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Hintergrund der Erfindung
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Menschliches
Interferon-alpha (IFN-α),
auch bekannt als Leukozyten-Interferon und α-Interferon, umfasst eine Familie extrazellulärer Signalproteine
mit antiviralen, antiproliferativen und immunmodulierenden Aktivitäten. IFN-α ist das
erste Interferon, das identifiziert und kommerzialisiert wurde,
und bleibt das bei klinischen Anwendungen am breitesten verwandte
Interferon.
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IFN-α ist ein
Mitglied der Typ I-Interferon-Familie, die auch auch IFN-β, Omega (Leukozyten
(II))-Interferon und Tau(Trophoblasten)-Interferon umfasst. Omega-
und Tau-Interferone
werden nicht klinisch verwendet. IFN-β, das auch als Fibroblasten-Interferon
bekannt ist, ist gut charakterisiert, wird aber in der Klinik weniger
eingesetzt als IFN-α.
Fibroblasten sind die vorherrschenden zellulären Produzenten für IFN-β. IFN-β wurde in
den Vereinigten Staaten für
die Behandlung von rezidivierenden Formen der multiplen Sklerose
zugelassen. Interferon gamma (IFN-γ), das auch als Gamma-Interferon
bekannt ist, ist das einzige bekannte Typ II-Interferon. IFN-γ wird von
aktivierten T-Lymphozyten produziert und spielt beim Aufbau einer
Th1-Immunantwort eine wichtige Rolle. Sein therapeutischer Nutzen
ist begrenzt. In den Vereinigten Staaten wurde menschliches IFN-γ für die Verringerung
der Häufigkeit
und Schwere von Infektionen mit chronischer Granumolatose zugelassen.
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IFN-α selbst steht
für eine
Familie von mehr als einem Dutzend verwandter, homologer Proteine
(Isoformen, Tabelle 1), von denen jedes von einem einzigartigen
Gen codiert wird und von denen jedes ein einzigartiges Aktivitätsprofil
aufweist. Die Aktivitäten
der verschiedenen α-Interferon-Arten
in Bezug auf Viren können um
den Faktor zwanzig oder mehr differieren.
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Klinisch
verwendete IFN-α-Produkte
sind rekombinante Proteine oder hochgereinigte natürliche Proteine
einer einzelnen Isoform. Rekombinantes IFN-α wurde für die Verwendung bei der Behandlung
einer Vielzahl von Tumoren und viralen Erkrankungen zugelassen (Tabelle
2).
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Bis
vor kurzem nahm man an, dass B-Lymphozyten die vorherrschenden Produzenten
für IFN-α sind. Kürzlich wurde
ein neuer Zelltyp im peripheren Blut als die Hauptquelle der Produktion
von Typ I-Interferon identifiziert. Diese vorher unerkannten „natürliches
Interferon-produzierenden Zellen” (IPC) waren viele Jahre lang
als seltene CD4
+/MHC-Klasse II
+-Population
(1:1000 innerhalb der mononukleären
Zellen des peripheren Blutes (PBMC)) beschrieben worden, die nach
viraler Infektion fähig
sind, außergewöhnlich große Mengen
von Typ I-IFN zu produzieren. Cella M et al. Nat. Med 5:919 (1999);
Galy A et al. Blond 95: 128 (2000); Siegal FP et al. Science 284:
1835 (1999). Nach der Isolierung von IPCs aus dem peripheren Blut
wird IL-3 für
das Überleben
dieses Zelltyps benötigt. Tabelle 1. Die Familie von menschlichem
IFN-α
IFN-αA | (IFN-α2a) |
IFN-α2 | (IFN-α2b) |
IFN-α4b | (IFN-α4) |
IFN-αB2 | (IFN-α8) |
IFN-αC | (IFN-α10) |
IFN-αD | (IFN-α1) |
IFN-αF | (IFN-α21) |
IFN-αG | (IFN-α5) |
IFN-αH2 | (IFN-α14) |
IFN-αI | (IFN-α17) |
IFN-αJ1 | (IFN-α7) |
IFN-αK | (IFN-α6) |
IFN-αM1 | |
IFN-αN | |
IFN-αWA | (IFN-α16) |
Tabelle 2. Derzeitige klinische Zulassung
für IFN-α
Zugelassen
in den Vereinigten Staaten | Zugelassen
außerhalb
der Vereinigten Staaten |
Chronische
Hepatitis B
Chronische Hepatitis C
Haarzellen-Leukämie
Haut-T-Zellen-Leukämie
Chronische
myeloische Leukämie
Non-Hodgkin-Lymphom
Adjuvans-Therapie
für malignes
Melanom
Kaposi-Sarkom (in Zusammenhang mit AIDS)
Condyloma
acuminatum (spitze Kondylome) | Multiples
Myelom
Nierenzellkarzinom
Blasenzellkarzinom
Dickdarmkarzinom
Zervikale
Dysplasie
Kehlkopfpapillomatose |
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Es
wird angenommen, dass dendritische Zellen (DC) eine wichtige Rolle
bei der Ausrichtung der Immunantworten gegen Neoantigene spielen.
Banchereau J et al. Nature 392: 245 (1998). Vor kurzem erbrachte Belege
legen das Vorkommen mehrerer distinkter DC-Subtypen in menschlichem
peripherem Blut nahe. Zhong RK et al. J Immunol 163: 1254 (1999).
Diese DC-Subtypen umfassen myeloische DC (mDC) und plasmazellenartige
DC (pDC, auch bekannt als DC2-Zellen). Vorstufen der dendritischen
Zellen enthalten zwei Untergruppen, eine CD11c+/CD123+/–-Population
(Vorläufer
der mDC) und eine CD11c–/CD123++-Population (Vorläufer der
pDC). Die letztere hat kürzlich
grosse Aufmerksamkeit erregt, da berichtet wurde, dass sie identisch mit
den natürlichen
Typ I-IFN-produzierenden Zellen (IPC) sei. O'Doherty U et al. J Exp Med 178: 1067
(1993); Grouard G et al. J Exp Med 185: 1101 (1997); Thomas R et
al. J Immunol 153: 4016 (1994). Nach der Reifung entwickelt dieser
Zelltyp charakteristische DC-Merkmale. O'Doherty U et al. J Exp Med 178: 1067
(1993); Thomas R et al. J Immunol 153: 4016 (1994); Galy A et al.
Blood 95: 128 (2000); Chehimi J et al. Immunology 68: 488. (1989).
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Die
Häufigkeit
der IPCs in PBMC in normalen Lebewesen bewegt sich im Bereich zwischen
0,2 und 0,6 Prozent. Sie sind gekennzeichnet durch die Abwesenheit
der Abstammungs-Marker
CD3 (T-Zellen), CD14 (Monozyten), CD19 (B-Zellen) und CD56 (NK-Zellen),
durch die Abwesenheit von CD11c und durch ihre Expression von CD4,
CD123 (IL-3-Rezeptor α,
IL-3Rα)
und MHC Klasse II. Grouard G et al. J Exp Med 185: 1101–11 (1997);
Rissoan M-C et al. Science 283: 1183–6 (1999); Siegal FP et al.
Science 284: 1835–7
(1999); Cella M et al. Nat Med 5: 919–23 (1999). Morphologisch ähneln IPCs
Lymphozyten. IPCs können
aus PBMC durch eine Kombination von Sortieren von aktivierten Zellen
mittels magnetischer Kügelchen
(MACS) und Sortieren fluoreszenzaktivierter Zellen (Durchflusszytometrie,
FACS) isoliert werden. Ohne die Zugabe von IL-3 sterben die meisten
IPCs in der Zellkultur innerhalb von 3 Tagen. Eine Infektion der
IPCs mit dem Herpes simplex-Virus (HSV, Siegal FP et al. Science
284: 1835–7
(1999)) oder Grippevirus (Cella M et al. Nat Med 5: 919–23 (1999))
führt zur
Produktion großer
Mengen von Typ I-Interferonen, wie bestimmt durch einen biologischen
Test (Schutz von Fibroblasten vor vesikulärem Stomatitisvirus).
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Neben
ihrer Rolle als Trägerin
des genetischen Codes wurde kürzlich
gezeigt, dass DNA als Signalmolekül wirkt (Krieg AM, 1998, Biodrugs).
Die Immunsysteme höherer
Eukaryonten scheinen im Verlauf der Evolution einen Mechanismus
entwickelt zu haben, um prokaryontische Nukleinsäuren auf der Grundlage unmethylierter
CpG-Dinukleotide in bestimmten Basen-Zusammenhängen nachzuweisen. Krieg AM
et al. Nature 374: 546–9
(1995). Unmethylierte CpG-Dinukleotide sind in bakterieller DNA
verbreitet, aber in Wirbeltier-DNA unterrepräsentiert („CpG-Unterdrückung”) und methyliert.
Bird AP Trends in Genetics 3: 342 (1987). DNA, die diese unmethylierten
CpG-Dinukleotide in immunstimulierenden Basen-Zusammenhängen („CpG-Motive”) enthält, löst eine
humorale Immunität
aus durch Induktion der B-Zellen-Aktivierung, Resistenz gegen Aktivierungsinduzierte
Apoptose und IL-6- und IgM-Sekretion aus. Krieg AM et al. Nature
374: 546–9
(1995); Yi AK et al. J Immunol 157: 5394 (1996); und Klinman D et
al. Proc. Natl Acad Sci USA 92: 2879 (1996). Solche CpG-DNA aktiviert
auch Monozyten und Makrophagen, Th1-artige Zytokine zu sekretieren. Ballas
ZK et al. J Immunol 157: 1840 (1996); Cowdery JS et al. J Immunol
156: 4570 (1996); und Halpern MD et al. Cell Immunol 167: 72 (1996).
Dies führt
zur Aktivierung der lytischen Aktivität von natürlichen Killerzellen (NK) und
IFN-γ-Sekretion. Ballas
ZK et al. J Immunol 157: 1840 (1996); Cowdery JS et al. J Immunol
156: 4570 (1996); und Chace JH Clin Immunol Immunopath 84: 185–93 (1997).
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Yamamoto
et al. berichteten 1988 von ihren Erkenntnissen, nach denen eine
als MY-1 bezeichnete Nukleinsäurefraktion,
die aus Mycobacterium bovis (BCG) extrahiert war, in vitro Typ I-Interferone
induzierte. Yamamoto S et al. Jpn J Cancer Res 79: 866–73 (1988).
Daraufhin synthetisierten Tokunaga et al. einen Satz von 45-mer-Oligonukleotiden
mit Sequenzen, die in cDNA vorhanden sind, die für drei zufällig ausgewählte, bekannte BCG-Proteine codiert,
und fanden heraus, dass eine Sequenz, BCG-A4, ein starker Induktor
von Typ I-IFN in Suspensionen von Maus-Milzzellen war. Tokunaga
T et al. Microbiol Immunol 36: 55–66 (1992). Von einem 5'30-mer-Fragment,
BCG-A4a, wurde berichtet, dass es ein so wirksamer Induktor von
IFN war wie das intakte 45-mer BCG-A4.
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Diese
Wissenschaftler berichteten weiter, dass alle Oligonukleotide, die
IFN induzierten, eine palindromische Hexamer-Sequenz GACGTC (vorhanden
in BCG-A4 und BCG-A4a), AGCGCT und AACGTT, aber nicht ACCGGT, umfassten.
Yamamoto S et al. J Immunol 148: 4072–6 (1992). Kimura et al. fanden
anschliessend heraus, dass unter 30-mer-Phosphodiester-Oligodesoxynukleotiden
(ODNs), die das Hexamer-Palindrom AACGTT und oligoA-, oligoC-, oligoT-
und oligoG-Enden enthielten, das letztere (GGGGGGGGGGGGAACGTTGGGGGGGGGGGG,
SEQ ID NO: 165) der stärkste
Induktor für
Typ I-IFN in Suspensionen von Maus-Milzzellen war. Kimura Y et al.
J Biochem (Tokio) 116: 991–4
(1994).
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Kürzlich wurde überraschenderweise
entdeckt, dass CpG-ODN-Sequenzen mit der stärksten Aktivität auf menschliche
B-Zellen keine nachweisbaren Titer von Typ I-IFN in PBMC induzierten.
Hartmann G et al. J Immunol 164: 1617–24 (2000).
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Zusammenfassung der Erfindung
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Gemäß der Erfindung
wurde entdeckt, dass bestimmte immunstimulierende Nukleinsäuren (ISNAs) besonders
als Einzelagenzien geeignet sind, um sowohl das Überleben als auch die Stimulierung
von IPCs zu fördern.
Gemäß der Erfindung
wurde ebenfalls entdeckt, dass bestimmte ISNAs die Notwendigkeit
von IL-3 für das Überleben
von IPC und die Notwendigkeit einer viralen Infektion für die IPC-Aktivierung
aufheben.
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Zusätzlich wurde
gemäß der Erfindung überraschenderweise
entdeckt, dass bestimmte CpG-ISNA
die Produktion großer
Mengen von Typ 1-IFN induzieren, aber minimale Wirkungen auf die
B-Zellen-Aktivierung aufweisen, wohingegen bestimmte andere CpG-ISNA
menschliche B-Zellen und IPCs stark aktivieren, aber minimale Wirkungen
auf die Induktion von Typ I-IFN aufweisen. Überraschenderweise wurde entdeckt,
dass die CpG-ISNA, die starke Induktoren für Typ I-IFN sind, nicht notwendigerweise
ein Hexamer-Palindrom GACGTC, AGCGCT oder AACGTT enthalten, das
von Yamamoto und Kollegen beschrieben wurde. Yamamoto S et al. J
Immunol 148: 4072–6
(1992).
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Diese
Entdeckungen eröffnen
Wege für
die Verwendung von ISNA, und insbesondere von bestimmten CpG-ISNA,
als ein therapeutisches Agens für
klinische Anwendungen, die die Verwendung von IFN-α erfordern.
Klinische Strategien umfassen die lokale und systemische in vivo-Verabreichung
von ISNA genauso wie ex vivo-Strategien, bei denen in vitro ISNA-aktivierte isolierte
IPCs lokal oder systemisch re-infundiert werden. Diese therapeutischen
Strategien schliessen die Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren
(IL-3, GM-CSF, flt3-Ligand
etc.) und anderen Reizen (Superantigene, virale Produkte) ein. CpG-ISNA
der Erfindung, die Induktoren für
Typ I-IFN sind, erlauben auch die in vitro-Produktion von natürlichen
Interferonen unter Verwendung einer aus IPCs abgeleiteten Dauerzelllinie.
Da natürliches
IFN-α eine
Familie von mehr als einem Dutzend separater Genprodukte ist, deren
individuelle Produkte einzigartige Aktivitätsprofile aufweisen, ist die
klinische Verwendung von natürlichen
Interferonen dem aus einem einzelnen rekombinanten IFN-α-Gen abgeleiteten rekombinanten
IFN-α möglicherweise
vorzuziehen.
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Gemäß der Erfindung
wurde überraschenderweise
auch entdeckt, dass Typ I-IFN eine als γδ-T-Zellen bezeichnete Untergruppe von
T-Lymphozyten aktiviert. Zusätzlich
wurde gemäß der Erfindung
weiterhin entdeckt, dass CpG-ODN, die starke Induktoren für Typ I-IFN
sind, aber nicht CpG-ODN, die starke Aktivatoren von B-Zellen und
pDCs sind, ohne starke Induktoren für Typ I-IFN zu sein, γδ-T-Zellen
aktivieren können,
die innerhalb von einer Population von mononukleären Zellen des peripheren Blutes
(PBMCs) vorhanden sind. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden
sein zu wollen, erscheint es wahrscheinlich, dass Typ I-IFN-induzierende CpG-ODN γδ-T-Zellen,
die innerhalb der PBMC vorhanden sind, durch ihre Fähigkeit
aktivieren können,
die Sekretion von Typ I-IFN durch IPCs zu induzieren, die ebenfalls
in den PBMC vorhanden sind.
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Zusätzlich zur
Fähigkeit, γδ-T-Zellen
zu aktivieren, wurde gemäß der Erfindung überraschenderweise ebenfalls
entdeckt, dass Typ I-IFN-induzierende CpG-ODN, aber nicht CpG-ODN,
die starke Aktivatoren von B-Zellen und pDCs sind, ohne starke Induktoren
für Typ
I-IFN zu sein, die Proliferation von Antigen-aktivierten γδ-T-Zellen
erhöhen
können,
die innerhalb einer Population von PBMCs vorhanden sind. Insbesondere
ist die Proliferation im Zusammenhang mit der Anwesenheit von spezifischem
nicht-Peptid-Antigen erhöht,
z. B. dem Phosphoantigen Isopentenylpyrophosphat (IPP).
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Gemäß der Erfindung
wurde überraschenderweise
ebenfalls entdeckt, dass bestimmte CpG-ODN in Zusammenhang mit IPP synergistisch
die Produktion von IFN-γ und
Perforin in γδ-T-Zellen induzieren.
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Gemäß der Erfindung
wurde im Rahmen einer weiteren überraschenden
Entdeckung festgestellt, dass Typ I-IFN-induzierende CpG-ODN, aber
nicht CpG-ODN, die starke Aktivatoren von B-Zellen und pDCs sind, ohne
starke Induktoren für
Typ I-IFN zu sein, die CD40-stimulierte IL-12-Produktion in PBMC
blockieren können. Überraschenderweise
wurde darüber
hinaus herausgefunden, dass CpG-ODNs, die starke Aktivatoren von
B-Zellen und pDCs sind, ohne starke Induktoren für Typ I-IFN zu sein, die gegenteilige
Wirkung hatten, d. h. diese ODN erhöhten tatsächlich die CD40-stimulierte
IL-12-Produktion in PBMC.
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Gemäß der Erfindung
wurde weiterhin entdeckt, dass CpG-ODN, die starke Aktivatoren von
B-Zellen und pDCs sind, ohne starke Induktoren für Typ I-IFN zu sein, bessere
Förderer
des Antigen-spezifischen Primings und Rückrufs von menschlichen zytotoxischen
T-Lymphozyten (CTLs)
sind als CpG-ODN, die wirksame Induktoren von Typ I-IFN sind.
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In
einem Aspekt sieht die Erfindung eine Verbesserung für Therapien
vor, die die Verabreichung von IFN-α an Lebewesen einschliessen.
Diese Verbesserung schliesst die Co-Verabreichung von einer wirksamen Menge
einer isolierten ISNA ein. In einer Ausführungsform ist das IFN-α in einer
klinisch etablierten wirksamen Dosis für IFN-α alleine zu verabreichen. In
einer anderen Ausführungsform
ist das IFN-α in
einer Dosierung unterhalb der klinisch etablierten wirksamen Dosis
für IFN-α alleine
zu verabreichen. Das IFN-α kann
auch in der höchsten
tolerierten Dosis von IFN-α in
der Abwesenheit des Oligonukleotides verabreicht werden. In anderen
Ausführungsformen
ist das IFN-α in
Dosen von 20 Prozent unterhalb, 30 Prozent unterhalb, 40 Prozent unterhalb
oder sogar 50 Prozent unterhalb der höchsten tolerierten Dosis von
IFN-α oder
der klinisch etablierten wirksamen Dosis für IFN-α alleine zu verabreichen.
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In
einem Aspekt betrifft die Erfindung daher die Verwendung einer isolierten
Nukleinsäure
für die
Herstellung eines Medikamentes für
die Verwendung zur Behandlung einer proliferativen Krankheit oder
viralen Infektion, die eine IFN-α-Behandlung
erfordert, wobei die besagte Nukleinsäure eine Sequenz aufweist,
die ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus:
wobei
jeder Kleinbuchstabe für
eine Phosphothioat-Bindung steht und jeder Großbuchstabe eine Phosphodiester-Bindung
anzeigt.
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In
bestimmten bevorzugteren Ausführungsformen
weist die ISNA eine Sequenz auf, die entspricht:
ggGGGACGAGCTCGTCgggggG
(ODN 2247; SEQ ID NO: 11),
ggGGGACGATCGTCGgggggG (ODN 2255;
SEQ ID NO: 16),
ggGGACGTTCGAACGTgggggG (ODN 2295); SEQ ID NO:
20),
ggGGTCGACGTCGACGTCGAGgggggG (ODN 2334; SEQ ID NO: 36)
oder
ggGGACGACGTCGTGgggggG (ODN 2336; SEQ ID NO: 37), wobei
jeder Kleinbuchstabe für
eine Phosphothioat-Bindung steht und jeder Großbuchstabe eine Phosphodiester-Bindung
anzeigt.
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In
einer Ausführungsform
schliesst die Verbesserung weiterhin die Co-Verabreichung von Granulozyten-Monozyten-Kolonie-stimulierendem
Faktor (GM-CSF) an das Lebewesen ein.
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In
einer Ausführungsform
weist das Lebewesen eine proliferative Krankheit auf, wie Haarzellen-Leukämie, chronische
myeloische Leukämie,
Haut-T-Zellen-Leukämie,
multiples Myelom, Follikellymphom, malignes Melanom, Plattenepithelkarzinom,
mit AIDS verbundenes Kaposi-Sarkom, Nierenzellkarzinom, Prostatakarzinom,
Blaszenzellkarzinom, zervikale Dysplasie und Dickdarmkarzinom. In
einer weiteren Ausführungsform
hat das Lebewesen eine virale Infektion wie Hepatitis B, Hepatitis
C, Condyloma acuminatum, menschliches Immundefizienzvirus, Herpes,
Cytomegalievirus, Epstein-Barr-Virus und Papillomavirus.
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In
einem weiteren Aspekt der Erfindung schliesst die Behandlung die
Supplementierung einer IFN-α-Behandlung
eines Lebewesens ein. Dieser Aspekt der Erfindung schliesst die
Verabreichung einer wirksamen Menge IFN-α und einer ISNA der Erfindung
an ein Lebewesen ein, das eine IFN-α-Behandlung benötigt. Die
IFN-α-Dosen,
ISNAs, gleichzeitige Therapie und Zustände, die die Behandlung mit
IFN-α gemäß diesem
Aspekt der Erfindung erfordern, sind die gleichen wie diejenigen,
die oben beschrieben sind.
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In
einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst die Behandlung das Behandeln
eines Lebewesens, um die IPCs des Lebewesens zu aktivieren. Dieses
schliesst die Isolierung von IPCs aus dem Lebewesen, das eine solche
Behandlung benötigt,
die Kultivierung der isolierten IPCs in vitro, das in vitro Kontaktieren
der IPCs mit einer wirksamen Menge einer isolierten ISNA und das
Zurückgeben
der kontaktierten Zellen an das Lebewesen. Die Zellen können in
vitro auch mit einem Wachstumsfaktor oder einem Zytokin in Kontakt
gebracht werden. In einer Ausführungsform
umfasst das Verfahren weiterhin das Kontaktieren der IPC-Zellen
in vitro mit IL-3 oder GM-CSF. In einer weiteren Ausführungsform
werden die Zellen in vitro bei Abwesenheit von IL-3 und/oder GM-CSF
kultiviert. Die ISNAs und die Zustande, die die Behandlung mit IFN-α gemäß diesem
Aspekt der Erfindung erfordern, sind oben beschrieben.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung schliesst die Behandlung die Erhöhung der
Wirksamkeit der IFN-α-Behandlung
eines Lebewesens ein. Dies schliesst die Verabreichung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung die IFN-α umfasst,
an ein eine solche Behandlung benötigendes Lebewesen und die
Co-Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an das Lebewesen
ein, die eine Menge eines ISNA umfasst, die zusammen mit dem verabreichten
IFN-α eine
wirksame IFN-α-Behandlung
darstellt. Die Wirksamkeit der IFN-α-Behandlung ist größer als
die Wirksamkeit der Verabreichung der gleichen Menge IFN-α in Abwesenheit
der co-verabreichten IFN-α.
Die ISNAs und Zustände,
die die Behandlung mit IFN-α gemäß diesem Aspekt
der Erfindung erfordern, sind wie oben beschrieben. In einer Ausführungsform
werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen lokal verabreicht.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung schliesst die Behandlung die Senkung
der IFN-α-Dosis ein,
die für
eine wirksame Behandlung eines Lebewesens benötigt wird. Diese schliesst
die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein
eine Behandlung mit IFN-α benötigendes
Lebewesen ein, die IFN-α umfasst,
und die Co-Verabreichung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ISNA umfasst, an das
Lebewesen. Die Menge des verabreichten IFN-α ist geringer als eine IFN-α-Menge, die
benötigt
wird, um den gleichen therapeutischen Nutzen bei Abwesenheit einer
Co-Verabreichung
der ISNA zu erzielen. In bestimmten Ausführungsformen liegt die Menge
des verabreichtem IFN-α mindestens
20 Prozent, mindestens 30 Prozent, mindestens 40 Prozent, oder gar
mindestens 50 Prozent unter der Menge IFN-α, die bei Abwesenheit der co-verabreichaen immunstimulierenden
Nukleinsäure
benötigt
wird. Die pharmazeutische Zusammensetzung, die die ISNA umfasst,
kann lokal verabreicht werden. Die ISNAs und Zustände, die
die Behandlung mit IFN-α nach
diesem Aspekt der Erfindung erfordern, sind wie oben beschrieben.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung schliesst die Behandlung die Verhinderung
einer mit der IFN-α-Behandlung
zusammenhängenden
Nebenwirkung in einem Lebewesen ein, das eine Behandlung mit IFN-α erhält oder
benötigt.
