CN102492677A - 一种羧肽酶(Aus CpA)基因的克隆及重组酶的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型羧肽酶及其基因序列，新型羧肽酶工程菌的构建，以其重组羧肽酶的高效表达和纯化方法，经生物信息学分析确定该酶属于蛋白水解酶S1家族，特命名为Aus CpA，相应的基因序列命名为Aus cpA。Aus CpA具有较好的活性和稳定性，有较大工业化生产的潜力和经济价值，也为其他羧肽酶的研究奠定了理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及源自宇佐美曲霉（Aspergillus usamii)E001的一种羧肽酶及其基因序列，羧肽酶基因工程菌的构建，以其重组羧肽酶的表达及酶活测定方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
羧肽酶(Carboxypeptidase)是一类肽链端水解酶，作用于肽链的游离羧基末端释放单个氨基酸，其在医药和食品工业领域有着广泛的应用。在医药领域，可用于重组人胰岛素的生产，肿瘤抗体导向酶的前药治疗，以及作为诊断急性胰腺炎轻重程度的血清标记等；在食品工业上，羧肽酶可作用于苦味肽，水解肽链羧基端的疏水性氨基酸，达到脱苦的目的。另外，羧肽酶还可用于多肽的氨基酸测序。羧肽酶有小麦羧肽酶、动物羧肽酶和微生物羧肽酶，其中，动物来源的羧肽酶主要存在于猪和牛等的胰脏中，数量非常有限，价格昂贵，其应用因此而受到限制。而微生物来源的羧肽酶来源广泛，目前已在酵母和霉菌中检测到羧肽酶的存在。因此，利用微生物发酵生产羧肽酶具有广阔的应用前景。
曲霉(Aspergillus)中存在的羧肽酶主要为丝氨酸羧肽酶，主要存在液泡中，在酸性环境下，它们同时具有末端蛋白水解酶、酯酶和脱酰胺酶的活性，参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节。亚夫尔在其发明专利(公开号CN95191058.2)中报道了编码黑曲霉羧肽酶的基因，其产生的羧肽酶存在于液泡中，可降解异源蛋白。Ichishima等人分离得到的一株黑曲霉液体发酵生产羧肽酶，酶活为360mU/mL滤液。Krishnan等人用清酒曲培养基固体发酵培养黑曲霉产羧肽酶酶活为60.5U/mg。Morita等人用土豆葡萄糖琼脂培养基固体发酵生产羧肽酶O，酶活为463.0mkat/kg(27.780U/mg)。综上所述，羧肽酶广泛存在于曲霉中，但目前无论是液态发酵或固态发酵，微生物产羧肽酶活力均较低，导致了羧肽酶的生产和应用成本高，从而限制了该酶的广泛应用。
基因工程羧肽酶纯度高、不含其他蛋白酶，不含动物源性的任何物质，终产物不需进行病毒等的检疫等，不含胰蛋白酶抑制剂-PMSF，同时，利用基因工程菌生产羧肽酶不受动、植物原料来源的限制、不表达需要大面积的占地种植，也不受季节气候的影响，不破坏资源，不污染环境，是一种安全、高效、高产、高质的高新技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种羧肽酶及其基因序列，羧肽酶工程菌的构建，以其重组羧肽酶的高效表达方法，经生物信息学分析确定该酶属于蛋白酶S1家族，命名为Aus CpA，相应的 基因序列命名为Aus cpA。Aus CpA具有较好的活性和稳定性，有较大的工业化生产的潜力和经济价值。
本发明的技术方案：一种来源于A.usamii E001的羧肽酶，其全基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，全基因获取的过程如图1所示。
A.usamii E001已在文献【宇佐美曲霉木聚糖酶基因xyn II在不同毕赤酵母中的分泌表达，生物加工过程，第6卷第2期，2008年3月】中公开，本发明人承诺该微生物在20年内向公众发放。
所述的羧肽酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
所述的羧肽酶基因的克隆及表达方法：
(1)A.usamii E001羧肽酶基因3′端cDNA序列的合成
首先对Aspergillus terreus、Aspergillus clavatus和Aspergillus niger的羧肽酶的氨基酸序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的保守序列。然后对它们的mRNA进行同源比对，寻找出对应的核苷酸序列后设计两条简并引物AucpA-3F1和AucpA-3F2；
AucpA-3F1：5′-TTGAGAAYCCDTACTCGT-3′
AucpA-3F2：5′-ACTGGAGARAGTTAYGCG-3′
提取A.usamii E001的总RNA，按照TaKaRa生产的RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中的说明书进行RT-PCR，经过两轮PCR可以得到羧肽酶基因3′端cDNA序列。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA3′，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A.usamii E001羧肽酶基因3′端cDNA序列。
(2)A.usamii E001羧肽酶基因5′端cDNA序列的合成
以A.usamii E001羧肽酶基因3′端cDNA序列设计两条扩增5′端cDNA序列的反向引物AucpA-5R1和AucpA-5R2；
AucpA-5R1：5′-ACTGACCAATACAGGGAT-3′
AucpA-5R2：5′-AGCAGCGGATATGTAAGGA-3′
按照TaKaRa生产的5′-Full RACE Kit中的说明书进行5′-RACE，最后经过两轮PCR可以得到羧肽酶基因5′端cDNA序列，将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA5′，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A.usamii E001羧肽酶基因5′端cDNA序列。
(3)A.usamii E001羧肽酶基因5′端调控序列的合成
利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerF和AucpA-5R1为引物进行第一轮PCR，T-PrimerF和AucpA-R2为引物第二轮PCR，经过两轮PCR得到羧肽酶基因5′端调控序列，将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpAP，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A.usamii E001羧肽酶基因5′端调控序列。
(4)A.usamii E001羧肽酶基因3′端调控序列的合成
以A.usamii E001羧肽酶基因3′端cDNA序列设计两条扩增3′端调控序列的正向引物AucpA-F 1和AucpA-F2；
AucpA-F1：5′-GGGAATACTATCTACTATGGG-3′
