CN102495208B - 禽流感病毒rt-pcr elisa试剂盒 - Google Patents
禽流感病毒rt-pcr elisa试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102495208B CN102495208B CN201110325932.XA CN201110325932A CN102495208B CN 102495208 B CN102495208 B CN 102495208B CN 201110325932 A CN201110325932 A CN 201110325932A CN 102495208 B CN102495208 B CN 102495208B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- pcr
- primer
- kit
- hole
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了根据流感病毒保守的M基因设计了特异性引物，借助生物素与链霉亲和素特异性结合的原理，使生物素标记的PCR产物结合到酶标板上，之后加入抗地高辛的过氧化物酶，最后加TMB显色液，阳性产物即可显色；在此基础上本发明成功研制了专用试剂盒。该方法将PCR和高灵敏度的地高辛检测系统相结合，敏感性比常规琼脂糖凝胶电泳检测方法高l00倍以上，而且特异性强，克服了组织样品中AIV含量少而难以检测的困难，与病毒分离方法相比符合率可达95%以上，且排除了化学试剂(如溴化乙锭)的污染，有利于自动化，适于大量样本的检测，为禽流感的早期诊断和分子流行病学调查提供了一条新途径。
Description
技术领域
本发明涉及动物病毒学领域，特别涉及生物技术领域内的诊断技术，更具体涉及一种利用RT-PCR ELISA技术对禽流感病毒进行高通量快速诊断及应用该诊断方法制备的试剂盒。
背景技术
禽流感是由A型流感病毒引起的一种急性接触性的传染病，能感染包括人、禽、猪、马等多种动物。禽流感不仅给畜牧业带来灾难性的破坏，而且对公共健康也构成了严重威胁。禽流感病毒(AIV)变异迅速，虽然尚未获得在人群中有效传播的能力，但其日益频繁的致人感染的事件表明，AIV病毒正经历着适应于人体的复杂的变异过程，再一次的人类流感暴发已在酝酿之中。对多个种属的易感动物进行长期的流行病学监测，从而密切跟踪AIV变异的趋势，无疑是应对流感暴发的有效措施。因此，除了研制疫苗外，敏感、快速、经济并能进行大规模样本筛查的病原检测方法是我们目前亟需的应对流感大流行的技术储备。
禽流感的检出方法主要包括病原学、免疫学及分子生物学三个方面。病毒分离和HA/HI试验是经典的实验室诊断方法，结果可靠但耗时太长；琼脂扩散(AGP)试验具有简便快速的特点，但此法的敏感性较低；RT-PCR虽然能检出禽流感病毒，但敏感性不高，对含毒量低的样本的检出率较低；免疫荧光检测技术虽然具有快速准确等优点，但不能进行大规模检测和容易受检测人员判定水平影响等缺点。RT-PCR ELISA将RT-PCR的特异性和ELISA的高灵敏性结合起来，具有灵敏度和特异性高、无EB污染、适于高通量检测等特点，已应用于多种疫病的实验室检测中。但是上述方法在AIV的检测方面依然是一个空白。
发明内容
本发明的发明人提供的检测方法，首先根据流感病毒保守的M基因设计了特异性引物，该引物特异性强，且上下游引物并分别用生物素和地高辛标记，先用特异性的引物扩增出保守片段，然后用链霉亲和素包被酶标板，借助生物素与链霉亲和素特异性结合的原理，使生物素标记的PCR产物结合到酶标板上，之后加入抗地高辛的过氧化物酶，最后加TMB显色液，阳性产物即可显色；在此基础上本发明成功研制了专用试剂盒。该方法将PCR和高灵敏度的地高辛检测系统相结合，敏感性比常规琼脂糖凝胶电泳检测方法高100倍以上，可检出0.001EID50的AIV病毒总RNA，而且特异性强，克服了组织样品中AIV含量少而难以检测的困难，与病毒分离方法相比符合率可达95％以上，且排除了化学试剂(如溴化乙锭)的污染，有利于自动化，适于大量样本的检测，为禽流感的早期诊断和分子流行病学调查提供了一条新途径。
本发明所采用的具体检测方法是：
根据流感病毒保守的M基因设计特异性上游引物M1和下游引物M2，其中所用的上游引物M1其序列如Seq ID No：1所示，采用生物素标记后：5’BIOTIN-TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3’，下游引物M2其序列如Seq ID No：2所示，采用地高辛标记后：5’DIG-AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3’，均采用现有技术直接合成标记，引物在应用时以灭菌双蒸水稀释，浓度为20pmol/μL，预期扩增产物长度229bp；
更为具体的步骤如下：
采用常规方法提取待测样品基因组中RNA；
根据上游引物M1和下游引物M2 RT-PCR反应获得PCR产物；
将上述获得的PCR产物与0.01M pH7.4的PBST按体积比1∶50进行稀释，然后加入到以50μL 2μg/mL链霉亲和素4℃过夜包被好的酶标板中，每孔加样品50μL，于37℃温箱中孵育1.5h后取出，倒掉孔内液体，再用0.01M pH7.4的PBST洗板，洗板时每孔加200μLPBST洗板，然后在滤纸上拍干，重复3次；之后每孔加入50μL按体积比1∶3000稀释的Anti-Digoxigenin-POD溶液，37℃温箱中孵育1h，倒掉孔内液体，采用上述的洗板方法用PBST洗板3次，之后加入50μLTMB底物，室温孵育30min后加入终止液终止反应，酶标仪中测定OD450值；