Dies schliesst die Verabreichung von einer IFN-α-pharmazeutischen Zusammensetzung
und einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Lebewesen, das
die Behandlugn benötigt,
ein, die eine immunstimulierende Nukleinsäure in einer Menge umfasst,
die zusammen mit dem verabreichten IFN-α eine wirksame IFN-α-Behandlung
darstellt. Die mit der IFN-α-Behandlung zusammenhängende Nebenwirkung
wird im Vergleich zu der Nebenwirkung, die auftritt, wenn IFN-α bei Abwesenheit
der co-verabreichten ISNA verabreicht wird, reduziert. Die mit der
IFN-α-Behandlung
zusammenhängende
Nebenwirkung ist möglicherweise
systemisch. Die mit der IFN-α-Behandlung
zusammenhängende
Nebenwirkung, die von dem Verfahren verhindert wird, kann eine jede
der folgenden umfassen: erkältungsähnlichen
Syndrom, Fieber, Kopfschmerz, Schüttelfrost, Muskelschmerz, Müdigkeit,
Anorexie, Übelkeit,
Erbrechen, Diarrhöe
und Depression. Die ISNAs und Zustande, die die Behandlung mit IFN-α gemäß diesem
Aspekt der Erfindung erfordern, sind wie oben beschrieben.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung schliesst die Behandlung die Erhöhung der
Wirksamkeit einer IFN-α-Behandlung
bei einem Lebewesen ein, das eine solche Behandlung benötigt. Dies
schliesst die Verabreichung einer wirksamen Menge einer pharmazeutischen
Zusammensetzung, die IFN-α für die Behandlung
dieses Zustandes umfasst, an ein Lebewesen, das eine solche Behandlung
benötigt,
die Isolierung natürlicher
IFN-produzierender
Zellen von einem Spender, das Kontaktieren der isolierten IFN-produzierenden Zellen
ex vivo mit einer ISNA-Menge, die dahingehend wirkt, dass sie IFN-produzierende Zellen
anregt, IFN-α freizusetzen,
und die Verabreichung der kontaktierten Zellen an das Lebewesen
ein. Der Spender kann, muss aber nicht das Lebewesen sein. Die Behandlung
kann weiterhin das Kontaktieren der isolierten Zellen mit einem
Antigen umfassen. Die Verabreichung der Zellen kann auf eine beliebige,
für die
Zwecke des Verfahrens geeignete Weise erfolgen und kann lokale Injektion
umfassen. Die lokale Injektion kann über ein Blutgefäß erfolgen,
das ein Zielgewebe versorgt. Das Blutgefäß kann unter anderem aus der
Gruppe bestehend aus Leberarterie, Pfortader, Bauchhöhlenarterie
und Milzarterie ausgewählt
werden. Die ISNAs und Zustände,
die die Behandlung mit IFN-α gemäß diesem
Aspekt der Erfindung erfordern, sind wie oben beschrieben.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung schliesst die Behandlung die Unterstützung des Überlebens
der IPCs in vitro ein. Dies umfasst die Isolierung solcher Zellen
aus einem Lebewesen, die Kultivierung der Zellen in einem sterilen
Medium, das für
Gewebekulturen geeignet ist, und das Kontaktieren der Zellen in vitro
mit einer ISNA-Menge, die dahingehend wirkt, dass sie das Wachstum
der Zellen bei Abwesenheit von IL-3 unterstützt, ein. In einer bevorzugten
Ausführungsform
können
die Zellen dendritische Zellen vom Vorläufer-Typ 2 sein. Die Kulturbedingungen
können
auch so ausgewählt
werden, dass sie kein IL-3 und/oder GM-CSF enthalten, oder sie können IL-3,
GM-CSF oder andere Wachstumsfaktoren und Zytokine enthalten. Die
ISNAs, einschließlich
der Oligonukleotide, Sequenzen, Modifikationen u. ä., gemäß diesem
Aspekt der Erfindung, sind wie oben beschrieben.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung schliesst die Behandlung die in vitro-Stimulierung isolierter
IPCs ein. Dies schliesst die Isolierung solcher Zellen aus einem
Lebewesen, die Kultivierung der Zellen in einem sterilen, für Gewebekulturen
geeigneten Medium und das Kontaktieren der Zellen in vitro mit einer ISNA-Menge
ein, die dahingehend wirksam ist, dass sie die Sekretion von mindestens
einem Typ I-Interferon oder die Expression von CD80 induziert. Die
Kulturbedingungen können
die Anwesenheit oder Abwesenheit von Interleukin-3, GM-CSF oder
anderen Wachstumsfaktoren und Zytokinen umfassen. Die IPCs können dendritische
Zellen vom Vorläufer-Typ
2 sein. Die ISNAs, einschliesslich der Oligonukleotide, Sequenzen,
Modifikationen u. ä.
gemäß diesem
Aspekt der Erfindung, sind wie oben beschrieben.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung schliesst die Behandlung die Stimulierung
der Produktion eines Satzes von mindestens 3, 4, 5, 6, 7 oder gar
8 oder mehr Interferon-Subtypen ein. Dies schliesst das Kontaktieren
von IFN-produzierenden Zellen mit einer ISNA ein. Die Zellen können, müssen aber
nicht isoliert sein. Das Kontaktieren kann in vivo oder in vitro
erfolgen. Die ISNAs, die Oligonukleotide, Sequenzen, Modifikationen
u. ä. nach
diesem Aspekt der Erfindung einschliessen, sind wie hierin beschrieben.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Inhibierung
der IL-12-Produktion bereitgestellt.
Dieses Verfahren schliesst das Kontaktieren IL-12-produzierender
Zellen bei Anwesenheit von Interferon-produzierenden Zellen unter
Bedingungen, bei denen die IL-12-produzierenden Zellen normalerweise
IL-12 produzieren, mit einer Menge einer immunstimulierenden Nukleinsäure ein,
die dahingehend wirksam ist, dass sie die Sekretion von Typ I-Interferon
induziert.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure bereit,
die eine Sequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist,
die folgende umfasst:
wobei
jeder Kleinbuchstabe für
eine Phosphothioat-Bindung steht und jeder Großbuchstabe eine Phosphodiester-Bindung
anzeigt.
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In
noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische
Zusammensetzung bereit, die eine isolierte Nukleinsäure umfasst
mit einer Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die folgende umfasst:
wobei
jeder Kleinbuchstabe für
eine Phosphothioat-Bindung steht und jeder Grossbuchstabe eine Phosphodiester-Bindung
anzeigt, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst. In einigen Ausführungsformen
enthält
die pharmazeutische Zusammensetzung auch IFN-α.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Interferon-Zusammensetzung
zur Verabreichung an ein Lebewesen bereitgestellt. Die Zusammensetzung
umfasst Interferon in einem Behälter
zur Verabreichung an ein Lebewesen. Die Interferonmenge im Behälter beträgt mindestens
ungefähr
10% weniger als die maximal tolerierte Dosis (MTD). Bevorzugterweise
liegt die Interferonmenge im Behälter
mindestens ungefähr
20% unter dem MTD, mindestens 30% unter dem MTD, mindestens 40%
unter dem MTD oder sogar mindestens 50% unter dem MTD. Der Behälter kann
auch eine ISNA umfassen.
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In
noch einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung die Bereitstellung
von Kits zur Verabreichung von Interferon und einer ISNA an ein
Lebewesen vor. Die Kits umfassen einen Behälter, der eine Zusammensetzung
beinhaltet, die IFN-α umfasst,
sowie Anweisungen zur Verabreichung des Interferons an ein Lebewesen umfasst,
das eine solche Behandlung benötigt,
in einer Menge, die mindestens ungefähr 10% weniger als die MTD,
20% weniger als die MTD, 30% weniger als die MTD, 40% weniger als
die MTD oder 50% weniger als die MTD beträgt. Der Kit kann im gleichen
Behälter
oder in einem getrennten Behälter
eine ISNA umfassen. Der Kit kann auch Anweisungen für die Behandlung
eines Lebewesens mit einem Zustand, der für eine Behandlung mit IFN-α empfänglich ist,
umfassen.
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Diese
und andere Aspekte der Erfindung werden unten detaillierter beschrieben.
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Kurze Beschreibung der Figuren
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1 stellt
FACS-Analysen von Zellpopulationen während der Isolierung und Charakterisierung
von IPCs mittels magnetischer Kügelchen
und Durchflusszytometrie dar. Von links nach rechts werden gezeigt:
Selektion von lin–/MHC
Klasse II+-Zellen aus PBMCs; weitere Selektion von CD123+/MHC Klasse
II+-Zellen von aus lin–/CD4+/MHC
Klasse II+-Zellen; und Charakterisierung von frisch isolierten lin–/CD4+/MHC
Klasse II+/CD123+ IPCs als CD80-.
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2 stellt
FACS-Analysen des Überlebens
und der Aktivierung (CD80) von frisch isolierten IPCs nach zweitägiger Inkubation
bei Anwesenheit von ausgewählten
Wachstumsfaktoren und Stimuli dar. Wachstumsfaktor (GM-CSF) und/oder
Stimulus (CpG-Oligonukleotid
oder LPS) für
jedes Feld: oben links, keine; oben Mitte, CpG-Oligonukleotid; oben
rechts, LPS; unten links, GM-CSF; und unten Mitte, GM-CSF und CpG-Oligonukleotid.
Die Zahl in der oberen rechte Ecke von jedem Feld zeigt die mittlere
Fluoreszenzintensität (MFI)
von CD80. Die Ergebnisse stehen für fünf unabhängige Experimente.
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3 stellt
FACS-Analysen dar, die die unterschiedlichen Wirkungen zeigen, die
CpG und Poly IC auf das Überleben
und die Aktivierung frisch isolierter IPCs haben. Alle Zellen wurden
drei Tage lang bei Anwesenheit von IL-3 inkubiert. Die Zellen wurden
anschließend
für zusätzliche
24 Stunden inkubiert unter Zugabe von: nichts (linke Felder); CpG
(mittlere Felder); oder Poly IC (rechte Felder). Die MFI von CD80
wird in jedem der unteren Felder oben rechts gezeigt. Die Ergebnisse
stehen für
drei unabhängige
Experimente.
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4 ist
eine Kurve, die die Konzentration von IFN-α (durch IFN-α-spezifischen ELISA bestimmt)
im Überstand
bei Anwesenheit von IL-3 und GM-CSF für zwei Tage inkubierten IPCs
darstellt, entweder mit CpG-Oligonukleotid (geschlossener Balken)
oder ohne CpG-Oligonukleotid
(offener Balken). Die Ergebnisse stehen für drei unabhängige Experimente.
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5 zeigt
eine Kurve, die die Konzentration von IFN-α darstellt, die in den Überständen von
PBMC von verschiedenen Spender nach einer 48-ständigen Inkubation in Anwesenheit
bei 3 μM
ODN 2006 (n = 7), 1585 (n = 7), 2197 (n = 6), 2198 (n = 5) oder
Medien ohne hinzugegebene ODN (n = 7) induziert ist. Die Fehlerbalken
zeigen die SEM an.
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6 zeigt
eine Kurve, die die Dosis-Antwort von CpG-ODN-induzierter IFN-α-Synthese
durch PBMC darstellt, die 48 Stunden lang bei Anwesenheit von ODN
2216, 1585, 2006 und 2243, deren Konzentration 0,2 bis 12 μg/m betrug,
kultiviert wurden.
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7 zeigt
eine Kurve, die die CpG-ODN-vermittelte Stimulierung der IFN-α- und IFN-β-Produktion in PBMC
darstellt, die bezüglich
plasmazellenartigen dentritischen Zellen angereichert waren, mit
(n = 3) und ohne (n = 4) Zugabe von Lipofectin (10 μg/m). PBMC
wurden 48 Stunden lang bei Anwesenheit von IL-3 alleine (–) oder
IL-3 mit Zugabe von ODN 2006, 1585, 2197 oder 2216 inkubiert. Die
Ergebnisse werden als Mittelwerte von drei oder vier unabhängigen Experimenten
mit verschiedenen Spender gezeigt; jedes wurde zweifach ausgeführt. Die
Fehlerbalken zeigen die SEM an. *p ≤ 0,0018 (Bonferroni-Dann-Korrektur).
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8 zeigt eine Serie von vier Kurven, die
die Ergebnisse von vier FACS-Experimenten zur Untersuchung des intrazellulären IFN-α darstellen.
Feld A, Identifizierung von lin+- und lin–-Zellen. Feld B, Identifizierung
von CD123+/–/HLA
DR++mDC (Gate II) und CD123++/HLA
DR+ pDC (Gate III) in lin–-Zellen.
Feld C, fehlende Färbung
auf intrazelluläres
IFN-α in
lin+-Zellen.
Feld D, Färbung
auf intrazelluläres
IFN-α in
lin–-Zellen.
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9 zeigt eine Serie von sechs Kurven, die
Ergebnisse aus sechs FACS-Experimenten zur Untersuchung von intrazellulärem IFN-α (Felder
A) und TFN-α (Felder
B) in lin–/HRA
DR+-plasmazellenartigen
dentritischen Vorläuferzelien
nach Stimulierung mit verschieden CpG-Oligonukleotiden (2006, 2216, beide
mit 3 μg/m)
darstellen. Brefeldin A wurde während
der TFN-α-Inkubation
hinzugefügt.
MFI, mittlere Fluoreszenzintensität.
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10 zeigt eine Kurve, die die CD86-Expression auf
plasmazellenartigen dentritischen Zellen als Reaktion auf IL-3 alleine
(–) oder
auf IL-3 mit verschiedenen CpG-ODN (2006, 585, 2197 oder 2216, alle
bei einer Konzentration von 3 μg/m)
darstellt. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten
mit Zellen von verschiedenen Spender gezeigt. Die Fehlerbalken zeigen
die SEN. *p < 0,0018 (Bonferroni-Dunn-Korrektur).
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11 stellt eine Kurve dar, die eine FACS-Reinigung
von plasmazellenartigen dendritischen Zellen (Feld A) und die Sekretion
von IFN-α und
IFN-β durch
gereinigte plasmazellenartige dentritische Zellen als Reaktion auf
IL-3 mit oder ohne ODN 2216 (Feld B) zeigt.
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12 stellt die NK-Zellen-vermittelte Lyse von K562-Zellen
dar nach Exponierung von PBMC gegenüber ODN 2216, 1585, 2006, 2118,
IL-2 oder Medium alleine.
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13 zeigt eine Kurve, die die Konzentration von
IL-8 (durch einen IL-8-spezifischen ELISA bestimmt), die im Überstand
von IPCs nach zweitägiger
Kultur bei Anwesenheit von IL-3 alleine (links), IL-3 supplementiert
mit CpG-Oligonukleotid (Mitte) oder IL-3 supplementiert mit Poly
IC (rechts) vorhanden ist, darstellt. Die Ergebnisse stehen für drei unabhängige Experimente.
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14 zeigt eine Kurve, die die IFN-γ-Produktion
durch γδ-T-Zellen
als Reaktion of CpG-ODN
2006, 1585 oder 2216 bei Anwesenheit oder Abwesenheit von Nichtpeptid-Antigen
Isopentenylpyrophosphat (IPP) darstellt. Ergebnisse werden als mittlere
Fluoreszenzintensität
(MFI) für
intrazelluläre
Färbung
auf IFN-γ,
mit Medium alleine als Negativkontrolle, gezeigt. Daten werden als
Mittelwert + SEM gezeigt; *(p < 0,01)
und **(p < 0,001)
zeigen p-Werte an, die gemäß dem Studenten-t-Test
für gepaarte
Probem berechnet wurden, wobei die Mediumkontrolle mit CpG-ODN und
IPP alleine mit IPP + CpG-ODN verglichen wird.
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15 zeigt ein Kurvenpaar, das die Proliferation
von γδ-T-Zellen
als Reaktion auf CpG-ODN
2006, 1585 oder 2216 bei Anwesenheit oder Abwesenheit des nicht-peptidischen
Antigens Isopentenly-Pyrophosphat (IPP) darstellt. Feld A stellt
die Kinetiken der γδ-T-Zellen-Expansion über zehn
Tage aus einem repräsentativen
Experiment dar. Feld B stellt die Expansion von γδ-T-Zellen zehn Tage nach Stimulierung
mit IPP alleine oder in Kombination mit verschiedenen CpG-ODN dar.
Für jedes
ODN wurden zwischen neun und sechzehn Spender analysiert. Die Daten
werden als x-fache Zunahme im Vergleich zu IPP alleine gezeigt (Mittelwert
+ SEN); *zeigt p < 0,05
an (IPP gegen IPP + CpG-ODN).
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16 zeigt eine Kurve, die die Regulierung der CD40-induzierten
IL-12p70-Produktion durch Typ I-IFN und durch verschiedene CpG-ODN
darstellt. Die Daten sind als x-faches der IL-12p70-Produktion durch anti-CD40
alleine (Mittelwert = 143 pg/m) gezeigt und stehen für den Mittelwert
plus SEM von drei verschiedenen Spender.
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17 zeigt eine Serie von Kurven, die die
Wirkungen von CpG-ODN 2006, 1585 und 2216 auf die Erinnerungs- und
primäre
peptidspezifische menschliche CTL-Reaktion darstellt. Felder A und
C, peptidespezifische IFN-γ-produzierende
CTL als Prozentsatz aller CD8+-T-Zellen
für das
Erinnerungsantigen Grippe-Matrix-Peptid bzw. für das primäre Antigen melan-A/mart-1-Peptid.
Felder B und D, Antigen-spezifische Tetramer-positivfärbende CD8+-T-Zellen für das Erinnerungs-Antigen Grippe-Matrix-Peptid
bzw. das primäre
Antigen melan-A/mart-1-Peptid.
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18 zeigt eine schematische Wiedergabe eines Kits,
der einen Behälter
umfasst, der eine Zusammensetzung beinhaltet, die IFN-α in einer
Menge, die mindestens ungefähr
10% geringer ist als die maximal tolerierte Dosis (MTD) und, im
gleichen Behälter
oder in einem getrennten Behälter,
eine ISNA umfasst. Der Kit kann auch Anweisungen für die Behandlung
eines Lebewesens mit einem Krankheitsbild, das für die Behandlung mit IFN-α empfänglich ist,
umfassen.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Diese
Erfindung schliesst die Entdeckung ein, dass eine bestimmte Untergruppe
von Blutzellen, natürlich
IFN-produzierende Zellen (IPCs), durch ISNAs stimuliert werden,
IFN-α zu produzieren.
Diese Entdeckung war überraschend,
weil es vorher unbekannt war, welcher Bestandteil eines UV-bestrahlten
Virus oder von durch Hitze abgetöteten
Bakterien für
die Induktion der IFN-α-Produktion
durch IPCs verantwortlich war. Siegal FP et al. Science 284: 1835–7 (1999).
Die Entdeckung war ebenfalls überraschend,
weil reife DC2s, die aus den IPCs entstehen, keine starken Produzenten
für IFN-α sind. Weiterhin
war ebenfalls bekannt, dass von Monozyten abgeleitete dendritische
Zellen (DC1s) kein IFN-α als
Reaktion auf CpG-Nukleinsäuren
produzieren. Es war ebenfalls überraschend,
dass eine ganze Reihe von IFN-α-Molekülen stimuliert
wird. Zusätzlich schliesst
diese Erfindung die lokale Induktion von IFN-α an der Stelle der ISNA-Verabreichung
ein, wodurch toxische Wirkungen vermieden werden, die mit der systemischen
Verabreichung von IFN in Dosen, die notwendig sind, um ähnliche
lokale Konzentrationen von IFN-α zu
erreichen, verbunden sind. Die Erfindung schliesst ebenfalls die
unerwartete Entdeckung ein, dass ISNAs IFN-produzierende Zellen dazu stimulieren können, sie
zu aktivieren, das co-stimulierende Molekül CD80 (B7-1) zu exprimieren.
Eine weitere unerwartete Entdeckung ist, dass ISNAs das Überleben
von IFN-produzierenden Zellen selbst in der Abwesenheit von Interleukin-3
unterstützen
können.
Diese verschiedenen Entdeckungen haben zu den in vivo, ex vivo,
und in vitro-Erfindungen geführt,
die hierin beschrieben sind.
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Eine
ISNA ist ein Nukleinsäuremolekül, das nach
Kontaktieren mit Zellen des Immunsystems selbst in der Lage ist,
kontaktierte Zellen des Immunsystems anzuregen, zu proliferieren
und/oder aktiviert zu werden. Das Kontaktieren kann direkt oder
indirekt sein, z. B. können
die ISNA möglicherweise
einen ersten Typ von Immunzellen direkt stimulieren, ein Produkt
zu exprimieren, das wiederum einen zweiten Typ von Immunzellen stimulieren
kann, der nicht der ISNA ausgesetzt gewesen ist oder nicht auf sie
reagiert. Die immunstimulierende Wirkung der ISNA ist von einem
beliebigen Produkt getrennt, das vielleicht zufällig durch die Sequenz der ISNA
codiert wird. In ähnlicher
Weise ist die immunstimulierende Wirkung einer ISNA verschieden
von und hängt
nicht ab von irgendeinem Antisense-Mechanismus. Nur bestimmte Nukleinsäuren sind
ISNAs. Ursprünglich
nahm man an, dass bestimmte palindromische Sequenzen immunstimulierend
waren. Tokunaga T et al. Microbiol Immunol 36: 55–66 (1992);
Yamamoto T et al. Antisense Res Dev. 4: 119–22 (1994). Weitere Arbeiten zeigten,
dass nicht-palindromische Sequenzen ebenfalls immunstimulierend
sind, solange sie CpG-Dinukleotide in bestimmten Sequenz-Zusammenhängen (CpG-Motive)
enthalten. Krieg AM et al. Nature 374: 546–9 (1995). Die ISNAs können einzelsträngig oder
doppelsträngig
sein. Im Allgemeinen sind doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle in vivo
stabiler, wohingegen einzelsträngige
Nukleinsäuremoleküle eine
erhöhte
Immunaktivität
aufweisen. Daher wird in einigen Aspekten der Erfindung bevorzugt,
dass die ISNA einzelsträngig
ist, und in anderen Aspekten wird bevorzugt, dass die ISNA doppelsträngig ist.
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Die
Begriffe „Nukleinsäure” und „Oligonukleotid” werden
synonym verwendet und bedeuten mehrere, kovalent verbundene Nukleotide,
wobei jedes Nukleotid einen Zucker (z. B. Ribose oder Desoxyribose),
der an eine Phosphatgruppe und an eine austauschbare organische
Base gebunden ist, die entweder ein substituiertes Pyrimidin (z.
B. Cytosin (C), Thymin (T) oder Uracil (U)) oder ein substituiertes
Purin ist (z. B. Adenin (A) oder Guanin (G)), umfasst.
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Wie
hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „Nukleinsäure” und „Oligonukleotid” auf Oligoribonukleotide
genau so wie auf Oligodesoxyribonukleotide. Diese Begriffe sollen
auch Polynukleoside (d. h. ein Polynukleotid minus dem Phosphat)
und ein jedes andere Polymer, das organische Basen enthält, umfassen.
Nukleinsäuremoleküle können aus
vorhandenen Nukleinsäurequellen
(z. B. genomischer DNA oder cDNA) erhalten werden, sind aber vorzugsweise
synthetisch (z. B. durch Oligonukleotidsynthese produziert).
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Die
Begriffe „Nukleinsäure” und „Oligonukleotid” umfassen
auch Nukleinsäuren
oder Oligonukleotide mit einer kovalent modifizierten Base und/oder
Zucker. Z. B. umfassen sie Nukleinsäuren, die Rückgrat-Zucker aufweisen, die
kovalent an andere organische Gruppen mit geringem Molekulargewicht
als eine Hydroxygruppe an der 3'-Position
und eine andere Gruppe als einer Phosphatgruppe an der 5'-Position befestigt
sind. Derartige modifizierte Nukleinsäuren können möglicherweise eine 2'-O-alkylierte Ribose-Gruppe
umfassen. Zusätzlich
können
modifizierte Nukleinsäuren
möglicherweise
Zucker wie Arabinose statt Ribose umfassen. Somit können die
Nukleinsäuren
bezüglich
der Rückgrat-Zusammensetzung heterogen
sein und dadurch eine jede mögliche
Kombination aus miteinander verbundenen Polymer-Einheiten enthalten
wie Peptid-Nukleinsäuren
(die ein Aminosäuren-Rückgrat mit
Nukleinsäure-Basen
aufweisen). In einigen Ausführungsformen sind
die Nukleinsäuren
bezüglich
der Rückgrat-Zusammensetzung
homogen.
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Nukleinsäuren können auch
Basen-Analoga wie C-5-Propyn-modifizierte Basen umfassen. Wagner
et al. Nature Biotechnology 14: 840–844 (1996). Purine und Pyrimidine
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, 5-Methylcytosin, 2-Aminopurin, 2-Amino-6-chlorpurin,
2,6-Diaminopurin, Hypoxanthin und andere natürlich oder nicht-natürlicherweise
vorkommende Nukleobasen, substituierte und nicht-substituierte aromatische
Gruppen.
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Die
Nukleinsäure
ist ein verbundenes Polymer aus Basen, Nukleobasen-Analoga oder
Nukleotiden. Wie hierin im Zusammenhang mit verbundenen Einheiten
einer Nukleinsäure
verwendet, bedeutet „verbundene” oder „Bindung” zwei Einheiten,
die aneinander durch ein beliebiges physikochemikalisches Mittel
gebunden sind. Dies beinhaltet jede beliebige kovalente oder nicht-kovalente
Bindung, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist. Solche Bindungen
sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt. Natürliche Bindungen,
die die gewöhnlich
in der Natur gefundenen sind und die die einzelnen Einheiten einer
Nukleinsäure
verbinden, sind am üblichsten.
Die einzelnen Einheiten einer Nukleinsäure können jedoch durch synthetische oder
modifizierte Bindungen verbunden sein.
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Die
Nukleinsäuren
gemäß der Erfindung
umfassen mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid. Ein Oligonudeotid, das
mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid umfaßt, ist
ein Nukleinsäuremolekül, das eine
unmethylierte Cytosin-Guanin-Dinukleotidsequenz
enthält
(d. h. „CpG-DNA” oder DNA,
die ein von einem 3'-Guanin
gefolgtes 5'-Cytosin
umfasst, das durch eine Phosphatbindung verbunden ist) und das Immunsystem
aktiviert. Das gesamte CpG-Oligonukleotid oder Teile können unmethyliert
sein, aber mindestens das C des 5'-CG-3' muss unmethyliert sein. Die CpG-Oligonukleotide
können
doppelsträngig
oder einzelsträngig
sein. Die Begriffe CpG-Oligonukleotid oder CpG-Nukleinsäure, wie hierin verwendet,
bezeichnen ein immunstimulierendes CpG-Oligonukleotid oder eine Nukleinsäure, sofern
nicht anders angegeben.