AucpA-F2：5′-GTGATTATCAGTGCCTGGTG-3′
利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerR和AucpA-F1为引物进行第一轮PCR；然后以第一轮PCR产物为模板、T-PrimerR和AucpA-F2为引物进行第二轮PCR；将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA3T，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A.usamii E001羧肽酶基因3′端调控序列。
(5)A.usamii E001羧肽酶基因的生物信息学分析
将Aus cpA的5′端cDNA与3′端cDNA进行序列拼接，得到转录起始位点至PolyA的cDNA序列，在NCBI上进行开放阅读框架(Open Reading Frame)分析，进而推测出Aus cpA的氨基酸序列，然后进行信号肽预测；将cDNA序列与两侧调控序列进行拼接，然后进行启动子区域预测和PolyA加尾信号预测。
(6)A.usamii E001羧肽酶基因内含子序列的测定
以预测出的A.usamii E001羧肽酶基因的cDNA为模板，设计一对引物AucpA-F3和AucpA-R；
AucpA-F3：5′-GAATTCATGCTGTTTCGCAGTCTGTT-3′，含EcoR I酶切位点；
AucpA-R：5′-GCGGCCGCTTAGGCACTATCAATAGCAG-3′，含Not I酶切位点；
以A.usamii E001的基因组DNA为模板，AucpA-F3和AucpA-R为引物进行PCR，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA-DNA，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A.usamii E001羧肽酶编码区的DNA序列；将DNA序列与cDNA用DNAMAN 6.0进行序列比对，便能得出A.usamii E001羧肽酶基因内含子序列。
(7)构建含有编码A.usamii E001羧肽酶成熟肽基因的表达质粒
以预测出的A.usamii E001羧肽酶成熟肽基因为模板设计一对引物AucpA-F和AucpA-R；
AucpA-F：5′-GAATTCATCCCTGTCGAGGACTAT-3′，含EcoR I酶切位点；
AucpA-R：5′-GCGGCCGCTTACAGGGTATCACGCCG-3′，含Not I酶切位点；
按照TaKaRa生产的RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中的说明书进行RT-PCR：以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和AucpA-F为引物进行第一轮PCR；以第一轮的PCR产物为模板、AucpA-F和AucpA-R为引物进行第二轮PCR；将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-Aus cpA，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定。
将测序结果正确的pUCm-T-Aus cpA与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-Aus cpA(图2)，并对重组质粒进行序列测定。
(8)GS115/Aus cpA的构建、表达及活性测定
用Sac I对pPIC9K-Aus cpA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的重组GS115/Aus cpA，以手册上的标准流程进行诱导表达，对表达产物用茚三酮法进行活性分析。
本发明的优点：
本发明提供了一种羧肽酶及其基因序列，羧肽酶工程菌的构建，以其重组羧肽酶的高效表达及活性测定方法。该羧肽酶具有较好的活性和稳定性，有较大的工业化生产的潜力和经济意义，也为其它羧肽酶的研究奠定了理论基础。
附图说明
图1：获取A.usamiiAus cpA全基因序列的流程图
图2：重组质粒pPIC9K-Aus cpA构建示意图
具体实施方式
实施例1A.usamii E001羧肽酶基因3′端cDNA序列的合成
按照TaKaRa生产的RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中的说明书进行RT-PCR：以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和AucpA-3F1为引物进行第一轮PCR(94℃，2min；94℃，30s，48℃，30s，72℃，90s，30个循环；72℃，10min)；以第一轮的PCR产物为模板、M13Primer M4和AucpA-F2为引物进行第二轮PCR(94℃，2min；94℃，30s，48℃，30s，72℃，90s，30个循环；72℃，10min)；将两轮PCR 产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA3′，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A.usamii E001羧肽酶基因3′端cDNA序列。
实施例2A.usamii E001羧肽酶基因5′端cDNA序列的合成
按照TaKaRa生产的5′-Full RACE Kit中的说明书进行5′-RACE：以5′RACE Outer Primer和AucpA-5R1为引物进行第一轮PCR(94℃，3min；94℃，30s，47℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min)；以第一轮的PCR产物为模板、5′RACE Inner Primer和AucpA5-R2为引物进行第二轮PCR(94℃，3min；94℃，30s，51℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min)；将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA5′，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A.usamiiE001羧肽酶基因5′端cDNA序列。
实施例3A.usamii E001羧肽酶基因5′端调控序列的合成
利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerF和AucpA-5R1为引物进行第一轮PCR(94℃，4min；94℃，30s，47℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min)；然后以第一轮PCR产物为模板、T-PrimerF和AucpA-R2为引物进行第二轮PCR(94℃，4min；94℃，30s，51℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min)；将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpAP，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A.usamii E001羧肽酶基因5′端调控序列。
