfach als Naturstoff isolierbar bzw. durch chemische Synthese zugänglich sein.

Überraschenderweise wurden bei der Untersuchung von 1-Arylisochromanderivaten die gesuchten cytostatischen, wachstumsregulierenden bzw. differenzierenden Eigenschaften gefunden. 1-Arylisochromane sind eine neue Klasse von Naturstoffen, die kürzlich als Bestandteil von Olivenöl erkannt wurden (Bianco at el. 2001). Nach einem von Guiso et al. (2001, 2003) entwickelten Syntheseverfahren sind 1-Arylisochromanderivate über eine säurekatalysierte oxa-Pictet-Sprengler-Reaktion (siehe Formelschema II) zugänglich. 1-Arylisochromane gehören zu den bisher wenig untersuchten Naturstoffen, von denen gegenwärtig nur einige biologische Wirkungen bekannt sind. So wurden beispielsweise 1-Arylisochromane als Radikalfänger und Schutzsubstanzen (Antioxidantien) gegen oxidativen und nitrosativen Stress untersucht (Lorenz et al., 2005). Aus der Literatur ist bekannt, dass 1-Arylisochromanderivate die Aggregation menschlicher Erythrocyten wirksam inhibieren (Tonga et al., 2003). Deshalb erscheint es überraschend, dass für diese Stoffklasse hier eine neue erfindungsmäßige Verwendung gegen Hyperproliferationsvermittelte Krankheitszustände, wie insbesondere Krebs, aufgezeigt werden kann.

Von der Klasse der 1-Arylisochromane wurden bevorzugt die in 3',4',6,7-Stellung substituierten Derivate (R1 – R4, siehe Formel I) hergestellt und untersucht. Die hier erfindungsgemäß verwendeten 1-Arylisochromanderivate sind besonders bevorzugt durch Hydroxy- (OH) und Methoxy-Gruppen (OCH₃) substituiert, da diese u.a. als Naturstoffe bzw. Naturstoffanaloga beschrieben wurden. Es können aber auch sehr leicht, über die vorstehend genannt oxa-Pictet-Sprengler-Reaktion, 1-Arylisochromanderivate mit anderen Substituenten (R1 – R4 = OAlkyl, OAryl, Alkyl, und/oder Aryl) hergestellt und im Sinne der Erfindung verwendet werden. Die erfindungsgemäß verwendeten 1-Arylisochromane sind gut in aprotisch polaren sowie dipolaren Lösungsmitteln wie Ethanol, Methanol, n- und iso-Propanol, Polyvinylalkoholen, Ethylacetat, DMSO und Acetonitril löslich. In hochpolaren Lösungsmitteln wie Wasser, Pufferlösungen, sowie in apolaren Solventien, wie beispielsweise Kohlenwasserstoffen und Ölen, ist ihre Löslichkeit begrenzt. Die Löslichkeit kann aber durch Verwendung kleiner Mengen eines oben genannten Lösungsvermittlers und/oder Zusatz von 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin erhöht werden, so dass eine gute Formulierbarkeit bzw. günstige Pharmakokinetik der Wirkkomponente erzielt wird.

Die cytostatische und Zellproliferations-regulierende Wirkung der 1-Arylisochromanderivate (Formel I) wird an einer stark invasiven malignen Ratten-Astroglioma-Zellline (C6-Zellen) nachgewiesen, die dem Fachmann als gebräuchliches biologisches Modell zur Untersuchung bzw. Testung von Cytostatika gegen Glioblastome bekannt ist (siehe: Sasaki et al., 2002, Cuevas et al., 2004).

Ein Glioblastom (Glioblastoma multiforme), in welchem massiv maligne Astroglioma-Zellen gebildet werden, ist ein verbreiteter und zugleich sehr bösartiger Hirmtumor, der beim Menschen häufiger bei Männern als bei Frauen auftritt. Jährlich wird allein in Deutschland bei 4000 bis 5000 Patienten diese Erkrankung diagnostiziert. Obwohl in den letzten Jahren eine Reihe neuer Methoden zur Behandlung dieser Krankheit erprobt wurden, sind die Fortschritte bescheiden.