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Für die Verwendung
im Rahmen der vorliegenden Erfindung können die Nukleinsäuren de
novo unter Verwendung von irgendeiner aus einer Vielzahl von Verfahren
synthetisiert werden, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Z. B.
können
die Nukleinsäuren
unter Verwendung des β-Cyanoethyl-Phosphoramidit-Verfahrens
(Beaucage SL and Caruthers MH Tetrahedron Lett 22: 1859 (1981))
oder des Nucleosid-H-Phosphonat-Verfahrens (Garegg et al. Tetrahedron
Lett 27: 4051 (1986); Froehler et al. Nucl Acid Res 14: 5399 (1986); Garegg
et al. Tetrahedron Lett 27: 4055 (1986)), Gaffney et al. Tetrahedron
Lett 29: 2619 (1988)) synthetisiert werden. Diese Reaktionen können von
einer Vielzahl von automatisierten Oligonukleotidsynthesemaschinen ausgeführt werden,
die auf dem Markt erhältlich
sind. Diese Oligonukleotide werden als synthetische Oligonukleotide
bezeichnet. Alternativ können
ISNAs im großen
Maßstab
in Plasmiden produziert werden (siehe Sambrook, T., et al., „Molecular
Cloning: A Laboratory Manual”,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) und in kleinere
Teile aufgetrennt oder als Ganzes verabreicht werden. Oligonukleotide
können
aus vorhandenen Nukleinsäuren
(z. B. genomischer DNA oder cDNA) unter Verwendung von bekannten
Techniken, wie denjenigen, die Restriktionsenzyme, Exonukleasen
oder Endonukleasen verwenden, hergestellt werden. Oligonukleotide,
die auf diese Weise hergestellt werden, werden als isolierte Oligonukleotide
bezeichnet. Der Begriff ISNA umfasst sowohl synthetische als auch
isolierte immunstimulierende Nukleinsäuren.
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Für die Verwendung
in vivo sind ISNAs bevorzugterweise relativ resistent gegen Abbau
(sind z. B. stabilisiert). Ein „stabilisiertes Nukleinsäuremolekül” soll ein
Nukleinsäuremolekül bezeichnen,
das relativ resistent gegen in vivo-Abbau (z. B. durch eine Exo-
oder Endonuklease) ist. Wenn z. B. das 3'-Ende eines Oligonukleotides eine Selbst-Komplementarität bezüglich einer
stromaufwärts
gelegenen Region aufweist, so dass es zurückfalten und eine Art Stemloop-Struktur
bilden kann, dann wird das Oligonukleotid stabilisiert und zeigt daher
eine höhere
Aktivität.
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Alternativ
kann die Stabilisierung einer Nukleinsäure durch Phosphat-Rückgrat-Modifikationen erreicht werden.
Bevorzugte stabilisierte Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung
weisen ein modifiziertes Rückgrat auf.
Es wurde gezeigt, dass die Modifikation des Oligonukleotid-Rückgrates
eine erhöhte
Aktivität
der ISNAs mit sich bringt, wenn diese in vivo verabreicht werden.
Diese stabilisierten Strukturen sind bevorzugt, da die ISNAs der
Erfindung ein mindestens teilweise modifiziertes Rückgrat aufweisen.
Z. B. liefern CpG-Oligonukleotide
einer gegebenen Sequenz, die mindestens zwei Phosphothioat-Bindungen
am 5'-Ende des Oligonukleotids
und mehrere Phosphothioat-Bindungen am 3'-Ende umfassen, bevorzugterweise fünf, eine
maximale Aktivität
und schützen
das Oligonukleotid vor dem Abbau durch intrazelluläre Exo-
und Endonukleasen. Andere modifizierte Oligonukleotide umfassen
Phosphodiester-modifizierte Oligonukleotide, Kombinationen von Phosphodiester- und Phosphothioat-Oligonukleotiden,
Methylphosphonat, Methylphosphothioat, Phosphodithioat und Kombinationen
davon. Jede dieser Kombinationen und ihre besonderen Wirkungen auf
Immunzellen werden detaillierter in den veröffentlichten PCT-Patentanmeldungen
PCT/US95/01570 und PCT/US97/19791 diskutiert, die Priorität der US-Patentanmeldungen
08/386,063 und 08/960,774 beanspruchen, die am 07. Februar 1995
bzw. 30. Oktober 1997 eingereicht wurden. Man nimmt an, dass diese
Oligonukleotide mit modifiziertem Rückgrat aufgrund von verstärkter Nukleaseresistenz,
erhöhter
zellulärer
Aufnahme, erhöhter
Proteinbindung und/oder veränderter
intrazellulärer
Lokalisation möglicherweise
eine höhere
stimulierende Aktivität
zeigen.
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Modifizierte
Rückgrate
wie Phosphothioate können
unter Verwendung von autmoatisierten Techniken, die entweder Phosphoramidat-
oder H-Phosphonat-Reaktionen verwenden, synthetisiert werden. Aryl-
und Alkyl-Phosphonate können
hergestellt werden wie z. B. in
US-Patent
Nr. 4,469,863 beschrieben wird; und Alkylphosphotriester
(bei denen die geladene Sauerstoffgruppe wie in
US-Patent Nr. 5,023,243 und im
europäischen Patent Nr. 092,547 beschrieben
alkyliert ist) können
durch automatisierte Festphasensynthese unter Verwendung von kommerziell
erhältlichen
Reagenzien hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung anderer DNA-Rückgratmodifikationen
und -Substitutionen wurden beschrieben. Uhlmann E und Peyman A Chem
Rev 90: 544 (1990); Goodchild J Bioconjugate Chem 1: 165 (1990).
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Andere
stabilisierte Oligonukleotide umfassen: nicht-ionische DNA-Analoga
wie Alkyl- und Aryl-Phosphate (bei denen der geladene Phosphonat-Sauerstoff
durch eine Alkyl- oder Aryl-Gruppe
ersetzt ist) und Alkylphosphodiester und Alkylphosphotriester (bei
denen die geladene Sauerstoffgruppe alkyliert ist). Auch von Oligonukleotiden,
die an einem oder beiden Enden ein Diol wie Tetraethylenglykol oder
Hexaethylenglykol enthalten, konnte gezeigt werden, dass sie im
wesentlichen gegen Nuklease-Abbau resistent sind.
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In
einigen Ausführungsformen
sind die gemäß der Erfindung
nützlichen
ISNAs S- und R-chirale
ISNAs. Wie hierin verwendet, ist eine „S-chirale ISNA” eine ISNA,
bei der wenigstens zwei Nukleotide eine Rückgratmodifikation aufweisen,
die ein Chiralitätszentrum
bildet, und bei der eine Vielzahl der Chiralitätszentren S-Chiralität aufweisen.
Eine „R-chirale
ISNA”,
wie hierin verwendet, ist eine ISNA, bei der mindestens zwei Nukleotide
eine Rückgratmodifikation
aufweisen, die ein Chiralitätszentrum
bildet, und bei der eine Vielzahl der chiralen Zentren R-Chiralität aufweisen.
Die Rückgrat-Modifikation
kann eine jede Art von Modifikation sein, die ein Chiralitätszentrum
bildet. Die Modifikationen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
Phosphothioate, Phosphodithioate, Methylphosphonate, Methylphosphothioate
und Kombinationen davon.
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Die
chiralen ISNAs müssen
mindestens zwei Nukleotide innerhalb des Oligonukleotides aufweisen, die
eine Rückgratmodifikation
aufweisen. Jedoch können
alle oder weniger als alle der Nukleotide in den Oligonukleotiden
ein modifiziertes Rückgrat
aufweisen. Von den Nukleotiden, die ein modifiziertes Rückgrat aufweisen
(die als Chiralitätszentren
bezeichnet werden) weist eine Vielzahl die gleiche Chiralität, S oder
R, auf. Eine „Vielzahl”, wie hierin
verwendet, bezieht sich auf eine Menge, die größer als 50% ist. Daher können weniger
als alle der Chiralitätszentren
S- oder R-Chiralität
aufweisen, solange eine Vielzahl der Chiralitätszentren S- oder R-Chiralität aufweisen.
In einigen Ausführungsformen
weisen wenigstens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder
100% der Chiralitätszentren
S- oder R-Chiralität
auf. In anderen Ausführungsformen
weisen mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder
100% der Nukleotide Rückgratmodifikationen
auf.
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Die
S- und R-chiralen ISNAs können
durch ein jedes auf dem Gebiet für
die Herstellung chiral reiner Oligonukleotide bekanntes Verfahren
hergestellt werden. Viele Veröffentlichungen
lehren Verfahren zur Herstellung stereoreiner Phosphothioat-Oligodesoxynukleotide
unter Verwendung eines Oxathiaphospholan-Verfahren wurden veröffentlicht.
Stec WJ et al. J Am Chem Soc 117: 12019 (1995). Andere Verfahren
zur Herstellung chiral reiner Oligonukleotide wurden von Firmen
wie ISIS Pharmaceuticals beschrieben. Auch US-Patente haben diese
Verfahren ebenfalls beschrieben. Z. B. offenbaren die
US-Patente mit den Nummern 5,883,237 ;
5,837,856 ;
5,599,797 ;
5,512,668 ;
5,856,465 ;
5,359,052 ;
5,506,212 ;
5,521,302 und
5,212,295 Methoden zur Erzeugung stereoreiner
Oligonukleotide.
-
Ein „Lebewesen” soll einen
Menschen oder ein Wirbeltier bezeichnen, was einen Hund, eine Katze, ein
Pferd, eine Kuh, ein Schwein, ein Schaf, eine Ziege, ein Huhn, einen
nicht-menschlichen
Primaten (z. B. Affe), einen Fisch (Arten in der Wasserwirtschaft,
z. B. Lachs), ein Kaninchen, eine Ratte und eine Maus umfasst, aber
nicht darauf beschränkt
ist.
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Ein „Lebewesen,
das eine proliferative Störung
aufweist” ist
ein Lebewesen, das nachweisbare und unerwünschte proliferierende Zellen
aufweist. Die unerwünschte proliferierende
Zelle kann in einem Lebewesen, das unter Krebs leidet, Krebszellen
sein. Der Krebs kann ein maligner oder nicht-maligner Krebs sein. Krebsarten
oder Tumore umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Krebs des Gallenganges,
Blasenkrebs, Hirntumor, Brustkrebs, Zervixkarzinom, Koriokarzinom,
Dickdarmkarzinom, Gebärmutterschleimhautkrebs, Speiseröhrenkrebs,
Magenkrebs, intraepithelialer Tumor, Leukämie, Leberkrebs, Lungenkrebs
(z. B. kleinzellig und nicht-kleinzellig), Lymphom, Melanom, multiples
Myelom, Neuroblastom, Mundkrebs, Krebs der Eierstöcke, Pankreaskrebs,
Prostatakrebs, Mastdarmkrebs, Nierenkrebs, Sarkome, Hautkrebs, Magenkrebs,
Hodenkrebs und Schilddrüsenkrebs,
aber auch andere Karzinome und Sarkome. In anderen Ausführungsformen können die
unerwünschten
proliferierenden Zellen Nicht-Krebszellen sein, z. B. Zellen, die
mit einer Autoimmunkrankheit oder einem Entzündungszustand zusammenhängen.
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Ein „Lebewesen,
das eine virale Infektion aufweist” ist ein Lebewesen, das einem
Virus ausgesetzt war und akute oder chronische Manifestationen aufweist
oder nachweisbare Titer des Virus im Körper aufweist.
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Beispiele
von Viren, die in Menschen gefunden worden sind, umfassen, sind
aber beschränkt
auf: Retroviridae (z. B. menschliche Immundefizienzviren, wie HIV-1
(auch bezeichnet als HTLV-III, LAV oder HTLV-III/LAV oder HIV-III;
und andere Isolate, wie HIV-LP); Picornaviridae (z. B. Polioviren,
Hepatitis A-Virus; Enteroviren, menschliche Coxsackie-Viren, Rhinoviren,
Echoviren); Calciviridae (z. B. Stämme, die Gastroenteritis verursachen);
Togaviridae (z. B. Pferdeenzephalitisviren, Rubellaviren); Flaviridae
(z. B. Dengue-Viren, Enzephalitisviren, Gelbfieberviren); Coronaviridae
(z. B. Coronaviren); Rhabdoviridae (z. B. vesikuläre Stomatitisviren,
Tollwut-Viren); Filoviridae (z. B. Ebolaviren); Paramyxoviridae
(z. B. Parainfluenzaviren, Mumpsvirus, Masernvirus, Atmungs-syncytial-Virus);
Orthomyxoviridae (z. B. Grippeviren); Bungaviridae (z. B. Hantaan-Viren,
Bungaviren, Phleboviren und Nairo-Viren); Arenaviridae (hämorrhagische
Fieberviren); Reoviridae (z. B. Reoviren, Orbiviren und Rotaviren);
Birnaviridae; Hepadnaviridae (Hepatitis B-Virus); Parvoviridae (Parvoviren);
Papovaviridae (Papillomaviren, Polyomaviren); Adenoviridae (die
meisten Adenviren); Herpesviridae (Herpes simplex-Virus (HSV) 1
und 2, Varizella Zoster-Virus, Cytomegalievirus (CMV), Herpesviren);
Poxviridae (Variolaviren, Impfpockenviren, Pockenviren); und Iridoviridae
(z. B. Afrikanischer Schweinefiebervirus); und unklassifizierte
Viren (z. B. die ätiologischen
Agentien der spongiformen Enzephalopathien, das Agens der Delta-Hepatitis-Krankheiten
(man glaubt, dass es sich um einen defekten Satellit des Hepatitis
B-Virus handelt), die Agentien der nicht-A-, nicht-B-Hepatitis (Klasse
1 = innerlich übertragen;
Klasse 2 = parenteral übertragen
(d. h. Hepatitis C); Norwalk- und verwandte Viren und Astroviren).
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Auch
wenn viele der oben beschriebenen Viren menschliche Störungen betreffen,
ist die Erfindung auch für
die Behandlung von nicht-menschlichen Wirbeltieren nützlich.
Nicht-menschliche
Wirbeltiere sind ebenfalls in der Lage, Infektionen zu entwickeln,
die durch die hierin offenbarten ISNAs verhindert oder behandelt
werden können.
Z. B. sind die Verfahren dieser Erfindung zusätzlich zur Behandlung von infektiösen Krankheiten
des Menschen bei der Behandlung von tierischen Infektionen nützlich.
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Infektiöse Viren
sowohl von menschlichen als auch nicht-menschlichen Wirbeltieren
umfassen Retroviren, RNA-Viren und DNA-Viren. Diese Gruppe von Retroviren
umfasst sowohl einfache Retroviren als auch komplexe Retroviren.
Die einfachen Retroviren umfassen die Untergruppen der B-Typ-Retroviren,
C-Typ-Retroviren und D-Typ-Retroviren. Ein Beispiel eines B-Typ-Retrovirus
ist das Maus-Brustkrebsvirus (MMTV). Die C-Typ-Retroviren umfassen die Subgruppen C-Typ
Gruppe A (umfasst Rous-Sarkom-Virus (RSV), Vogel-Leukämie-Virus
(ALV) und Vogelmyeloblastose-Virus (AMV)) und C-Typ Gruppe B (umfasst
murines Leukämie-Virus
(MLV), Katzenleukämie-Virus
(FeLV), murines Sarkomvirus (MSV), Gibbon-Affen-Leukämievirus
(GALV), Milz-Nekrose-Virus (SNV), Reticuloendotheliosevirus (RV)
und Affensarkomvirus (SSV)). Die D-Typ-Retroviren umfassen Mason-Pfizer-Affenvirus
(MPMV) und Affenretrovirus Typ 1 (SRV-1). Die komplexen Retroviren umfassen
die Untergruppen der Lentiviren, T-Zellen-Leukämie-Viren und Foamyviren. Lentiviren
umfassen HIV-1, umfassen aber auch HIV-2, SIV, Visnavirus, Katzen-Immunodefizienz-Virus
(FIV) und Pferde-infektiöse-Anämie-Virus
(EIAV). Die T-Zellen-Leukämie-Viren
umfassen HTLV-1, HTLV-2, Affen-T-Zellen-Leukämie-Virus (STLV) und Rinder-Leukämie-Virus
(BFV). Die Foamyviren umfassen menschliches Foamyvirus (HFV), Affen-Foamyvirus
(SFV) und Rinder-Foamyvirus (BFV).
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Beispiele
für andere
RNA-Viren, die bei Wirbeltieren Antigene darstellen, umfassen, sind
aber nicht beschränkt
auf die folgenden: Mitglieder der Familie der Reoviridae, einschließlich der
Gattung Orthoreovirus (verschiedene Serotypen sowohl von Säugetier-
als auch Vogel-Retroviren),
die Gattung Orbivirus (Blauzungenvirus, Eugenangeevirus, Kemerovovirus, Afrikanische
Pferdekrankheit-Virus und Colorado-Zecken-Fieber-Virus), der Gattung
Rotavirus (menschliches Rotavirus, Nebraska-Kalb-Diarrhoe-Virus,
murines Rotavirus, Affen-Rotavirus, Rinder- oder Schafs-Rotavirus,
Vogel-Rotavirus); die Familie Picornaviridae, einschließlich der
Gattung Enterovirus (Poliovirus, Coxsackievirus A und B, menschliche
enterisch-zytopathische Orphan (ECHO)-Viren, Hepatitis A-Virus,
Affen-Enteroviren,
murine Encephalomyelitis (ME)-Viren, Poliovirus muris, Rinder-Enteroviren,
Schweine-Enteroviren, der Gattung Cardiovirus (Encephalomyocarditis-Virus
(EMC), Mengovirus), der Gattung Rhinovirus (menschliche Rhinoviren,
die mindestens 113 Subtypen umfassen; andere Rhinoviren), der Gattung
Apthiovirus (Maul- und Klauenseuche (FMDV) umfasst; die Familie
Calciviridae, einschließlich
vesikuläres
Exanthema des Schweinevirus, San Miguel Seelöwen-Virus, Katzen-Picornavirus und
Norwalkvirus umfasst; der Familie Togaviridae, einschließlich der
Gattung Alphavirus (östliche
Pferdeencephalitis-Virus, Semliki-Forest-Virus, Sindbis- Virus,
Chikungunya-Virus, O'Nyong-Nyong-Virus,
Ross-River-Virus,
venezuelanische Pferdeencephalitis-Virus, westliches Pferdeencephalitis-Virus),
die Gattung Flavirius (durch Moskito übertragenes Gelbfiebervirus,
Dengue-Virus, japanische Encephalitis-Virus, St. Louis Encephlaitis-Virus,
Murray Valley Encephalitis-Virus, West-Nile-Virus, Kunjin-Virus, zentraleuropäisches-Zecken-übertragenes
Virus, Far Esstern Zecken-übertragenes
Virus, Kyasanur-Forrest-Virus, Louping-III-Virus, Powassan-Virus,
Omsk-hämorrhagisches
Fiebervirus), der Gattung Rubivirus (Rubella-Virus), der Gattung Pestivirus
(Schleimhaut-Krankheiten-Virus, Hog-Cholera-Virus, Border-disease-Virus);
die Familie Bunyaviridae, einschließlich der Gattung Bunyvirus
(Bunyamwera und verwandte Viren, kalifornische Encephalitis-Gruppe-Viren),
der Gattung Phlebovirus (sizilianisches Sandfliegenfieber-Virus,
Rift Valley Fieber-Virus), der Gattung Nairovirus (Krim-Kongo hämorrhagisches
Fiebervirus, Nairobi Schafskrankheit-Virus) und der Gattung Uukuvirus
(Uukuniemi und verwandte Viren); der Familie Orthomyxoviridae, einschließlich der
Gattung Grippevirus (Grippevirus Typ A, viele menschliche Subtypen);
Schweinegrippevirus und Vogel- und Pferde-Grippe-Viren; Grippetyp
B (viele menschliche Subtypen), und Grippetyp C (mögliche separate
Gattung); der Familie Paramyxoviridae, der Gattung Paramyxovirus
(Parainfluenzavirus Typ 1, Sendaivirus, Hämadsorptions-Virus, Parainfluenza-Viren
Typ 2–5,
Newcastle-Disease-Virus, Mumpsvirus), der Gattung Morbillivirus (Masernvirus,
subakute sklerosierende Panencephalitis-Virus, Distemper-Virus,
Rinderpest-Virus), der Gattung Pneumovirus (respiratorisches synzytisches-Virus
(RSV), respiratorisches synzytiales Rinder-Virus und Lungenentzündungsvirus von Mäusen); Forest-Virus,
Sindbis-Virus, Chikungunya-Virus,
O'Nyong-Nyong-Virus,
Ross-river-Virus, venezuelanische Pferde-Encephalitis, westliche
Pferde-Encephalitis-Virus), der Gattung Flavirius (Mosquito-übertragenes
Gelbfiebervirus, Dengue-Virus, japanische Encephalitis-Virus, St.
Louis Encephalitis-Virus, Murray Valley Encephalitis Virus, West-Nile-Virus,
Kunjin-Virus, zentraleuropäisches
Zecken-übertragenes
Virus, Far Eastern Zecken-übertragenes
Virus, Kyasanur Forest-Virus, Louping III-Virus, Powassan vrus,
Omsk-hämorrhagisches
Fiebervirus), der Gattung Rubivirus (Rubella-Virus), der Gattung
Pestivirus (Schleimhaut-Krankheit-Virus, Wildschwein Cholera-Virus,
Border-disease-Virus); der Familie Bunyaviridae, einschliceßlich der
Gattung (Bunyamwera und verwandte Viren, kalifornische Encephalitisgruppe-Viren),
der Genus Phlebovirus (sizilianisches Sandfliegen-Fiebervirus, Rift
Valley-Fiebervirus), der Gattung Nairovirus (Krim-Kongo hämorrhagisches
Fiebervirus, Nairobi-Schafskrankheitsvirus) und der Gattung Uukuvirus (Uukuniemi
und verwandte Viren); der Familie Orthomyxoviridae, die Gattung
Grippe-Virus (Grippe-Virus Typ A, viele menschliche Subtypen); Schweine-Grippevirus
und Vogel- und Pferdegrippeviren; Grippetyp B (viele menschliche
Subtypen) und Grippe Typ C (mögliche
separate Gattung); der Familie Paramyxoviridae, einschließlich der
Gattung Paramyxovirus (Parainfluenza-Virus Typ 1, Sendai-Virus,
Hämadsorptions-Virus,
Parainfluenza-Viren Typ 2–5,
Newcastle-disease-Virus, Mumpsvirus), der Gattung Morbillivirus
(Masernvirus, subakute sklerotisierende Panencephalitis-Virus, Distemper-Virus,
Rinderpestvirus), die Gattung Pneumovirus (Respiratory-syncytial-Virus
(RSV), respiratorisches synzytiales Rinder-Virus und Lungenentzündungsviren der
Mäuse);
der Familie Rhabdoviridae, einschließlich der Gattung Vesiculovirus
(VSV), Chandipura-Virus, Flanders-Hart-Park-Virus), der Gattung
Lyssavirus (Tollwut-Virus), Fischrhabdo-Viren, und zwei wahrscheinliche
Rhabdoviren (Marburg-Virus und Ebola-Virus); der Familie Arenaviridae,
einschließlich
des die lymphozytischen Choriomengitis-Virus (LCM), Tacaribe-Virus-Komplexes
und Lassa-Virus; der Familie Coronaviridae, einschließlich des
infektiösen
Bronchitisvirus (IBV), Maus-Hepatitis-Virus, menschlichen enteralen
Coronavirus, und der Katzen-infektiöse Peritonitis (Katzen-Coronavirus).
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Beispielhafte
DNA-Viren, die in Wirbeltieren Antigene darstellen, umfassen, sind
aber nicht beschränkt auf:
die Familie Poxviridae, einschließlich der Gattung Orthopoxvirus
(Variola major, Variola minor, Affenpocken-Vaccinia, Kuhpocken,
Büffelpocken,
Kanninchenpocken, Ectromelie), der Gattung Leporipoxvirus (Myxom,
Fibrom), der Gattung Avipoxvirus (Geflügelpocken, andere Vogelpockenviren),
einschließlich
der Gattung Capripoxvirus (Schafpocken, Ziegenpocken), der Gattung
Suipoxvirus (Schweinepocken), einschließlich der Gattung Parapoxvirus
(ansteckender postularer Dermatitisvirus, Pseudokuhpocken, papillärer Rinder-Stomatitis-Virus);
der Familie Iridoviridae (afrikanisches Schweinefiebervirus, Froschviren
2 und 3, Fisch-Lymphozysten-Virus); die Familie Herpesviridae, die α-Herpesviren (Herpes
Simplex Typen 1 und 2, Varicella-Zoster, Pferde-Abort-Virus, Pferde-Herpesvirus 2 und
3, Pseudotollwutvirus, infektiöser
Rinderkeratoconjunctivitis-Virus, infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus,
Katzenrhinotracheitis-Virus, infektiöser Laryngoracheitis-Virus), der
Beta-Herpes-Viren (menschlicher Cytomegalievirus und Cytomeegalieviren
von Schweinen, Affen und Nagetieren); der Gamma-Herpesviren (Epstein-Barr-Virus
(EBV), Marek-Virus, Herpes saimiri, Herpesvirus ateles, Herpesvirus
sylvilagus, Meerschweinchen-Herpesvirus, Lucke-Tumor-Virus); der
Familie Adenoviridae, einschließlich
der Gattung Mastadenovirus (menschliche Untergruppen A, B, C, D,
E, und ungruppierte; Affenadenoviren (mindestens 23 Serotypen),
infektiöse
Hunde-Hepatitis und Adenviren von Rindern, Schweinen, Schafen, Fröschen und
vielen anderen Arten, der Gattung Aviaadenovirus (Vogel-Adenviren);
und nicht-kultivierbare Adenviren; der Familie Papoviridae, einschließlich der
Gattung Papillomavirus (menschliche Papillomaviren, Rinderpapillomaviren,
Shope-Kanninchen-Papillomavirus und verschiedene pathogene Papilloma-Viren
anderer Arten), der Gattung Polyomavirus (Polyomavirus, Affenbläschenbildendes
Agens (SV-40), Kanninchen-bläschenbildendes
Agens (RKV), K-Virus, BK-Virus, JC-Virus und andere Primaten-Polyomaviren wie
lymphotropher Papillomavirus); der Familie Parvoviridae, einschließlich der
Gattung Adeno-assoziierte Viren, der Gattung Parvovirus (Katzen-Panleukopenie-Virus,
Rinderparvovirus, Hunde-Parvovirus, Aleutenherz-Krankheit-Virus,
etc.). Schließlich
können
DNA-Viren Viren umfassen, die nicht in die obigen Familien passen,
wie Kuru- und Creutzfeld-Jacob-Krankheit-Viren und chronische infektiöse neuropathische
Agenzien (CHINA-Virus).
