CN102499938A - Toll样受体7和8激动剂及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种针对Toll样受体7和8激动剂及用途，所述激动剂为含有17个碱基特征的核苷酸序列片段，其基本结构为GUCUGAGUGUGUUCUUG。所述激动剂能特异性与TLR7/8结合，促使机体免疫细胞高效释放TNF-a，IL-12和IL-6等细胞因子，而上调免疫功能，可用于抗病毒和抗肿瘤的辅助治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种激动剂，特别涉及一种Toll样受体7和8(TLR7/8)激动剂及应用。
背景技术
对于病毒和肿瘤，直至目前，人们没有很好的药物来应对，对于非自限性病毒和多种肿瘤，机体免疫系统仍是主要的防御力量。近年来，一些免疫调节剂，比如：肿瘤坏死因子a(TNF-a)，自介素12(IL-12)和白介素6(IL-6)等细胞因子，被用于抗病毒和抗肿瘤治疗中，疗效比较理想，但是，价格昂贵，难以联合使用。
自从90年代末期，Toll样受体(TLR)发现以来，人们逐渐认识到多种TLR家族成员处于机体免疫前线，能够特异性地识别不同的病原模式分子，启动固有免疫，来阻击外源性病原微生物的入侵和破坏。这些病原模式分子主要包括脂蛋白、脂多糖和核酸结构的碎片等，由此可见，虽然病原微生物中的外壳蛋白可能早期接触机体免疫系统，而核酸序列可能在病毒复制繁殖后，才被机体识别，因此，机体免疫系统往往处于“被动”防御的状态。为了提高机体的“主动”防御机制，国内外学术界认识到，根据TLR识别特征，来操控免疫调节，增进免疫力，可以提高抗病毒和抗肿瘤的效果。
2004年Heil小组在《科学》杂志上发表文章，首次提出了病毒中一组富含GU结构的单链RNA能够被机体免疫细胞上的TLR7和TLR8特异性地识别，特别是，其中被称为ssRNA40的序列，结构为GCCGUCUGUUGUGUGACUC，能够刺激以TNF-a，IL-12和IFN-a为主的多种细胞因子高水平释放，为细胞免疫治疗提供了新的策略。
那么，科学利用TLR7/8识别病毒病原模式分子，并介导多种细胞因子释放的特性，有利于增进机体免疫力；同时，TLR7/8的天然配基(核苷酸片段)相对于细胞因子，在价格上要便宜，质量便于控制，安全性好，因此，寻找高效的TLR7/8天然激动剂或类天然激动剂，对于临床抗病毒和抗肿瘤治疗都具有积极的意义。
申请人长期从事Toll样家族相关先天免疫研究，目前，针对TLR7/8识别病毒单链RNA特征的规律，利用生物信息学技术，高通量分析了富含GU结构的RNA基序，包括不同侧翼碱基的组合排列特征序列，通过实验筛选验证，成功获得了本发明的ssRNA120，其免疫效率在先前ssRNA40的两倍以上，可作为未来抗病毒和抗肿瘤的辅助治疗药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Toll样受体7和8激动剂及用途。所述激动剂能特异性作用于TLR7/8，促使机体免疫细胞高效释放TNF-a，IL-12和IFN-a等细胞因子，从而上调免疫功能，可用于抗病毒和抗肿瘤的辅助治疗。
本发明的技术方案是：
Toll样受体7和8(TLR7/8)的强力激动剂，所述强力激动剂包含GUCUGAGUGUGUUCUUG的核苷酸序列片段。
上述激动剂在制备治疗抗病毒和抗肿瘤药物中的用途。
本发明所述激动剂基本结构为5`-GUCUGAGUGUGUUCUUG-3`的核苷酸序列片段，其中富含GU结构，以及相应的侧翼碱基组合排列特征，可通过硫代骨架修饰来稳定其结构。本发明所述激动剂能与TLR7/8发生特异性结合，促使机体免疫细胞高效释放TNF-a，IL-12和IL-6等细胞因子，从而上调免疫功能。其效能是以往报道的ssRNA40的两倍以上。
本发明所述激动剂的制备过程：按上述核苷酸序列，通过普通RNA化学合成、硫代修饰并纯化的方法获得。所述激动剂剂型为粉末(水溶性)，使用时，经HBS缓冲液稀释，并与DOTAP(阳离子脂质体)形成混合液(按1∶2体积比，详见实施例1)。该激动剂可在体外诱导细胞活化后，进行回输疗法，或通过注射剂或输液剂等形式给药。可分高中低三个剂量，酌情给药：针对体外诱导使用时，高剂量为25μg/1x106个靶细胞/ml，中剂量为10μg/1x106个靶细胞/ml，低剂量为5μg/1x106个靶细胞/ml；刺激时间24小时后，进行回输。针对成人可经静脉体内诱导时，高剂量10mg，中剂量5mg，高剂量2.5mg。可按每天一次，每周为一个疗程，实际疗程次数可按临床具体情况而定。
由于本发明所述激动剂的作用靶点明确、活化效率高、安全性好的优点，在免疫调节过程中，能有力增进机体免疫功能，可作为抗病毒、抗肿瘤的辅助治疗药物，以及相关研究实验用的试剂，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为ssRNA120通过TLR7刺激细胞因子TNF-a释放状况；
图2为ssRNA120通过TLR8刺激细胞因子TNF-a释放状况；
图3为ssRNA120通过TLR8刺激细胞因子IL-12释放状况；
图4为ssRNA120刺激人外周血单个核细胞释放细胞因子状况；
具体实施方式
下面的实施例可详细地说明本发明，但不以此限制本发明。
实施例1：Toll样受体7和8激动剂实例及制备
激动剂名称：ssRNA120
序列结构：GUCUGAGUGUGUUCUUG
修饰结构：rG*rU*rC*rU*rG*rA*rG*rU*rG*rU*rG*rU*rU*rC*rU*rU*rG(*为硫代修饰，r为RNA)
制备方式：化学合成，委托美国Integrated DNA technologies(IDT)公司。初产量为250 nmole RNA oligo，纯化量为45.2 nmoles，即255.5μg。
使用配置：1)ssRNA120由HBS缓冲液稀释成0.1μg/μl；
2)阳离子脂质体DOTAP由HBS缓冲液，以1∶3比例稀释；
3)将上述第1和2步试剂按1∶2比例混合，作为工作液。
实施例2：ssRNA120通过TLR7的免疫活化效应测定(ELISA法)
2.1主要材料、试剂与设备：
1)细胞株：RAW264.7(ATCC，USA.)。
2)细胞培养基：DMEM(Gibco，Inc.，USA)。
3)参考试剂：fakeRNA120(5’-GACAGAGAGAGAACAAG-3’)
ssRNA40(5’-GCCGUCUGUUGUGUGACUC-3’)
(IDT，Inc.合成)
4)Elisa试剂盒：抗鼠TNF-a(eBioscience，Inc.，USA)。
5)细胞培养箱：FORMA 3111.