Erstaunlicherweise zeigt sich, dass bei erfindungsgemäßer Behandlung von C6-Zellen mit den hier beschriebenen 1-Arylisochromanderivaten, über ein Inkubationszeitraum von 2 Tagen, in vitro eine signifikante Verringerung der Zellzahl beobachtet wird (2.). Die verwendeten 1-Arylisochromanderivate sind somit eindeutig cytostatisch. Der cytostatische Effekt der 1-Arylisochromanderivate wird außerdem durch Messung der Gesamtproteinproduktion nach Anfärbung mittels Sulforhodamin B verdeutlicht (3)

Gleichzeitig kann bei 2 der hier hier erfindungsgemäß verwendeten Substanzen, ISO-4 und ISO-2, welche in vitro auch am stärksten anti-proliferativ waren und das Gesamtprotein am effektivsten senkten, ein Einfluss auf die Veränderung der Zellmorphologie nachgewiesen werden (s. 4.). Mikroskopische Aufnahmen (5a. und 5b.) zeigen, dass die C6-Zellen, welche gewöhnlich eine rundliche Form aufweisen und nur wenige Fortsätze ausbilden, nach Behandlung mit ISO-2 erstaunlicherweise sehr lange Fortsätze bilden bzw. später die Morphologie typischer Astrocyten ("spiegeleiförmige" Zellen) annehmen. Diese morphologische Veränderung, die überraschenderweise nach Behandlung mit allen getesteten 1-Arylisochromanderivaten zu beobachten war, ist ein typisches Zeichen der Re-Differenzierung von C6-Zellen. Nach Auszählung der ausdifferenzierten "spiegeleiförmigen" und undifferenzierten Zellen pro mikroskopischem Sehfeld kann gezeigt werden, dass durch Behandlung (vorzugsweise mit ISO-4 und ISO-2) der prozentuale Anteile der ausdifferenzierten Zellen zunimmt (6.).

Die Induktion einer verstärkten Differenzierung der C6-Zellen, durch erfindungsgemäße Verwendung von 1-Arylisochromanderivaten, wird zusätzlich anhand der verstärkten Expression und Phosphorylierung von alpha-MHC (= alpha' cardiac myosin heavy chain' protein) demonstriert. Alpha-MHC wurde als Markerprotein der Zelldifferenzierung von embryonalen Stammzellen in Kardiomyozyten und andere Zelltypen erkannt (Takahashi et al., 2003). Eine Phosphorylierung von alpha-MHC ist mit einer Akltivierung des Proteins verbunden.

Durch immunohistochemischen Nachweis von phosphoryliertem alpha-MHC (73 KDa-Protein), nach der erfindungsgemäßen Anwendung von 1-Arylisochromanderivaten auf C6-Zellen, wird gezeigt, dass eine verstärkte Zelldifferenzierung magligner Zellen in Zellen vom Astrocytentyp erfolgt (7.). Erstaunlicherweise waren die in der entsprechend maximalen Wirkkonzentration (100 μM) verwendeten 1-Arylisochromanderivate nicht cytotoxisch, im Vergleich zu Zellgiften wie Wasserstoffperoxid und Colchicin, was durch Messung der Lactatdehydrogenase-Freisetzung an C6-Zellen gezeigt werden konnte (8.). Deshalb erscheint es plausibel, das die hier in vitro zur Inhibierung der Zellproliferation und Ausdifferenzierung von Astrocyten erfindungsgemäß verwendeten 1-Arylisochromanderivate auch in vivo, z.B. an einem Versuchstier oder am Menschen, eingesetzt werden können.