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Jede
der vorangehenden Listen ist beispielhaft, und es ist nicht beabsichtigt,
dass sie beschränkend sein
sollen. Zusätzlich
können
andere Viren als Antigene für
Immunisierungs-Vorgehensweise
verwendet werden, entweder in intakter Form oder als Fragmente davon.
Ein Antigen ist eine Substanz, die durch das Immunsystem als fremd
erkannt wird, und die spezifische Immunität induziert. Antigene können Kohlenhydrate (einschließlich z.
B. Polysaccharide, Glykolipide und Glycoproteine), Proteine und
Polypeptide sein genauso wie andere Oligomere, Polymere und kleine
Moleküle
sein, die an die Antigenrezeptoren auf Immunzellen binden können. Die
spezifische Immunität
gegenüber
einem Antigen kann die Antigenerkennung durch T-Zellen und/oder
B-Zellen einschliessen.
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Nukleinsäuren, die
eine geeignete ISNA enthalten, können
in jedem Wirbeltier wirksam sein. Verschiedene Nukleinsäuren, die
eine ISNA enthalten, können
in Abhängigkeit
von der Säugetierart
eine optimale Immunstimulierung auslösen. Demnach kann ein Oligonukleotid,
das die optimale Stimulierung oder Inhibierung in Menschen verursacht,
möglicherweise
keine optimale Stimulierung oder Inhibierung in einer Maus verursachen,
und umgekehrt. Ein Fachmann auf diesem Gebiet kann unter Verwendung
der hierin bereitgestellten Anleitung die optimalen Oligonukleotide,
die für
eine bestimmte Säugetierart
nützlich
sind, unter Verwendung von Routinetests, die hierin beschrieben
und/oder auf dem Gebiet bekannt sind, identifizieren.
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Die
ISNA kann dem Lebewesen direkt verabreicht oder zusammen mit einem
Nukleinsäure-Abgabekomplex verabreicht
werden. Ein „Nukleinsäure-Abgabekomplex”, soll
ein Nukleinsäuremolekül bezeichnen, das
mit einem Zielmittel (z. B. einem Molekül, das zu einer höheren Bindungsaffinität an eine
Zielzelle (z. B. B-Zellen-Oberflächen
und/oder erhöhte
zelluläre
Aufnahme durch Zielzellen) verbunden ist (z. B. ionisch oder kovalent
daran gebunden; oder darin eingekapselt). Beispiele für Nukleinsäure-Abgabekomplexe
umfassen Nukleinsäuren,
die verbunden sind mit: einem Sterol (z. B. Cholesterin), einem
Lipid (z. B. ein kationisches Lipid, Virosom oder Liposom), oder
einer Substanz, die Zielzellen spezifisch bindet (z. B. ein Ligand,
der von einem Zielzellen-spezifischen Rezeptor erkannt wird). Bevorzugte
Komplexe können
in vivo möglicherweise ausreichend
stabil sein, um eine erhebliche Trennung vor der Internalisierung
durch die Zielzelle zu verhindern. Jedoch kann der Komplex unter
geeigneten Bedingungen im Inneren der Zelle spaltbar sein, so dass
die Nukleinsäure
in einer funktionellen Form freigesetzt wird.
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Die
ISNA oder andere Therapeutika können
alleine (z. B. in Saline oder Puffer) oder unter Verwendung von
einem beliebigen der auf dem Gebiet bekannten Abgabevehikel verabreicht
werden: Cochleate (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); Emulsomen
(Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1997); ISCOMs (Mowat et al.,
1993, Carlsson et al., 1991, Hu et., 1998, Morein et al., 1999);
Liposomen (Childers, et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992,
de Haan 1995a, 1995b); lebende bakterielle Vektoren (z. B. Salmonella,
Escherichia coli, Bacillus Calmette-Guerin, Shigella, Lactobacillus) (Hone
et al., 1996, Pouwels et al., 1998, Chatfield et al., 1993, Stover et
al., 1991, Nugent et al., 1998); lebende virale Vektoren (z. B.
Vaccinia, Adenvirus, Herpes Simplex) (Gallichan et al., 1993, 1995,
Moss et al., 1996, Nugent et al., 1998, Flexner et al., 1988, Morrow
et al., 1999); Mikrosphären
(Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore
et al., 1995, O'Hagan
et al., 1994, Eldridge et al., 1989); Nukleinsäureimpfstoffe (Fynan et al.,
1993, Kulkin et al., 1997, Sasaki et al., 1998, Okada et al., 1997,
Ishii et al., 1997); Polymere (z. B. Carboxymethylzellulose, Chitosan)
(Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al., 1998); Polymerringe
(Wyatt et al., 1998); Proteosomen (Vancott et al., 1998, Lowell
et al., 1988, 1996, 1997); Natriumfluorid (Hashi et al., 1998);
transgene Pflanzen (Tacket et al., 1998, Mason et al., 1998, Haq
et al., 1995); Virosomen (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al.,
1995, Cryz et al., 1998); Virus-artige Partikel (Jiang et al., 1999,
Leibl et al., 1998). Die Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen,
dass auch andere Abgabevehikel, die auf dem Gebiet bekannt sind,
verwendet werden können.
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Zusammen
mit den hierin bereitgestellten Lehren kann durch das Auswählen aus
den verschiedenen aktiven Verbindungen und Gewichtungsfaktoren wie
Wirksamkeit, relative Bioverfügbarkeit,
Patientenkörpergewicht,
Schwere von ungünstigen
Nebenwirkungen und bevorzugte Verabreichungsweise, ein wirksames prophylaktisches
oder therapeutisches Behandlungsschema geplant werden, das keine
wesentliche Toxizität bewirkt
und dennoch bei der Behandlung des speziellen Lebewesens völlig wirksam
ist. Die wirksame Menge für
eine bestimmte Anwendung kann in Abhängigkeit von solchen Faktoren
wie der Krankheit oder des Zustandes, die oder der behandelt wird,
der besonderen verabreichten ISNA (z. B. die Anzahl der unmethylierten CpG-Motive
oder ihre Position in der Nukleinsäure, das Ausmaß der Chiralität des Oligonukleotides),
des Antigens, der Größe des Lebewesens,
oder der Schwere der Krankheit oder des Zustandes schwanken. Ein Fachmann
auf diesem Gebiet kann die wirksame Menge einer bestimmten ISNA
und/oder eines Antigens oder eines anderen therapeutischen Agens
empirisch bestimmen, ohne dass unangemessene Versuche notwendig werden.
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Bei
erwachsenen menschlichen Lebewesen reichen Dosen der ISNA-Verbindungen,
die hierin beschrieben sind, typischerweise von ungefähr 50 μg/Dosis bis
20 mg/Dosis, typischererweise von ungefähr 80 μg/Dosis bis 8 mg/Dosis und am
typischsten von ungefähr
800 μg/Dosis
bis 4 mg/Dosis. Angegeben in Relation zum Körpergewicht des Patienten reichen
typische Dosierungen von ungefähr
0,5 bis 500 μg/kg/Dosis, typischererweise
von ungefähr
1 bis 100 μg/kg/Dosis
und am typischsten von ungefähr
10 bis 50 μg/kg/Dosis. Die
Dosen werden von Faktoren abhängen,
einschließlich
des Weges der Verabreichung, z. B. kann für die orale Verabreichung eine
erheblich größere Dosis
notwendig sein als für
die subkutane Verabreichung.
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Die
Formulierungen der Erfindung werden in pharmazeutisch akzeptablen
Lösungen
verabreicht, die routinemäßig pharmazeutisch
akzeptable Konzentrationen von Salz, puffernden Agenzien, Konservierungsmitteln,
kompatiblen Trägern,
Adjuvanzien und optional anderen therapeutischen Inhaltsstoffen
enthalten können.
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Die
ISNA kann in Verbindung mit anderen Agenzien gegeben werden, die
auf dem Gebiet dafür
bekannt sind, in Verbindung mit IFN-α virale und proliferative Störungen zu
behandeln. Beispiele für
solche andere Agenzien, die gegenwärtig verwendet werden oder
Gegenstand von Untersuchungen bezüglich der Verwendung in Kombination
mit IFN-α sind,
umfassen Ribavirin, Amantadin, chemotherapeutische Agenzien (z. B.
5-Fluoruracil und BCNU), Strahlentherapie, Phototherapie, und Cytokine,
einschließlich
IL-2, IL-12 und IFN-γ.
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Zur
Verwendung bei der Therapie kann eine wirksame Menge der ISNA einem
Lebewesen auf eine beliebige Weise verabreicht werden, die die ISNA
an die gewünschte
Stelle abgibt, z. B. mucosal, systemisch. Die „Verabreichung” der pharmazeutischen
Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auf jede Weise erreicht
werden, die dem Fachmann bekannt ist. Bevorzugte Verabreichungswege
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf oral, parenteral, in eine Verletzung einführend, topisch, transdermal,
intramuskulär,
intranasal, intratracheal, durch Inhalation, Okular, vaginal und
rektal.
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Für die orale
Einnahme können
die Verbindungen (d. h. ISNA, Antigen, andere therapeutische Agenzien)
leicht durch Kombination der aktiven Verbindung(en) mit pharmazeutisch
akzeptablen Trägern,
die auf dem Gebiet wohlbekannt sind, formuliert werden. Solche Träger ermöglichen
es, dass die Verbindungen der Erfindung als Tabletten, Pillen, Dragees,
Kapseln, Flüssigkeiten,
Gele, Sirupe, Aufschlämmungen,
Suspensionen u. dgl. für
die orale Aufnahme durch ein zu behandelndes Lebewesen formuliert
werden. Pharmazeutische Zubereitungen für die orale Verwendung können als
feste Trägerstoffe
erhalten werden, optional durch das Mahlen einer resultierenden
Mischung, und Verarbeitung der Granula-Mischung, nach Zugabe geeigneter Hilfsmittel,
wenn erwünscht,
um Tabletten oder Dragee-Kerne zu erhalten. Geeignete Trägerstoffe
sind insbesondere Füllmittel
wie Zucker, die Lactose, Saccharose, Manitol oder Sorbitol umfassen;
Zellulosezubereitungen wie z. B. Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine,
Tragantgummi, Methylzellulose, Hydroxypropylmethyl-Zellulose, Natriumcarboxymethylzellulose
und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Wenn erwünscht, können Sprengmittel wie vernetztes
Polyvinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder ein Salz davon wie Natriumalginat
hinzugefügt
werden. Optional können
die oralen Formulierungen auch in Saline oder Puffer zur Neutralisierung
von inneren sauren Bedingungen formuliert oder ohne einen Träger verabreicht
werden.
-
Dragee-Kerne
werden mit geeigneten Beschichtungen bereitgestellt. Zu diesen Zweck
können
konzentrierte Zuckerlösungen
verwendet werden, die optional Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon,
Carbopolgel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und
geeignete organische Lösungsmittel
oder Lösungsmittelmischungen
enthalten können.
Zu den Tabletten- oder Dragee-Beschichtungen können Farbstoffe oder Pigmente
für die
Identifizierung oder Charakterisierung verschiedener Kombinationen
von aktiven Verbindungsdosen hinzugefügt werden.
-
Pharmazeutische
Zubereitungen, die oral verwendet werden können, umfassen Push-fit-Kapseln aus Gelatine
genauso wie weiche verschlossene Kapseln aus Gelatine und einem
Weichmacher wie Glycerol oder Sorbitol. Die Push-fit-Kapseln können die
aktiven Inhaltsstoffen unter Beimischung von Füllstoffen wie Lactose, Binder
wie Stärken
und/oder Schmiermitteln wie Talk oder Magnesiumstearat und optional
Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die aktiven Verbindungen
gelöst
oder in geeigneten Flüssigkeiten
wie fetten Ölen,
flüssigem
Paraffin oder flüssigen
Polyethylenglycolen suspendiert sein. Zusätzlich können Stabilisatoren hinzugefügt werden.
Mikrosphären,
die für
die orale Einnahme formuliert sind, können ebenfalls benutzt werden.
Solche Mikrosphären
sind auf diesem Gebiet gut definiert. Alle Formulierungen für die orale
Verabreichung sollten in Dosen vorliegen, die für solche Verabreichungen geeignet
sind.
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Für die bukkale
Verabreichung können
die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pasten, die auf
die übliche
Weise formuliert sind, annehmen.
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Zur
Verabreichung durch Inhalation können
die Verbindungen für
die Verwendung gemäß der vorliegenden
Erfindung bequem in Form einer Aerosol-Spray-Darreichung aus unter Druck
befindlichen Verpackungen oder einem Vernebler unter Benutzung eines
geeigneten Treibmittels, z. B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan,
Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder einem anderen geeigneten
Gas bequem abgegeben werden. Im Falle eines unter Druck befindlichen
Aerosols kann die Dosierungseinheit durch das Bereitstellen eines
Ventils für
die Abgabe einer abgemessenen Menge festgelegt werden. Kapseln und
Patronen aus z. B. Gelatine für
die Verwendung in einem Inhalationsgerät oder Insufflator können so
formuliert sein, dass sie eine Pulvermischung der Verbindung und
eine geeignete Pulverbase wie beispielsweise Laktose oder Stärke umfassen.
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Wenn
es erwünscht
ist, sie systemisch abzugeben, können
die Verbindungen für
die parenterale Verabreichung durch Injektion, z. B. durch Bolusinjektion
oder kontinuierliche Infusion, formuliert sein. Formulierungen für die Injektion
können
in der Form von Einheitsdosierungen bereitgestellt werden, z. B.
in Ampullen oder Mehrfachdosenbehältern mit einem hinzugefügten Konservierungsmittel.
Die Zusammensetzungen können
solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder
wässrigen
Vehikeln einnehmen und können
Formulierungsagenzien wie suspendierende, stabilisierende und/oder
dispergierende Agenzien umfassen.
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Pharmazeutische
Formulierungen zur parenteralen Verabreichung umfassen wässrige Lösungen der aktiven
Verbindungen in wasserlöslicher
Form. Zusätzlich
können
Suspensionen der aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspension
hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel umfassen
fette Öle
wie Sesamöl
oder synthetische Fettsäureester
wie Ethyloleat oder Triglyceride, oder Liposomen. Wässrige Injektionssuspensionen
können
Substanzen, die die Viskosität
der Suspension erhöhen
wie Natriumcarboxymethyl-Zellulose, Sorbitol oder Dextran, enthalten.
Optional kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder
Agenzien umfassen, die die Löslichkeit
der Verbindungen erhöhen,
um die Herstellung von hochkonzentrierten Lösungen zu erlauben.
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Alternativ
können
die aktiven Verbindungen in Pulverform zur Darreichung mit einem
geeigneten Vehikel vor der Benutzung, z. B. sterilem, Pyrogen-freien
Wasser, vorliegen.
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Die
Verbindungen können
auch als Rektal- oder Vaginalzusammensetzungen wie Zäpfchen oder
Retentionseinlaufmittel gestaltet sein, z. B. indem sie gewöhnliche
Zäpfchen-Grundstoffe wie Kakaobutter
oder andere Glyceride enthalten.
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Zusätzlich zu
den vorher beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch
als Depotpräparate
formuliert sein. Solche lang wirkenden Formulierungen können mit
geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (z. B. als eine
Emulsion in einem akzeptablen Öl)
oder Innenaustausch-Harzen oder als mäßig lösliche Derivate, z. B. als
mäßig lösliches
Salz, formuliert werden.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch geeignete feste oder
in einer Gelphase vorliegende Träger
oder Bindemittel umfassen. Beispiele solcher Träger oder Bindemittel umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf Kalziumkarbonat, Kalziumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Zellulosederivate, Gelatine
und Polymere wie Polyethylenglycole.
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Geeignete
flüssige
oder feste pharmazeutische Präparate
sind z. B. wässrige
oder saline Lösungen zur
Inhalation, mikroeinverkapselte, als Cochlear-Implantat bereitgestellte,
auf mikroskopische Goldpartikel beschichtete, in Liposomen enthaltene,
vernebelte, Aerosole, Kügelchen
für die
Implantation in die Haut, oder auf einem scharfen Objekt getrocknet,
um in die Haut eingeritzt zu werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen
umfassen auch Granulat, Pulver, Tabletten, beschichtete Tabletten,
(Mikro)Kapseln, Zäpfchen,
Sirupe, Emulsionen, Suspensionen, Cremes, Tropfen oder Präparate mit
verzögerter
langwieriger Freisetzung der aktiven Verbindung; wobei in solchen
Präparaten
Bestandteile und Zusatzstoffe und/oder Hilfssubstanzen wie Zersetzungsmittel,
Bindemittel, Beschichtungsagenzien, Schwellmittel, Schmiermittel,
Geschmacksstoffe, Süßstoffe
oder löslichkeitsverbessernde
Stoffe in üblicher
Weise wie oben beschrieben verwendet werden. Die pharmazeutischen
Zusammensetzungen sind für
die Verwendung in einer Vielzahl von Systemen zur Medikamentenabgabe
geeignet. Für
einen kurzen Überblick über Verfahren
zur Wirkstoffabgabe siehe Langer Science 249: 1527 (1990), das hierin
durch Bezugnahme aufgenommen ist.
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Die
ISNAs können
per se (nackt) oder in Form eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes
verabreicht werden. Zur medizinischen Verwendung sollten die Salze
pharmazeutisch akzeptabel sein, aber pharmazeutisch inakzeptable
Salze können
bequem benutzt werden, um pharmazeutisch akzeptable Salze davon
herzustellen. Solche Salze umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
solche, die aus den folgenden Säuren
zubereitet sind: Salzsäure, Hydrogenbromid,
Schwefelsäure,
Salpetersäure,
Phosphorsäure,
Maleinsäure,
Essigsäure,
Salicylsäure,
p-Toluensulfonsäure,
Weinsäure,
Zitronensäure,
Methansulfonsäure,
Ameisensäure,
Malonsäure,
Bernsteinsäure,
Naphthalen-2-sulfonsäure
und Benzensulfonsäure.
Solche Salze können
auch als Salze von Alkali- oder Erdalkalimetallen wie Natrium-,
Kalium- oder Kalziumsalze der Carboxylsäuregruppe hergestellt sein.
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Geeignete
puffernde Agenzien umfassen: Essigsäure und ein Salz (1–2 Prozent
Gew./Vol.); Zitronensäure
und ein Salz (1–3
Prozent Gew./Vol.); Borsäure
und ein Salz (0,5–2,5
Prozent Gew./Vol.); und Phosphorsäure und ein Salz (0,28–2 Prozent
Gew./Vol.). Geeignete Konservierungsmittel umfassen Benzalkoniumchlorid
(0.003–0,03
Prozent w/v); Chlorbutanol (0,3–0,9
Prozent Gew./Vol.); Hydroxybenzoesäureester (0,01–0,25 Prozent
Gew./Vol.) und Thimerosal (0,004–0,02 Prozent Gew./Vol.).
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung enthalten eine
wirksame Menge einer ISNA und optional Antigene und/oder andere
therapeutische Agenzien, die optional in einem pharmazeutisch akzeptablen
Träger
enthalten sind. Der Begriff „pharmazeutisch
akzeptabler Träger” bedeutet
ein oder mehrere kompatbile feste oder flüssige Füllstoffe, Verdünnungsmittel
oder einkapselnde Substanzen, die für die Verabreichung an einen
Menschen oder ein anderes Wirbeltier geeignet sind. Der Begriff „Träger” bezeichnet
einen organischen oder anorganischen Bestandteil, natürlich oder
synthetisch, mit dem der aktive Bestandteil verbunden ist, um die
Anwendung zu erleichtern. Die Bestandteile der pharmazeutischen
Zusammensetzungen sind auch in der Lage, mit den Verbindungen der
vorliegenden Verbindung und auch miteinander auf eine Weise zusammengemischt
zu sein, dass es keine Wechselwirkung gibt, die die erwünschte pharmazeutische Wirkung
wesentlich beeinträchtigen
würde.
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Eine
Vielzahl von Verabreichungswegen sind verfügbar. Der spezielle ausgewählte Modus
wird natürlich
von dem speziellen Adjuvans oder Antigen abhängen, das gewählt ist,
dem besonderen Zustand, der behandelt wird, und der Dosierung, die
für die
therapeutische Wirksamkeit benötigt
wird. Allgemein ausgedrückt können die
Verfahren dieser Erfindung unter Verwendung jedes Verabreichungsmoduses,
der medizinisch akzeptabel ist, ausgeführt werden; dies bedeutet einen
jeden Modus, der einen wirksamen Umfang einer Immunantwort hervorruft
ohne klinisch inakzeptable nachteilige Wirkungen zu verursachen.
Bevorzugte Modi der Verabreichung werden oben diskutiert.
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Die
Zusammensetzungen können
bequem in Einheitsdosierung dargereicht und durch ein jedes Verfahren,
die auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannt sind, hergestellt werden.
Alle Verfahren umfassen den Schritt, die Verbindungen in Verbindung
mit einem Träger
zu bringen, der einen oder mehrere zusätzliche Bestandteile umfasst.
Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen hergestellt, indem die
Verbindungen gleichförmig
und sehr eng mit einem flüssigen
Träger,
einem fein gemahlenen festen Träger
oder beiden in Verbindung gebracht wird, und dem Produkt wenn nötig dann
die Form gegeben wird. Dosiseinheiten für Flüssigkeiten sind Fläschchen
oder Ampullen. Dosiseinheiten für
Feststoffe sind Tabletten, Kapseln und Zäpfchen. Für die Behandlung eines Patienten
können
in Abhängigkeit
von der Aktivität
der Verbindung, Art der Verabreichung, Zweck der Immunisierung (d.
h. prophylaktisch oder therapeutisch), Art und Schwere der Störung, Alter
und Körpergewicht
des Patienten verschiedene Dosen notwendig sein. Die Verabreichung
einer gegebenen Dosis kann sowohl durch Einzelverabreichung in der
Form einer individuellen Dosiseinheit oder in der Form von mehreren
kleineren Dosiseinheiten erfolgen.
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Andere
Abgabesysteme können
Abgabesysteme für
die zeitabhängige
Freisetzung, verzögerte
Freisetzung oder fortwährende
Freisetzung umfassen. Solche Systeme können wiederholte Verabreichungen
der Verbindungen vermeiden, was die Bequemlichkeit für das Lebewesen
und den Arzt erhöht.
Viele Arten von Freisetzungs-Abgabesystemen sind verfügbar und
den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Sie umfassen auf Polymeren
basierende Systeme wie Poly (Laktid-Glycolid), Copolyoxalate, Polycaprolactone,
Polyesteramide, Polyorthoester, Polyhydroxybutansäure, und
Polyanhydride. Mikrokapseln der vorstehenden Polymere, die Medikamente
enthalten, sind z. B. im
US Patent
5,075,109 beschrieben. Abgabesysteme umfassen auch Nicht-Polymersysteme
wie Lipide, die Sterole wie Cholesterin, Cholesterinester und Fettsäuren oder
Neutralfette wie Mono-, Di- und Tri-Glyceride umfassen; Hydrogelfreisetzungssysteme;
Polydimethylsiloxan-Systeme; Peptid-basierte Systeme; Wachsbeschichtungen;
komprimierte Tabletten unter Verwendung von konventionellen Bindemitteln
und Arzneimittelträgern;
teilweise fusionierte Implantate u. dgl. Spezifische Beispiele umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf: (a) Erosionssysteme, bei denen ein Agens der Erfindung in einer
Form innerhalb einer Matrix enthalten ist wie die in den
US Patenten Nr. 4,452,775 ,
4,675,189 und
5,736,152 beschriebene und (b) Diffusionssysteme,
bei denen der aktive Bestandteil mit einer gesteuerten Geschwindigkeit aus
einem Polymer austritt, wie in den
US
Patenten 3,854,480 ,
5,133,974 und
5,407,686 beschrieben ist.
Zusätzlich
können
Abgabesysteme, die auf Pumpen basieren, verwendet werden, von denen
einige für
die Implantation angepasst sind.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich ein Verfahren, das die Verabreichung
von IFN-α erfordert,
auf ein klinisches Verfahren für
die Behandlung eines Lebewesens durch die Verabreichung von IFN-α mit dem
Ziel ein erwünschtes
therapeutisches Ergebnis zu erreichen. Es gibt eine Anzahl von klinischen
Indikationen, für die
IFN-α ein
etabliertes therapeutisches Agens ist. Ein Lebewesen, das eine IFN-α Behandlung
benötigt,
weist eine klinische Indikation auf, bei der IFN-α ein etabliertes
therapeutisches Agens ist. Diese klinischen Indikationen umfassen
bestimmte virale Infektionen und bestimmte proliferative Störungen,
insbesondere Krebs und Zustände
vor Krebs. Die viralen Infektionen, bei denen IFN-α zum derzeitigen
Zeitpunkt für
die Verwendung in den Vereinigten Staaten zugelassen ist, sind Hepatitis
B, Hepatitis C und Condylomata acuminata (Feigwarze oder anogenitale
Warzen). Die Neoplasmen, für
die IFN-α zum gegenwärtigen Zeitpunkt
in den Vereinigten Staaten zur Verwendung zugelassen ist, sind Haarzell-Leukämie, kutane
T-Zellen-Leukämie,
chronische myelogene Leukämie
(CML), nicht-Hodgkin's-Lymphom,
malignes Melanom und das mit AIDS zusammenhängende Kaposi-Sarkom. Außerhalb
der Vereinigten Staaten wird IFN-α auch
klinisch eingesetzt bei Blasenzellen-Karzinom, Dickdarm-Karzinom,
Nierenzell-Karzinom, multiplem Myelom, zervikale Dysplasie und Kehlkopf-Papillomatose.