6)酶标仪：全波长多功能酶标仪(Thermo Scientific，USA).
2.2实验方法：将RAW264.7细胞稀释至1×106/mL，加入96孔板(200μL/孔)，置37℃，5％CO2培养箱培养2h后，加入5μg/ml ssRNA120为实验组；5μg/mlssRNA40为阳性对照组；5μg/ml fakeRNA120为无效对照组；DOTAP-HBS缓冲液为空对照组，以上各组均设4复孔。继续培养24h后，收集上清，按试剂盒操作说明，进行Elisa实验，以450nm处测定的各孔吸光度(OD450)值，获取TNF-a浓度。
2.3实验结果：ssRNA120与ssRNA40均能刺激RAW264.7细胞释放TNF-a，并且，ssRNA120刺激力显著高于ssRNA40(P＜0.001)，但是，fakeRNA120无刺激效应，因此，相对于fakeRNA120的GA结构，说明ssRNA120的GU结构发挥了刺激作用；同时，相对于ssRNA40，说明ssRNA120的GU结构与相邻碱基的不同排列后，能发挥更强的刺激作用。此外，由于RAW264.7细胞本身含有TLR7而无TLR8，所以，此状态下，该效应主要为ssRNA120经TLR7介导的。如附图1所示。
实施例3：ssRNA120通过TLR8的免疫活化效应测定(ELISA法)
3.1主要材料、试剂与设备：
1)细胞株：THP-1(ATCC，USA.)。
2)细胞培养基：RPMI1640(Gibco，Inc.，USA)。
3)Elisa试剂盒：抗人TNF-a和抗人IL-12p40(eBioscience，Inc.，USA)。
4)细胞培养箱：FORMA 3111.
5)酶标仪：全波长多功能酶标仪(Thermo Scientific，USA).
3.2实验方法：将THP-1细胞稀释至1×106/mL，加入96孔板(200μL/孔)，置37℃，5％CO2培养箱培养2h后，以1.25，2.5，5，10，20μg/ml为浓度梯度，分别加入ssRNA120设为各剂量实验组；并以此梯度加入ssRNA40设立各剂量对照组，以上各组均设4复孔。培养24h后收集上清，按试剂盒操作说明，进行Elisa实验，分别检测TNF-a和IL-12的浓度。
3.3实验结果：ssRNA120和ssRNA40均能刺激THP-1细胞释放TNF-a和IL-12，而且，ssRNA120刺激效能约是ssRNA40的两倍，并且量效关系明显。同时，由于THP-1本身含有TLR8而无TLR7，故该效应主要是ssRNA120通过TLR8介导的。如附图2，图3所示。
实施例4：ssRNA120对人外周血单个核细胞(hPBMC)的免疫活化效应测定
3.1主要材料、试剂与设备：
1)细胞：hPBMC(西南医院血库提高.)。
2)细胞培养基：RPMI1640(Gibco，Inc.，USA)。
3)Elisa试剂盒：抗人TNF-a，抗人IL-12p40，抗人IL-6(eBioscience，Inc.，USA)。
4)细胞培养箱：FORMA 3111.
5)酶标仪：全波长多功能酶标仪(Thermo Scientific，USA).
3.2实验方法：将hPBMC细胞稀释至1×106/mL，加入96孔板(200μL/孔)，置37℃，5％CO2培养箱培养2h后，加入5μg/ml ssRNA120为药物刺激组，DOTAP-HBS缓冲液为空对照组，各组设4复孔。培养24h后收集上清，按试剂盒操作说明，进行Elisa实验，分别检测各细胞因子浓度。
3.3实验结果：由于hPBMC同时含有TLR7和8，实验数据表明，相对于DOTAP组，ssRNA120能刺激hPBMC高水平释放TNF-a，IL-12以及IL-6(p＜0.001)。如附图4所示。
Claims (2)
1.一种Toll样受体7和8激动剂，其特征在于：激动剂包含GUCUGAGUGUGUUCUUG的核苷酸序列片段。
2.权利要求1所述的激动剂在制备治疗抗病毒和抗肿瘤药物中的用途。
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