实施例4A.usamii E001羧肽酶基因3′端调控序列的合成
利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerR和AucpA-3F1为引物进行第一轮PCR(94℃，4min；94℃，30s，47℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min)；然后以第一轮PCR产物为模板、T-PrimerR和AucpA-F2为引物进行第二轮PCR(94℃，4min；94℃，30s，47℃，30s，72℃，1min30s，30个循环；72℃，10min)；将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA3T，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A.usamii E001羧肽酶基因3′端调控序列。
实施例5A.usamii E001羧肽酶基因的生物信息学分析
将AucpA的5′端cDNA与3′端cDNA进行序列拼接，得到转录起始位点至PolyA的cDNA序列，在NCBI上进行开放阅读框架(Open Reading Frame)分析，进而推测出AucpA的氨基酸序列，然后进行信号肽预测；将cDNA序列与两侧调控序列进行拼接，然后进行启动子 区域预测(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)和PolyA加尾信号预测(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)。
实施例6A.usamii E001羧肽酶基因内含子序列的测定
以A.usamii E001的基因组DNA为模板，AucpA-F3和AucpA-R为引物进行PCR(94℃，4min；94℃，30s，53℃，30s，72℃，2min，30个循环；72℃，10min)，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA-DNA，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A.usamii E001羧肽酶编码区的DNA序列；将DNA序列与cDNA用DNAMAN 6.0进行序列比对，便能得出A.usamii E001羧肽酶基因内含子序列。
实施例7构建含有编码A.usamii E001羧肽酶成熟肽基因的表达质粒
按照TaKaRa生产的RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中的说明书进行RT-PCR：以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和AucpA-F为引物进行第一轮PCR(94℃，2min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，90s，30个循环；72℃，10min)；以第一轮的PCR产物为模板、AucpA-F和AucpA-R为引物进行第二轮PCR(94℃，2min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，90s，30个循环；72℃，10min)；将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-Aus cpA，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定。将测序结果正确的pUCm-T-Aus cpA与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-Aus cpA，并对重组质粒进行序列测定。
实施例8GS115/Aus cpA的构建、表达及活性测定
用Sac I对pPIC9K-Aus cpA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的重组GS115/Aus cpA，以手册上的标准流程进行诱导表达，对表达产物用茚三酮法进行活性分析。
Claims (3)
1.一种来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的羧肽酶，其完整的基因序列为SEQ IDNO：1。
2.如权利要求1所述的羧肽酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
3.A.usamii E001羧肽酶基因全基因序列获得的方法：
(1)A.usamii E001羧肽酶基因3′端cDNA序列的合成
首先对Aspergillus terreus、Aspergillus clavatus和Aspergillus niger的羧肽酶的氨基酸序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的保守序列。然后对它们的mRNA进行同源比对，寻找出对应的核苷酸序列后设计两条简并引物AucpA-3F1和AucpA-3F2；
AucpA-3F1：5′-TTGAGAAYCCDTACTCGT-3′
AucpA-3F2：5′-ACTGGAGARAGTTAYGCG-3′
按照TaKaRa生产的RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中的说明书进行RT-PCR：以OligodT-AdaptorPrimer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13PrimerM4和AucpA-3F1为引物进行第一轮PCR(94℃，2min；94℃，30s，48℃，30s，72℃，90s，30个循环；72℃，10min)；以第一轮的PCR产物为模板、M13Primer M4和AucpA-F2为引物进行第二轮PCR(94℃，2min；94℃，30s，48℃，30s，72℃，90s，30个循环；72℃，10min)；将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA3′，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A.usamii E001羧肽酶基因3′端cDNA序列；
(2)A.usamii E001羧肽酶基因5′端cDNA序列的合成
以A.usamii E001羧肽酶基因3′端cDNA序列设计两条扩增5′端cDNA序列的反向引物AucpA-5R1和AucpA-5R2；
AucpA-5R1：5′-ACTGACCAATACAGGGAT-3′