Prüfung der Erfindung durch Labormuster
Beispiel 1: Synthese der 1-Arylisochromanderivate (ISO-4, ISO-3, ISO-2, ISO-0)
Die Synthese der 1-Arylisochromanderivate (Formel I) erfolgte durch Umsetzung von 3-Hydroxytyrosol (2-(3',4'-Dihydroxyphenyl)ethanol) mit einem entsprechenden aromatischen Aldehyd (siehe Formelschema II), nach einer Vorschrift von Guiso et al. (2001), modifiziert nach Lorenz et al. (2005). Dazu wurden 1.45 g (9.4 mmol) 3-Hydroxytyrosol und der aromatische Aldehyd (9.4 mmol) in Methanol (70 ml) gelöst und nach Zusatz von p-Toluolsulfonsäure (p-TsOH, 200 mg) für 6 h bei 64 °C refluxiert. Nach dünnschichtchromatographischer Kontrolle (DC) des Umsatzes der Edukte (DC, stationäre Phase: Merck-Kieselgel-60-DC-Folien, mobile Phase:
Chloroform/Methanol = 9/1, vol/vol) wurde das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer weitgehend abdestilliert und der Rückstand einer Vakuum-Flüssigkeits-Chromatographie (VLC) unterworfen, unter Verwendung einer Kieselgel-Säule (78 g Merck-Kieselgel-60 zur DC). Letztere wurde vor der Beladung mit Chloroform vorkonditioniert. Die Elution erfolgte mit Chloroform/Methanol (9/1, vol/vol), unter Abtrennung mehrerer Fraktionen. Alle Fraktionen welche das reine Produkt enthielten wurden vereinigt, das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand im Vakuum getrocknet.
ISO-0 wurde durch Umsetzung von 3.00 g 2-(3',4'-Dimethoxyphenyl)ethanol (16.46 mmol) mit 2.73 g 3,4-Dimethoxybenzaldehyd (16.46 mmol), 146 ml Methanol und p-TsOH (400 mg) gewonnen. Das Rohprodukt wurde wie oben beschrieben durch VLC gereinigt. Dazu wurde die stationäre Phase (Kieselgel 60) mit 2-Methylbutan vorkonditioniert, das Produkt mit einem 2-Methylbutan/Ethylacetat-Gradienten (5/1 bis 1/1.5, vol/vol) eluiert und anschließend das Rohmaterial aus 2-Methylbutan/Ethylacetat umkristallisiert.
Die Reinheit der isolierten Substanzen (≥ 95%) wurde durch DC bzw. HPLC überprüft. Die Charakterisierung der gereinigten 1-Arylisochromanderivate erfolgte durch ¹H- und ¹³C-NMR-Spektroskopie, sowie massenspektroskopisch durch LC/MS (für analytische und spektroskopische Daten, siehe: Lorenz et al. 2005).
Nach der vorstehenden Vorschrift wurden hergestellt: ISO-4 (R₁-R₄ = OH), ISO-3 (R₁-R₃ = OH, R₄ = OCH₃), ISO-2 (R₁, R₂ = OH, R₃, R₄ = OCH₃) sowie ISO-0 (R₁-R₄ = OCH₃), siehe: 1.
Stock-Lösungen der getesteten 1-Arylisochromanderivate (25, 50, 100 mM) wurden in DMSO hergestellt und für Zellkulturexperimente durch einen 0.22 μm Nalgene-Nylon-Filter sterilfiltriert. Bis zur Verwendung wurden die Stock-Lösungen als Aliquots bei – 20 °C gelagert.
Beispiel 2: Antiproliferafions-Test an malignen Ratten-Astroglioma-Zellen (C6-Zellen)
C6-Zellen wurden mit einer Zelldichte von 1 × 10⁵ Zellen/ml in sterile Plastik-6-Vial-Platten (Vial-Durchmesser: 35 mm, Füllvolumen je 2 ml) ausgesät. Die Kultivierung der C6-Zellen erfolgte in RPMI 1640-Medium (Gibco, Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland), unter Zusatz von 10 Vol% filtriertem fötalem Kälberserum (FKS), Penicillin (5 IU/ml), Steptomycin (5 μg/ml) und 2 mM L-Glutamin, bei 37 °C in humider Atmosphäre (mit 5% CO₂). Nach 1 d (1 DIV = 'day in vitro') Vorkultivierung wurde das Kulturmedium erneuert und die C6-Zellen 2 DIV mit den Testsubstanzen inkubiert (25, 50 und 100 μM). Am 3. Inkubationstag (Gesamt-Inkubation = 3 DIV) wurde das Kulturmedium für einen Lactatdehydrogenase-Test abgenommen, auf Eis gelagert und die C6-Zellen mit 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer (PBS) 20 min fixiert. Anschließend wurde nach einem PBS-Waschschritt 5 min mit Hämatoxylin nach MEYER gefärbt, kurz mit dest. Wasser gespült und dann die C6-Zellen 10 min mit Leitungswasser behandelt. Danach wurden die Zellen für 5 min mit Eosin (0.1%ige Lösung, verdünnt 1:10 (vol/vol) + 1 Tropfen 100%ige Essigsäure) gegengefärbt, anschließend mit dest. Wasser gespült und in Immumount^® eingebettet.