反应同时设阳性和阴性对照孔，阴性阳性的判定标准为OD450值大于或等于0.1357为阳性，小于0.1357为阴性，当阳性孔和阴性孔OD450值结果成立时判定结果有效。
其中所述的稀释时使用的PBST溶液规格如下：每1000mL该溶液种含8g的NaCl，0.2g的KCl，2.9g的Na2HPO4·12H2O，0.2g的KH2PO4和0.5mL的tween-20，余量为水。
而所述的预先以2μg/mL链霉亲和素包被的酶标板为：
用50uL含2μg/mL链霉亲和素的包被液4℃包被过夜，以0.01M pH7.4PBST洗板3次，每次3分钟，加入封闭液，37℃封闭1h的酶标板，其中所采用的包被液为含15mM NaCO3，35mM NaHCO3，pH 9.6的水溶液，其中所述的封闭液为100mLPBST中含1g牛血清白蛋白(BSA)的溶液。
所述的Anti-Digoxigenin-POD是以PBST按体积比1∶3000纯水稀释获得的水溶液。
所述的TMB底物为TMB母液10mL，底物缓冲液90mL，H2O2 750uL临用前配制而成；其中所述的TMB母液为0.1gTMB以100mL无水乙醇溶解获得的溶液；所述的底物缓冲液为每500mL溶液含14.2g柠檬酸，10.5g Na2HPO4·12H2O以纯净水配制的溶液。
所述的终止液为每100mL溶液中含11.1mL98％浓硫酸H2SO4，88.9mL纯净水的溶液。
所用阳性对照标准品为在上述扩增M基因的引物基础上，在上游引物M1 5’端加入T7启动子序列，在下游引物M2 5’端加入oligo-dT用于转录M基因，上游引物F 5’- TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3’(斜体部分为T7启动子序列，下划线部分为上述M1引物)其序列如Seq ID No：3所示，下游引物R 5’- 
AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3’(斜体部分为Oligo-dT，下划线部分为上述M2引物)其序列如Seq ID No：4所示，引物由现有技术直接合成获得，稀释至20μM浓度使用。以禽流感病毒基因组为模板，按前面所述RT-PCR条件扩增该片段，然后使用T7体外转录系统(RiboMAX LargeScale RNA Production Systems)按照试剂盒操作步骤加入：Buffer 20μL，dNTP30μL，上述纯化的PCR产物5-10μg、酶混合物(T7)10μL，DEPC水补至100μL体外转录制备M基因RNA，所得RNA经苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后，用DEPC水溶解，紫外分光光度计测定浓度后作为标准阳性模板-70℃分装保存备用。
阴性阳性结果判定的临界值为0.1357，是通过对22份从SPF鸡采取的咽拭子和直肠拭子阴性样品的检测，根据公式：阴阳性标准的临界值＝阴性样品的平均值+3×标准差确定。
综上所述，本发明的发明人根据流感病毒保守的M基因设计了特异性引物， 该引物特异性强，且上下游引物并分别用生物素和地高辛标记，先用特异性的引物扩增出保守片段，然后用链霉亲和素包被酶标板，借助生物素与链霉亲和素特异性结合的原理，使生物素标记的PCR产物结合到酶标板上，之后加入抗地高辛的过氧化物酶，最后加TMB显色液，阳性产物即可显色；而且发明人在此基础上本发明成功研制了专用试剂盒。该方法将PCR和高灵敏度的地高辛检测系统相结合，敏感性比常规琼脂糖凝胶电泳检测方法高100倍以上，可检出0.001EID50的AIV病毒总RNA，而且特异性强，克服了组织样品中AIV含量少而难以检测的困难，与病毒分离方法相比符合率可达95％以上，且排除了化学试剂(如溴化乙锭)的污染，有利于自动化，适于大量样本的检测，为禽流感的早期诊断和分子流行病学调查提供了一条新途径。
附图说明
图1为RT-PCR扩增禽流感病毒M基因电泳图；
图中M为DL2000 marker，1为1pgM基因RNA，2为0.1pgM基因RNA，3为0.01pgM基因RNA，4为0.001pgM基因RNA，5为0.0001pgM基因RNA；从图上可看出1-4泳道条带较清晰，第5泳道条带模糊几乎看不到，说明本发明中的RT-PCR方法检测灵敏度为0.001pg M基因RNA；
图2为RT-PCR产物ELISA检测结果灰度图；
图中1-11列为11份阳性样品RT-PCR产物梯度稀释后的ELISA结果，第12列1-4孔为阳性对照孔，5-8孔为阴性对照孔；从图中可以看出随着稀释度的升高，孔中溶液的颜色也逐渐变浅，即OD450值在逐渐降低，RT-PCR阳性产物稀释到1∶6400时其OD450值仍大于阳性对照，而用常规的琼脂糖凝胶电泳法检测，RT-PCR产物稀释到1∶40就已检测不到，其灵敏度比凝胶电泳法高出100多倍。
图3为图2的彩色示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明有关内容。下列实例中未注明的具体试验方法，通常按照分子克隆实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商提供的条件。