Andere Indikationen, für
die die IFN-α-Behandlung
untersucht wird, umfassen andere virale Infektionen und andere Krebsarten,
einschließlich
z. B. die Behcet'sche
Krankheit, HIV, Prostatakrebs, kleinzelliges Lungenkarzinom, Pankreaskrebs,
Plattenepithelzellenkrebs, Gliom, und malignes Pleurom u. a.
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Wie
hierin verwendet, bezeichnet eine pharmazeutische Zusammensetzung,
die IFN-α umfasst,
ein Präparat
aus rekombinantem oder natürlichem
IFN-α, das
für die
pharmazeutische Verwendung geeignet ist. IFN-α kann aus natürlichem
Material gewonnen werden (z. B. Leukozytenmyeloblasten, Lymphozyten)
oder daraus gewonnenem Material (z. B. Zelllinien) oder solchem,
das mit rekombinanter DNA-Technologie hergestellt wurde. Details
der Klonierung von IFN-α und
dessen direkter Expression, insbesondere in Escherichia coli, waren
der Gegenstand zahlreicher Veröffentlichungen.
Die Herstellung von rekombinanten IFNs ist z. B. aus Gray et al.
Nature 295: 503–8
(1982), Goeddel et al. Nature 284: 316–20 (1980), Goeddel et al.
Nature 290: 20–26
(1981) und
EP 174143 bekannt.
In den Vereinigten Staaten ist IFN-α als rekombinantes menschliches
IFN-α2a
(ROFERON-A), rekombinantes menschliches IFN-α2b (INTRON A) und als gereinigtes
natürliches
IFN-αn3
(ALFERON N) verfügbar.
Außerhalb
der Vereinigten Staaten ist IFN-α auch
als gereinigtes natürliches
IFN-αn1
(WELLFERON) verfügbar.
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Wie
hierin verwendet, bezeichnet eine klinisch etablierte wirksame Dosis
von IFN-α alleine
eine Dosis von rekombinantem oder natürlichem IFN-α, die in
Abwesenheit eines anderen Agens verabreicht wird, das die IFN-α-Bioverfügbarkeit
erhöht,
die die empfohlene Standarddosis für eine bestimmte klinische
Indikation ist. Eine klinisch etablierte wirksame Dosis für IFN-α alleine
kann jedoch die Verwendung von IFN-α in Kombination mit anderen
Agenzien und Behandlungsmodalitäten,
wie konventioneller Chemotherapie, Bestrahlungstherapie, antivirale
Agenzien und einem chirurgischen Eingriff umfassen. Bei einer Mehrheit
der Lebewesen würde
man erwarten, dass die empfohlene Standarddosis von IFN-α für eine bestimmte
klinische Indikation eine erwünschte
klinische Wirkung entfaltet. Bei einer gegebenen klinischen Anwendung
in einem gegebenen Lebewesen kann eine klinisch etablierte wirksame
Dosis von IFN-α alleine
auch eine IFN-Dosis bezeichnen, von der erwartet wird, wurde, oder
würde,
dass sie bei diesem Lebewesen für
die Behandlung eines Zustandes des Lebewesens wirksam ist. Z. B.
könnte
ein Lebewesen auf eine Dosis von IFN-α alleine ansprechen, die geringer
ist als die empfohlene Standarddosis. Umgekehrt könnte ein
Lebewesen nicht in der Lage sein, eine klinisch etablierte wirksame
Dosis aufgrund von tatsächlichen
oder erwarteten Nebenwirkungen der IFN-α-Behandlung zu vertragen.
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Die
maximal tolerierte Dosis (MTD) einer beliebigen therapeutischen
Verbindung wird als Teil ihrer klinischen Evaluierung bestimmt.
Z. B. können
klinische Studien der Phase I eine Bestimmung der maximalen tolerierten
Dosis, der die Dosis begrenzenden Toxizitäten (DLT) und der Pharmakokinetiken
einer Testverbindung umfassen. Somit ist die MTD einer jeden von
der Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen therapeutischen
Verbindung den Fachleuten auf dem Gebiet als Teil der öffentlichen
Akte bekannt. Die MTD einer bestimmten therapeutischen Verbindung
kann in Abhängigkeit
von ihrer Formulierung (z. B. injizierbare Formulierung, implantierbare
bioerosive Polymer-Formulierung, orale Formulierung), ihrem Verabreichungsweg (z.
B. intravenös,
oral, intratumoral), Art und Weise der Abgabe (z. B. Infusion, Bolusinjektion),
Dosierungsschema (z. B. stündlich,
täglich,
wöchentlich)
u. dgl. variieren. Die MTD wird häufig als die höchste Dosis
definiert, bei der 50% der Testpersonen, denen der Wirkstoff verabreicht
wurde, Dosis-begrenzende Toxizitäten entwickeln.
Andere Definitionen, die klinisch relevant und allgemein anerkannt
sind, sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
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Beispiele
für MTDs
verschiedener IFN-α-Typen
wurden in Studien veröffentlicht,
die verschiedene Verabreichungswege, Indikationen, Kombinationen
mit anderen Agenzien und klinische Konstellationen einschlossen.
In einer Studie betrug die MTD von rekombinantem IFN-α2a 18 Millionen
internationale Einheiten (IU), wenn es intramuskulär dreimal
pro Woche in Kombination mit einer Phototherapie zur Behandlung
von kutanem T-Zellen-Lymphom
(funguide Pilzinfektion und Sézary-Syndrom)
gegeben wurde. Kuzel TM et al. J Natl Cancer Inst 82: 203–7 (1990).
Bei einer unabhängigen
Studie wurde herausgefunden, dass die MTD von IFN-α2b für die Behandlung
von kutanem T-Zellen-Lymphom 18 Millionen IU betrug, wenn es intramuskulär dreimal
pro Woche gegeben wurde. Qiu B und Chen M Chin Med J (Engl) 109:
404–6
(1996). Die MTD für IFN-α2a war geringer,
3 Millionen IU subkutan dreimal pro Woche, bei Patienten, die sich
wegen Mastdarmkrebs hohen Dosen einer Becken-Bestrahlung unterzogen.
Perera F et al. Int J Radial Oncol Biol Phys 37: 297–303 (1997).
Die MTD für
IFN-α2b
betrug bei Patienten mit mit AIDS zusammenhängendem Kaposi-Sarkom nach
zytotoxischer Chemotherapie 10 Millionen IU pro Tag. Gill PS et
al. J Biol Response Mod 9: 512–6 (1990).
Bei noch einer anderen Studie betrug die MTD von IFN-α2b bei wöchentlicher
Gabe als 24-Stunden-Infusion in Kombination mit 5-Fluoruracil und
Leucovorin an Patienten mit metastatischem colorektalem Krebs 18
Millionen IU/m2. Cascinu S et al. Anticancer
Drugs 7: 520–4
(1996).
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Die
Bestimmung der maximalen tolerierten Dosis kann als Gewicht des
Wirkstoffs pro Gewicht des Lebewesens, Gewicht des Wirkstoffs pro
Körperoberflächen-Einheit
etc. angegeben werden. Die MTD von Wirkstoffen gegen Krebs wird
oft als Gewicht pro Quadratmeter (mg/m2)
Körperoberfläche angegeben.
Die MTD kann auch als Dosis relativ zu einer Zeit-Komponente angegeben
werden wie Gewicht des Wirkstoffs pro Körperoberfläche pro Tag.
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Bei
Therapeutika, die noch nicht Gegenstand von klinischen Studien am
Menschen oder Gegenstand einer beliebigen Art der Bestimmung der
MTD beim Menschen (z. B. experimentelle oder hoch toxische Verbindungen)
waren, kann ein Fachmann die MTD unter Verwendung von Tiermodellen
abschätzen.
Die Berechnung der MTD in Tieren kann oft auf der Grundlage einer
Anzahl physiologischer Parameter wie Tod, bestimmten Vergiftungserscheinungen
und durch den Wirkstoff ausgelösten
Gewichtsverlust bestimmt werden. Bei Verwendung des Todes als Endpunkt
kann die MTD die höchste
den Versuchstieren gegebene Dosis sein, bei der jedes Mitglied der
Testgruppe überlebte.
Bei Verwendung von Toxizität
als ein Endpunkt kann die MTD die Dosis sein, bei der eine mäßige, aber
keine schwere Toxizität
beobachtet wird. Bei Verwendung von Gewichtsverlust als Endpunkt
kann die MTD die Dosis sein, oberhalb der eine bestimmte prozentuale Änderung
des Körpergewichtes
induziert wird. Andere Verfahren zur Bestimmung von MTDs unter Verwendung
von Tiermodellen und verschiedenen Endpunkten sind den Fachleuten
auf dem Gebiet bekannt. Die Korrelation von Tier-MTDs mit menschlichen
MTDs für
eine therapeutische Verbindung ist auf dem Gebiet der Pharmazie
eine akzeptierte Vorgehensweise.
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Demnach
sieht die Erfindung in einem Aspekt die Bereitstellung von Zusammensetzungen
und Formulierungen für
die Verabreichung an ein Lebewesen vor, bevorzugt ein menschliches
Lebewesen, die eine Menge an Interferon umfasst, die unter der maximalen
tolerierten Dosis für
Interferon liegt.
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In
einem Aspekt umfasst die Erfindung die Behandlung eines Lebewesens,
das eine Behandlung mit IFN-α benötigt, was
die Co-Verabreichung einer wirksamen Menge einer isolierten ISNA
in Verbindung mit der Verabreichung von IFN-α einschließt. Wie hierin verwendet, bezeichnet
eine wirksame Menge einer isolierten ISNA die Menge einer isolierten
ISNA, die bewirkt, dass Zellen IFN-α produzieren. In einer bevorzugten
Ausführungsform
bezeichnet eine wirksame Menge einer isolierten ISNA die Menge einer
isolierten ISNA, die bewirkt, dass Zellen in vivo IFN-α produzieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bezeichnet eine wirksame
Menge einer isolierten ISNA jene Menge einer isolierten ISNA, die
einer Menge entspricht, die bewirkt, dass Zellen in vitro IFN-α produzieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bezeichnet eine wirksame
Menge einer isolierten ISNA die Menge einer isolierten ISNA, die
eine Erhöhung
der lokalen oder zirkulierenden Menge von IFN-α oberhalb des entsprechenden
Titers bewirkt, der nur durch die Verabreichung von exogenem IFN-α auftreten
würde.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bezeichnet eine
wirksame Menge einer isolierten ISNA die Menge einer isolierten
ISNA, die den therapeutischen Nutzen von exogenem IFN-α über den
erhöht,
der ohne ISNA erhalten werden würde.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bezeichnet eine
wirksame Menge einer isolierten ISNA die Menge einer isolierten
ISNA, die erlauben würde,
dass die gleiche therapeutische Wirkung mit einer gegebenen IFN-α-Menge erreicht
wird, wenn das Oligonukleotid mit einer geringeren IFN-α-Dosis co-verabreicht
wird.
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Wie
hierin verwendet, bezeichnet der Begriff Co-Verabreichen die Verabreichung
von mindestens zwei Agenzien, wobei beide klinisch miteinander verbunden
sind. Co-Verabreichung
kann die Verabreichung von mindestens zwei Agenzien zusammen oder
nacheinander umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ISNA entweder
vor, zur gleichen Zeit oder nach der Verabreichung von IFN-α verabreicht,
unter der Voraussetzung, dass die lokale oder systemische Konzentration
von IFN-α über die
entsprechende Konzentration von IFN-α erhöht wird, die durch die Verabreichung
der gleichen IFN-α-Menge alleine erreicht
würde.
Co-Verabreichung bedeutet, dass die Verabreichung von Interferon-α zeitlich
nahe genug an der Verabreichung der ISNA erfolgt, so dass ihre Wirkungen
höher sind
als die Wirkungen, die erreicht würden, wenn jeweils eines alleine
in der gleichen Dosis verabreicht würde. Bevorzugterweise sind
die Wirkungen mindestens additiv. Sie können auf verschiedenen Wegen
verabreicht werden, z. B. durch die systemische Verabreichung des
Interferons und die lokale Verabreichung der ISNA.
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In
bestimmten Ausführungsformen,
die die gleichzeitige Co-Verabreichung umfassen, können das IFN-α und die
ISNA als eine einzige Formulierung hergestellt sein. In weiteren
Ausführungsformen,
die eine simultane Co-Verabreichung umfassen, können das IFN-α und die
ISNA getrennt zubereitet und verabreicht werden. Im letzteren Fall
können
individuelle IFN-α-
und ISNA-Formulierungen zusammen als Kit mit Anweisungen für die gleichzeitige
Verabreichung verpackt sein. Ähnlich
können
individuelle INF-α-
und ISNA-Formulierungen in Ausführungsformen,
die die aufeinanderfolgende Co-Verabreichung erfordern, als Kit
mit Anweisungen für
die aufeinanderfolgende Verabreichung verpackt sein.
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Wie
hierin verwendet, bezeichnet lokal verabreicht die Verabreichung
durch einen Weg, mit dem eine lokale IFN-α-Konzentration erreicht wird,
die die systemische Konzentration von IFN-α übertrifft. Z. B. kann die lokale
Verabreichung an eine bestimmte Verletzung oder ein bestimmtes Organ
durch die direkte Injektion in die Verletzung oder das Organ oder
durch die direkte Injektion in ein zuführendes Blutgefäß, das mit
der Verletzung oder dem Organ, die/das zu behandeln ist, verbunden
ist und es versorgt, erreicht werden. Beim Beispiel der lokalen
Verabreichung an die Leber kann die lokale Verabreichung durch Injektion
oder Infusion in die Leberarterie, die Baucharterie oder die Pfortader
erreicht werden.
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In
einem anderen Aspekt schliesst die Erfindung die Ergänzung der
IFN-α-Behandlung
eines Lebewesens, das eine IFN-α-Behandlung
benötigt,
ein, wobei sowohl eine wirksame IFN-α-Menge als auch eine isolierte ISNA dem
Lebewesen verabreicht werden. Das durch die ISNA induzierte IFN-α ergänzt das
direkt an das Lebewesen verabreichte IFN-α, so dass die klinische Wirksamkeit
einer gegebenen Dosis IFN-α erweitert wird.
Weiterhin wird dadurch, dass das ISNA-induzierte IFN-α typischerweise
eine Vielzahl von Subtypen umfasst, wohingegen das direkt verabreichte
IFN-α typischerweise
nur einen einzelnen Subtypen umfassen, die Bandbreite der biologischen
Wirkungen, die durch die IFN-α-Behandlung
bereitgestellt werden, ebenfalls durch die Co-Verabreichung der
ISNA und des IFN-α erweitert.
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Die
Erfindung schließt
auch die Erhöhung
der Wirksamkeit einer IFN-α-Behandlung
eines Lebewesens ein. Dieser Aspekt der Erfindung umfasst die Verabreichung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Lebewesen, das eine
Behandlung mit IFN-α benötigt, die
IFN-α beinhaltet,
sowie die Co-Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung
an ein Lebewesen, das eine solche Behandlung benötigt, die eine ISNA in einer
Menge umfasst, die, zusammen mit dem verabreichten IFN-α, eine wirksame
IFN-α-Behandlung darstellt,
wobei die Wirksamkeit der IFN-α-Behandlung
höher als
die Wirksamkeit der Verabreichung derselben Menge IFN-α bei Abwesenheit
der Co-Verabreichung
der ISNA ist.
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Wie
hierin verwendet, bezeichnet ein Verfahren zur Verstärkung der
Wirksamkeit oder Erhöhung
der Wirksamkeit einer IFN-α-Behandlung
eines Lebewesens ein Verfahren, bei dem die Wirkung der Verabreichung
einer gegebenen IFN-α-Dosis
an ein Lebewesen zu einer größeren klinischen
Wirkung führt
als erwartet oder als vorher unter Verwendung der gleichen Dosis
IFN-α beobachtet
wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform
beinhaltet das Verfahren die Co-Verabreichung einer ISNA-Menge in
einer für
die Induktion der Produktion von IFN-α durch IPCs wirksamen Menge.
Die bei diesem Verfahren lokal oder systemisch erreichte Menge an
IFN-α spiegelt
Beiträge
sowohl von dem verabreichten IFN-α als
auch von dem induzierten IFN-α wieder,
wodurch eine erhöhte
Wirksamkeit der IFN-α-Behandlung bei einer
gegebenen Dosis von verabreichtem IFN-α erreicht wird. Die erhöhte Wirksamkeit
könnte
sich z. B. in einem größeren Ausmaß der Reaktion auf
die Behandlung, einem schnelleren Verlauf der Reaktion auf die Behandlung
oder einer verbesserten Umsetzung des Behandlungsplanes äußern.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt schliesst die Erfindung die Verringerung einer für die Behandlung
eines Lebewesens, das eine Behandlung mit IFN-α benötigt, wirksamen Dosis an IFN-α ein. Das
Verfahren umfasst die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung,
die IFN-α umfasst,
an ein Lebewesen, das eine Behandlung mit IFN-α benötigt, und die Co-Verabreichung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Lebewesen, das eine
solche Behandlung benötigt,
die eine Menge einer immunstimulierenden Nukleinsäure umfasst,
die zusammen mit dem verabreichten IFN-α eine wirksame IFN-α-Behandlung darstellt,
und wobei die Menge des verabreichten IFN-α geringer ist als eine Menge
an IFN-α,
die bei Abwesenheit der co-verabreichten immunstimulierenden Nukleinsäure erforderlich
ist.
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Wie
hierin verwendet, bezeichnet ein Verfahren für die Senkung einer für die Behandlung
eines Lebewesens wirksamen IFN-α-Dosis
ein Verfahren, bei dem einem Lebewesen eine Menge an IFN-α oder IFN-α mit einer
Häufigkeit
verabreicht wird, die im Vergleich zu einer zuvor etablierten Menge
oder Häufigkeit
verringert ist, während
eine erwünschte
klinische Wirkung bei der Behandlung einer Störung des Lebewesens erreicht
wird. In einer bevorzugten Ausführungsform
kann die Dosismenge in einem klinisch bestimmten Umfang auf eine
Menge reduziert werden, die, z. B., wenigstens 10% unter der üblichen
oder maximalen tolerierten Dosis für IFN-α alleine liegt. In anderen bevorzugteren
Ausführungsform
kann die IFN-α-Dosis
um einen klinisch bestimmten Umfang bis zu einer Menge reduziert
werden, die mindestens 20%, mindestens 30% oder mindestens 40% unter
der üblichen
oder maximalen tolerierten Dosis von IFN-α alleine liegt. In einer bevorzugtesten
Ausführungsform
kann die Dosismenge von IFN-α in
einen klinisch bestimmten Umfang auf eine Menge reduziert werden,
die mindestens 50% unter der üblichen
oder maximalen tolerierten Dosis von IFN-α alleine liegt. In einer weiteren
bevorzugten Ausführungsform
kann die Häufigkeit
der Dosis in ein klinisch bestimmten Umfang auf eine Häufigkeit
reduziert werden, die, z. B., mindestens 10% unter der üblichen
oder maximalen tolerierten Dosis von IFN-α alleine liegt. In anderen bevorzugteren Ausführungsform
kann die Häufigkeit
der IFN-α-Dosis
in einen klinisch bestimmten Umfang auf eine Häufigkeit reduziert werden,
die mindestens 20%, mindestens 30%, oder mindestens 40% unter der üblichen
oder maximalen tolerierten Dosis von IFN-α alleine liegt. In einer bevorzugtesten
Ausführungsform
kann die Häufigkeit
der IFN-α-Dosis
in einem klinisch bestimmten Umfang auf eine Häufigkeit reduziert werden,
die mindestens 50% unter der üblichen
oder maximalen tolerierten Dosis von IFN-α alleine liegt.
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In
noch einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung die Verhinderung
einer mit einer IFN-α-Behandlung zusammenhängenden
Nebenwirkung bei einem Lebewesen vor, das eine Behandlung mit IFN-α erhält oder benötigt. Das
Verfahren schließt
die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein
Lebewesen ein, das eine Behandlung mit IFN-α benötigt, die IFN-α enthält, und
die Co-Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an das
Lebewesen, das eine solche Behandlung benötigt, die eine Menge einer
immunstimulierenden Nukleinsäure
umfasst, die zusammen mit dem verabreichten IFN-α eine
wirksame IFN-α-Behandlung
darstellt, und wobei eine mit einer IFN-α-Behandlung verbundene Nebenwirkung
im Vergleich zu der Nebenwirkung reduziert ist, wenn IFN-α bei Abwesenheit
der Co-Verabreichung der immunstimulierenden Nukleinsäure verabreicht
wird.
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IFN-α-Tests sind
auf dem Gebiet wohlbekannt. Sie umfassen direkte Tests, z. B. Enzymgekoppelten Immunadsorptionstest
(ELISA), die für
mindestens ein IFN-α spezifisch
sind, und indirekte Tests, z. B. funktionelle Tests, die die NK-Zellen-Aktivierung/Zytotoxizität umfassen
(Trinchieri G Adv Immunoll 47: 187–376 (1989) und die Phänotypisierung
durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierungs-(FACS)-Analyse auf
Klasse I MHC. Zusätzliche
spezifische Testverfahren, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind,
können
besonders nützlich bei
Konstellationen sein, bei denen die lokale Konzentration oder die
lokale Anwesenheit von IFN-α von
Interesse ist; diese Verfahren umfassen z. B. Immunohistochemie,
Nukleinsäure-Hybridisierung (z.
B. Northern Blotting), Western Blotting, reverse Transkriptase/Polymerasekettenreaktion
(RT/PCR) und in situ RT/PCR. Ein weiteres Verfahren, das den Nachweis
von intrazellulärem
IFN-α durch
Flusszytometrie einschließt,
wird unten in Beispiel 6 offenbart.
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Wie
hierin verwendet, bezeichnet ein Verfahren zur Verhinderung einer
mit einer IFN-α-Behandlung verbundenen
Nebenwirkung in einem Lebewesen ein Verfahren zur Verringerung der
Wahrscheinlichkeit oder Schwere einer mit einer IFN-α-Behandlung
verbundenen Nebenwirkung, die einem Lebewesen widerfährt, das eine
IFN-α-Behandlung
erhält.
Wie hierin verwendet, ist eine mit einer IFN-α-Behandlung verbundenen Nebenwirkung
eine klinische Nebenwirkung, die in einem Lebewesen als ein Ergebnis
der Verabreichung von IFN-α an
das Lebewesen induziert wird. Durch klinische Erfahrungen und klinische
Versuche wurde eine Anzahl solcher Nebenwirkungen gut dokumentiert.
Solche Nebenwirkungen sind bei einem Lebewesen häufig dosisbegrenzend. Systemische,
mit einer IFN-α-Behandlung
verbundenen Nebenwirkungen, die am häufigsten auftreten, umfassen:
Grippe-artiges Syndrom, Fieber, Kopfschmerzen, Kältegefühl, Muskelschmerzen, Müdigkeit, Magersucht, Übelkeit,
Erbrechen, Diarrhoe, Depression, Schilddrüsenunterfunktion, Neutropänie und
Anämie. In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die mit einer IFN-α-Behandlung verbundenen
Nebenwirkung ausreichend reduziert, um ein besseres Annehmen der
IFN-α-Behandlung
zu fördern.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die mit der
IFN-α-Behandlung
zusammenhängende
Nebenwirkung ausreichend verringert, um die Wiederaufnahme einer
IFN-α-Behandlung,
die ansonsten durch diese Nebenwirkung ausgeschlossen wäre, zu erlauben.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die mit der
IFN-α-Behandlung verbundene
Nebenwirkung ausreichend verringert, um eine Intensivierung einer
IFN-α-Behandlung
zu erlauben.
-
In
einem anderen Aspekt sieht die Erfindung die Bereitstellung eines
zweiten Verfahrens für
die Verstärkung
der Wirksamkeit der IFN-α-Behandlung
eines Lebewesens vor, das eine solche Behandlung benötigt. Dieses
umfasst die Schritte der Verabreichung einer Menge einer pharmazeutischen
Zusammensetzung, die IFN-α enthält, die
für die
Behandlung eines Zustandes des Lebewesens wirksam ist, an ein Lebewesen,
das eine solche Behandlung benötigt,
der Isolierung natürlicher
Interferon-produziernder Zellen (IPCs) aus einem Spender, des Kontaktierens
der isolierten IPCs ex vivo mit einer Menge einer pharmazeutischen
Zusammensetzung, die eine immunstimulierende Nukleinsäure umfasst,
die wirksam ist, um die IPCs zu induzieren, IFN-α freizusetzen, und der Verabreichung
der kontaktierten Zellen an das Lebewesen. Der Spender und das Lebewesen
können
eine einzige Person sein oder sie können verschiedene Personen
sein. In bestimmten Ausführungsformen
werden dem Lebewesen die kontaktierten Zellen lokal verabreicht,
z. B. durch Injektion oder Infusion in ein Blutgefäß, das ein
zu behandelndes Zielgewebe versorgt. Das Verfahren gemäß diesem
Aspekt der Erfindung kann optional das Kontaktieren der isolierten
IPCs mit einem Antigen umfassen. Bei bestimmten Ausführungsformen
kann das Verfahren auch das Kontaktieren der isolierten IPCs mit
einem Wachstumsfaktor umfassen, den die IPCs nicht selbst produzieren.
Ein derartiger Wachstumsfaktor, den die IPCs nicht produzieren,
kann z. B. IL-3 oder GM-CSF umfassen und würde IL-8 und TNF-α ausschließen.