Die mikroskopische Auszählung der Zellen erfolgte unter Verwendung eines Zeiss-Axiophot-Mikroskops, sowie eines digitalen Kamera- und Zähl-Systems. 2 Zählfelder (400 × 500 μm) pro Vial wurden fotografisch aufgenommen und ausgezählt.
Beispiel 3: Prüfung der verminderten Proteinbiosynthese durch das Sulforhodamin-B-Assay
C6-Zellen werden, wie oben beschrieben, 1 DIV vorkultiviert und anschließend mit den Testsubstanzen (50 und 100 μM) für 3 DIV inkubiert. Am 3. Inkubationstag wird das Kulturmedium abgenommen, je Vial 1 ml Trichloressigsäure (10%ig, w/vol) zur Denaturierung der Proteine zugesetzt und die Kulturgefäße für 1 h auf Eis gestellt (ca. 4 °C). Anschließend werden die Protein-Präzipitate in 2 ml-Eppendorf-Röhrchen überführt und bei 4 °C zentrifugiert, die Überstände anschließend verworfen und das Protein-Pellet mit 1 ml Sulforhodamin B-Lösung (0.4%, w/vol) für 30 min unter Schütteln (vortexen!) angefärbt. Nach dem Zentrifugieren werden die Überstände verworfen, die Präzipitate 1x mit destilliertem Wasser gewaschen, zentrifugiert und anschließend in 10 mM TRIS-Puffer (je 1 ml) auf einem Schüttler solubilisiert. Vom Solubilisat werden je 25 μl abgenommen und in einer Meßküvette mit 975 μl TRIS-Puffer gemischt. Anschließend wird die optische Dichte (OD) bei λ_max = 564 nm spektrophotometrisch, gegen Proben vom Tag 0 der Inkubation gemessen. Der Proliferations-Index (PI) errechnet sich aus dem Quotienten der optischen Dichte am Tag 3 (3 DIV) und der optischen Dichte am Tag 0 (0 DIV) und wird prozentual auf die Kontrolle (100%) bezogen. Berechnung: PI = OD_tx/OD_t0.
Beispiel 4: Prüfung der Cytotoxizität anhand der Lactatdehydrogenase (LDH)-Aktivität
Die Lactatdehydrogenase-Freisetzung, als Maß für die Cytotoxizität, wird über die enzymatische Umwandlung von Pyruvat in Lactat (in Gegenwart von NADH), nach Inkubation mit den Testsubstanzen (3 DIV), in den Überständen der C6-Zellen gemessen. Dazu werden je 100 μl der Probe mit 880 μl Phosphatpuffer (PBS, pH 7.4) und 20 μl Reagenzmischung (bestehend aus: 1.25 g Natriumpyruvat, 40 mg NADH und 10 ml PBS, pH 7.4) versetzt. Die enzymatische LDH-Aktivität wird über die Abnahme der NADH-Absorption (λ_max = 340 nm, ε NADH 340 = 6.22 mM^–1 × cm^–1) innerhalb von 10 min spektrophotometrisch verfolgt. Die Berechnung der LDH-Aktivität der Einzelproben bezieht sich auf die entsprechend eingesetzte Proteinmenge und wird prozentual verglichen (Kontrolle = 100% LDH-Freisetzung):
Beispiel 5: Quantifizierung von phosphoryliertem alpha-MHC als Differenzierungsmarker (Westernblot mit 4G10-Antiphosphotyrosin)
C6-Zellen wurden in Gegenwart von ISO-2 (10, 25, 50 und 100 μM) 3 DIV in FKS-freiem Medium inkubiert. Danach wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit Hilfe eines Lysis-Puffers lysiert (30 min bei 0 °C). Die Protein-Lysate wurden daraufhin bei 14.000 g (15 min) zentrifugiert. Vom Überstand wurden die Proteine dann durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und der Phosphorylierungszustand von alpha-MHC mit Hilfe eines Phosphotyrosin (αPY)-spezifischen Antikörpers (4G10) im Immunoblot bei 73 KDa analysiert.