实施例1
样品中基因组RNA的提取取研磨的临床病理组织或咽拭子、肛拭子样品300μL加入800μLTRIzol，按照TRIzol试剂盒操作步骤提取RNA。
根据流感病毒保守的M基因设计特异性上游引物M1和下游引物M2，其中所用的上游引物M1其序列如Seq ID No：1所示，其中采用了生物素标记：5’BIOTIN-TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3’，下游引物M2其序列如Seq ID No：2所示，其中采用地高辛标记：5’DIG-AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3’，均采用现有技术直接合成标记，
RT-PCR反应利用PrimerScript One Step RT-PCR试剂盒进行RT-PCR反应，反应体系为buffer 25μL，Enzyme Mix 2μL，上游引物M1(20μM)1μL，下游引物M2(20μM)1μL，模板6μL，加DEPC水至50μL。RT-PCR反应程序为：50℃30min，94℃2min，94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，30个循环。RT-PCR产物于-20℃保存备用。
ELISA反应 将上述获得的PCR产物与0.01M pH7.4的PBST按体积比1∶50进行稀释，然后加入到以50μL 2μg/mL链霉亲和素4℃过夜包被好的酶标板中，每孔加样品50μL，于37℃温箱中孵育1.5h后取出，倒掉孔内液体，再用0.01MpH7.4的PBST洗板，洗板时每孔加200μLPBST洗板，然后在滤纸上拍干，重复3次；之后每孔加入50μL按体积比1∶3000稀释的Anti-Digoxigenin-POD溶液，37℃温箱中孵育1h，倒掉孔内液体，采用上述的洗板方法用PBST洗板3次，之后加入50μLTMB底物，室温孵育30min后加入终止液终止反应，酶标仪中测定OD450值；
反应同时设阳性和阴性对照孔，阴性阳性的判定标准为OD450值大于或等于0.1357为阳性，小于0.1357为阴性，当阳性孔和阴性孔OD450值结果成立时判定结果有效。
其中所述的稀释时使用的PBST溶液规格如下：每1000mL该溶液种含8g的NaCl，0.2g的KCl，2.9g的Na2HPO4·12H2O，0.2g的KH2PO4和0.5mL的tween-20，余量为水。
而所述的预先以2μg/mL链霉亲和素包被的酶标板为：
用50uL含2μg/mL链霉亲和素的包被液4℃包被过夜，以0.01M pH7.4PBST洗板3次，每次3分钟，加入封闭液，37℃封闭1h的酶标板，其中所采用的包被液为含15mM NaCO3，35mM NaHCO3，pH 9.6的水溶液，其中所述的封闭液为100mLPBST中含1g牛血清白蛋白(BSA)的溶液。
所述的Anti-Digoxigenin-POD是以PBST按体积比1∶3000纯水稀释获得的水溶液。
所述的TMB底物为TMB母液10mL，底物缓冲液90mL，H2O2 750uL临用前配制而成；其中所述的TMB母液为0.1gTMB以100mL无水乙醇溶解获得的溶液；所述的底物缓冲液为每500mL溶液含14.2g柠檬酸，10.5g Na2HPO4·12H2O以纯净水配制的溶液。
所述的终止液为每100mL溶液中含11.1mL98％浓硫酸H2SO4，88.9mL纯净水的溶液。
所用阳性对照标准品为在上述扩增M基因的引物基础上，在上游引物M1 5’端加入T7启动子序列获得上游引物F，其序列如Seq ID No：3所示，上游引物F5’- TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3’(斜体部分为T7启动子序列，下划线部分为上述M1引物)，在下游引物M2 5’端加入oligo-dT用于转录M基因获得下游引物R，其序列如Seq ID No：4所示，下游引物R5’- 
AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3’(斜体部分为Oligo-dT，下划线部分为上述M2引物)，引物由现有技术直接合成获得，稀释至20μM浓度使用。以禽流感病毒基因组为模板，按前面所述RT-PCR条件扩增该片段，然后使用T7体外转录系统(RiboMAX Large Scale RNA Production Systems)按照试剂盒操作步骤加入：Buffer 20μL，dNTP 30μL，上述纯化的PCR产物5-10μg、酶混合物(T7)10μL，DEPC水补至100μL体外转录制备M基因RNA，所得RNA经苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后，用DEPC水溶解，紫外分光光度计测定浓度后作为标准阳性模板-70℃分装保存备用。
阴性阳性结果判定的临界值为0.1357，是通过对22份从SPF鸡采取的咽拭子和直肠拭子阴性样品的检测，根据公式：阴阳性标准的临界值＝阴性样品的平均值+3×标准差确定。
结果判定 阴性阳性的判定标准为OD450值大于或等于0.1357为阳性，小 于0.1357为阴性，当阳性孔和阴性孔OD450结果成立时判定结果有效。