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Wie
hierin verwendet, bezeichnet der Begriff Wachstumsfaktor einen löslichen
Signalfaktor, der einen darauf ansprechenden Zelltyp induziert,
Reifung und Mitose zu durchlaufen. Die Wachstumsfaktor-Kategorien umfassen
zahlreiche Zytokine, Wachstumsfaktoren per se und Hormone. Spezifische
Beispiele für
Wachstumsfaktoren umfassen ohne Beschränkung IL-1, IL-2, IL-3, IL-6,
GM-CSF, G-CSF, PDGF, TGF-β,
NGF, IGFs, Wachstumshormon, Erythropoietin, Thrombopoietin u. ä.. Zusätzlich zu
natürlich
vorkommenden Wachstumsfaktoren können
Wachstumsfaktoranaloga und Wachstumsfaktor-Derivative wie Fusionsproteine
für die
Zwecke der Erfindung verwendet werden.
-
Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff natürliches Interferon-produzierende
Zellen (IPC) einen spezialisierten Leukozytentyp, der der Hauptproduzent
von IFN-α als
Antwort auf umhüllte
Viren, Bakterien und Tumore ist. IPCs sind Abstammungs-negative
(lin–)/CD4+/MHC
Klasse II+-Zellen, die in geringer Häufigkeit in mononukleären Zellen
des peripheren Blutes und im Mandelgewebe vorkommen. Siegal FP et
al. Science 284: 1835–7
(1999); Grouard G et al. J Exp Med 185: 1101–11 (1997). Die Häufigkeit
von IPCs in PBMCs in normalen Lebewesen schwankt zwischen 0,2 und
0,6 Prozent. Sie sind gekennzeichnet durch die Abwesenheit der Abstammungs-Marker
CD3 (T-Zellen), CD14 (Monozyten), CD19 (B-Zellen) und CD56 (NK-Zellen), durch
die Abwesenheit von CD11c und durch ihre Expression von CD4, CD123
(IL-3-Rezeptor α,
IL-3R α)
und MHC Klasse II. Grouard G et al. J Exp Med 185: 1101–11 (1997);
Rissoan M-C et al. Science 283: 1183–86 (1999); Siegal FP et al.
Sceince 284: 1835–7
(1999); Cella M et al. Nat Med 5: 919–23 (1999).
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Wie
hierin verwendet bezeichnet die Isolierung von IPCs aus einem Spender
das Verfahren der Entfernung einer Körperflüssigkeit oder eines Körpergewebes,
die/das IPCs enthält,
aus einem Lebewesen und die Anreicherung der IPCs aus der Körperflüssigkeit
oder dem Körpergewebe
in einem Umfang, dass mindestens 1 Prozent dieser Zellen IPCs sind.
In einer bevorzugtesten Ausführungsform
sind mindestens 99 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
sind mindestens 95 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
sind mindestens 90 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
sind mindestens 80 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
sind mindestens 70 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform sind
mindestens 60 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
sind mindestens 50 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
sind mindestens 40 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
sind mindestens 30 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
sind mindestens 20 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
sind mindestens 10 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
sind mindestens 5 Prozent der Zellen IPCs. Die Anreicherung kann
durch eine Reihe von Auswahlschritten erreicht werden, die, z. B.,
eine Negativselektion von Abstammungs-positiven Zellen durch Kontaktieren
von Zellen mit magnetischen Kügelchen,
die mit Antikörpern
konjugiert sind, die für
die Abstammungs-Marker
spezifisch sind (d. h. anti-CD3, anti-CD11c, anti-CD14, anti-CD16,
anti-CD19, anti-CD56),
und dann das Laufenlassen der kontaktierten Zellen über eine
Abreicherungssäule
bei Anwesenheit eines stark magnetischen Feldes; einen Positivselektionsschritt,
der das Kontaktieren der Zellen, die durch die Abreicherungssäule laufen,
mit mit Mikrokügelchen
konjugiertem anti-CD4 und das Laufenlassen der kontaktierten Zellen über eine
Positivselektionssäule
umfasst; und eine weitere Vermehrung der IPCs durch Fluoreszenzaktivierte
Zellsortierung (FACS) unter Verwendung von anti-CD123 und anti-MHC
Klasse II umfassen kann. Andere Verfahren können, wie von den Fachleuten
auf dem Gebiet anerkannt werden wird, mit gleicher Wirkung verwendet
werden, sofern sie zu der Isolierung oder Anreicherung von (lin–)/CD4+/CD123+/MHC
Klasse II+-Interferon produzierenden Zellen in einem Umfang führen, dass
mindestens 1 Prozent der lebensfähigen Zellen
IPCs sind.
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In
noch einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung die Bereitstellung
eines Verfahrens für
die Unterstützung
des Überlebens
natürliches
Interferon-produzierender Zellen (IPCs) in vitro vor. Das Verfahren schließt die Isolierung
von IPCs aus einem Lebewesen (wie oben beschrieben), die Kultivierung
der IPCs in einem sterilen Medium, das für die Gewebekultur geeignet
ist, und das Kontaktieren der IPCs in vitro mit einer Menge einer
immunstimulierenden Nukleinsäure
ein, die bei der Unterstützung
des Wachstums der IPCs bei Abwesenheit von Interleukin 3 (IL-3)
wirksam ist. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die IPCs dendritische
Zellen vom Vorläufer-Typ
II (pDC2s; plasmazellenartige Monozyten). Siegel FP et al. Science
284: 1835–7
(1999). Die IPCs können
unter geeigneten Gewebekulturbedingungen entweder mit oder, bemerkenswerterweise,
ohne exogenes IL-3 und/oder GM-CSF kultiviert werden.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet ein Verfahren zur Unterstützung des Überlebens
von Interferon-produzierenden Zellen (IPCs) in vitro die Bereitstellung
von einem Faktor oder die Induktion von einem Signal, das die Lebensfähigkeit
von in einer in vitro-Kultur gehaltenen IPCs fördert. Zum Beispiel sterben
die meisten IPCs normalerweise bei Abwesenheit von IL-3 innerhalb von 3
Tagen nach der Einbringung in die Zellkultur. Die Zugabe von IL-3
zu IPCs wird das Überleben
der IPCs in der Kultur unterstützen.
Gemäß diesem
Aspekt der Erfindung ist IL-3 für
das Überleben
von IPCs in vitro nicht notwendig, wenn die IPCs mit einer wirksamen
Menge ISNA kontaktiert werden.
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In
einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung die Bereitstellung eines
Verfahrens zur Stimulierung isolierter Interferon-produzierender
Zellen (IPCs) in vitro vor. Das Verfahren schliesst die Schritte
der Isolierung von IPCs aus einem Lebewesen (oben beschrieben),
die Kultivierung der IPCs in einem sterilen Medium, das für die Gewebekultur
geeignet ist, und das Kontaktieren der IPCs in vitro mit einer Menge
immunstimulierender Nukleinsäure
ein, die für
die Induktion der Sekretion von wenigstens einem Typ I-Interferon
wirksam ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Typ-I-Interferon,
das durch das Verfahren induziert wird, IFN-α. Wie oben beschrieben sind
bevorzugte IPCs dendritischer Zellen vom Vorläufer-Typ 2 (pDC2s; plasmazellenartige Monozyten).
Siegal FP et al. Science 284: 1835–7 (1999). Es ist wichtig,
dass die IPCs in Kultur bei Abwesenheit von GM-CSF und ohne virale
Infektion durch z. B. den Sendai-Virus, HSV oder Grippevirus stimuliert
werden können.
Die Aktivierung kann unter Verwendung von in der Technik wohlbekannten
Verfahren getestet werden, die die FACS-Analyse des Zelloberflächen-Aktivierungsmarkers
CD80 und ELISA oder Biotests (z. B. Schutz von Fibroblasten vor
vesikulären-Stomatitisvirus)
auf Typ I IFN umfassen.
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Wie
hierin beschrieben bezeichnet ein Verfahren zur Stimulierung isolierter
Interferonproduzierender Zellen (IPCs) in vitro die Bereitstellung
von einem Faktor oder die Induktion eines Signals, das zu einer
Veränderung
der IPC-Größe, -Morphologie
oder der Expression eines Zelloberflächenantigens, eines Transkriptes oder
eines sekretierten Produktes führt,
das bei Abwesenheit des Faktors oder des Signals nicht für IPCs charakteristisch
ist. Frisch isolierte IPCs zeigen bei Abwesenheit eines Signals,
das durch virale Infektion, CD40L-Ligation oder GM-CSF bereitgestellt
wird, eine glatte runde Lymphoid-Morphologie mit einem Durchmesser
von 8–10 μm und exprimieren
kein CD80 oder CD86 auf ihrer Zelloberfläche. Grouard G et al. J Exp Med
185: 1101–11
(1999). In ähnlicher
Weise sekretieren frisch isolierte IPCs IFN-α nicht in großen Mengen. Siegal
FP et al. Science 284: 1835–7
(1999). Im Gegensatz dazu entwickeln IPCs, die in vitro gegenüber IL-3 exponiert
sind, Pseudopodien und eine verschleierte Morphologie, exprimieren
CD80 und CD86 auf ihrer Oberfläche
und sekretieren große
Mengen an Typ I-IFN (IFN-α und
IFN-β),
wenn sie mit Ultraviolett-bestrahltem Herpes simplex-Virus, Sendai-Virus
oder durch Hitze abgetötetem
Staphylococcus aureus ausgesetzt sind. Grouard G et al. J Exp Med
185: 1110–11
(1999); Siegal FP et al. Science 284: 1835–7 (1999). Gemäß diesem
Aspekt der Erfindung kann ISNA statt viraler Infektion, CD40L-Ligation
oder GM-CSF verwendet werden, um ein Signal zu induzieren, das dahingehend
wirkt, dass es für
die Stimulierung isolierte IPCs in vitro wirksam ist.
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Die
Erfindung schließt
weiterhin die Behandlung eines Lebewesens ein, um die Interferonproduzierenden
Zellen (IPCs) des Lebewesens zu aktivieren. Das Verfahren schließt die Isolierung
von IPCs aus einem Lebewesen, das eine solche Behandlung benötigt, die
Kultivierung der IPCs in vitro, das Kontaktieren der IPCs in vitro
mit einer wirksamen Menge einer isolierten immunstimulierenden Nukleinsäure und
die Rückgabe
der kontaktierten IPCs an das Lebewesen ein. IPCs werden wie oben
beschrieben aus einem Lebewesen isoliert und unter geeigneten in
vitro Zellkulturbedingungen in Kultur gegeben. Derartige Kulturbedingungen
können optional
die Bereitstellung von exogenem Wachstumsfaktor, einschließlich IL-3
oder GM-CSF, umfassen. Jedoch werden IL-3 oder GM-CSF möglicherweise
für die
Zwecke des Verfahrens nicht benötigt.
Gemäß diesem Verfahren
kann das Lebewesen ohne direkte Verabreichung einer pharmazeutischen
Zubereitung von IFN-α behandelt
werden. Die Aktivierung der IPCs kann wie oben beschrieben getestet
werden, wobei Bezug genommen wird auf in ähnlicher Weise erhaltene und
kultivierte, aber nicht mit ISNA kontaktierte IPCs.
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In
noch einem weiteren Aspekt schliesst die Erfindung die Stimulierung
der Produktion einer Vielzahl von Typ I-IFN-Subtypen ein. Das Verfahren
schließt
das Kontaktieren von IPCs mit einer Menge einer immunstimulierenden
Nukleinsäure
ein, die dahingehend wirkt, dass sie die Sekretion von mindestens
zwei Typ I-Interferonen induziert. In einer Ausführungsform werden die IPCs
mit ISNA in vivo in Kontakt gebracht. In weiteren Ausführungsformen werden
die IPCs isoliert und/oder mit ISNA in vitro und geeigneten Zellkulturbedingungen
in Kontakt gebracht. Verschiedene andere Ausführungsformen führen zur
Induktion von mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens
6, mindestens 7, und mindestens 8 Subtypen von Typ I-IFN. Die verschiedenen
Subtypen können
unter Verwendung von Verfahren bestimmt werden, die in der Technik
gut beschrieben und den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind,
z. B. Subtypen-spezifische ELISA, amino-terminales Sequenzieren
und Massenspektometrie (MS).
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Matrix-unterstützte Laser
Desoprtions/Ionisierungs-Flugzeit-(MALDI TOF)-MS und Elektrosprayionisierung
(ESI)-MS sind mittlerweile Standardverfahren, die zur Identifizierung
von Peptiden verwendet werden, die in femtomolaren Mengen zur Verfügung stehen.
Mann M and Talbo G Curr Opin Biotechnol 7: 11–19 (1996); Mann M and Wilm
M Trends Biochem Sci 20: 219–24
(1995); Mann M et al. Anal Chem 61: 1702–8 (1989). Einzelne Banden
wurden aus dem Polyacrylamidgel ausgeschnitten, mit Trypsin geschnitten
und dann eluiert, um Peptidfragmente zu ergeben, die der MALDI TOF-MS-
oder ESI-MS-Analyse unterzogen werden. Die Kombinationen aus Masse/Ladungs-Daten
aus der MS, Schnittstellen, Spezifität des Trypsin-Verdaus und der
Peptidsequenz-Daten erlaubten die Identifizierung von einzelnen
Proteinen und Peptiden. Die MALDI-TOF-MS-Analyse ergibt einen Massen-Fingerabdruck
der geschnittenen und analysierten Proteine. Der Fingerabdruck ist
nur für
das Abgleichen mit einer Datenbank mit berechneten Peptidmassen,
die vollständig sequenzierten
Proteinen entsprechen, nützlich.
Die ESI-MS-Analyse ist schwieriger, aber erlaubt die Identifizierung
auf der Grundlage eines Vergleichs mit entweder vollständigen oder
Teilsequenz-Ergebnissen. Die Massegenauigkeiten für beide
Methoden kann 0,01 Prozent, d. h. 1 Da per 10 kDa übertreffen.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Entdeckung, dass
Typ I-IFN die Aktivierung und Proliferierung von γδ-T-Zellen
induziert. Die γδ-T-Zellen
sind Antigenspezifische T-Zellen in einem voraktivierten Zustand,
die auf gewöhnliche
Phosphat umfassende, nicht-peptidische Antigene ansprechen. Beispiele
für γδ-T-Zellen-Antigene
umfassen Phosphat umfassende nicht-peptidische Moleküle aus durch
Hitze abgetöteten
Mycobakterien; Isopentenylpyrophosphat (IPP) und verwandte Prenylpyrophosphatderivate;
Monoethylphosphat; und γ-Monoethyl-Derivate
von Nukleosid- und Desoxynukleosidtriphosphaten. Tanaka Y et al.
Nature 375: 155–8
(1995). Frühere
Studien zeigten dass γδ-T-Zellen
eine Vielzahl von Lymphokinen sekretieren und zytolytische Reaktionen
aufbauen können.
Zum Beispiel stimuliert die Exposition der γδ-T-Zellen mit diesem Phosphat
umfassenden Nicht-Peptid-Antigenen die IFN-γ-Produktion bei Abwesenheit
von APC. Während
sie eindeutig zu der T-Zellabstammung gehören, unterscheiden sich γδ-T-Zellen
klar von α/β-T-Zellen
und sie teilen mehrere Merkmale mit NK-Zellen. Die Beobachtungen,
dass γδ-Zellen sich
in durch mycobakterielle Infektionen verursachten Verletzung anhäufen, auf
viral infizierte Zellen in einer Virus-unspezifischen Weise reagieren,
weder Antigen-verarbeitende noch Antigen-präsentierende Zellen benötigen, und
dass sie bevorzugterweise in verschiedenen Epithelien lokalisiert
sind, legen zusammen nahe, dass γδ-Zellen möglicherweise
auf Mustererkennung ansprechen und für eine erste Verteidigungslinie
verantwortlich sind.
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Gemäß diesem
Aspekt der Erfindung wurde entdeckt, dass CpG-ODN in Kombination
mit ITP synergistisch die Aktivierung von in PBMC vorhandenen menschlichen γδ-T-Zellen
induzierten, wie durch die Produktion von IFN-γ und Perforin gemessen wurde.
Zusätzlich
wurde auch gemäß diesem
Aspekt der Erfindung entdeckt, dass CpG-ODN in Verbindung mit IPP
synergistisch die in in den PBMC vorhandenen menschlichen γδ-T-Zellen
zur Proliferation anregen. Diese Wirkungen wurden durch die Isolierung
von γδ-T-Zellen
aus PBMC oder durch die Zugabe von neutralisierenden Antikörpern gegen
Typ I-IFN aufgehoben, und sie wurden durch das Hinzufügen von
rekombinantem Typ I-IFN reproduziert. Bemerkenswerterweise waren
ODN 2216 und 1585, beide starke Induktoren für Typ I-IFN, in ihrer Wirkungen
auf γδ-T-Zellen
wirksamer als ODN 2006.
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Bei
Menschen werden Th1-Reaktionen durch IL-12 und/oder IFN-γ angetrieben.
IL-12 und IFN-α/β fordern
beide die IFN-γ Synthese
in T-Zellen und NK-Zellen. Es war zuvor bekannt, dass IL-12 γδ-T-Zellen
fördert, IFN-γ zu sekretieren.
Da beschrieben worden war, dass IFN-β die IL-12-Produktion herunterreguliert,
wurden Experimente durchgeführt,
um die Wirkung auf die IL-12-Produktion zu untersuchen, die von
ISNA, die Typ I-IFN induzieren, ausgeübt wird. Die Ergebnisse dieser
Experimente (Beispiel 13) zeigen, dass bestimmte CpG-ODN die CD40-abhängige IL-12p70-Produktion
durch einen IFN-α/β-vermittelten
negativen Rückkopplungsmechanismus
auf IL-12p40-mRNA-Produktion unterdrücken. Daher führt die
Wechselwirkung von T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen über CD40L
zu einem Zytokin-Milieu, das von IL-12 oder IFN-α/β beherrscht wird. Obwohl beide
Th1-Reaktionen fördern,
können
CpG-ODN, die bessere Induktoren für die B-Zellen-Aktivierung
als für
Typ I-IFN sind, bei der Aktivierung naiver T-Zellen überlegen
sein, und umgekehrt können
CpG-ODN, die starken
Induktoren für
Typ I-IFN sind, eine höhere
Aktivität
aufweisen, voraktivierte und Gedächtnis-T-Zellen
zu unterstützen.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Interferonzusammensetzung
zur Verabreichung an ein Lebewesen bereitgestellt. Die Zusammensetzung
umfasst rekombinantes oder natürliches
Interferon in einem Behälter
zur Verabreichung an ein Lebewesen. Die Interferonmenge in dem Behälter ist
mindestens ungefähr
10 Prozent geringer als die maximale tolerierte Dosis (MTD). Bevorzugterweise
liegt die Interferonmenge in dem Behälter mindestens 20 Prozent
unter der MTD, mindestens 30 Prozent unter der MTD, mindestens 40
Prozent unter der MTD, oder sogar mindestens 50 Prozent unter der
MTD. In anderen Ausführungsformen
liegt die Interferonmenge in dem Behälter mindestens ungefähr 20 Prozent
unter, 30 Prozent unter, 40 Prozent unter oder sogar 50 Prozent
unter der klinisch etablierten wirksamen Dosis. Der Behälter kann auch
eine ISNA umfassen.
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Gemäß einem
noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung Kits für die Verabreichung von Interferon
und einer ISNA an ein Lebewesen bereit. Unter Bezugnahme auf 18, die einen Kit 11 darstellt, umfassen
die Kits einen Behälter 19,
der eine Zusammensetzung 17 enthält, die IFN-α und Anweisungen 21 für die Verabreichung
des Interferons an ein Lebewesen umfasst, das eine solche Behandlung
benötigt,
in einer Menge, die mindestens etwa 10 Prozent geringer als die
maximale tolerierte Dosis (MTD), 20 Prozent geringer als die MTD,
30 Prozent geringer als die MTD, 40 Prozent geringer als die MTD
oder 50 Prozent geringer als die MTD ist. Der Kit 11 kann
eine ISNA in dem gleichen Behälter
oder in einem getrennten Behälter 19 umfassen.
Der Kit kann auch Anweisungen 21 für die Behandlung eines Lebewesens
mit einer Krankheit, die mit IFN-α behandelt
werden kann, umfassen. Beispiele für solche proliferativen und
viralen Zustände
sind wie oben beschrieben. Kit 11 umfasst auch eine Schachtel-ähnliche
Verpackung 15.
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Die
vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele
veranschaulicht, die in keinster Weise als weiter begrenzend ausgelegt
werden sollten.
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BEISPIELE
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Beispiel 1. Isolierung und Charakterisierung
von IPCs.
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Mononukleäre Zellen
des peripheren Blutes (PBMCs) enthalten eine Gesamtmenge von 0,2
bis 0,4 Prozent IPCs, die durch das Fehlen von Abstammungs-Markern
(CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56) gekennzeichnet sind und die
von anderen Abstammungs-negativen Zellen durch die Expression von
CD4, CD123 (IL-3Rα)
und MHC Klasse II unterschieden werden können.
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IPCs
wurden aus peripherem Blut unter Verwendung der VARIOMACS-Methode
(Milteny Biotec, Auburn, CA) und der früher beschriebenen Methode isoliert.
O'Doherty U et al.
J Exp Med 178: 1067–76
(1993). PBMCs wurden aus dem Leukozyten/Trombozyten-Film aus gesunden
Blutspendern durch Ficoll-Paque-Dichtegradient-Zentrifugation (Histopaque-1077,
Sigma) erhalten, wie früher
beschrieben. Hartmann G et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:
291–9
(1996). Monoklonale Antikörper,
die gegen CD3 (UCHT1), CD14 (M5E2), und CD19 (B43) gerichtet sind,
wurden von PharMingen (San Diego) gekauft. PBMCs wurden mit anti-CD3-,
CD14-, CD16-, CD19- und CD56-Antikörpern, die mit kolloidalen
superparamagnetischen Mikrokügelchen
konjugiert waren, inkubiert und über
eine Abreicherungssäule
in einem starken Magnetfeld laufen gelassen. Die daraus resultierenden
Abstammungs-negativen (lin–)-Zellen
im Durchfluss wurden mit einem mit Mikrokügelchen konjugierten Antikörper gegen
CD4 inkubiert und über
eine Positivselektionssäule
laufen gelassen. Die weitere Reinigung von IPCs bis zu mehr als
99 Prozent aus lin–/CD4+-Zellen
wurde durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) unter Verwendung
von Phycoerythrin(PE)-markiertem anti-CD123 und FITC-markiertem
anti-MHC Klasse II erreicht.
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Die
Oberflächenantigenfärbung wurde
wie früher
beschrieben ausgeführt.
Hartmann G et al. J Pharmacol Exp Ther 285: 920–8 (1998). Monoklonale Antikörper gegen
MHC Klasse II (HLA-DR, Immun-357) und CD80 (MAB104) wurden von Immunotech
(Marseilles, Frankreich) gekauft. Alle anderen Antikörper wurden von
PharMingen (San Diego) gekauft: mAbs gegen CD3 (UCHT1), CD14 (M5E2),
CD19 (B43), und CD86 (2331 (FUN-1)). FITC-markiertes IgG1,κ (MOPC-21) und Phycoerythrin-markiertes
IgG2b,κ wurden
als Kontrolle für
die spezifische Färbung
verwendet. Lyons AB and Parish CR J Immuno Methods 171: 131–7 (1994).
-
Flusszytometrie-Daten
wurden auf einem FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San
Jose, CA), aufgenommen. Die spektrale Überlappung wurde durch geeignete
Kompensation korrigiert. Die Analyse wurde mit lebendigen Zellen
innerhalb eines morphologischen Gates (Streuung nach vorne (FFC), Seitenstreuung
(SSC), > 94 Prozent
der Zellen MHC Klasse II-positiv und Abstammungs-Marker negativ)
ausgeführt.
Die Daten wurden mit dem Computerprogramm FLOWJO (Version 2.5.1,
Tree Star, Standford, CA) analysiert.
-
Ergebnisse.
Die durch Trypan Blau-Ausschluss bestimmte Lebensfähigkeit
betrug > 95 Prozent. Frisch
isolierte IPCs sind negativ bezüglich
der co-stimulierenden Moleküle
CD80 und CD86. 1 zeigt die FACS-Analysen von
mit magnetischen Kügelchen
und Flusszytometrie aus PBMCs isolierten IPCs. Von links nach rechts
werden gezeigt: Selektion von lin–/MHC Klasse II+-Zellen aus
PBMCs; weitere Selektion von CD123+/MHC Klasse II+-Zellen aus lin–/MHC Klasse
II+-Zellen; und Charakterisierung von frisch isolierten lin–/MHC Klasse
II+/CD123+ IPCs als CD80-.
-
Beispiel 2. CpG-Oligonukleotid untersützt das Überleben
und die Aktivierung von IPCs in vitro.
-
Die
Mehrheit von frisch isolierten IPCs sterben innerhalb von 3 Tagen,
wenn sie nicht in Anwesenheit von IL-3 oder GM-CSF inkubiert werden.
Die verbleibenden lebenden Zellen sind nicht aktiviert oder nur schwach
aktiviert. Wenn CpG-Oligonukleotide, aber keine anderen Wachstumsfaktoren
zur Zellkultur von IPCs hinzugefügt
werden, überleben
die IPCs und werden stark aktiviert, wie durch ihre erhöhte Expression
co-stimulierender Moleküle
gezeigt ist (z. B. CD80, 2).
-
Frisch
isolierte IPCs (siehe Beispiel 1) wurden in RPMI 1640 Kulturmedium
suspendiert, das mit 10 Prozent (Vol./Vol.) Hitze-inaktiviertem
(56°C, 1
Std.) FCS (HyClone), 1,5 mM L-Glutamin,
100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (alle von
GIBCO/BRL) supplementiert war (Vollmedium). Alle Verbindungen wurden
Endotoxin-getestet gekauft. Frisch präparierte IPCs (Endkonzentration
5 × 105 Zellen pro ml) wurden zwei Tage lang in
Vollmedium alleine oder in mit 6 μg/ml
Phosphothioat CpG-ODN 2006 (5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'; SEQ ID NO: 147),
100 ng/ml LPS (aus Salmonella typhimurium, Sigma Katalog Nr. L2262),
800 Einheiten/ml GM-CSF (1,25 × 104 Einheiten/mg, Genzyme) oder CpG-Oligonukleotid
in Kombination mit GM-CSF ergänztem
Vollmeidum inkubiert. Die Expression von CD80 und MHC Klasse II
auf IPCs wurde durch Flusszytometrie (siehe Beispiel 1) untersucht.