Statististische Auswertung
Alle quantitativen Daten sind als Mittelwerte dargestellt (± SEM = Standardfehler vom Mittelwert). Die Gauss-Verteilung der Daten wurde durch einen komplett randomisierten Einweg-ANOVA-Test (Behandlung × Dosis) ermittelt, gefolgt von einem Tukey/Kramer-t-Test, wenn erlaubt. (p)-Werte < 0.05 können als signifikant angesehen werden; entsprechend sind: **bzw.^## (p < 0.01), * bzw. ^# (p < 0.05).
Erläuterungen zu den Abbildungen
1. Strukturformeln der erfindungsmäßig verwendeten 1-Arylisochromanderivate. ISO-4 (1-(3',4'-dihydroxy)phenyl-6,7-dihydroxy-isochroman), ISO-3 (1-(3'-methoxy-4'-hydroxy)phenyl-6,7-dihydroxyisochroman, ISO-2 (1-(3',4'-dimethoxy)phenyl-6,7-dihydroxyisochroman), ISO-0 (1-(3',4'-dimethoxy)phenyl-6,7-dimethoxyisochroman).
2. Antiproliferativer Effekt auf C6-Zellen, nach Inkubation mit den Testsubstanzen (ISO-4 bis ISO-0), erkennbar an einer verminderten Zelldichte.
Nach 3 DIV-Inkubation der C6-Zellen wurden je Vial in einem Sehfeld von 400 × 500 μm die Anzahl der Zellen ermittelt. Von 3 Versuchen (mit je 2 Vials) wurden je 2 Sehfelder ausgezählt. Es ist überraschend, dass bei einer Einsatzkonzentration von 100 μM ISO-4, ISO-3 bzw. ISO-2, im Vergleich zur DMSO-Kontrolle (683 Zellen/Sehfeld) die Zellzahl auf 184, 338 bzw. 180 Zellen/Sehfeld reduziert ist. Bei einer Einsatzkonzentration von 50 μM ist eine signifikante Reduzierung der Zellzahl bei ISO-4 (470 Zellen/Sehfeld) und ISO-2 (313 Zellen/Sehfeld) erkennbar. ISO-0 zeigt nur einen geringfügigen Einfluss auf die Verringerung der Zellzahl, war in hoher Konzentration (100 μM) aber eindeutig cytostatisch; ^##p < 0.01, ^# p < 0.05, Tukey/Kramer-t-Test korrigiert für die Anzahl der verglichenen Proben (n = 6). Ein Einweg-ANOVA zeigte, dass die Zugabe der Testsubstanzen eine signifikante Verringerung der Zellzahl gegenüber der Kontrolle bewirkt (** p < 0.01).
3. Sulforhodamin-B-Assay (Gesamtprotein). Nach Inkubation von C6-Zellen (3 DIV) mit den Testsubstanzen wurde die Menge des mit Sulforhodamin B-anfärbbaren Gesamtproteins/Vial spektrophotometrisch bestimmt. Die mit ISO-4, ISO-3, ISO-2 und ISO-0 (100 μM) inkubierten Zellen zeigten eine Verringerung des Gesamtproteins um 17, 13, 15 und 7%, im Vergleich zu Kontroll-Kulturen (DMSO).