实施例2
RT-PCR ELISA的敏感性对测定EID50的病毒提取RNA模板并梯度稀释后进行RT-PCR检测，RT-PCR产物一部分用1.5％琼脂糖凝胶电泳法检测，一部分作1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400稀释，进一步利用本发明建立的ELISA方法进行检测。结果如图2所示，发现RT-PCR ELISA法能检测到0.001EID50的AIV总RNA，RT-PCR ELISA检测发现阳性产物被稀释到1∶6400仍能被检测到，比琼脂糖凝胶电泳法的灵敏度高100多倍(用琼脂糖凝胶电泳法检测，AIV阳性产物被稀释到1∶40就已检测不到)。
实施例3
RT-PCR ELISA的特异性用TRIzol试剂盒按照说明书步骤提取AIV H9N2、H5N1、H4N6、NDV、IBV的RNA，并以它们为模板用已建立的RT-PCR ELISA方法进行特异性检测。检测结果如下表所示，前3种血清型的AIV病毒OD450值均大于0.65，NDV、IBV病毒OD450值均小于阴性对照值，说明此方法特异性强，与部分病毒无交叉反应，可用于AIV的鉴别诊断。
表.RT-PCR ELISA方法的特异性试验
实施例4
对临床肺组织阳性样品进行10倍梯度稀释，将其分为三份：一份用本发明中的M1、M2引物进行RT-PCR检测；一份用本发明中的RT-PCR ELISA方法进行检测；一份用常规病毒分离法进行了检测，即取病料200μL接种9-10日龄鸡胚，然后进行血凝(HA)和血凝抑制(HI)实验，结果RT-PCR ELISA和常规病毒分离能检测到104稀释的病料，而RT-PCR仅能检测到103稀释的病料(结果见下表)，表明RT-PCRELISA与RT-PCR凝胶电泳法相比检测灵敏度更高，与常规的病毒分离鉴定法具有较高的符合率。
表.RT-PCR，RT-PCR ELISA和常规病毒分离对系列稀释的临床发病鸡肺组织样品的检测
Claims (6)
1.一种禽流感病毒试剂盒，其特征在于：该试剂盒中包括：
上游引物M1和下游引物M2，其中所用的上游引物M1其序列如Seq ID No:1所示，采用生物素标记后：5’BIOTIN-TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3’，
下游引物M2其序列如Seq ID No:2所示，采用地高辛标记后：5’DIG-AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3’，
链霉亲和素包被酶标板，Anti-Digoxigenin-POD溶液，TMB底物和终止液；
该试剂盒应用的具体方法如下：
首先根据流感病毒保守的M基因设计特异性引物：上游引物M1和下游引物M2；再用特异性的引物扩增出保守片段，然后用链霉亲和素包被酶标板，借助生物素与链霉亲和素特异性结合的原理，使生物素标记的PCR产物结合到酶标板上，之后加入抗地高辛的过氧化物酶，最后加TMB显色液，阳性产物即可显色；
上下游引物的浓度均为20pmol/μL，预期扩增产物长度229bp。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒应用的具体方法的具体步骤如下：
采用常规方法提取待测样品基因组中RNA；
根据上游引物M1和下游引物M2RT-PCR反应获得PCR产物；
将上述获得的PCR产物与0.01M pH7.4的PBST按体积比1:50进行稀释,然后加入到以50μL2μg/mL链霉亲和素4℃过夜包被好的酶标板中，每孔加样品50μL，于37℃温箱中孵育1.5h后取出，倒掉孔内液体，再用0.01M pH7.4的PBST洗板，洗板时每孔加200μLPBST洗板，然后在滤纸上拍干，重复3次；之后每孔加入50μL按体积比1:3000稀释的Anti-Digoxigenin-POD溶液，37℃温箱中孵育1h，倒掉孔内液体，采用上述的洗板方法用PBST洗板3次，之后每孔加入50μLTMB底物，室温孵育30min后加入终止液终止反应，酶标仪中测定OD450值；
反应同时设阳性和阴性对照孔，阴性阳性的判定标准为OD450值大于或等于0.1357为阳性，小于0.1357为阴性，当阳性孔和阴性孔OD450值结果成立时判定结果有效。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的稀释时使用的PBST溶液规格如下：每1000mL该溶液种含8g的NaCl，0.2g的KCl,2.9g的Na2HPO4·12H2O,0.2g的KH2PO4和0.5mL的tween-20，余量为水。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的预先以2μg/mL链霉亲和素包被的酶标板为：
用50uL含2μg/mL链霉亲和素的包被液4℃包被过夜，以0.01M pH7.4PBST洗板3次，每次3分钟，加入封闭液，37℃封闭1h的酶标板，其中所采用的包被液为含15mM NaCO3,35mM NaHCO3,pH9.6的水溶液，其中所述的封闭液为100mLPBST中含1g牛血清白蛋白的溶液。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的TMB底物为TMB母液10mL,底物缓冲液90mL，H2O2750uL临用前配制而成；