-
Ergebnisse.
Repräsentative
Ergebnisse von fünf
unabhängigen
Experimenten sind in 2 dargestellt. Eine Einzelzugabe
von CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147, 2 μg/ml) zu frisch präparierten
IPCs war gegenüber
GM-CSF (800 Einheiten/ml) darin überlegen,
das Überleben
der Zellen (74,3 Prozent ± 5,2
Prozent gegen 57,1 Prozent ± 2,3
Prozent) zu fördern.
Die Kombination aus GM-CSF und CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147) erhöhte die
Anzahl der lebensfähigen
Zellen weiter (81,0 Prozent ± 6,7
Prozent). Frisch isolierte IPCs, die zwei Tage lang ohne IL-3 oder
GM-CSF in Kultur gehalten wurden, blieben unaktiviert, wie durch
das Fehlen von Färbung
auf CD80 angezeigt, selbst wenn LPS den Medien hinzugegeben wurde.
Die Zugabe von GM-CSF induzierte CD80. Die Zugabe von CpG-ODN 2006
(SEQ ID NO: 147, 6 μg/ml)
aktivierte IPCs in einem noch größeren Ausmaß als GM-CSF
(800 Einheiten/ml). Eine weitere Aktivierung von IPCs trat auf,
wenn GM-CSF und CpG-Oligonukleotid
zusammen anwesend waren. Dies zeigt, dass CpG IL-3 und GM-CSF bei der
Unterstützung
des Überlebens
von IPCs ersetzt. LPS trugen weder zum Überleben noch zur Aktivierung von
IPCs bei (2).
-
Beispiel 3. CpG-Oligonukleotide, aber
nicht Poly IC aktivierten IPCs in vitro.
-
IL-3
sorgt für
das hervorragende Überleben
von IPCs, aktiviert aber IPCs nicht. Wenn IL-3 mit CpG-Oligonukleotid
kombiniert wurde, erhöhte
sich die Expression von CD80 5 bis 20-fach (3). Poly
IC, ein weiteres Polynukleotid mit wohlbekannten immunstimulierenden
Wirkungen auf myeloide Zellen (dendritische Zellen, Makrophagen)
stimulierte IPCs nicht.
-
Frisch
präparierte
IPCs (siehe Beispiel 1, Endkonzentration 3 × 105 Zellen
pro ml) wurden drei Tage lang in Vollmedium (siehe Beispiel 2),
das mit 10 ng/ml in IL-3 supplementiert war, inkubiert. IPC-Kulturen
wurden dann für
weitere 24 Stunden weitergeführt
(a) ohne zusätzliche
Supplementierungen, (b) nach Zugabe von 6 μg/ml CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO:
147) und (c) nach Zugabe von 10 μg/ml
Poly IC. Die Streuung nach vorne (FSC), die Seitenstreuung (SSC)
und die Expression von CD80 und MHC Klasse II auf IPCs wurden durch Flusszytometrie
(siehe Beispiel 1) untersucht.
-
Ergebnisse:
Repräsentative
Ergebnisse von drei unabhängigen
Experimenten sind in 3 gezeigt. In Vollmedium, das
mit IL-3 und CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147,6 μg/ml) supplementiert war, kultivierte
IPCs waren größer und
granulärer
als IPCs, die in Vollmedium kultiviert wurden, das IL-3 alleine
enthielt, oder in Vollmedium supplementiert mit IL-3 und Poly IC.
Zusätzlich
waren IPCs in mit IL-3 und CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147,6 μg/ml) supplementiertem
Vollmedium stärker
aktiviert als IPCs, die in Vollmedium, das IL-3 alleine enthielt,
oder in mit IL-3 und Poly IC supplementiertem Vollmedium kultiviert
wurden. Dies zeigt, dass CpG-Oligonukleotide IPCs in vitro aktivieren.
-
Beispiel 4. CpG-Oligonukleotid induziert
die IFN-α-Produktion
durch IPCs.
-
Die
Induktion von Typ I-Interferon durch CpG in Ganz-PBMC ist früher gezeigt
worden. Sun S et al. J Exp Med 188: 2335-42 (1998). Hier wird zum
ersten Mal unter Verwendung eines ELISAs, der für 9 von 10 Subspezies von getestetem
IFN-α spezifisch
ist, gezeigt, dass IFN-α in IPCs
durch ein CpG-Oligonukleotid innerhalb von 48 Stunden induziert
wird.
-
Frisch
präparierte
IPCs (siehe Beispiel 1, Endkonzentration 3 × 105 Zellen
pro ml) wurden zwei Tage lang in Vollmedium (siehe Beispiel 2) inkubiert,
das mit 10 ng/ml IL-3 und 800 Einheiten/ml GM-CSF (1,25 × 104 Einheiten/mg, Genzyme) supplementiert war.
Die Hälfte
der Kulturen wurde mit 6 μg/ml
CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147) supplementiert. IFN-α wurde im Überstand unter Verwendung einer
Kombination von getrennten ELISAs, die für IFN-α (Multispezies-ELISA für menschliches
IFN-α, PBL
Biomedical Laboratories, New Brunswick, NJ) und für IFN-β (PBL Biomedical
Laboratories, New Brunswick, NJ) spezifisch waren, gemäß den Anweisungen
des Herstellers gemessen. Der Multispezies-IFN-α-ELISA
weist einen Bereich von 100 bis 5.000 pg/ml auf, weist alle menschlichen
IFN-α-Subtypen außer IFN-αF nach und
weist kein IFN-β oder IFN-γ nach. Der
IFN-β-ELISA
hat einen Bereich von 250 bis 10.000 pg/ml.
-
Ergebnisse.
Repräsentative
Ergebnisse von drei unabhängigen
Experimenten erscheinen in 4. IPCs,
die für
48 Stunden in mit 10 ng/ml IL-3, 800 Einheiten/ml GM-CSF und 6 μg/ml CpG-ODN
2006 (SEQ ID NO: 147) supplementiertem Vollmedium kultiviert wurden,
wurden im Vergleich zu ähnlichen
Kulturen ohne hinzugegebenes CpG-Oligonukleotid stark induziert,
IFN-α zu
sekretieren. Dieses Ergebnis zeigt, das CpG-Oligonukleotid menschliche IPCs
induziert, mehrere IFN-α–Subspezies
zu sekretieren. Dieses Ergebnis zeigt auch, dass CpG-Oligonukleotid
die in vitro-Produktion von natürlichen
Interferonen unter Verwendung einer Dauer-Zelllinie, die aus IPCs
abgeleitet ist, erlauben würde.
-
Beispiel 5. Identifizierung von CpG-ODN
mit IFN-α– und IFN-β-induzierender
Aktivität.
-
Das
24mer CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147), das drei aufeinanderfolgende „menschliche” CpG-Motive
(5'GTCGTT 3') enthält, ist
eine der wirksamsten CpG-Sequenzen bei der Aktivierung von menschlichen B-Zellen.
Hartmann G et al. J Immunol 164: 944–53 (2000); Hartmann G et al.
J Immunol 164: 1617–24
(2000). Im Gegensatz zu anderen mikrobiellen Stimuli wie LPS und
Poly (I:C) fördert
ODN 2006 das Überleben
und die Aktivierung von pDC-Vorläufern
stark. Jedoch ist die Fähigkeit
von ODN 2006, Typ I-IFN in pDC-zu induzieren, im Vergleich zu seiner
starken Fähigkeit,
NK-Zellen zu aktivieren relativ schwach.
-
Um
die Hypothese zu testen, dass andere CpG-ODN NK-Zellen durch Induktion
von Typ I-IFN in
pDC aktivieren können,
wurde ein Satz von CpG-ODN mit bekannter NK-Zellen-Aktivität auf ihre
Fähigkeit
getestet, die IFN-α-Produktion
in PBMC zu stimulieren. Der Satz von CpG-ODN umfasste die folgenden,
wobei Kleinbuchstaben Phosphothioat-Bindungen kennzeichnen, Großbuchstaben
Phosphodiester-Bindungen kennzeichnen und m 7-Deaza-Guanosin kennzeichnet:
tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt | ODN 2006 | (SEQ ID NO: 147) |
ggGGTCAACGTTGAgggggG | ODN 1585 | (SEQ ID NO: 1) |
gmGGTCAACGTTGAgggmggG | ODN 2197 | (SEQ ID NO: 148) |
ggGGAGTTCGTTGAgggggG | ODN 2198 | (SEQ ID NO: 149) |
-
Alle
ODN wurden in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8) bei einer
Konzentration von 20 mg/ml gelöst.
In PBS verdünnte
Aliquoten (0,4 mg/ml) wurden bei – 20°C gelagert und vor der Verwendung aufgetaut.
Für alle
Verdünnungen
wurden pyrogenfreie Reagenzien verwendet. ODN wurden unter Verwendung
des LAL-Tests (Bio Whittaker, Walkersville, MD; untere Nachweisgrenze
0,1 EU/ml) auf Endotoxin getestet.
-
Frisch
isolierte PBMC wurden mit CpG-ODN (3 μg/ml) 48 Stunden lang inkubiert.
IFN-α wurde im Überstand
mit einem ELISA gemessen, der 10 von 13 Isoformen von IFN-α nachweist. Unter allen anfänglich untersuchten
Sequenzen zeigte CpG-ODN 1585 (SEQ ID NO: 1) die höchste Aktivität, IFN-α in PBMC
zu induzieren. ODN 1585 ist eine chimäre ODN (gemischtes Phosphothioat-Phosphodiester-Rückgrat)
mit Poly G an beiden Enden und einem zentralen CpG-Dinukleotid innerhalb
von eines 10mer Palindroms. Harmann G et al. J Pharmacol Exp Ther
285: 920 (1998). ODN 1585 stimulierte im Vergleich zu ODN 2006,
das keine wesentlichen Mengen von IFN-α in PBMC induzierte (0,021 ± 0,015
ng/ml; n = 8), IFN-α im Nanogrammbereich (1,3 ± 0,4 ng/ml;
n = 7) (5). Das Kontroll-ODN 2197 (7-Deaza-Guanosin-Substitution
an Poly G-Enden, unfähig,
G-Tetraden zu bilden) und ODN 2198 (CG und Poly G-Enden aber kein
Palindrom) waren im wesentlichen inaktiv (5). Auf
der Grundlage der Sequenz von ODN 1585 wurde ein neuer Satz von
CpG-ODN entworfen. ODN 2216 (ggGGGACGATCGTCgggggG; SEQ ID NO: 7),
das Poly G-Enden und drei CG-Dinukleotide innerhalb eines Palindroms
enthält,
ist ein Beispiel unter mehreren Sequenzen mit ausgeprägter IFN-α-induzierender
Aktivität
in PBMC (23,7 ± 5,2
ng/ml; n = 7).
-
CpG-ODN
stimulierte die IFN-α-Produktion
in einer konzentrationsabhängigen
Weise ( 6). Die Aktivitäten von
ODN 2216 und ODN 1585 wurden bei Konzentrationen von bis zu 12 μg/ml getestet,
was bestätigt,
dass die höhere
Wirksamkeit von ODN 2216 keine konzentrationsabhängige Wirkung war. So geringen Mengen
wie 0,4 μg/ml
ODN 2216 induzierten erhebliche Mengen von IFN-α (0,7 mg/ml) in PBMC, wohingegen ODN
2006 und die GC-Kontrolle zu ODN 2216 (ggGGGAGCATGCTCgggggG; ODN
2243; SEQ ID NO: 150) selbst bei höheren Konzentrationen keine
Wirkung hatten. Die maximale Aktivität wurde bei 3 μg/ml erreicht. Die
Produktion von IFN-α konnte
schon nach sechsstündiger
Inkubation (0,2 ng/ml) nachgewiesen werden und erreichte nach 48
Stunden ein Plateau.
-
Die
natürliches
Interferon produzierende Zelle in PBMC nach Virusinfektion ist mit
einer Häufigkeit
von weniger als 0,5% identisch mit dem pDC-Vorläufer. PBMC wurden auf PDC-Vorläufer hin
durch Verminderung von T-Zellen, NK-Zellen und Monozyten (2–18% CD123++ pDC; 3–10% CD11c+ myeloide
DC (mDC); 50–90% B-Zellen;
n = 4) 10- bis 70-fach
angereichert. Um die Lebensfähigkeit
der pDC zu erhöhen,
wurde IL-3 zu allen Proben gegeben. Diese Vorgehensweise führte zu
einer 30- bis 60-fachen Erhöhung
der IFN-α-Produktion (bis 428,3 ± 56,8
ng/ml mit ODN 2216; n = 4; 7, obere
Reihe, linke Seite).
-
Die
aktivsten CpG-ODN bei PBMC waren auch die in den mit pDC angereicherten
Proben am aktivsten. ODN 2006, ODN 2197 oder IL-3 alleine induzierten
nur wenig IFN-α (Mittelwert
0,8, 0,4 bzw. 0,6 ng/ml, n = 4). Poly (I:C) (7 μg/ml), das doppel-strängige RNA
nachahmt und von dem bekannt ist, dass es IFN-α in Makrophagen induziert, war
ein noch schwächerer
Stimulus für
IFN-α in
auf pDC angereicherten Zellen (0,3 ng/ml, nicht in der Figur). Das
gleiche CpG-ODN, das große
Mengen an IFN-α induzierte,
stimulierte auch die IFN-β-Produktion
(bis zu 2,8 ± 0,8
ng/ml, n = 4; 7, untere Reihe, linke Seite).
Wenn man berücksichtigt, dass
IFN-β eine
einzelne Isoform darstellt und dass IFN-α aus mindestens 13 Isoformen
besteht, werden beachtliche IFN-β–Mengen
produziert.
-
Um
zu bestimmen, ob die zelluläre
Aufnahme von CpG-ODN für
die Induktion von IFN-α und IFN-β durch CpG-ODN
entscheidend war, wurden die Wirkungen des kationischen Lipids Lipofectin
untersucht (7, obere und untere Reihe,
rechte Seite). Positiv geladene kationische Lipide bilden Komplexe
mit negativ geladenen ODN, was die zelluläre Aufnahme von ODN erhöht. Lipofectin
erhöht
die Produktion von IFN-α und IFN-β, die durch
CpG induziert wird (bis zu 786 ng/ml IFN-α, n = 3; und bis zu 9 ng/ml
IFN-β, n
= 3). Diese Erhöhung
wurde bei allen untersuchten CpG-ODN festgestellt, war aber bei
ODN 1585 am ausgeprägtesten (21-fach).
-
Beispiel 6. CpG-ODN-induziertes IFN-α wird ausschließlich durch
plasmozytoide dentritische Vorläuferzellen produziert.
-
Um
zu untersuchen, welcher Zelltyp innerhalb der PBMC IFN-α als Reaktion
auf CpG-ODN produziert, wurde ein Protokoll entwickelt, das den
Nachweis von intrazellulärem
IFN-α auf
der Grundlage einer einzelnen Zelle mittels Flusszytometrie erlaubt.
PBMC wurden mit ODN 2216 (SEQ ID NO.: 7) oder ODN 2006 (SEQ ID NO.:
147) bei einer Konzentration von 3 μg/ml kultiviert. Nach 5 Stunden
wurden die Zellen geerntet und eine intrazelluläre Färbung auf IFN-α durchgeführt.
-
Zur
Analyse von intrazellulärem
IFN-α wurde
während
der Inkubationsdauer kein Brefeldin A hinzugefügt, um die Proteinsekretion
zu blockieren. PBMC wurden geerntet (ungefähr 600.000 Zellen pro Röhrchen), mit
anti-CD123-Biotin (Pharmingen) inkubiert, in PBS gewaschen (400
g, 5 Minuten, 4°C)
und mit Streptavidin-APC (Pharmingen), mit FITC-konjugiertem anti-Abstammungs-Cocktail
(bestehend aus anti-CD3, -CD14, -CD16, -CD19, -CD20 und -CD56; Becton
Dickinson) und anti-HLA DR-PerCP (Becton Dickinson) gefärbt. Anschließend wurden
die Zellen mit PBS gewaschen, in 100 μl Fixierungspuffer A (Fix and
Perm Kit, Caltag Laboratories, Burlingame, CA) resuspensiert und
15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden
noch einmal in 2 ml PBS gewaschen und dann in 100 μl Permeabilisierungspuffer
B (Fix and Perm Kit) resuspensiert. 4 μg/ml Maus-antihuman-IFN-α-mAK (MMHA-11,
PBL Biomedical Laboratories) wurden hinzugefügt. PE-markiertes Maus-IgG1 (MOPC-21, Pharmingen)
wurde als Kontrollantikörper
verwendet. Nach 15-minütiger
Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur wurden die Zellen in 2
ml PBS gewaschen. Zum Nachweis von intrazellulärem IFN-α wurden die Zellen wiederum
in 100 μl
Permeabilisierungspuffer B (Fix and Perm Kit) resuspensiert und
mit Ratten-anti-Maus-Ig-κ leichte
Kette (R8-140, Pharmingen) als sekundärem Antikörper gefärbt. Nach dem Waschen in PBS
wurden die Zellen durch Vierfarben-Flusszytometrie mit einem mit
zwei Lasern (Anregung bei 488 nm und 635 nm) ausgestatteten Becton
Dickinson FACS Calibur analysiert. Die spektrale Überlappung
wurde durch geeignete Kompensation korrigiert und die Gates wurden
unter Verwendung von Isotyp-Kontroll-Antikörpern eingestellt. Die Analyse
wurde an lebenden Zellen innerhalb eines morphologischen Gates (FSC,
SSC, > 97 % lebende
Zellen, wie durch Propidiumiodid-Färbung bestätigt) durchgeführt. Die
Daten wurden unter Verwendung von CELLQUEST (Becton Dickinson) oder
FLOWJO Software (Version 2.5.1, Tree Star, Inc., Stanford, CA) analysiert.
-
Ergebnisse.
Wie in 8A gezeigt, wurden Abstammungs+- und Abstammungs–-(lin+ und lin–)
Zellen durch die Abstammungs-Markerexpression und Vorwärts-Streuungsmerkmale
definiert. Nach Stimulierung mit ODN 2216 war intrazelluläres IFN-α in lin+-Zellen nicht nachweisbar, die die Monozyten
und Makrophagen als potentielle IFN-α-produzierende Zellen enthalten
(8C). Innerhalb der lin–-Zellen,
die hauptsächlich
pDC und mDC enthalten, wies eine distinkte Population mit mittlerer
HLA DR (MHC-Klasse II)-Expression eine für IFN-α positive Färbung auf (8D).
-
Innerhalb
der lin–-Population
können
mDC und pDC durch ihren HLA DR/CD123-Phänotyp unterschieden werden
(8B). Die mDC sind CD123+/+ und
HLA DR++ (Gate II); pDC sind CD123++ und HLA DR+ (Gate III).
Die CD123++/HLA DR–-Population
sind Basophile. 9A zeigt die intrazelluläre Färbung auf
IFN-α in lin–/HLA
DR+-Zellen. IFN-α wurde ausschließlich durch
pDC als Reaktion auf ODN 2216 produziert, aber nicht als Reaktion
auf ODN 2006. Unter den pDC färbten
46% positiv für
IFN-α, was
einer Häufigkeit
von 0,25% der Zellen innerhalb der PBMC, die zu diesem speziellen
Zeitpunkt der Färbung
IFN-α produzieren,
entspricht. In drei anderen Experimenten betrugen die Häufigkeiten
von IFN-α-produzierenden Zellen
als Reaktion auf ODN 2216 0,08%, 0,05% und 0,22% der PBMC (16%,
8% und 63% der pDC).
-
Im
Gegensatz zu den Ergebnissen mit pDC wurde in pDC nach Stimulierung
mit ODN 2006 oder ODN 2216 keine IFN-α-Synthese nachgewiesen.
-
Demnach
waren pDC die einzigen Zellen in den PBMC, die IFN-α als Reaktion
auf CpG-ODN produzierten.
Von Interesse ist, dass das intrazelluläre IFN-α-Färben ohne Brefeldin A durchgeführt wurde.
Daher stellt die nachgewiesene Menge von IFN-α die tatsächliche IFN-α-Produktion
zum Zeitpunkt der Ernte und nicht die über mehrere Stunden angesammelte
IFN-α-Menge
dar. Wenn Brefeldin A während
der Inkubation hinzugefügt
wurde, um die Proteinsekretion zu blockieren (Standardprotokoll
für die
Färbung
von intrazellulärem
Zytokin), wurden keine IFN-α-produzierenden
Zellen nachgewiesen.
-
Beispiel 7. Sowohl IFN-α-induzierende
als auch nicht-IFN-α-induzierende
CpG-ODN stimulieren die frühe TFN-Produktion
in plasmazellenartigen dendritischen Zellen.
-
Es
wurde berichtet, dass pDC TNF-α als
Reaktion auf IL-3 produzieren und demnach ihre eigene Reifung in
einer autokrinen Art und Weise fördern.
Hartmann G et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6: 291–9 (1996).
Daher wurde die intrazelluläre
Ansammlung von TFN-α in
pDC als Reaktion auf verschiedene CpG-ODN untersucht (9B). PBMC wurden 5 Stunden lang mit ODN 2216 (SEQ
ID NO.: 7) oder ODN 2006 (SEQ ID NO.: 147) bei 3 μg/ml in Abwesenheit
von IL-3 inkubiert. Brefeldin A (1 μg/ml, Sigma) wurde während der
fünfstündigen Stimulierungsperiode
hinzugefügt,
um die Zytokin-Sekretion zu blockieren. PBMC wurden geerntet (ungefähr 600.000
Zellen pro Röhrchen),
mit anti-CD123-Biotin inkubiert, mit PBS gewaschen (400 g, 5 Minuten,
4°C) und
mit Streptavidin-APC (Pharmingen), mit FITC-konjugiertem anti-Abstammungs-Cocktail und
anti-HLA DR-PerCP (Becton Dickinson) gefärbt. Anschließend wurden
die Zellen in PBS gewaschen, in 100 μl Fixierungspuffer A (Fix and
Perm Kit, Caltag Laboratories, Burlingame, CA) resuspensiert und
15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden
wieder in 2 ml PBS gewaschen und dann in 100 μl Permeabilisierungspuffer B
(Fix and Perm Kit) resuspensiert. 5 μg/ml PE-markiertes Maus-anti-human
TNF-α mAK
(MAb11, Pharmingen) wurde als primärer Antikörper hinzugefügt. PE-markiertes
Maus-IgG1 (MOPC-21, Pharmingen) wurde als Kontrollantikörper verwendet.
Nach 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln wurden
die Zellen in 2 ml PBS gewaschen und dann durch Vierfarben-Flusszytometrie wie
oben beschrieben analysiert.
-
Ergebnisse.
Im Gegensatz zu IFN-α war
der Prozentsatz an TNF-α-produzierenden
pDC als Reaktion auf ODN 2006 und ODN 2216 ähnlich (59% gegenüber 56%).
Zwei andere Experimente zeigten vergleichbare Ergebnisse (26 gegenüber 22%
und 8 gegenüber
6% TNF-α+ pDC mit ODN 2006 bzw. ODN 2216). Die Produktion
von TNF-α pro
Zelle (MFI, mittlere Fluoreszenzintensität) war mit ODN 2216 konsistent
höher als
mit ODN 2006 (9B). Kein TNF-α wurde in
mDC nachgewiesen. Abstammungs+-Zellen produzierten
keine erheblichen Mengen von TNF-α als
Reaktion entweder auf ODN 2006 oder ODN 2216.
-
Beispiel 8. Hochregulierung co-stimulierender
Moleküle
auf pDC als Reaktion auf IFN-α-induzierende CpG-ODN.
-
In
früheren
Studien wurde berichtet, dass ODN 2006 die Expression von co-stimulierenden
Molekülen auf
CD4+-DC des peripheren Blutes stimuliert.
Zhong RK et al. J Immunol 163: 1354 (1999). Um die Fähigkeit von
verschiedenen CpG-ODN zu untersuchen, CD80 und CD86 auf pDC hochzuregulieren,
wurde der Gehalt der PBMC an Monozyten, T-Zellen und NK-Zellen vermindert,
und die verbleibenden Zellen mit verschiedenen CpG-ODN bei Anwesenheit
von IL-3 stimuliert. Nach 48 Stunden wurde die Expression von CD80
und CD86 auf pDC (CD123++/HLA DR+) durch Dreifarben-Flusszytometrie untersucht.
B-Zellen (CD123–/HLA DR+)
und mDC (CD123+/–/HLA DR++)
wurden aus der Analyse ausgeschlossen. Wie in 10 gezeigt, wurde die Expression von CD86 auf
pDC durch ODN 2006 (SEQ ID NO: 147) ebenso wie durch ODN 1585 (SEQ
ID NO: 1) und ODN 2216 (SEQ ID NO: 7) erhöht. Die Wirkung von ODN 1585
wurde durch die Substitution des Poly G-Schwanzes mit 7-Deaza-Guanosin
(ODN 2197; SEQ ID NO: 148) aufgehoben. Das nicht-palindromische CpG-ODN 2198 (SEQ ID
NO: 149) war inaktiv. Die Hochregulierung von CD80 und HLA DR war
der von CD86 ähnlich.
Eine erhöhte
Expression von CD80 und CD86 als Reaktion auf das schwach IFN-α-induzierende
ODN 2006 war nach sechs Stunden nachweisbar. Im Gegensatz dazu zeigten
ODN 1585 und ODN 2216 eine verzögerte
Antwort, die später
als nach 12 Stunden begann. Bei beiden stark IFN-α-induzierenden
CpG-ODN (ODN 1585, ODN 2216) und dem schwach IFN-α-induzierende
CpG-ODN (ODN 2006) wurde nach 48 Stunden ein Plateau erreicht. Zu
späteren
Zeitpunkten wurde die Identifizierung der pDC unter den PBMC durch Flusszytometrie
durch die Herunterregulierung von CD123 während der Zellkultur erschwert.