4. Mikroskopische Aufnahmen der C6-Zellen (Sehfelder: 400 × 500 μm), nach Inkubation mit den Testsubstanzen (3 DIV). Es ist erkennbar, dass bei ISO-4 und ISO-2 (geringfügig auch bei ISO-3), die Zelldichte im Vergleich zur Kontrolle (DMSO) deutlich verringert ist. ISO-4 und ISO-2 bewirken eine morphologische Veränderung der malignen C6-Zellen zu mehr langgestreckten Formen. Auch ist eine größere Anzahl ausdifferenzierter Zellen erkennbar (Astrozyten-Typ). ISO-0 hat hingegen nur einen geringfügigen Einfluss auf die Zellproliferation.
5a. und 5b. Ausschnittvergrößerungen mikroskopischer Aufnahmen von mit ISO-2 (100 μM, 3 DIV) inkubierter C6-Zellen, mit unterschiedlicher Zellmorphologie. A = ausdifferenzierte Zelle vom Astrozyten-Typ (= "spiegeleiförmige" Zellen); B = undifferenzierte Zelle (maligner Typ), mit Anzeichen beginnender Differenzierung.
6. Prozentualer Anteil ausdifferenzierter C6-Zellen pro mikroskopischem Sehfeld (400 × 500 μm, n = 4), nach Inkubation (3 DIV) mit den Testsubstanzen (Gesamt-Zellzahl = 100%). Bei ISO-2 (100 und 50 μM) ist eine deutliche Erhöhung des Anteils differenzierter Zellen (40 und 16%) im Vergleich zur Kontrolle (7%) zu erkennen. ISO-4 und ISO-3 (100 μm) zeigten mit 19% bzw. 15% ausdifferenzierter Zellen/Sehfeld eine schwächere Wirkung.
7. Westernblot zur Quantifizierung von phosphoryliertem alpha-MHC bei 73 kDa, nach Inkubation von C6-Zellen (3 DIV) mit ISO-2 (10, 25, 50 und 100 μM). An der verstärkten Proteinbanden-Intensität (bei 73 KDa), nach Reaktion mit dem 4G10-Antikörper (Anti-Phosphotyrosin), ist erkennbar dass in mit 50 bzw. 100 μM ISO-2 inkubierten C6-Zellen eine verstärkte Expression und Phosphorylierung von alpha-MHC erfolgt, bei Auftragung gleicher Proteinmengen. Dieser Befund ist mit einer verstärkten Ausdifferenzierung der C6-Zellen erklärbar.
8. Lactatdehydrogenase-Assay. Nach Inkubation von C6-Zellen mit den Testsubstanzen ISO-4 bis ISO-0 (100 μM; 3 DIV) konnten im Kulturüberstand keine erhöhten LDH-Werte im Vergleich zur Kontrolle (= 100% LDH-Freisetzung, bezogen auf Protein) gemessen werden. Die Zellgifte Wasserstoffperoxid und Colchicin zeigen bei gleicher Einsatzkonzentration (100 μM) eine LDH-Erhöhung auf 340.9 bzw. 238%, bezogen auf Protein, und damit eine Cytotoxizität; (n = 6); ** p < 0.01 gegenüber der Kontrolle (Einweg-ANOVA-Test und Tukey/Kramer-t-Test). Somit erscheint es überraschend, dass die erfindungsmäßig verwendeten Verbindungen bei der untersuchten Einsatzkonzentration nicht cytotoxisch für C6-Zellen sind.
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Claims

Verwendung von 1-Arylisochromanderivaten der Formel (I), worin R₁, R₂, R₃, R₄ für H, OH oder OCH₃ steht, zur Prävention, Behandlung oder Nachbehandlung von Krebs.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Krebs ein fester Tumor ist.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei der Tumor ein Glioblastom (Gliosarkom, Glioblastoma multiforme) oder Gliom ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der wirksame Bestandteil in sterilem Wasser, Phosphatpuffer, TRIS-Puffer, Hepes-Puffer, Ringer-Lösung oder physiologischer Kochsalzlösung gelöst ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Lösungsvermittler für die aktive Komponente Methanol, Ethanol, n- bzw. iso-Propanol, Butylenglycol, Propylenglycol, Polyvinylalkohole, DMSO, Tween, 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin und/oder fette Öle sind.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Applikation oral, kutan oder per Infusion (intravenös, subkutan, intramuskulär, intracerebral, intraperitonial, intracerebroventriculär) erfolgt.