其中所述的TMB母液为0.1gTMB以100mL无水乙醇溶解获得的溶液；
所述的底物缓冲液为每500mL溶液含14.2g柠檬酸，10.5g Na2HPO412H2O以纯净水配制的溶液。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的终止液为每100mL溶液中含11.1mL98%浓硫酸H2SO4，88.9mL纯净水的溶液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110325932.XA CN102495208B (zh) | 2011-10-24 | 2011-10-24 | 禽流感病毒rt-pcr elisa试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110325932.XA CN102495208B (zh) | 2011-10-24 | 2011-10-24 | 禽流感病毒rt-pcr elisa试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102495208A CN102495208A (zh) | 2012-06-13 |
| CN102495208B true CN102495208B (zh) | 2014-03-26 |
Family
ID=46187049
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110325932.XA Expired - Fee Related CN102495208B (zh) | 2011-10-24 | 2011-10-24 | 禽流感病毒rt-pcr elisa试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102495208B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104651533B (zh) * | 2015-02-13 | 2016-08-24 | 河北农业大学 | 用于禽流感病毒检测的rt-lamp引物组、试剂盒及其应用 |
| CN106086234A (zh) * | 2016-06-17 | 2016-11-09 | 广西壮族自治区兽医研究所 | H9亚型aiv、h6亚型aiv和aiv的三重rt‑pcr试剂盒及其应用 |
| CN109913587A (zh) * | 2019-03-25 | 2019-06-21 | 新乡学院 | 一种利用pcr-elisa检测prrsv的方法 |
| CN109913585A (zh) * | 2019-03-25 | 2019-06-21 | 新乡学院 | 一种利用pcr-elisa检测prv的方法 |
| CN109988868A (zh) * | 2019-03-25 | 2019-07-09 | 新乡学院 | 一种利用pcr-elisa检测csfv的方法 |
| CN109913586A (zh) * | 2019-03-25 | 2019-06-21 | 新乡学院 | 一种利用pcr-elisa检测pcv-2的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1712965A (zh) * | 2005-06-30 | 2005-12-28 | 上海交通大学 | 鉴别诊断禽流感自然感染鸡群酶联免疫吸附试验的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2045323A1 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-08 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag | Linear expression constructs for production of influenza virus particles |
| US20100048423A1 (en) * | 2008-08-19 | 2010-02-25 | Animal Health Research Institute, Council Of Agriculture, Executive Yuan | Simultaneous detection, differentiation and typing system of newcastle disease and avian influenza viruses |
-
2011
- 2011-10-24 CN CN201110325932.XA patent/CN102495208B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1712965A (zh) * | 2005-06-30 | 2005-12-28 | 上海交通大学 | 鉴别诊断禽流感自然感染鸡群酶联免疫吸附试验的方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| 人隐孢子虫RT-PCR-ELISA检测方法的建立;徐前明等;《中国人兽共患病学报》;20101231;第26卷(第2期);150-153 * |