AucpA-5R2：5′-AGCAGCGGATATGTAAGGA-3′按照TaKaRa生产的5′-Full RACE Kit中的说明书进行5′-RACE：以5′RACE Outer Primer和AucpA-5R1为引物进行第一轮PCR(94℃，3min；94℃，30s，47℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min)；以第一轮的PCR产物为模板、5′RACE Inner Primer和AucpA5-R2为引物进行第二轮PCR(94℃，3min；94℃，30s，51℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min)；将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA5′，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A.usamii E001羧肽酶基因5′端cDNA序列；
(3)A.usamii E001羧肽酶基因5′端调控序列的合成
利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerF和AucpA-5R1为引物进行第一轮PCR(94℃，4min；94℃，30s，47℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min)；然后以第一轮PCR产物为模板、T-PrimerF和AucpA-R2为引物进行第二轮PCR(94℃，4min；94℃，30s，51℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min)；将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpAP，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A.usamii E001羧肽酶基因5′端调控序列；
(4)A.usamii E001羧肽酶基因的生物信息学分析
将Aus cpA的5′端cDNA与3′端cDNA进行序列拼接，得到转录起始位点至PolyA的cDNA序列，在NCBI上进行开放阅读框架(Open Reading Frame)分析，进而推测出Aus CpA的氨基酸序列，然后进行信号肽预测；将cDNA序列与两侧调控序列进行拼接，然后进行启动子区域预测(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)和PolyA加尾信号预测(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)；
(5)A.usamii E001羧肽酶基因内含子序列的测定
以预测出的A.usamii E001羧肽酶基因的cDNA为模板，设计一对引物AucpA-F3和AucpA-R；
AucpA-F3：5′-GAATTCATGCTGTTTCGCAGTCTGTT-3′，含EcoR I酶切位点；
AucpA-R：5′-TTAGGCACTATCAATAGCAG-3′，含Not I酶切位点；
以A.usamii E001的基因组DNA为模板，AucpA-F3和AucpA-R为引物进行PCR(94℃，4min；94℃，30s，53℃，30s，72℃，2min，30个循环；72℃，10min)，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA-DNA，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A.usamii E001羧肽酶编码区的DNA序列；将DNA序列与cDNA用DNAMAN 6.0进行序列比对，便能得出A.usamii E001羧肽酶基因内含子序列；
(6)构建含有编码A.usamii E001羧肽酶成熟肽基因的表达质粒
以预测出的A.usamii E001羧肽酶成熟肽基因为模板设计一对引物AucpA-F和AucpA-R；
AucpA-F：5′-GAATTCATCCCTGTCGAGGACTAT-3′，含EcoR I酶切位点；
AucpA-R：5′-GCGGCCGCTTACAGGGTATCACGCCG-3′，含Not I酶切位点；
按照TaKaRa生产的RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中的说明书进行RT-PCR：以OligodT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和AucpA-F为引物进行第一轮PCR(94℃，2min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，90s，30个循环；72℃，10min)；以第一轮的PCR产物为模板、AucpA-F和AucpA-R为引物进行第二轮PCR(94℃，2min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，90s，30个循环；72℃，10min)；将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-Aus cpA，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定。将测序结果正确的pUCm-T-Aus cpA与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-Aus cpA，并对重组质粒进行序列测定；
(7)GS115/Aus cpA的构建、表达及活性测定
用Sac I对pPIC9K-Aus cpA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的重组GS115/Aus cpA，以手册上的标准流程进行诱导表达，对表达产物用茚三酮法进行活性分析。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN111139189A (zh) * | 2020-01-14 | 2020-05-12 | 浙江工业大学 | 曲霉wbx-38及其在生产环匹阿尼酸中的应用 |
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-
2011
- 2011-12-12 CN CN2011104105687A patent/CN102492677A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109666664A (zh) * | 2019-01-15 | 2019-04-23 | 中国农业大学 | 一种具有降解赭曲霉毒素a功能的羧肽酶a的制备方法及其应用 |
| CN111139189A (zh) * | 2020-01-14 | 2020-05-12 | 浙江工业大学 | 曲霉wbx-38及其在生产环匹阿尼酸中的应用 |
| CN111139189B (zh) * | 2020-01-14 | 2022-04-19 | 浙江工业大学 | 曲霉wbx-38及其在生产环匹阿尼酸中的应用 |
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