-
Beispiel 9. Stimulierung der IFN-α- und IFN-β-Produktion
durch CpG-ODN ist eine direkte Wirkung auf plasmazellenartige dendritische
Zellen und wird teilweise durch magnetische anti-CD4-Kügelchen
blockiert.
-
Um
zu untersuchen, ob CpG-ODN die IFN-α-Produktion direkt induzieren,
wurden gereinigte pDC und nicht pDC-angereicherte PBMC untersucht.
PBMC wurden bezüglich
Monozyten, T-Zellen, NK-Zellen und B-Zellen abgereichert. Aus der
verbleibenden Zellpopulation wurden CD123++ und
HLA DR+-pDC durch FACS aussortiert, um gereinigte
(97%) pDC zu ergeben (11A).
Gereinigte pDC (160.000 Zellen/ml) wurden mit oder ohne ODN 2216
(SEQ ID NO: 7) bei Anwesenheit von IL-3 inkubiert. Nach 48 Stunden
wurden IFN-α und IFN-β im Überstand
durch ELISA gemessen. Wie in 11B gezeigt,
stimulierte ODN 2216 die Produktion hoher IFN-α-Titer (146 ng/ml; 1 pg pro
einzelner pDC) und IFN-β-Titer
(1 ng/ml) im Vergleich zu IL-3 alleine (< 10 pg/ml).
-
In
den PBMC genauso wie in pDC-angereicherten PBMC wurden 4,2 ± 0,8 pg
IFN-α (0,8
bis 1,4 U; n = 4) pro einzelner pDC produziert. Die IFN-α-Produktion
der pDC war viel geringer, wenn pDC unter Verwendung magnetisch
markiertem anti-CD4 mAK angereichert wurden. Dies war nicht auf
einen Verlust an IFN-α-produzierenden
Zellen in der CD4–-Fraktion zurückzuführen, da
die CD4–-Fraktion
kein IFN-α produzierte.
Die Zugabe der CD4–-Fraktion zurück zu CD4+-DC stellte die IFN-α-Reaktion nicht wieder her und
schloss dadurch eine Sekundärwirkung
des CpG-ODN durch zusätzliche
Zellen in der CD4–-Fraktion aus. Demnach schien
das Quervernetzen von CD4 an der Oberfläche der pDC für die reduzierte
Aktivität
verantwortlich zu sein.
-
Beispiel 10. IFN-α-induzierende CpG-ODN stellen
im Vergleich zu nicht-IFN-α-induzierenden CpG-ODN
eine überlegene
indirekte Aktivierung von NK-Zellen bereit.
-
Um
zu untersuchen, ob CpG-ODN, die große Mengen an IFN-α induzieren,
auch eine höhere
Aktivierung der NK-Zellen zeigen, wurden PBMC mit verschiedenen
CpG-ODN inkubiert. Die NK-Zellen-Aktivierung wurde als CD69-Expression
(FACS) und durch die in vitro NK-Zellen-lytische
Aktivität
gemessen. Zur Bestimmung der NK-Zellen-lytischen Aktivität wurden
PBMC mit verschiedenen ODN bei verschiedenen Konzentrationen inkubiert.
Nach 18 Stunden wurden die Zellen geerntet und als Effektorzellen
in einem standardmäßigen vierstündigen 51Cr-Freisetzungstest gegen K562-Zielzellen
wie früher
beschrieben verwendet. Hartmann G et al. Gene Therapy 6: 893 (1999).
Positivkontrollen umfassten rekombinantes IL-2 (100 IU/ml) und Negativkontrollen
umfassten das Medium alleine. Ergebnisse werden ausgedrückt in %
spezifischer Lyse: spezifische Lyse (%) = ((experimentelle Zähler – spontane
Freisetzungszähler)/(maximale
Freisetzungszähler – spontane Freisetzungszähler)) × 100%.
-
Ergebnisse.
Die IFN-α-induzierenden
ODN 2216 und ODN 1585 erhöhten
den Prozentsatz an CD69-positiven (früher Marker der Aktivierung)
NK-Zellen innerhalb von 24 Stunden (38 ± 12% mit ODN 2216; n = 5)
im Vergleich zur Kontrolle ohne Stimulus (8 ± 2%; n = 5). ODN 2006 zeigte
eine geringere Reaktion (19% ± 6%).
In Übereinstimmung
mit der erhöhten
CD69-Expression war die NK-Zellen-vermittelte Lyse von K562-Zellen
ausgeprägt
erhöht,
wenn PBMC mit CpG-ODN inkubiert wurden. Selbst bei der geringen
Konzentration von 0,6 μg/ml
war ODN 2216 (SEQ ID NO: 7) immer noch so wirksam wie IL-2 (100
IU/ml) bei der Stimulierung der NK-Zellen-lytischen Aktivität (12). ODN 1585 (SEQ ID NO: 1) und ODN 2006 (SEQ
ID NO: 147) waren weniger wirksam. Selbst bei höheren Konzentrationen (6 μg/ml) war
die GC-Kontrolle von ODN 1585 (5' ggGGTCAAGCTTGAgggggG
3'; ODN 2118; SEQ
ID NO: 151) völlig
inaktiv im Vergleich zu Medium alleine (12).
Wenn gereinigte NK-Zellen mit CpG-ODN inkubiert wurden, war die
CD69-Expression und Lyse der K562-Zellen nicht erhöht, was
eine indirekte Wirkung von CpG-ODN auf NK-Zellen zeigt.
-
Beispiel 11. CpG-Oligonukleotid induziert
die Produktion großer
IL-8-Mengen durch IPCs.
-
IL-8
ist ein Chemokin, das andere Immunzellen anlockt. In IL-3 gewachsene
IPCs produzieren kein IL-8, wohingegen CpG-Oligonukleotid die Produktion
von großen
IL-8-Mengen (im
Mittel 23 ng/ml, 13) durch IPCs stimuliert.
-
Frisch
präparierte
IPCs (siehe Beispiel 1, Endkonzentration 2 × 105 – 5 × 105 Zellen pro ml) wurden zwei Tage lang in
Vollmedium, das mit 10 ng/ml IL-3 supplementiert war, inkubiert.
Eine Reihe von parallelen Kulturen wurde mit 10 μg/ml Poly IC supplementiert,
und eine andere Reihe von parallelen Kulturen wurde mit 6 μg/ml CpG-ODN
2006 (SEQ ID NO: 147) supplementiert. Die Überstände wurden unter Verwendung
eines für
humanes IL-8 spezifischen ELISA gemäß der Anweisungen des Lieferanten
analysiert.
-
Ergebnisse.
Repräsentative
Daten von drei verschiedenen Spender sind in 13 gezeigt.
Die IL-8-Sekretion durch IPCs wurde durch die Zugabe von CpG-Oligonukleotiden
zu IL-3 enthaltendem Vollmedium stark induziert. Dagegen hatte die
Zugabe von Poly IC zum Medium keine Wirkung. Dieses Ergebnis zeigt,
dass CpG-Oligonukleotide IPCs induzieren, große Mengen an IL-8 zu produzieren.
-
Beispiel 12. Typ I-IFN induziert die Aktivierung
und Proliferation von γδ-T-Zellen.
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Die γδ-T-Zellen
(Vγ9/Vδ2) sind Antigen-spezifische
T-Zellen in einer voraktivierten Phase, die auf übliche Nicht-Peptid-Phosphorantigene
reagieren. Die Exponierung von γδ-T-Zellen
gegen diese Antigene stimuliert bei Abwesenheit von APC die IFN-γ-Produktion.
Um die γδ-T-Zellen-Aktivierung
zu untersuchen, wurden PBMC (2 × 106/ml) von gesunden Spender drei Tage lang
mit 6 μg/ml
CpG-ODN (2006, 1585 oder 2216) oder Medium alleine bei Anwesenheit
oder Abwesenheit von 15 μM
Isopentenyl/Pyrophosphat (IPP, spezifisches Phosphorantigen für Vγ9/Vδ2-Zellen)
stimuliert. Brefeldin A wurde für
die letzten vier Stunden hinzugegeben. Nach der Oberflächenfärbung gegen
Vγ9-TCR
und CD3 wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit mAK gegen
IFN-γ gefärbt. Bei
der Dreifarben-Flusszytometrie
wurden γδ-T-Zellen
unter Verwendung ihres FSC/SSC-Profils, ihrer CD3- und TCR Vγ9-Expression
gegatet und bezüglich
der IFN-γ-Expression
analysiert. Um die Ergebnisse von verschiedenen Spender zu vergleichen,
wurden die Daten zunächst
als X-fache Erhöhung im
Vergleich zum Medium oder IPP-Kontrollen berechnet und dann mit
dem Mittelwert des Mediums bzw. von IPP multipliziert. Für jedes
CpG-ODN wurden zwischen 14 und 20 Spender analysiert. Die Daten
sind als Mittelwerte + SEM gezeigt; *(p < 0,01) und **(p < 0,001) zeigen p-Werte an, die mit
Hilfe des Student-t-Tests für
gepaarte Proben berechnet worden, wobei Mediumkontrolle mit CpG-ODN
und IPP alleine mit IPP + CpG-ODN
verglichen wurden.
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Um
die γδ-T-Zellen-Proliferation
zu untersuchen, wurden PBMC von gesunden Spender mit IPP (30 μM) bei Anwesenheit
oder Abwesenheit von verschiedenen CpG-ODN (2006, 1585 oder 2216,
jeweils 6 μg/ml) stimuliert.
Die Expansion von γδ-TCR-positiven
Zellen wurde durch Flusszytometrie mit einem anti-Vγ9-Antikörper untersucht
und wird als Prozent TCR-Vγ9-positive
Zellen innerhalb der lebensfähigen
PBMC gezeigt. Zwischen 9 und 16 Spender wurden für jedes ODN analysiert. Die
Daten sind als X-fache Erhöhung
im Vergleich zu IPP allein (Mittelwert + SEM) gezeigt; *zeigt p < 0,05 (IPP gegen
IPP + CpG-ODN) an.
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Ergebnisse.
Innerhalb der PBMCs reagierten sowohl γδ-T-Zellen als auch NK-Zellen,
nicht aber αβ-T-Zellen
auf CpG-ODN mit erhöhter
CD69-Expression, IFN-γ-
und TNF-α-Produktion, erhöhtem Perforingehalt
und lytischer Aktivität.
CpG-ODN induzierten die Produktion von IFN-γ (14)
und Perforin in γδ-T-Zellen
synergistisch in Kombination mit IPP. Die synergistische Wirkung
war stärker
ausgeprägt
bei ODN 2216 und 1585 als bei ODN 2006, d. h. ODN, die starke Induktoren
für Typ
I-IFN sind. In gereinigten γδ-T-Zellen oder
NK-Zellen zeigten CpG-ODN keine Aktivität oder sogar reduzierte IPP-stimulierte
Aktivität.
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Weiterhin
verstärkten
CpG-ODN synergistisch die proliferative Antwort von γδ-T-Zellen
auf IPP (15). 15A zeigt
die Kinetiken der γδ-T-Zellen-Expansion
aus einem repräsentativen
Experiment. 15B zeigt die Expansion von γδ-T-Zellen
10 Tage nach der Stimulierung mit IPP alleine oder in Kombination
mit verschiedenen CpG-ODN.
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Die
Zugabe von rekombinatem IFN-α/β oder IL-12
ahmte die stimulierenden Wirkungen von CpG-ODN innerhalb der PBMC
nach. Funktionelles IL12p70 konnte in den Überständen von mit CpG-ODN stimulierten PBMCs
nicht nachgewiesen werden. Das Potential von CpG-ODN, γδ-T-Zellen
und NK-Zellen zu aktivieren, korrelierte gut mit ihrer Fähigkeit,
IFN-α/β zu induzieren.
Die Blockade der IFN-α/β-Funktion
durch eine Kombination von neutralisierendem Antikörper gegen
IFN-α/β-Protein
und den entsprechenden Rezeptor inhibierte die CpG-ODN-induzierte
Aktivierung von γδ-T-Zellen
und NK-Zellen. Ein neutralisierender Antikörper gegen IL-12 oder die Zugabe
von IL-18-bindendem Protein reduzierte den IFN-γ-Grundtiter, nicht aber CpG-ODN-stimuliertes
IFN-γ. Das
Neutralisieren von TNF-α,
IL-1β oder
IL-15 zeigten keine Wirkung. Entsprechend zeigten die Ergebnisse,
dass (i) IFN-α/β ein wirksamer
Aktivator von γδ-T-Zellen
ist; (ii) CpG-ODN γδ-T-Zellen
und NK-Zellen durch Induktion von IFN-α/β aktiviert; (iii) CpG-ODN, die
starke Induktoren für
Typ I-IFN sind, bei der Aktivierung von γδ-T-Zellen und NK-Zellen wirksamer
sind als ODN, die nicht starke Induktoren für Typ I-IFN sind; (iv) CpG-ODN
Antigen-spezifische T-Zellen-Reaktionen
in γδ-T-Zellen
co-stimulieren; und (v) CpG-ODN-induzierte nicht-spezifische Aktivierung von γδ-T-Zellen
und NK-Zellen frühes
IFN-γ bereitstellt,
das Th1-Reaktionen
fördert.
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Beispiel 13. Typ I-IFN-induzierende ISNA
inhibieren die IL-12-Produktion.
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Es
wurde beschrieben, dass IFN-β die
IL-12-Produktion herunterreguliert. Daher wurde die Wirkung von
Typ I-IFN-induzierenden und nicht-Typ I-IFN-induzierenden ISNA auf
die IL-12-Produktion
wie folgt untersucht. PBMC (2 × 106/ml) aus gesunden Spender wurden mit 25 μg/ml eines
stimulierenden anti-CD40-Antikörpers
bei Anwesenheit von IL-4 (100 U/ml), GM-CSF (10 U/ml) und IFN-γ (10 ng/ml)
stimuliert. Es wurden entweder Medium, 6 μg/ml ODN 2006 (SEQ ID NO: 147),
6 μg/ml
ODN 1585 (SEQ ID NO: 1) oder eine Kombination aus 5.000 U/ml rekombinantem
IFN-α und
500 U/ml IFN-β hinzugegeben.
Nach 48 Stunden wurde IL-12p70 im Überstand durch ELISA gemessen.
Die Daten sind als X-faches der IL-12p70-Produktion durch anti-CD40 alleine
(Mittelwert = 143 pg/ml) gezeigt und zeigen den Mittelwert (+ SEM)
von drei verschiedenen Spender.
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Ergebnisse. 16 zeigt, dass ODN 1585 in Kombination mit anti-CD40,
die IL-12p70-Produktion
verglichen mit anti-CD40-Kontrolle in einem Ausmaß inhibiert,
das ähnlich
der Inhibierung durch die Zugabe von rekombinantem IFN-α und rekombinantem
IFN-β ist.
Im Gegensatz dazu verstärkte
ODN 2006 in Kombination mit anti-CD40 die IL-12p70-Produktion über die
anti-CD40-Positivkontrolle hinaus. Diese Ergebnisse zeigen, dass
ISNA, die Typ I-IFN induzieren, in PBMC die Produktion von IL-12p70
unterdrücken
können,
und dass umgekehrt ISNA, die Typ I-IFN nicht induzieren, die Produktion
von IL-12p70 verstärken
können.
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Die
Analyse der mRNA-Titer durch quantitative Echtzeit-PCR zeigte die
Induktion von kleinen, aber gleichen Anzahlen von Kopien von IL-12p40
und IL-12p35-mRNA durch ISNA, die nicht Typ I-IFN induzieren. Im
Gegensatz dazu induzierten ISNA, die Typ I-IFN induzieren, eine
größere Anzahl
von Kopien von IL-12p35-mRNA, IL-12p40-mRNA konnte aber nicht nachgewiesen
werden. ISNA, die nicht Typ I-IFN induzieren, verstärkten (170%)
und ISNA, die Typ I-IFN induzierten, blockierten (25%) die IL-12p70-Synthese.
Die Inhibierung von IL-12p70 konnte durch rekombinantes IFN-β nachgeahmt
werden. Eine Kombination von neutralisierenden Antikörpern gegen
IFN-α/β-Protein
und -Rezeptor kehrten die durch Typ I induzierende ISNA vermittelte
Inhibierung von IL-12p70 um. Diese Ergebnisse zeigen, dass CpG-ODN,
die starke Induktoren von Typ I-IFN sind, die CD40-abhängige IL-12p70-Produktion über einen
IFN-α/β-vermittelten
negativen Rückkopplungsmechanismus
auf die IL-12p40-mRNA-Produktion unterdrücken. Demnach führt die
Wechselwirkung von T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen über CD40L
zu einem Zytokinmilieu, das von IL-12 (ISNA, die nicht Typ I-IFN
induzieren) oder IFN-α/β (ISNA, die
Typ I-IFN induzieren) beherrscht wird. Auch wenn beide Th1-Reaktionen
fördern,
können
ISNA, die nicht Typ I-IFN induzieren, für die Aktivierung naiver T-Zellen überlegen,
und ISNA, die Typ I-IFN induzieren, können eine höhere Aktivität aufweisen,
voraktivierte und Gedächtnis-T-Zellen
zu unterstützen.
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Beispiel 14. Wirkung von CpG-ODN auf primäre und Erinnerungs-Peptid-spezifische
menschliche CTL-Antworten.
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CD8+-T-Zellen
(1 × 10
6) aus HLA A2-positiven gesunden Spendern
wurden in 24 Napf-Platten
bei Anwesenheit oder Abwesenheit von CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147),
1585 (SEQ ID NO: 1) oder 2216 (SEQ ID NO: 7) bei einer Konzentration
von 6 μg/ml
entweder mit einem HLA A2-beschränkten
Peptid, das aus dem Grippematrixprotein (GILGFVFTL) abgeleitet wurde,
oder einem Peptid, das aus dem Melan A/mart-1-Protein (ELAGIGILTV)
abgeleitet wurde, stimuliert. Autologe PBMC (3 × 10
6)
wurden als APCs verwendet. Nach 14 Tagen wurden die Zellen geerntet,
gewaschen und mit Grippematrix- oder Melan-A-Peptiden 6 Stunden
erneut stimuliert. Brefeldin A wurde für die letzten vier Stunden
hinzugefügt.
Die Zellen wurden gegen CD8 und CD3 gefärbt, anschließend fixiert,
permeabilisiert und mit mAK gegen IFN-γ gefärbt. Nach 14 Tagen wurde auch
der Prozentanteil von Tetramerpositiven CD8
+-T-Zellen
(HLA-A2/melan-A-Peptid und HLA-A2/Grippematrix-Peptid) durch Flusszytometrie
bestimmt. Tetramere sind Fluorchrom-markierte MHC-Peptidtetramere,
die so konstruiert sind, dass sie spezifisch an einen Peptid-spezifischen
T-Zell-Rezeptor
binden, was ermöglicht,
Peptid-spezifische T-Zellen unter Verwendung von Flusszytometrie
zu identifizieren. Altman JD et al. Science 274: 94–96 (1996);
US-Patent Nr. 5,635,363 .
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Ergebnisse.
In der Dreifarben-Flusszytometrie wurden CD8+-T-Zellen
(CTL) auf IFN-γ-Expression analysiert.
Die Ergebnisse sind in 17A und 17C als Prozent-IFN-γ-positive Zellen von allen CD8+-T-Zellen gezeigt. Die Peptidspezifität wurde
durch Stimulierung mit einem irrelevanten HLA A2-Peptid, das aus
HIV pol abgeleitet war, getestet und betrug weniger als 0,2% für alle Proben.
Die Daten von sieben Spender sind als Mittelwert + SEM gezeigt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass ODN 2006 sowohl primäre als auch Erinnerungs-CTL-Antworten auf das
melan A/mart-1-Peptid bzw. auf das Grippepeptid erhöhte, im
Gegensatz zu ODN 1585 und ODN 2216, die eine geringere Erinnerung
induzierten und keine Wirkung auf die Entwicklung von primären CTLs
hatten oder sie sogar inhibierten.
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Ergebnisse
aus der Quantifizierung von Antigen-spezifischen CTLs unter Verwendung
von MHC-Tetramer-Färbung
sind für
das Grippepeptid bzw. das melan A/mart-1-Peptid in 17B bzw. 17D gezeigt. Die
Daten von 7 Spender sind als Mittelwert + SEM gezeigt; *zeigt p-Werte < 0,05 berechnet
nach dem Student-t-Test für
gepaarte Proben (Medium verglichen mit Stimulierung mit CpG-ODN).
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Beispiel 15. IFN-α-Sekretion in „stark
Reagierenden”
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PBMC
aus 12 verschiedenen Spender wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen
von ODN inkubiert, die aus einem Satz von ODN ausgewählt waren,
der umfasste: ODN 2336 (SEQ ID NO: 37), ODN 2334 (SEQ ID NO: 36),
ODN 2295 (SEQ ID NO: 20), ODN 2255 (SEQ ID NO: 16), ODN 2247 (SEQ
ID NO: 11), ODN 2216 (SEQ ID NO: 7) und ODN 2006 (SEQ ID NO: 147).
Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass 6 der Spender als „stark
Reagierende” klassifiziert
werden konnten insoweit, als dass die Zellen dieser Blutspender mehr
als 500 pg/ml (bis zu 7.000 pg/ml) IFN-α nach Inkubation mit dem ausgewählten ODN
sekretierten. Eine Unterscheidung zwischen „stark” und „schwach” Reagierenden konnte gemacht
werden, da die Zellen der 6 verbleibenden Spender nur IFN-α-Mengen zwischen
10 und 500 pg/ml sekretierten. Ein Grund für diese unterschiedlichen Ergebnisse
mag sich aus der Verwendung von Leukozytenfilmen ergeben, die mindestens
24 Stunden alt sind. pDC, als der Hauptzelltyp, der IFN-α sekretiert, überleben
nur ungefähr
drei Tage in Zellkultur, so dass PBMC aus Leukozytenfilmen, die
mindestens 24 Stunden alt sind, eine sehr geringe Anzahl dieses
Zelltyps enthalten können.
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IFN-α wurde in
den obigen Experimenten unter Verwendung eines ELISA-Kits gemessen,
das alle Subtypen von IFN-α erkennt.
Dagegen messen die meisten anderen ELISA-Kits nur IFN-α2B. Daher
wurden die Mengen an IFN-α2B
gegen alle IFN-α-Subtypen
in mehreren Experimenten verglichen, um Informationen über mögliche Unterschiede
für die
Induktion von verschiedenen IFN-α-Subtypen
zu erhalten. Zusätzlich
wurden die IFN-α-Mengen
mit IFN-γ verglichen.
Auf der Grundlage der Ergebnisse dieser Studie gab es eine Korrelation
zwischen der Induktion von IFN-α2B
und allen IFN-α-Subtypen.
Im Gegensatz dazu gab es jedoch keine klare Korrelation zwischen
IFN-α und
IFN-γ.
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Beispiel 16. Induktion von IFN-α-Sekretion
durch ausgewählte
CpG-ODN
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Menschliche
PBMCs von einem einzelnen Spender wurden hinsichtlich DC durch die
Anwendung des ersten Schrittes des Miltenyi C-Isolierungskits angereichert,
was den Gehalt an Monozyten, NK-Zellen und T-Zellen vermindert,
so dass vor allem B-Zellen, RBCs und DCs übrig bleiben. Diese wurden
anschließend zwei
Tage lang bei Anwesenheit von IL-3 (10 ng/ml) und verschiedenen
ODN bei einer Konzentration von 6 μg/ml inkubiert: ODN 1585 (SEQ
ID NO: 1), ODN 2022 (SEQ ID NO: 2), ODN 2118 (SEQ ID NO: 151), ODN 2184
(SEQ ID NO: 3), ODN 2185 (SEQ ID NO: 4), ODN 2192 (SEQ ID NO: 5),
ODN 2197 (SEQ ID NO: 148), ODN 2198 (SEQ ID NO: 149), ODN 2204 (SEQ
ID NO: 6), ODN 2216 (SEQ ID NO: 7) oder ODN 2217 (SEQ ID NO: 8).
In parallelen Proben wurde IFN zu einer Konzentration von 1.000
U/ml hinzugefügt.
Die Überstände wurden
gesammelt und mit einem für
IFN-α-spezifischen
ELISA analysiert.
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Ergebnisse.
ODN induzierten IFN-α in
unterschiedlichen Ausmaßen,
mit etwas Steigerung durch die Hinzugabe von IFN-γ. Einige
der ODN induzierten IFN-α in
einem außergewöhnlichen
Ausmaß (> 50.000 pg/ml), selbst
bei Abwesenheit von hinzugefügtem
IFN-γ.
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Beispiel 17. Spender- und Sequenzabhängigkeit
der IFN-α-Reaktion
auf verschiedene ODN.
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PBMC,
die aus vier verschiedenen Spender gewonnen waren, wurden zwei Tage
mit einer Vielzahl von ODN bei einer Konzentration von 0,1 μg/ml inkubiert.
Der Satz von ODN umfasste die folgenden:
(Z in
ODN 2313 steht für
5-Methylcytosin)
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Überstände wurden
gesammelt und mittels ELISA auf IFN-α getestet. In Parallelexperimenten
wurden aus denselben vier verschiedenen Spender gewonnene PBMC zwei
Tage lang mit dem gleichen Satz von ODN bei einer Konzentration
von 1 μg/ml
inkubiert.
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Ergebnisse.
Die Ergebnisse für
PBMC, die von den vier Spendern gewonnen und mit ODN bei einer Konzentration
von 0,1 μg/ml
und mit ODN bei einer Konzentration 1 μg/ml inkubiert wurden, zeigten
wiederum Dosis- und Spenderschwankungen, wobei mehrere ODN IFN-α auf Spiegel
von mindestens 5.000 pg/ml induzierten und manche IFN-α auf Titer,
die weit über
5.000 pg/ml hinausgingen, induzierten. SEQUENZPROTOKOLL