| 刘婧君.禽流感病毒和新城疫病毒双重RT-PCR检测及野鸭源禽流感病毒M基因序列分析.《农业科技辑》.2009,D050-78. |
| 徐前明等.人隐孢子虫RT-PCR-ELISA检测方法的建立.《中国人兽共患病学报》.2010,第26卷(第2期),150-153. |
| 杨利峰等.猪瘟RT-PCR ELISA诊断方法的建立.《中国兽医学报》.2007,第27卷(第3期),292-295. |
| 猪瘟RT-PCR ELISA诊断方法的建立;杨利峰等;《中国兽医学报》;20070531;第27卷(第3期);292-295 * |
| 禽流感病毒和新城疫病毒双重RT-PCR检测及野鸭源禽流感病毒M基因序列分析;刘婧君;《农业科技辑》;20090720;D050-78 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102495208A (zh) | 2012-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102495208B (zh) | 禽流感病毒rt-pcr elisa试剂盒 | |
| US7611837B2 (en) | Kit for detecting non-pathogenic or pathogenic influenza a subtype h5 virus | |
| CN103614489B (zh) | 一种登革热病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法 | |
| CN105543414B (zh) | 一种呼吸道合胞病毒a/b亚型多重荧光定量pcr检测引物组和探针组及其试剂盒和制备方法 | |
| CN102337351A (zh) | 一种流感病毒分型检测试剂盒 | |
| CN101363063B (zh) | 三重荧光定量rt-pcr检测a、b和h5亚型流感病毒的引物、探针、试剂盒及方法 | |
| CN101864494B (zh) | 一种甲型h1n1病毒的恒温扩增检测试剂盒 | |
| CN112280901B (zh) | 一种改进的核酸检测技术在制备病毒检测试剂盒中的用途 | |
| Read et al. | Application of real‐time PCR and ELISA assays for equine influenza virus to determine the duration of viral RNA shedding and onset of antibody response in naturally infected horses | |
| CN105316431B (zh) | 同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用 | |
| CN110669872A (zh) | H9和h10亚型禽流感病毒三重rt-pcr检测引物组、试剂盒及方法 | |
| CN106353499A (zh) | 肺癌血清标志物适配体和基因同时检测试剂盒及应用 | |
| US20230213517A1 (en) | Method for detecting virus particles and kits therefor | |
| CN109468411A (zh) | 一种h5亚型禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法 | |
| CN101575644B (zh) | 玉米丝黑穗病菌pcr检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN101230405B (zh) | H5型和h9型禽流感病毒及新城疫病毒多重检测试剂盒及方法 | |
| CN106086234A (zh) | H9亚型aiv、h6亚型aiv和aiv的三重rt‑pcr试剂盒及其应用 | |
| CN111363748B (zh) | 一种核酸适配体及其构建方法和其在检测中华鳖彩虹病毒中的应用 | |
| CN114457083A (zh) | 一组特异识别孔雀石绿的单链dna核酸适配体及其应用 | |
| CN101864498B (zh) | 一种禽流感h5n1病毒的恒温扩增检测试剂盒 | |
| CN105861757A (zh) | H9亚型禽流感病毒和h6亚型禽流感病毒的二重rt-pcr试剂盒及其应用 | |
| CN101864497B (zh) | 一种人季节性流感h1n1的恒温扩增检测试剂盒 | |
| CN104711370A (zh) | 一种埃博拉病毒分型荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN109735658A (zh) | 一种新城疫病毒的荧光定量rt-pcr检测方法 | |
| CN103667522A (zh) | 甲型h7n9流感病毒(2013)核酸检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140326 Termination date: 20141024 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |